本發(fā)明涉及有機配合物，具體涉及雙核鎳配位有機化合物。

背景技術(shù)：

G-四鏈體(G-quadruplex)是一種特殊的DNA二級結(jié)構(gòu)。人類基因組中很多富含鳥嘌呤(G)區(qū)域具有形成這一結(jié)構(gòu)的能力，包括端粒末端鳥嘌呤重復(fù)序列，以及多種基因的啟動子區(qū)域，如c-kit、c-myc、c-myb、bcl-2、PDGF、kRAS、VEGF、Rb和胰島素基因等。G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成對于體內(nèi)的一系列生理過程都存在調(diào)控作用。有研究表明，某些啟動子區(qū)域的G-四鏈體結(jié)構(gòu)會顯著影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，因此G-四鏈體結(jié)構(gòu)被認為是起到分子開關(guān)的功能，其形成和拆散可能涉及到信號傳導(dǎo)、細胞凋亡和細胞增殖等一系列體內(nèi)重要的生理過程。所以在體內(nèi)或者體外試驗中，能夠特異性地結(jié)合G-四鏈體結(jié)構(gòu)或誘導(dǎo)G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成，對于開發(fā)以G-四鏈體結(jié)構(gòu)為靶點的抗癌藥物具有非常重要的作用。

人端粒DNA是染色體末端由DNA重復(fù)序列TTAGGG組成的雙螺旋區(qū)，其末端是含有100-200nt(核苷酸)的富G堿基的單鏈懸突，雖然它們大多數(shù)是趨向于形成單倍體G-四鏈體，但是仍有少數(shù)趨向于形成更復(fù)雜的由TTA堿基序列連接的雙倍體或多倍體G-四鏈體結(jié)構(gòu)。許多疾病，如ALS病、脆性X綜合征和HIV等，都與能形成多倍體G-四鏈體的富G序列密切相關(guān)。然而，近些年來的研究大部分集中于對不同構(gòu)象的單倍體G-四鏈體的選擇性結(jié)合和識別研究，而對雙倍體或多倍體G-四鏈體結(jié)合劑的研究尚處于起步階段。因此特異性結(jié)合雙倍體或多倍體G-四鏈體有助于更好地理解這些G-四鏈體的結(jié)構(gòu)和功能，為開發(fā)出以雙倍體或多倍體G-四鏈體為靶點的抗腫瘤藥物提供有效指導(dǎo)。

近年來，對雙核及多核金屬配位化合物的研究非常活躍，其中對能同時結(jié)合兩個金屬離子的配體研究，更加引人注目。CN1579629A公開了一種橋連苯二胺的雙吡啶環(huán)的席夫堿雙核鎳配位化合物，用作乙烯齊聚反應(yīng)的主催化劑。CN1528763A公開了一種橋連大環(huán)多胺的雙核鎳配位化合物，作為一種水解DNA和RNA的仿酶催化劑。文獻《J.Am.Chem.Soc.》公開了一種類似鋅指結(jié)構(gòu)的納米尺度的手性超分子雙核鎳配位化合物NiM，其結(jié)構(gòu)如下式(Ⅰ)所示(J.Am.Chem.Soc.,2013,135,18786-18789)，

上述文獻僅報道了所述雙核鎳金屬配位化合物具有選擇性結(jié)合反平行雙倍體G-四鏈體DNA的功能，但卻未公開其是否能選擇性結(jié)合平行/反平行的混合型雙倍體G-四鏈體，以及是否具有誘導(dǎo)形成G-四鏈體的相關(guān)功能。此外，上述文獻所公開的雙核鎳金屬配位化合物的兩個活性部位均為立體結(jié)構(gòu)，其與G-四鏈體平面的π-π堆積作用相對較弱。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種席夫堿雙核鎳配位化合物，該化合物與雙倍體G-四鏈體平面的π-π堆積作用顯著增強。

本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案為：

一種席夫堿雙核鎳配位化合物，該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下式(II)所示，

一種制備上述席夫堿雙核鎳配位化合物的方法，該方法包括以下步驟：

(1)取1，11-二(4-甲基-苯磺?；?5-氧)-四乙二醇醚，分別加入2摩爾倍的3-硝基-4-氨基-苯酚和碳酸鉀，再加入適量的N,N-二甲基甲酰胺溶解，并加熱至80℃攪拌反應(yīng)6h；然后，將反應(yīng)溶液倒入水中，過濾，并將收集的固體物質(zhì)裝三氧化二鋁柱，以乙醇︰乙酸乙酯︰石油醚為0︰3︰8～0.2︰3︰8體積比的洗脫液梯度洗脫，收集乙醇︰乙酸乙酯︰石油醚為0.2︰3︰8體積比的洗脫液，除去溶劑得到1，11-二(3-硝基-4-氨基苯-5-氧)-四乙二醇醚；

(2)取1，11-二(3-硝基-4-氨基苯-5-氧)-四乙二醇醚溶解于適量的甲醇中，加入用量為1，11-二(3-硝基-4-氨基苯-5-氧)-四乙二醇醚0.04摩爾倍的催化劑Pd/C，通入氫氣還原出1，11-二(3，4-二氨基苯-5-氧)-四乙二醇醚；

(3)取1，11-二(3，4-二氨基苯-5-氧)-四乙二醇醚，加入4摩爾倍的2-羥基-4-(2-哌啶)-乙氧基-苯甲醛，溶于乙醇中，在無水無氧條件下加熱回流2h，再加入用量為1，11-二(3，4-二氨基苯-5-氧)-四乙二醇醚2摩爾倍的醋酸鎳加熱回流16h，去除溶劑，并用二氯甲烷︰戊烷＝1︰3體積比的混合溶劑溶解，重結(jié)晶得到席夫堿雙核鎳配位化合物。

本發(fā)明所述的席夫堿雙核鎳配位化合物的兩個金屬配位中心為近平面結(jié)構(gòu)，兩個活性部位與雙倍體G-四鏈體平面的距離較近，因此其與雙倍體G-四鏈體平面的π-π堆積作用顯著 增強，可誘導(dǎo)形成反平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)；此外，本發(fā)明所述的席夫堿雙核鎳配位化合物中間連接鏈長剛好和TTA堿基連接鏈相匹配，可選擇性結(jié)合含有一個TTA中間連接鏈的雙倍體G-四鏈體DNA結(jié)構(gòu)。由此可見，本發(fā)明所述的席夫堿雙核鎳配位化合物具有診斷ALS病、脆性X綜合征和HIV的潛在用途。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物與反平行雙倍體G-四鏈體G2T1結(jié)合的效果圖，其中，(a)為紫外光譜圖；(b)為表觀結(jié)合常數(shù)與濃度線性關(guān)系圖。

圖2為本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物與混合型雙倍體G-四鏈體G2T1結(jié)合的效果圖，其中(a)為紫外光譜圖；(b)為表觀結(jié)合常數(shù)與濃度線性關(guān)系圖。

圖3為本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物與反平行單倍體G-四鏈體G1結(jié)合的效果圖，其中，(a)為紫外光譜圖；(b)為表觀結(jié)合常數(shù)與濃度線性關(guān)系圖。

圖4為本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物與混合型單倍體G-四鏈體G1結(jié)合的效果圖，其中，(a)為紫外光譜圖；(b)為表觀結(jié)合常數(shù)與濃度線性關(guān)系圖。

圖5為本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物與CT DNA結(jié)合的效果圖，其中，(a)為紫外光譜圖；(b)為表觀結(jié)合常數(shù)與濃度線性關(guān)系圖。

圖6為反平行單倍體和雙倍體G-四鏈體DNA的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，圖中，泳道1～10依次分別為G1(16μM)、本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物(16μM)+G1(16μM)、G2T1(8μM)、本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物(16μM)+G2T1(8μM)、G1(16μM)+G2T1(8μM)、G1(16μM)+G2T1(8μM)+4μM本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物、G1(16μM)+G2T1(8μM)+8μM本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物、G1(16μM)+G2T1(8μM)+16μM本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物、G1(16μM)+G2T1(8μM)+32μM本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物、DNA maker的電泳條帶。

圖7為混合型單倍體和雙倍體G-四鏈體DNA的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，圖中，泳道1～10為G1(16μM)、本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物(16μM)+G1(16μM、G2T1(8μM)、本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物(16μM)+G2T1(8μM)、G1(16μM)+G2T1(8μM)、G1(16μM)+G2T1(8μM)+4μM本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物、G1(16μM)+G2T1(8μM)+8μM本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物、G1(16μM)+G2T1(8μM)+16μM本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物、G1(16μM)+G2T1(8μM)+32μM本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物、DNA maker的電泳條帶。

圖8為向未褪火的G-四鏈體DNA溶液中加入不同體積所述雙核鎳配位化合物溶液的圓 二色譜曲線圖，圖中，曲線1、2、3和4依次表示所述雙核鎳配位化合物溶液加入量為0、1.8uL、3.5uL和7.0uL的圓二色譜曲線。

圖9為向反平行雙倍體G-四鏈體G2T1的DNA溶液中加入不同體積所述雙核鎳配位化合物溶液的圓二色譜與解鏈溫度關(guān)系的曲線圖，圖中，圖例和所示曲線分別表示所述雙核鎳配位化合物溶液加入量為0、1.8uL、3.5uL和7.0uL的圓二色譜與解鏈溫度關(guān)系曲線。

圖10為向反平行單倍體G-四鏈體G1的DNA溶液中加入與不加入所述雙核鎳配位化合物溶液的圓二色譜與解鏈溫度關(guān)系的曲線圖，圖中，圖例所示曲線為不加入所述雙核鎳配位化合物溶液，圖例所示曲線為加入所述雙核鎳配位化合物溶液。

圖11為向反平行雙倍體G-四鏈體G2T2的DNA溶液中加入與不加入所述雙核鎳配位化合物溶液的圓二色譜與解鏈溫度關(guān)系的曲線圖，圖中，圖例所示曲線為不加入所述雙核鎳配位化合物溶液，圖例所示曲線為加入所述雙核鎳配位化合物溶液。

圖12為向反平行雙倍體G-四鏈體G2T4的DNA溶液中加入與不加入所述雙核鎳配位化合物溶液的圓二色譜與解鏈溫度關(guān)系的曲線圖，圖中，圖例所示曲線為不加入所述雙核鎳配位化合物溶液，圖例所示曲線為加入所述雙核鎳配位化合物溶液。

圖13為向反平行雙倍體G-四鏈體G2T6的DNA溶液中加入與不加入所述雙核鎳配位化合物溶液的圓二色譜與解鏈溫度關(guān)系的曲線圖，圖中，圖例所示曲線為不加入所述雙核鎳配位化合物溶液，圖例所示曲線為加入所述雙核鎳配位化合物溶液。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例一(本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物的合成)

本發(fā)明所述的席夫堿配位雙核鎳配位化合物，其合成路線如 (Ⅲ)所示。

本發(fā)明所述的席夫堿雙核鎳配位化合物的合成方法如下所述：

(1)取1.64mmol的1，11-二(4-甲基-苯磺?；?5-氧)-四乙二醇醚，分別加入3.28mmol的3-硝基-4-氨基-苯酚和碳酸鉀，再加入5mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，并加熱至80℃攪拌反應(yīng)6h；然后，將反應(yīng)溶液倒入50mL水中，過濾，并將收集的固體物質(zhì)裝三氧化二鋁柱，以乙醇︰乙酸乙酯︰石油醚為0︰3︰8～0.2︰3︰8體積比的洗脫液梯度洗脫，收集乙醇︰乙酸乙酯︰石油醚為0.2︰3︰8體積比的洗脫液，除去溶劑得到398mg紅色固體物質(zhì)，經(jīng)鑒定該紅色固體物質(zhì)為1，11-二(3-硝基-4-氨基苯-5-氧)-四乙二醇醚。上述化合物的具體鑒定數(shù)據(jù)如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ3.56(s,4H,-CH₂O-),3.57(s,4H,-CH₂O-),3.72(t,J＝4.4Hz,4H,-CH₂O-),4.04(t,J＝4.4Hz,4H,-CH₂O-),6.99(d,J＝8.6Hz,2H,ArH),7.19(d,J＝2.8Hz,2H,ArH),7.27(s,4H,ArH),7.38(d,J＝2.8Hz,2H,ArH).¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ68.2,69.3,70.4,106.5,121.2,128.0,129.5,142.4,148.8.ESI-MS:m/z 489.2([M+Na]⁺)and HRMS for C₂₀H₂₆N₄O₉([M+Na]⁺)Calcd:489.1597,found:489.1598。

(2)取0.113mmol的1，11-二(3-硝基-4-氨基苯-5-氧)-四乙二醇醚溶解于20mL的甲醇中，加入0.00452mmol的催化劑Pd/C，通入氫氣加熱回流2h，過濾出Pd/C，濾液減壓除溶劑，在N₂環(huán)境中干燥，得到42mg棕色油狀物質(zhì)，經(jīng)鑒定該棕色油狀物質(zhì)為1，11-二(3，4-二氨基苯-5-氧)-四乙二醇醚。上述化合物的具體鑒定數(shù)據(jù)如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ3.55(q,4H,-CH₂O-),3.56(q,4H,-CH₂O-),3.66(t,J＝4.8Hz,4H,-CH₂O-),3.87(t,J＝4.8Hz,4H,-CH₂O-),3.99(s,4H,-NH₂),4.48(s,4H,-NH₂),5.98(dd,J＝8.4Hz,J＝2.4Hz,2H,ArH),6.16(d,J＝2.8Hz,2H,ArH),6.40(d,J＝8.4Hz,2H,ArH).¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ67.6,69.7,70.4,102.4,102.9,115.7,137.0,158.5.HRMS(ESI⁺)for C₂₀H₃₀N₄O₅([M+H]⁺)Calcd:407.2294,found:407.2294。

(3)取0.1033mmol的1，11-二(3，4-二氨基苯-5-氧)-四乙二醇醚和0.4133mmol的2-羥基-4-(2-哌啶)-乙氧基-苯甲醛，溶于20mL乙醇，在無水無氧裝置中加熱回流2h，再加入0.2048mmol的醋酸鎳加熱回流16h，減壓去除溶劑，并用二氯甲烷︰戊烷＝1︰3體積比的混合溶劑溶解，重結(jié)晶得到124mg紅黑色固體產(chǎn)物，經(jīng)鑒定該紅黑色固體產(chǎn)物為Ⅱ式所示的席夫堿雙核鎳配位化合物；其中，所述醋酸鎳的加入方法最好是，先將醋酸鎳溶解于乙醇然后滴加。上述化合物的具體鑒定數(shù)據(jù)如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ1.38(br,8H,piperidine-H),1.49(br,16H,piperidine-H),1.91(s,9H,CH₃COO-),2.41(br,16H,piperidine-H),2.63(br,8H,-CH₂N-),3.57(br,4H,-CH₂O-),3.59(br,4H,-CH₂O-),3.75(br,4H,-CH₂O-),3.96(br,4H,-CH₂O-),4.04(br,4H,-CH₂O-),4.09(br,4H,-CH₂O-),6.19～6.30(br,8H,ArH),6.78(d,J＝8.4Hz,2H,ArH),7.28(d,J＝8.8Hz,2H,ArH),7.33(d,J＝8.8Hz,2H,ArH),7.50(br,2H,ArH),7.81(d,J＝9.2Hz,2H,ArH),8.24(s,2H,-CH＝N-),8.42(s,2H,-CH＝N-).¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ23.4,25.1,53.8,56.6,65.5,67.7,68.7,69.5,100.7,101.4,106.3,106.9,113.1,114.6,115.0,134.2,134.6,135.7,143.1,152.2,153.9,,157.5,163.6,164.2,166.2,167.2.MALDI-TOF:m/z 1467.9([M+Na]⁺)for C₇₆H₉₄N₈Ni₂O₁₃.Anal.Calcd for C₇₆H₉₄N₈Ni₂O₁₃·2CH₂Cl₂·3CH₃COOH:C,55.75；H,6.09；N,6.30.Found:C,56.21；H,6.18；N,6.24。

實施例二(本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物的活性檢測)

1、DNA制備樣品

G-四鏈體DNA樣品：DNA樣品購自上海生物生工技術(shù)有限公司，將適量DNA溶于相應(yīng)的緩沖溶液,95℃加熱10min后緩慢降至室溫，4℃孵育過夜，最后在SMA1000上測量260nm處的吸光度，根據(jù)朗伯比爾定律計算DNA的濃度。CT DNA溶液：DNA樣品購自上海生物生工技術(shù)有限公司，將DNA固體直接溶于10mM Tris-HCl,100mM NaCl(pH 7.08)緩沖液中，最后在SMA1000上測量260nm處的吸光度，根據(jù)朗伯比爾定律計算DNA的濃度。

2、制備本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物溶液(以下簡稱雙核鎳配位化合物溶液)

將實施例1所制備的席夫堿雙核鎳配位化合物溶解在混合溶液中得到母液，該母液中席夫堿雙核鎳配位化合物的濃度為3.0mM，其中所述的混合溶液由DMSO和濃度為1mM的HCl組成，且DMSO與濃度為1mM的HCl的體積比為95︰5；然后再用DMSO將母液中 席夫堿雙核鎳配位化合物的濃度稀釋至1mM，得到雙核鎳配位化合物溶液。

3、用紫外滴定法考察本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物與雙倍體G-四鏈體的結(jié)合能力

紫外滴定法測試使用了如下三種DNA序列：CT DNA，雙鏈線性DNA；G1，5’-A(G₃T TA)₃G₃-3’，單倍體G-四鏈體；G2T1，5’-A(GGGTTA)₇G₃-3’，雙倍體G-四鏈體。將人端粒寡聚核苷酸G1和G2T1溶于10mM Tris-HCl，pH 7.08和100mM KCl(或NaCl)緩沖溶液中，得到500μM的DNA溶液，95℃加熱10min后緩慢降至室溫，4℃孵育過夜。按需要配制500μM DNA溶液，該溶液作為滴定液。CT DNA溶液直接用10mM Tris-HCl，pH 7.08和100mM NaCl緩沖溶液配制成500μM。用對應(yīng)的緩沖溶液配制20μM雙核鎳配位化合物溶液，此溶液作為紫外滴定法的測定溶液，固定化合物的濃度，不斷加入500μM DNA的溶液，測試300-700nm范圍內(nèi)的吸收光譜，雙核鎳配位化合物與DNA的表觀結(jié)合常數(shù)K_a根據(jù)公式(1)計算，

[DNA]/Δε_ap＝[DNA]/Δε+1/(Δε×K) (1)

公式(1)中ε_a＝A_observed/[Complex],Δε_ap＝[ε_a–ε_f],Δε＝[ε_b–ε_f],ε_b是雙核鎳配位化合物結(jié)合DNA后的吸光系數(shù)，ε_f是化合物的吸光系數(shù)。紫外滴定結(jié)果如圖1～5。

圖1顯示了在10mM Tris-HCl，pH 7.08和100mM NaCl緩沖溶液中，終濃度為0～10uM的反平行雙倍體G-四鏈體G2T1對20μM雙核鎳配位化合物溶液的紫外光譜的影響；圖2顯示了在10mM Tris-HCl，pH 7.08和100mM KCl緩沖溶液中，終濃度為0～10uM的混合型雙倍體G-四鏈體G2T1對20μM雙核鎳配位化合物溶液的紫外光譜的影響。圖1和2分別顯示反平行和混合型雙倍體G-四鏈體G2T1均使雙核鎳配位化合物在310nm和360nm處的吸收峰發(fā)生了明顯的減色效應(yīng)，且使360nm處的吸收峰分別發(fā)生了12nm和7nm的紅移，說明雙核鎳配位化合物與兩種不同構(gòu)象的雙倍體G-四鏈體發(fā)生了較強的π-π堆積作用，其表觀結(jié)合常數(shù)分別為3.111×10⁷M^-1和1.149×10⁷M^-1。

圖3顯示了在10mM Tris-HCl，pH 7.08和100mM NaCl緩沖溶液中，終濃度為0～10uM的反平行單倍體G-四鏈體G1對20μM雙核鎳配位化合物溶液的紫外光譜的影響；圖4顯示了在10mM Tris-HCl，pH 7.08和100mM KCl緩沖溶液中，終濃度為0～10uM的混合型單倍體G-四鏈體G1對20μM雙核鎳配位化合物溶液的紫外光譜的影響；圖5顯示了在10mM Tris-HCl，pH 7.08和100mM KCl緩沖溶液中，終濃度為0～10uM的CT DNA對20μM雙核鎳配位化合物溶液的紫外光譜的影響。由圖3～5可見雙核鎳配位化合物對反平行單倍體G- 四鏈體、混合型單倍體G-四鏈體和線性CT DNA的表觀結(jié)構(gòu)常數(shù)分別為1.052×10⁶M^-1、2.140×10⁶M^-1和1.074×10⁵M^-1。對比研究發(fā)現(xiàn)：雙核鎳配位化合物對雙倍體G-四鏈體DNA的結(jié)合能力要比單倍體G-四鏈體高5～30倍，比線性DNA高107～290倍，而兩個不同構(gòu)象的雙倍體G-四連體結(jié)合能力相比，雙核鎳配位化合物對反平行雙倍體G-四鏈體DNA的結(jié)合能力要比混合型雙倍體G-四鏈體高3倍。由此說明雙核鎳配位化合物相對于線性DNA、不同構(gòu)象的單倍體G-四鏈體DNA和混合型雙倍體G-四鏈體DNA，對反平行雙倍體G-四鏈體具有更高的結(jié)合親和力。

4、用聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物與雙倍體G-四鏈體的結(jié)合特異性

將寡聚核苷酸G1和G2T1分別溶于Milli Q.水中，得到1mM的母液，然后用10mM Tris-HCl，pH 7.08和100mM NaCl的緩沖溶液稀釋到60μM，95℃加熱10min后緩慢降至室溫，4℃孵育過夜；將1mM雙核鎳配位化合物溶液用上述緩沖溶液稀釋到240μM。取一定量的60uM G1或G2T1溶液、240uM的雙核鎳配位化合物溶液及上述緩沖溶液混合，制備如下體積均為12uL的九種混合溶液：1號溶液,16μM的G1；2號溶液，16μM雙核鎳配位化合物和16μM的G1混合液；3號溶液，8μM的G2T1；4號溶液，16μM雙核鎳配位化合物和8μM的G2T1混合液；5號溶液，16μM的G1和8μM的G2T1混合液；6號溶液，16μM的G1、8μM的G2T1和4μM雙核鎳配位化合物混合液；7號溶液，16μM的G1、8μM的G2T1和8μM雙核鎳配位化合物混合液；8號溶液，16μM的G1、8μM的G2T1和16μM雙核鎳配位化合物混合液；9號溶液，16μM的G1、8μM的G2T1和32μM雙核鎳配位化合物混合液。然后將上述九種溶液在4℃反應(yīng)3h，然后在15％非變性聚丙烯酰胺凝膠上，1×TBE緩沖液(pH 8.3)中電泳，最后用EB染色，拍照，其結(jié)果如圖6。

如圖6所示，對比條帶1和2，雙核鎳配位化合物與反平行單倍體G1混合后，并沒有出現(xiàn)新的DNA條帶，說明雙核鎳配位化合物與DNA沒有形成穩(wěn)定的化合物；對比條帶3和4，雙核鎳配位化合物和反平行雙倍體G2T1混合后，在條帶4中出現(xiàn)了一個泳動速度更快的新的條帶，說明雙核鎳配位化合物與反平行雙倍體G2T1結(jié)合后，形成了結(jié)構(gòu)更加緊密的新的化合物；條帶5～9為不斷增大雙核鎳配位化合物的濃度，反平行單倍體G1和雙倍體G2T1混合DNA溶液的條帶的變化，由圖說明即使單倍體和雙倍體G-四鏈體混合在一起，雙核鎳配位化合物也只是和雙倍體G-四鏈體結(jié)合，并且存在一定的濃度依賴關(guān)系，隨著雙核鎳配位化合物濃度的增加，與雙倍體G-四鏈體的結(jié)合體G2T1-1的結(jié)合量越大。這些結(jié)果說明：雙核鎳配位化合物對反平行雙倍體G-四鏈體具有選擇性結(jié)合能力。

圖7反映的是雙核鎳配位化合物對混合型雙倍體G-四鏈體的結(jié)合選擇性電泳圖，實驗操作與圖6的實驗類似，不同之處在于所用緩沖溶液為10mM Tris-HCl，pH 7.08和100mM KCl，用于形成混合型雙倍體G-四鏈體DNA。其結(jié)果也與圖6類似，雙核鎳配位化合物同樣不與混合型單倍體形成穩(wěn)定化合物，但能與混合型雙倍體G-四鏈體形成穩(wěn)定化合物，即使單倍體和雙倍體G-四鏈體混合，雙核鎳配位化合物也只與混合型雙倍體G-四鏈體結(jié)合。

因此圖6和7的實驗結(jié)果說明：相對于單倍體G-四鏈體，雙核鎳配位化合物對反平行和混合型雙倍體G-四鏈體DNA均具有優(yōu)良的結(jié)合選擇性。

5、用CD光譜檢測本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物可否誘導(dǎo)形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)

將人端粒寡聚核苷酸G2T1溶于10mM Tris-HCl，pH 7.08緩沖溶液中，得到2.5μM的未褪火的G2T1溶液，在CD光譜儀上檢測G2T1的CD光譜的變化，比色皿寬4mm，反應(yīng)液為700μL，掃描范圍為220-340nm；向含有2.5μM G2T1溶液中，分別加入1.8uL、3.5uL和7uL的1mM雙核鎳配位化合物溶液，配制成三種含雙核鎳配位化合物濃度分別為2.5uM、5.0uM和10.0uM的2.5μM的G2T1溶液，采用上述方法測定三種混合溶液的CD光譜，最后上述四種溶液的CD光譜圖用Origin 8.0軟件處理，實驗結(jié)果如圖8所示。

由圖8可以看出:隨著雙核鎳配位化合物濃度的不斷增大，250nm單鏈DNA的CD信號峰逐漸降低，295nm處反平行G-四鏈體的特征CD信號峰出現(xiàn)，說明雙核鎳配位化合物可誘導(dǎo)形成反平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)；同時在431nm處出現(xiàn)了一個新的CD信號峰，說明雙核鎳配位化合物與形成的G-四鏈體DNA有很強的結(jié)合能力。

6、用CD-melting實驗檢驗本發(fā)明所述席夫堿雙核鎳配位化合物與雙倍體G-四鏈體DNA結(jié)合的熱穩(wěn)定性

將寡聚核苷酸G2T1溶于Milli Q.水中，得到1mM的DNA母液，然后用10mM Tris-HCl，100mM NaCl(pH 7.08)的緩沖溶液稀釋到10μM，95℃加熱10min后緩慢降至室溫，4℃孵育過夜。CD-melting實驗中，緩沖液中含有700μL 2.5μM G2T1，采集20℃至95℃溫度范圍內(nèi)295nm處的CD值(溫度間隔是5℃)，Origin8.0軟件處理數(shù)據(jù)，求出G2T1DNA本身的熔點T_DNA；向上述濃度的DNA溶液中分別加入0、1.8uL、3.5uL和7.0uL的1mM的雙核鎳配位化合物溶液，配制四種雙核鎳配位化合物濃度為0、2.5、5.0和10.0uM的G2T1混合溶液，采集溶液在20℃至95℃溫度范圍內(nèi)295nm處的CD值(溫度間隔是5℃)，Origin8.0軟件處理數(shù)據(jù)，求出加入不同濃度的雙核鎳配位化合物后DNA的熔點T_m；根據(jù)T_DNA和 T_m的值，計算DNA熔解溫度的變化值ΔT_m＝T_m-T_DNA。其實驗結(jié)果如圖9，隨著雙核鎳配位化合物濃度從0uM不斷增加至10uM，ΔT_m值不斷增大；當(dāng)雙核鎳配位化合物濃度是反平行雙倍體G-四鏈體DNA的2倍時，其ΔT_m為14.1℃；當(dāng)雙核鎳配位化合物濃度是反平行雙倍體G-四鏈體DNA的4倍時，其ΔT_m達到了20.0℃。由ΔT_m的大小，可以判斷雙核鎳配位化合物對G-四鏈體DNA的結(jié)合能力和熱穩(wěn)定性，其值越大，說明化合物對DNA的結(jié)合能力和熱力學(xué)穩(wěn)定性越強。由此說明雙核鎳配位化合物對反平行雙倍體G-四鏈體表現(xiàn)出高的熱力學(xué)穩(wěn)定性和強的結(jié)合親和力。

圖10～13反映了雙核鎳配位化合物的存在對單倍體G1、含兩個TTA堿基連接連的雙倍體G-四鏈體G2T2(5’-A(GGGTTA)₄(TTAGGG)₄-3’，雙倍體G-四鏈體)、含四個TTA堿基連接連的雙倍體G-四鏈體G2T4(5’-A(GGGTTA)₄(TTA)₂(TTAGGG)₄-3’，雙倍體G-四鏈體)和含六個TTA堿基連接連的雙倍體G-四鏈體G2T6(5’-A(GGGTTA)₄(TTA)₄(TTAGGG)₄-3’，雙倍體G-四鏈體)熱穩(wěn)定性的影響。實驗方法與圖9的實驗方法相似。當(dāng)5.0uM的G1或2.5uM的G2T2(或G2T4，或G2T6)中存在5.0uM的雙核鎳配位化合物時，其ΔT_m分別為2.0℃、11.9℃、8.1℃和6.3℃。對比圖9至13的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雙核鎳配位化合物對反平行雙倍體G-四鏈體的結(jié)合能力和熱穩(wěn)定性明顯高于單倍體G-四鏈體；隨著中間連接鏈TTA的不斷延長，雙核鎳配位化合物對雙倍體G-四鏈體的熱穩(wěn)定性和結(jié)合能力逐漸減弱。