本發(fā)明涉及常見菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及近海岸大腸桿菌檢測方法。

背景技術(shù)：

近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，近岸海水，尤其是海水浴場成為夏季人們休閑活動(dòng)的重要場所。但由于我國城市污水處理系統(tǒng)不夠完善，很多未經(jīng)處理的污水直接排入近海水域，對(duì)海水浴場的公共健康安全造成極大威脅。大腸桿菌，分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。與人類腸道疾病密切相關(guān)，在衛(wèi)生學(xué)中被用作飲用水、食品、娛樂用水等糞源性污染衛(wèi)生指標(biāo)。同時(shí)，由于與其他腸道病原菌在外界的存活時(shí)間近似，使其成為國際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌。因此，對(duì)海水中大腸桿菌的監(jiān)測能夠有效的評(píng)估海水浴場的公共健康安全。

然而現(xiàn)階段針對(duì)大腸桿菌的檢測主要為選擇性培養(yǎng)法，分子生物學(xué)方法等，且其多為針對(duì)食品中大腸桿菌的檢測方法。對(duì)于近岸海水中大腸桿菌的檢測，僅有關(guān)杰等提出的基于選擇性培養(yǎng)的檢測方法。但該方法耗時(shí)長，且無法測定不可培養(yǎng)的大腸桿菌數(shù)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供一種近岸海水中大腸桿菌的檢測方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中基于選擇性培養(yǎng)基方法檢測大腸桿菌耗時(shí)長，人力物力消耗大、無法定量海水中不可培養(yǎng)的大腸桿菌的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種近岸海水中大腸桿菌的檢測方法，包括如下步驟：

(1)大腸桿菌DNA提取

采用抽濾系統(tǒng)將海水中細(xì)菌截留在微孔濾膜上，并提取膜上DNA。

(2)擴(kuò)增目的片段

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，獲得針對(duì)大腸桿菌特有的大腸桿菌堿性磷酸酶(phoA)基因設(shè)計(jì)的引物，目的片段大小約622bp，引物信息如下：

上游引物：TACAGGTGACTGCGGGCTTATC

下游引物：CTTACCGGGCAATACACTCACTA

利用菌種(陽性對(duì)照)以及海水環(huán)境樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix 13μL、ddH₂O 9μL、上游引物(8-10μM)1μL、下游引物(8-10μM)1μL、DNA 1μL。PCR程序：90-95℃預(yù)變性5或10min；90-95℃變性20-60s，55--60℃退火50-60s，65-75℃延伸40-50s，30-40個(gè)循環(huán)；65-75℃終延伸10-15min。

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并切膠回收目的條帶中的DNA片段。

(3)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板

DNA片段經(jīng)純化后與T載體恒溫連接過夜。連接結(jié)束后，利用熱擊法將連接獲得的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)中。挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒并測序檢驗(yàn)。測序正確的質(zhì)粒用于標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板使用。

(4)建立Q-PCR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

提取完成后測定質(zhì)粒濃度，并計(jì)算質(zhì)粒模板的準(zhǔn)確拷貝數(shù)。

根據(jù)估計(jì)的海水樣品病原菌濃度，選擇合適的質(zhì)粒模板濃度，對(duì)質(zhì)粒提取液進(jìn)梯度稀釋并建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系：2×SYBR Green QPCR Mix 10μL、ddH₂O 7μL、上游引物(8-10μM)1μL、下游引物(8-10μM)1μL、樣品DNA 1μL。Q-PCR程序：90-95℃預(yù)變性3-5min；90-95℃變性10-20s，55-60℃退火30-40s，64-75℃延伸30-40s，30-40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后以Ct值和log拷貝數(shù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(5)環(huán)境樣品大腸桿菌數(shù)測定

采用Q-PCR技術(shù)測定大腸桿菌DNA濃度。反應(yīng)體系：2×SYBR Green QPCR Mix 10μL、ddH₂O 7μL、上游引物(8-10μM)1μL、下游引物(8-10μM)1μL、樣品DNA 1μL。Q-PCR程序：90-95℃預(yù)變性3-5min；90-95℃變性10-20s，55-60℃退火30-40s，64-75℃延伸30-40s，30-40個(gè)循環(huán)。然后按照定量標(biāo)準(zhǔn)曲線將Ct值轉(zhuǎn)換成拷貝數(shù)，從而定量環(huán)境樣品中大腸桿菌的濃度。

本發(fā)明的有益效果是：與當(dāng)下基于選擇性培養(yǎng)法檢測相比，本發(fā)明方法有以下優(yōu)點(diǎn)：首先，縮短了檢測時(shí)間，由原方法的10-12天，縮短為1天，在完成標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下僅需3-4個(gè)小時(shí)。其次，克服了原方法無法測定不可培養(yǎng)大腸桿菌的問題，提高了鑒別的準(zhǔn)確度。

附圖說明

圖1.瓊脂糖凝膠電泳圖，從左到右依次是Marker d1、d2都是大腸桿菌的菌種(陽性對(duì)照)海水樣品x1南浴場東浴場西浴場空白；

圖2.5.63×10⁰～5.63×10⁴copies/μL范圍內(nèi)Q-PCR定量曲線圖；

圖3.Q-PCR溶解曲線圖，其中溶解曲線呈現(xiàn)單峰，表明模板中擴(kuò)增產(chǎn)物特異是單一產(chǎn)物；

圖4.Q-PCR所得Ct值與log拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

采用抽濾系統(tǒng)將海水中細(xì)菌截留在孔徑為0.22μm的微孔濾膜上，用E.N.Z.A.TM Water DNA Kit試劑盒(Omega,USA)提取膜上DNA，具體步驟參見試劑盒說明書。

采用針對(duì)大腸桿菌特有的大腸桿菌堿性磷酸酶(phoA)基因設(shè)計(jì)的引物，目的片段大小約622bp，引物信息如下：

上游引物：TACAGGTGACTGCGGGCTTATC

下游引物：CTTACCGGGCAATACACTCACTA

利用菌種(陽性對(duì)照)以及海水環(huán)境樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix 13μL、ddH₂O 9μL、上游引物(10μM)1μL、下游引物(10μM)1μL、DNA 1μL。PCR程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸40s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。

使用PCR儀將切膠回收的DNA片段經(jīng)純化后與PGM-18載體在16℃下恒溫連接。連接結(jié)束后，全量(10μL)加入含100μL大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的1.5mL離心管中，混勻后冰浴30分鐘，42℃水浴熱激180s，冰浴1min后加入約1mL LB液體培養(yǎng)基在37℃，180轉(zhuǎn)，振蕩培養(yǎng)2h左右；10000rpm離心2min，去除上清液，將沉淀吸打混勻，取約100μL涂布于含氨芐青霉素(50μg/mL)的LB固體選擇培養(yǎng)基上，封口后37℃倒置培養(yǎng)過夜。

用無菌牙簽隨機(jī)挑取單菌落約15個(gè)，在含有氨芐青霉素(50μg/mL)的LB液體選擇培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)2h。以上述菌液為模板，采用載體專用引物RV-M+M13-47進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選陽性克隆，并用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測陽性克隆。將陽性克隆對(duì)應(yīng)的菌液，在5mL含有100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒并測序檢驗(yàn)。

提取完成后測定質(zhì)粒濃度，并計(jì)算質(zhì)粒模板的準(zhǔn)確拷貝數(shù)。對(duì)質(zhì)粒提取液進(jìn)梯度稀釋，在5.63×10⁰～5.63×10⁴copies/μL范圍內(nèi)建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系：2×SYBR Green QPCR Mix 10μL、ddH₂O 7μL、上游引物(10μM)1μL、下游引物(10μM)1μL、樣品DNA 1μL。Q-PCR程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性10s，57℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后以Ct值和log拷貝數(shù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用Q-PCR技術(shù)測定大腸桿菌DNA濃度。反應(yīng)體系：2×SYBR Green QPCR Mix 10μl、ddH₂O 7μL、上游引物(10μM)1μL、下游引物(10μM)1μL、DNA 1μL；Q-PCR程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性10s，57℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)。然后按照定量標(biāo)準(zhǔn)曲線將Ct值轉(zhuǎn)換成拷貝數(shù)，從而定量環(huán)境樣品中大腸桿菌的濃度。

本發(fā)明為涉及近海大腸桿菌的定量檢測提供了技術(shù)支持。為能快速準(zhǔn)確的測定近岸海水浴場，海洋排污口，海水養(yǎng)殖區(qū)中大腸桿菌數(shù)量，評(píng)估其公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)明人所在課題組運(yùn)用該檢測方法分別測定2015年7月和10月份、秦皇島養(yǎng)殖區(qū)固定站位及2016年1、3、5月份海水浴場，海洋排污口大腸桿菌數(shù)量，并取得良好效果。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。