本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學領(lǐng)域，具體涉及消化道腫瘤的結(jié)直腸癌組織及細胞中的長鏈非編碼RNA的表達及其用于制備治療所述癌癥的應用。

背景技術(shù)：

結(jié)直腸癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一。諸多類型腫瘤中，結(jié)直腸癌的分子機理研究開展比較早，研究得相對比較清楚。自Vogelstein提出經(jīng)典的結(jié)直腸癌的多步驟、多基因的發(fā)生發(fā)展模式以來，結(jié)直腸癌的分子病理學在不斷發(fā)展，一系列與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的基因被相繼發(fā)現(xiàn)。近二十年來，隨著我國居民生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升的趨勢，積極開展對結(jié)直腸癌相關(guān)分子的尋找，并進行功能研究，明確其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的確切作用及其相關(guān)分子機制，對尋找結(jié)直腸癌的診斷、治療、預后靶標有很重要的意義。

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是個多步驟的過程，其中從正常粘膜-腺瘤-癌變途徑是最重要的發(fā)生模式，其中致癌基因和抑癌基因是目前研究的重點，平時兩者處于平衡狀態(tài)，但一旦基因突變導致這種平衡被打破就會進而促進腫瘤的形成。由于我們對多基因參與的腫瘤多步驟調(diào)控的過程認識有限，并且缺少有效的控制手段，因此探索腫瘤診斷與治療新的分子來源就顯得十分迫切。

人類基因組計劃及其后續(xù)的DNA元件計劃的研究結(jié)果表明，編碼蛋白的基因序列僅占人類基因組序列的1-3％，而人基因組中絕大部分可轉(zhuǎn)錄的序列為非編碼的RNA，包括小片段的如microRNA以及長鏈的非編碼RNA(long non-coding RNA，IncRNA)。近年來的許多研究都表明示IncRNA參與了一系列重要的細胞調(diào)節(jié)過程。例如長鏈非編碼RNA參與了調(diào)節(jié)目標基因的轉(zhuǎn)錄、遺傳印記及細胞核內(nèi)的運輸?shù)缺姸嚓P(guān)鍵的調(diào)節(jié)控制的過程，和其它包括脫氧核糖核酸甲基化、遺傳印記及染色質(zhì)的重新構(gòu)建等表觀遺傳形式一樣，與疾病的關(guān)系持續(xù)成為關(guān)注的熱點。

LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核昔酸的非編碼RNA，，Tsai于2011年發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA有助于腫痛的早期診斷，預后的判斷和可以作為分子鞭向治療的目標基因，因此具有較好的臨床應用價值。并且大量的報道證實長鏈非編碼RNA與多種腫瘤的形成及發(fā)展有密切的關(guān)系，如肺癌、肝癌和乳腺癌等。中國科學院根據(jù)長鏈非編碼RNA不同的特征對其進行了分類，例如根據(jù)基因組的定位和背景可分為基因內(nèi)、基因間、正義以及反義；根據(jù)發(fā)揮功能的機制分為轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平等；根據(jù)尋鞭機制又可分為信號原型、誘巧原型、指導原型、分子支架原型；根據(jù)對DNA序列的作用方式分為順式作用和反式作用兩種等。LncRNA主要通過表觀遺傳水平、遺傳印記、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及蛋白功能調(diào)節(jié)等不同的信號轉(zhuǎn)導途徑實現(xiàn)基因水平的調(diào)節(jié)控制。目前在非編碼RNA研究中，miRNA已經(jīng)取得重要的成果；因此長鏈非編碼RNA可能也代表著另外一個重要的分子來源。目前并沒有發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中相關(guān)的IncRNA及其作用的發(fā)現(xiàn)，本申請首先證實了結(jié)直腸癌中可以作為診斷標志物以及治療靶點的IncRNA。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

TUC338是由多聚胞喀B定結(jié)合蛋白2(poly(rC)bindingprotein2，PCBP：2)基因獨立轉(zhuǎn)錄形成的轉(zhuǎn)錄片段，TUC338就是克隆該轉(zhuǎn)錄片段而來的。TUC338對腫瘤的增殖活性及細胞凋亡發(fā)揮著十分重要調(diào)控作用。

本發(fā)明提供一種在結(jié)直腸癌中高表達的可以作為診斷結(jié)直腸癌的標志物的TUC338，其具有如1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；2)包含一個或多個取代的與SEQ ID NO：1具有90％以上的同源性的核苷酸序列。

本發(fā)明提供一種干擾RNA序列，其可以降低細胞中TUC338的表達量，所示的細胞為結(jié)直腸癌細胞。所述的干擾RNA序列如SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明提供一種干擾載體，所述的載體包含SEQ ID NO：2所示的干擾序列。

本發(fā)明提供一種檢測TUC338表達的試劑，所述的試劑為引物，所述的引物對具有如SEQ ID NO：3-4所示的序列。

本發(fā)明提供一種診斷試劑盒，所述的試劑盒包含SEQ ID NO：2-3所述的引物對。

本發(fā)明還請求保護TUC338作為診斷結(jié)直腸癌診斷標志物的應用，所述的TUC338具有SEQ ID NO：1所示的序列。

本發(fā)明還請求保護一種抑制TUC338表達的試劑用于制備治療結(jié)直腸癌藥物的應用；所述的試劑為干擾RNA，優(yōu)選的，所述的干擾RNA具有SEQ ID NO：4所示的序列。

說明書附圖

圖1結(jié)直腸癌腫瘤組織與癌旁組織中TUC388表達差異對比；

圖2 RT-PCR檢測干擾RNA片段對于細胞系TUC338表達差異的對比；

圖3 MTT實驗檢測轉(zhuǎn)染shRNA干擾TUC338后的細胞增殖率被抑制的情況；

圖4侵襲實驗結(jié)果證明，在轉(zhuǎn)染shRNA后，明顯抑制了細胞的侵襲活性；

圖5轉(zhuǎn)染shRNA后HT29的凋亡率顯示。

具體實施方式

實施例1結(jié)直腸癌組織樣本中TUC338表達量的檢測

1)、選取科病理確診為結(jié)腸癌或直腸癌患者并且采用手術(shù)，治療的17例結(jié)直腸癌患者的新鮮癌組織及其對應的癌旁組織(切緣3cm以外)，所有患者術(shù)前均未行化療、放療等抗腫瘤治療，排除其他系統(tǒng)性疾病，排除轉(zhuǎn)移癌可能，各個重要器官功能在正常范圍么內(nèi)。

2)、引物的合成：在GenBank Blast查詢，查找到目的基因TUC338mRNA的序列(SEQ ID NO：1)，應用Primer的express 2.0軟件在CDS區(qū)上設計特異性引物探針，引物探針合成由(公司)合成，引物序列如下：

Forward(5′-3)：GCCCCACCCCTTCATTCTTA(SEQ ID NO：2)

Reverse(5′-3′)：CAGACACAATTTGAAACGAGCTG(SEQ ID NO：3)；

β-Actin序列：

Forward(5′-3)：ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGAT(SEQ ID NO：5)

Reverse(5′-3′)：CTTGCACATGCCGGAGCCGTT(SEQID NO：6)；

3)、總RNA的提取

a)將保存在-80℃冰箱中的結(jié)直腸癌及其對應的癌旁組織取出，然后馬上研磨成撤末。按100-200∶1的比例加入BiooPure，常溫放置五分鐘。按照BiooPure體積的五分之一加入氯仿，離心，吸取上清。

b)將上一步液體，再次離也沉淀RNA后去除上清。

c)用泛醇清洗RNA，常媼下干燥10分鐘，跟著取少許進行檢測。

4)、總RNA定量和純度檢測：超微量分光光度計(QuawellQ5000)

a)先用DEPC水調(diào)零；

b)取1.0μl樣品檢測，每檢測完一個樣品后，紗布擦干，緊跟著再檢測下一個樣品；

c)根據(jù)檢測結(jié)果取恰量RNA定量至1.0μg，備以后研究所用。

5)逆轉(zhuǎn)錄

a)體系配制(TaKaRa D6110A)

b)在PCR儀器上進行變性、退火反應：

65℃5min

冰上冷卻；

c)配制逆轉(zhuǎn)錄反應液體系(20μl)：

d)在PCR儀上進行如下的反應：

30℃10min

42℃60min

95℃5min；處理后，冰上放置。

6)QPCR檢測反應(TaKaRa DRR820A)

a)體系配制

混合均勻，離心，分裝96孔板，各個樣品各個基因進行三個重復。

b)QPCR反應條件設置

比較CT法分析數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖1所示。經(jīng)過數(shù)據(jù)計算及統(tǒng)計，結(jié)直腸癌腫瘤組織中TUC388的表達升高4.31±2.13倍，且數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學意義(t＝5.137，p＜0.001)。

實施例2干擾RNA序列的設計及載體制備

1)根據(jù)TUC338序列信息設計干擾片段和陰性對照序列，其中干擾序列為：

siRNA-TUC338：

Sense Seq：5′-UACAGCACAGGCAGCGACTT-3′；(SEQ ID NO：2)

Antisense Seq：5′-GUCGCUGCCUGUGCUGUATT-3′；

Negative Control siRNA：

Sense Seq：5′-UUGUGCGAAGCUGAUGCUTT-3′；(SEQ ID NO：7)

AntiSense Seq 5′-AGCAUCAGCUUCGCACAATT-3′。

2)載體構(gòu)建

化學合成上述的片段，退火后通過酶切連接入載體pLVX-shRNA1中，所述的方法包括：

a)寡核苷酸的退火

將合成好的脫氧核苷酸稀釋至1μg/μL，正義鏈和反義鏈各取5μL退火形成雙鏈，反應體系如下：

正義鏈 5μL

反義鏈 5μL

ddH₂O 15μL

反應溫度為95℃，反應5min，然后將至室溫。

b)載體的酶切

用BamH I和EcoR I雙酶切shRNA表達載體反應體系如下：

反應條件為37℃，反應時間為1h。

酶切后的產(chǎn)物進行凝膠電泳，膠回收酶切后的載體片段；4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

c)寡核苷酸片段與載體的連接

將退火形成的脫氧核苷酸雙鏈片段與雙酶切后的空白載體，反應體系如下

反應條件為16℃，連接過夜。

d)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞并進行克隆驗證

①將上述步驟獲得的連接產(chǎn)物加到CaCl₂法制備的大腸桿菌感受態(tài)細胞中，冰浴40min；

②將上述的感受態(tài)與連接片段的混合物至于42℃水浴中熱激90sec，然后取出至于冰浴中5min；

③將轉(zhuǎn)化后的菌株涂布在含有抗生素LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過夜；

④挑取單菌落加入到含有700μL含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，150rpm震蕩培養(yǎng)過夜；

⑤提取質(zhì)粒，雙酶切驗證；

⑥將酶切驗證正確的克隆送公司測序驗證連接序列是否正確；保留測序正確的克隆。

實施例3干擾RNA載體的干擾效果檢驗

HT29細胞作為受體細胞，轉(zhuǎn)染前進行復蘇，傳代培養(yǎng)；設置實驗組，即干擾組(Si)、陰性對照(NC)和空白對照組(Blank)。

1)細胞轉(zhuǎn)染

a)轉(zhuǎn)染前24h細胞改用不含有任何抗生素的培養(yǎng)基；

b)細胞匯合率達到70％；；

c)取20μL連接產(chǎn)物加入到400μL的無血清培養(yǎng)基中，加入5μL Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑，室溫下混勻，靜置20min；

d)每組設置三個重復孔，每孔加入上述步驟制得的轉(zhuǎn)染試劑400μL，置于5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-8h，然后更換為正常的培養(yǎng)液。

e)轉(zhuǎn)染后24-48小時，檢測RNA表達水平。

2)熒光定量PCR檢測

a)RNA提?。?/p>

b)RT-PCR檢測，具體方法請參見實施例1.結(jié)果見表1和圖2所示。

表1 RT-PCR驗證干擾片段的效果

實驗結(jié)果顯示，發(fā)明人設計的TUC338的RNAi片段可以明顯降低TUC338的轉(zhuǎn)錄量，而對照組并僅有少量的降低，說明本申請的RNAi片段構(gòu)建成功。

實施例4TUC338表達量降低對于腫瘤細胞的影響

1)HT29細胞增殖實驗——MTT檢測

a)細胞接種：細胞消化計數(shù)，按照600個/ml的密度接種到96孔板；每孔加入200μL，置于5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中放置培養(yǎng)；

b)細胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染含有siRNA的載體shRNA，以及陰性對照NC，分別在24h、48h和72h后進行染色、檢測；

c)染色：細胞培養(yǎng)24h后，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μL，基于置于5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中放置培養(yǎng)4h；

d)檢測：去除培養(yǎng)板每孔中的培養(yǎng)液，每孔加入150μL的DMSO，水平震蕩10min，酶標儀檢測492nm處的吸光值，繪制生長曲線。結(jié)果見表2以及圖3所示。

表2轉(zhuǎn)染shRNA72h后對于細胞的增殖抑制率

實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染shRNA的細胞系細胞增殖速率被明顯抑制，而對照組的抑制率則未有明顯降低，可見在抑制TUC338的轉(zhuǎn)錄后，有效抑制了結(jié)直腸癌細胞的增殖，提示其具有一定的抑癌作用。

2)細胞侵襲實驗——Transwell方法

a)細胞的培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)染同上；

b)在細胞轉(zhuǎn)染24h后，胰酶消化成單個細胞懸液，技術(shù)，離心，收集細胞沉淀，無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度在1×10⁶；

c)實驗前預先在Transwell小室的上室中涂布20μL的matrigel，使其在冰上風干，吸取多余的液體，然后每孔加入50μL的含10g/LBSA的無血清液，37℃，30min；

d)上室中添加200μL的細胞懸液，下室添加5％胎牛血清的1640培養(yǎng)基，500μL，置于37℃5％CO₂中培養(yǎng)24h；

e)棄去培養(yǎng)基，并擦去上室中的多余細胞；

f)酒精固定細胞，固定時間在30-40min；

g)用0.1％捷徑紫染色，染色20min，蒸餾水清洗未著色的燃料；

h)鏡檢，并計算細胞的平均值以及抑制率。

經(jīng)過鏡檢及計算得出，對照組中，HT29細胞系在轉(zhuǎn)染shRNA后，侵襲的抑制率分別為31.43±15.67％，而實驗組為161.47±24.56％，t值為2.654，p為0.002，具備統(tǒng)計學意義，而圖4中也可以看出，在轉(zhuǎn)染shRNA后，明顯抑制了細胞的侵襲及遷移活性。

3)細胞凋亡和細胞周期的檢測——流式細胞儀法

a)細胞培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)染同上；

b)轉(zhuǎn)染48h后，收集細胞；

c)加入PBS緩沖液清洗細胞沉淀2此；

d)75％的冰乙醇重懸細胞，并在-20℃條件下固定超過12h；

e)PBS清洗細胞，離心收集細胞；

f)RNase處理，37℃水域20-30min；

g)PI染色，混勻；

h)避光室溫孵育15min；

i)流式細胞儀上機檢測。

每組重復3此，計算細胞的凋亡率得出，HT29細胞系在轉(zhuǎn)染shRNA后，相比對照組以及空白組，其凋亡率有明顯上升，分別是空白組4.87±0.23％，陰性對照組5.61±0.05％，實驗組為11.20±0.04％，F(xiàn)值為5903.239，p＜0.001。具有一定的統(tǒng)計學意義，具體見圖5所示。

上述實施例僅是記載了本領(lǐng)域中的常規(guī)方法，用于說明本申請的發(fā)明構(gòu)思，其并不代表本申請的保護范圍，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉上述操作方法中的替代手段，均涵蓋在本申請的保護范圍之中。