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本申請(qǐng)要求于2014年12月1日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)62/085,834的優(yōu)先權(quán)，將其以全文通過引用特此結(jié)合。

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發(fā)明領(lǐng)域

本披露涉及真菌宿主菌株和用于其創(chuàng)建和使用的重組dna構(gòu)建體。該真菌宿主菌株特別穩(wěn)定，并且可用于可靠或變異較小表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)。本披露進(jìn)一步涉及如此構(gòu)建的真菌宿主菌株、感興趣的蛋白質(zhì)和組合物的使用，該組合物包含通過使此類改良的真菌宿主菌株發(fā)酵制備的此類感興趣的蛋白質(zhì)。

背景技術(shù)：

使用真菌菌株作為感興趣的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)宿主長(zhǎng)期以來一直被認(rèn)為是經(jīng)濟(jì)上可行的并且在一段時(shí)間廣泛用于商業(yè)環(huán)境中。然后，這些蛋白質(zhì)，任選地被純化后，可以用于各種工業(yè)、學(xué)術(shù)或其他應(yīng)用中。然而，常見的是實(shí)際上僅有非常少量的(如果有的話)使用分子技術(shù)構(gòu)建的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生感興趣的酶。如此少量的成功轉(zhuǎn)化體的一個(gè)原因可能只是轉(zhuǎn)化效率低，導(dǎo)致整體轉(zhuǎn)化體很少。另一個(gè)原因可能是低百分比的轉(zhuǎn)化體足夠穩(wěn)定以允許產(chǎn)生表達(dá)產(chǎn)物，該產(chǎn)物可以是蛋白質(zhì)、酶或其他分子。

作為與基因的核酸和/或氨基酸序列無關(guān)的因子的結(jié)果，可以發(fā)生異源基因(例如非天然基因或以與天然形式不同的形式存在的天然基因)的表達(dá)變異性。例如，非同源末端連接(nhej)機(jī)制在多細(xì)胞真核生物(包括大多數(shù)真菌)中占主導(dǎo)地位。因此，在隨機(jī)位置將表達(dá)載體整合到基因組中，可能導(dǎo)致各種轉(zhuǎn)化體之間的表達(dá)水平的位置效應(yīng)。此外，即使在已經(jīng)證實(shí)感興趣的基因的表達(dá)之后也可能產(chǎn)生不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體，需要進(jìn)一步篩選轉(zhuǎn)化體以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。作為多核原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的結(jié)果，變異性也可能通過異核體的產(chǎn)生而發(fā)生，因?yàn)榻z狀真菌的多核性質(zhì)阻礙了這些生物體中的靶向基因整合。因此，生產(chǎn)遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株以按降低的變異性表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)的可靠手段提供了明顯的優(yōu)點(diǎn)。

這樣的明顯優(yōu)點(diǎn)的非限制性實(shí)例在于由真菌表達(dá)的dna文庫(kù)中的感興趣的基因或變體的功能篩選。表達(dá)功效和/或水平的變異性使得難以將給定變體的特征與另一種變體的特征進(jìn)行比較。因此，如果感興趣的基因或變體可以被特定的宿主細(xì)胞可靠地表達(dá)，并且如果以變化性小的水平使得它們的特征可以更容易地被評(píng)估和比較，則明顯存在特別的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明概述

本披露涉及真菌宿主菌株和用于其創(chuàng)建和使用的重組dna構(gòu)建體。與本領(lǐng)域已知的其他表達(dá)方法相比，真菌宿主菌株可以用于提供感興趣的基因或變體在這些宿主中以更高可靠性和/或更低變異性的表達(dá)水平表達(dá)。在具體實(shí)施例中，真菌宿主菌株可用于有效地靶向基因整合以便可靠或變異較小表達(dá)感興趣的基因。

在第一方面，本披露提供構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株的方法，該方法包括：a)使用線性化dna和限制酶的混合物轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，其中該限制酶能夠在所述真菌菌株的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂；以及b)選擇在步驟a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株。

在某些實(shí)施例中，限制酶能夠使轉(zhuǎn)化的染色體dna線性化和/或在染色體dna中產(chǎn)生相容的粘性末端。

在一些實(shí)施例中，線性化dna包含一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因。合適地，感興趣的基因編碼以下各項(xiàng)之一：半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶或某些其他有用的酶。在一些情況下，線性化dna可以包含多于一個(gè)感興趣的基因，因此轉(zhuǎn)化的真菌菌株表達(dá)編碼多于一種感興趣的酶或蛋白質(zhì)的基因產(chǎn)物的混合物。在某些具體實(shí)施例中，轉(zhuǎn)化的真菌菌株合適地表達(dá)蛋白質(zhì)混合物。在一些實(shí)施例中，感興趣的基因能夠編碼肽激素、生長(zhǎng)因子、凝血因子、趨化因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、抗體、受體、粘附分子、微生物抗原或任何的這樣的基因產(chǎn)物的片段。

在一些實(shí)施例中，線性化dna進(jìn)一步包含至少一種選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記合適地是als1、amds、hygr、pyr2、pyr4、pyrg、suca、博來霉素抗性標(biāo)記、殺稻瘟菌素抗性標(biāo)記、吡啶硫胺抗性標(biāo)記、氯嘧磺隆乙酯抗性標(biāo)記、新霉素抗性標(biāo)記、腺嘌呤途徑基因、色氨酸途徑基因、胸苷激酶標(biāo)記或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或?qū)⒆兂杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的能夠用于制作本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的真菌菌株的任何其他標(biāo)記。

在一些實(shí)施例中，真菌菌株可以是子囊菌真菌菌株。

在一些實(shí)施例中，子囊菌真菌菌株可以合適地是絲狀真菌菌株。例如，絲狀真菌菌株是木霉屬(trichoderma)、青霉屬(penicillium)、曲霉屬(aspergillus)、腐質(zhì)霉屬(humicola)、金孢子菌屬(chrysosporium)、鐮刀菌屬(fusarium)、脈孢菌屬(neurospora)或翹孢霉屬(emericella)。在某些實(shí)施例中，絲狀真菌菌株合適地是里氏木霉(trichodermareesei或t.reesei)。在替代性實(shí)施例中，絲狀真菌菌株合適地是黑曲霉。

在第二方面，本披露提供使用包括以下步驟的方法獲得的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株：a)使用線性化dna和限制酶的混合物轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，其中該限制酶能夠在所述真菌菌株的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂；以及b)選擇在步驟a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株。

在一些實(shí)施例中，該方面的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株包含一種或多種感興趣的基因。例如，感興趣的基因可以是編碼以下各項(xiàng)的基因：半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶或其他有用的酶。在一些情況下，該方面的轉(zhuǎn)化的真菌菌株包含多于一個(gè)感興趣的基因，因此，轉(zhuǎn)化的真菌菌株可以產(chǎn)生作為感興趣基因的產(chǎn)物的物質(zhì)混合物。在此意義上，該方面的轉(zhuǎn)化的真菌菌株可以用于生產(chǎn)包含感興趣基因的產(chǎn)物的混合物或組合物。在某些實(shí)施例中，感興趣的基因可以是編碼肽激素、生長(zhǎng)因子、凝血因子、趨化因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、抗體、受體、粘附分子、微生物抗原或此類物質(zhì)中任何一種的片段的基因。

在一些實(shí)施例中，該方面的轉(zhuǎn)化的真菌菌株是子囊菌真菌菌株。在某些具體實(shí)施例中，子囊菌真菌菌株可以合適地是絲狀真菌菌株。例如，絲狀真菌菌株可以是來自木霉屬、青霉屬、曲霉屬、腐質(zhì)霉屬、金孢子菌屬、鐮刀菌屬、脈孢菌屬或翹孢霉屬的菌株。在某些具體實(shí)施例中，轉(zhuǎn)化的絲狀真菌菌株可以是里氏木霉。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，轉(zhuǎn)化的絲狀真菌菌株可以合適地是黑曲霉。

在第三方面，本披露提供了一種改善真菌轉(zhuǎn)化體的穩(wěn)定性的方法，該方法包括使用線性化dna和限制酶的混合物轉(zhuǎn)化真菌菌株的細(xì)胞，其中該限制酶能夠在所述真菌菌株的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂。

在一些實(shí)施例中，改善真菌轉(zhuǎn)化體的穩(wěn)定性的方法的限制酶能夠使轉(zhuǎn)化的染色體dna線性化和/或在染色體dna中產(chǎn)生相容的粘性末端。

在一些實(shí)施例中，在改善真菌轉(zhuǎn)化體的穩(wěn)定性的方法中使用的線性化dna包含一種或多種感興趣的基因。感興趣的基因合適地是編碼以下各項(xiàng)的基因：半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶等。在某些實(shí)施例中，在該方法中使用的線性化dna包含多于一個(gè)感興趣的基因，因此該方法可以用于生產(chǎn)此類酶的混合物，這些酶是由多于一個(gè)感興趣的基因編碼的產(chǎn)物。在此意義上，該方法可以用于生產(chǎn)組合物，該組合物包含由具有改善的穩(wěn)定性的真菌轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的酶或由這樣的真菌轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的酶或蛋白質(zhì)混合物。在一些另外的實(shí)施例中，感興趣的基因可以是編碼肽激素、生長(zhǎng)因子、凝血因子、趨化因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、抗體、受體、粘附分子、微生物抗原或這樣的物質(zhì)的片段的基因。

在一些實(shí)施例中，該方面的方法的線性化dna進(jìn)一步包含至少一種選擇標(biāo)記。例如，選擇標(biāo)記合適地可以是als1、amds、hygr、pyr2、pyr4、pyrg、suca、博來霉素抗性標(biāo)記、殺稻瘟菌素抗性標(biāo)記、吡啶硫胺抗性標(biāo)記、氯嘧磺隆乙酯抗性標(biāo)記、新霉素抗性標(biāo)記、腺嘌呤途徑基因、色氨酸途徑基因、和胸苷激酶標(biāo)記。

在一些實(shí)施例中，該方面的真菌菌株是子囊菌真菌菌株。例如，合適的子囊菌真菌菌株可以是絲狀真菌菌株。絲狀真菌菌株可以是木霉屬、青霉屬、曲霉屬、腐質(zhì)霉屬、金孢子菌屬、鐮刀菌屬、脈孢菌屬或翹孢霉屬菌株中的一種。在一些具體實(shí)施例中，絲狀真菌菌株是里氏木霉菌株。在某些其他實(shí)施例中，絲狀菌株是黑曲霉菌株。

在另一個(gè)方面，本披露提供了在合適的培養(yǎng)基中使轉(zhuǎn)化的真菌菌株發(fā)酵的方法，該菌株通過以下步驟獲得：a)使用線性化dna和限制酶的混合物轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，其中該限制酶能夠在所述真菌菌株的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂；以及b)選擇在步驟a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株。在某些實(shí)施例中，在允許感興趣的基因表達(dá)的條件下使真菌菌株發(fā)酵。

在一些實(shí)施例中，通過使用該方面的方法發(fā)酵的真菌菌株表達(dá)的感興趣的基因編碼半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶或一種或多種本文列出的酶的混合物。在一些其他實(shí)施例中，由真菌菌株表達(dá)的感興趣的基因也可以是編碼肽激素、生長(zhǎng)因子、凝血因子、趨化因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、抗體、受體、粘附分子、微生物抗原和一種或多種片段、或此類分子的混合物的基因。

在某些相關(guān)方面，本發(fā)明還涉及一種組合物，該組合物是該方面的最終發(fā)酵液，該最終發(fā)酵液包含由轉(zhuǎn)化的真菌菌株表達(dá)的感興趣的基因的產(chǎn)物。

在又另一個(gè)方面，本披露提供了表達(dá)感興趣的基因的方法，該方法包括在允許所述感興趣的基因表達(dá)的條件下在合適的培養(yǎng)基中使轉(zhuǎn)化的真菌菌株生長(zhǎng)和發(fā)酵，由此通過以下步驟獲得轉(zhuǎn)化的真菌菌株：a)使用線性化dna和限制酶的混合物轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，其中該限制酶能夠在所述真菌菌株的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂；以及b)選擇在步驟a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株。

在一些實(shí)施例中，該方面的方法進(jìn)一步包括測(cè)定所述感興趣的基因的表達(dá)水平。感興趣的基因可以合適地編碼半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、以及這些酶中的一種或多種的混合物?？商娲?，感興趣的基因合適地可以編碼肽激素、生長(zhǎng)因子、凝血因子、趨化因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、抗體、受體、粘附分子、微生物抗原、以及這些物質(zhì)的片段或這些物質(zhì)中的兩種或更多種的混合物。

在另一個(gè)方面，本披露提供了由感興趣的基因編碼的感興趣的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)通過在轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞中表達(dá)感興趣的基因的方法生產(chǎn)，其中該真菌細(xì)胞通過以下步驟獲得：a)使用線性化dna和限制酶的混合物轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，其中該限制酶能夠在所述真菌菌株的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂；以及b)選擇在步驟a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株。

在另一個(gè)方面，本披露提供了一種蛋白質(zhì)性組合物，該組合物包含由感興趣的基因編碼的感興趣的蛋白質(zhì)，由此該感興趣的基因通過轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞表達(dá)，該真菌細(xì)胞通過以下步驟獲得：a)使用線性化dna和限制酶的混合物轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，其中該限制酶能夠在所述真菌菌株的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂；以及b)選擇在步驟a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株。

在又另外的方面，本披露提供了在生物質(zhì)水解、清潔應(yīng)用、谷物加工、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、食品組合物、紡織品處理等中使用如通過使用本文的各種方面的方法中的任一種和/或本披露的轉(zhuǎn)化的真菌菌株生產(chǎn)的蛋白質(zhì)性組合物的方法。

在又另一個(gè)方面，本披露提供了真菌表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括：a)在染色體dna中含有至少一個(gè)限制酶位點(diǎn)的真菌宿主細(xì)胞；以及b)核酸分子，該核酸分子含有可操作以表達(dá)感興趣的基因的序列、選擇標(biāo)記和與所述染色體限制酶位點(diǎn)側(cè)翼的序列具有實(shí)質(zhì)同源性的序列；其中具有實(shí)質(zhì)同源性的所述序列引起導(dǎo)致感興趣的基因表達(dá)的同源重組事件。

在某些實(shí)施例中，真菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)一步包含表達(dá)盒，該表達(dá)盒表達(dá)能夠在真菌宿主細(xì)胞的染色體dna中產(chǎn)生合適的限制酶位點(diǎn)的限制酶。

感興趣的基因可以是編碼半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、以及這些酶中的兩種或更多種的混合物的基因?？商娲兀信d趣的基因可以編碼肽激素、生長(zhǎng)因子、凝血因子、趨化因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、抗體、受體、粘附分子、微生物抗原、這些分子的片段或這些分子中的兩種或更多種的混合物。

在一些實(shí)施例中，選擇標(biāo)記合適地可以是als1、amds、hygr、pyr2、pyr4、pyrg、suca、博來霉素抗性標(biāo)記、殺稻瘟菌素抗性標(biāo)記、吡啶硫胺抗性標(biāo)記、氯嘧磺隆乙酯抗性標(biāo)記、新霉素抗性標(biāo)記、腺嘌呤途徑基因、色氨酸途徑基因、或胸苷激酶標(biāo)記。

在一些實(shí)施例中，真菌宿主菌株是子囊菌真菌宿主菌株。例如，子囊菌真菌菌株合適地是絲狀真菌菌株。在一些實(shí)施例中，真菌宿主菌株是木霉屬、青霉屬、曲霉屬、腐質(zhì)霉屬、金孢子菌屬、鐮刀菌屬、脈孢菌屬或翹孢霉屬宿主菌株。在一個(gè)具體實(shí)例中，絲狀真菌宿主菌株是里氏木霉宿主菌株。在另一個(gè)具體實(shí)例中，絲狀宿主菌株是黑曲霉宿主菌株。

在相關(guān)方面，本披露提供了使用如本文所述的真菌表達(dá)系統(tǒng)的方法，該真菌表達(dá)系統(tǒng)包含a)在染色體dna中含有至少一個(gè)限制酶位點(diǎn)的真菌宿主細(xì)胞；以及b)核酸分子，該核酸分子含有可操作以表達(dá)感興趣的基因的序列、選擇標(biāo)記和與所述染色體限制酶位點(diǎn)側(cè)翼的序列具有實(shí)質(zhì)同源性的序列。具有實(shí)質(zhì)同源性的序列引起導(dǎo)致感興趣的基因表達(dá)的同源重組事件。在能夠產(chǎn)生染色體限制酶位點(diǎn)的限制酶的存在下，將b)的核酸分子轉(zhuǎn)化到真菌宿主細(xì)胞中。

在一些實(shí)施例中，限制酶由也位于真菌宿主細(xì)胞中的表達(dá)盒產(chǎn)生。

在進(jìn)一步的相關(guān)方面，本披露提供了通過使用如本文所述的真菌表達(dá)系統(tǒng)的方法獲得的轉(zhuǎn)化的或衍生的真菌菌株。此外，本披露還提供了使通過以下步驟獲得的轉(zhuǎn)化的或衍生的真菌菌株發(fā)酵的方法：a)使用線性化dna和限制酶的混合物轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，其中該限制酶能夠在所述真菌菌株的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂；以及b)選擇在步驟a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株。

在又另外的方面，本披露提供了表達(dá)感興趣的基因的方法，該方法包括在允許所述感興趣的基因表達(dá)的條件下，在合適的培養(yǎng)基中使轉(zhuǎn)化的或衍生的真菌菌株生長(zhǎng)和發(fā)酵。相關(guān)地，本披露還提供了由感興趣的基因編碼的感興趣的蛋白質(zhì)。此外，本披露提供了一種蛋白質(zhì)性組合物，該組合物包含感興趣的蛋白質(zhì)。本披露還提供了在生物質(zhì)水解、清潔應(yīng)用、谷物加工、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、食品組合物、紡織品處理等中使用此類蛋白質(zhì)性組合物的方法。

在另一個(gè)方面，本披露提供了靶向基因整合的方法，該方法包括：

a)獲得在染色體dna中含有至少一個(gè)限制酶位點(diǎn)的真菌宿主細(xì)胞；以及

b)獲得一種核酸分子，該核酸分子含有可操作以表達(dá)一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因的序列、至少一種選擇標(biāo)記和與所述染色體限制酶位點(diǎn)側(cè)翼的序列具有實(shí)質(zhì)同源性的序列，其中所述同源序列引起導(dǎo)致所述感興趣的基因的表達(dá)的同源重組事件；

并且在能夠產(chǎn)生限制酶位點(diǎn)的限制酶的存在下將b)的核酸分子轉(zhuǎn)化到a)的真菌宿主細(xì)胞中。

在一些實(shí)施例中，真菌宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含表達(dá)盒，該表達(dá)盒用于在真菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)限制酶。

感興趣的基因合適地編碼半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、或這些酶中的兩種或更多種的混合物。可替代地，感興趣的基因編碼肽激素、生長(zhǎng)因子、凝血因子、趨化因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、抗體、受體、粘附分子、微生物抗原、這些分子的片段或這些分子中的一種或多種的混合物。

選擇標(biāo)記合適地可以是als1、amds、hygr、pyr2、pyr4、pyrg、suca、博來霉素抗性標(biāo)記、殺稻瘟菌素抗性標(biāo)記、吡啶硫胺抗性標(biāo)記、氯嘧磺隆乙酯抗性標(biāo)記、新霉素抗性標(biāo)記、腺嘌呤途徑基因、色氨酸途徑基因、或胸苷激酶標(biāo)記。

在一些實(shí)施例中，真菌宿主菌株合適地是子囊菌真菌菌株。例如，子囊菌真菌菌株可以是絲狀真菌菌株。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌菌株是木霉屬、青霉屬、曲霉屬、腐質(zhì)霉屬、金孢子菌屬、鐮刀菌屬、脈孢菌屬或翹孢霉屬真菌菌株。在某些具體實(shí)施例中，絲狀真菌菌株合適地是里氏木霉菌株。在某些其他具體實(shí)施例中，絲狀真菌菌株是黑曲霉菌株。

在一個(gè)方面，本披露提供了構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的木霉屬菌株的方法，所述方法包括：a)使用線性化(也稱為“線性”)或環(huán)狀dna和限制酶(也稱為用限制酶“處理”)的混合物轉(zhuǎn)化木霉屬細(xì)胞，其中該限制酶能夠在木霉屬細(xì)胞的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂(dsb)；并且b)選擇在a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的木霉屬菌株，其中用限制酶處理的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比高于不用限制酶處理可獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比。

在另一個(gè)方面，本披露提供了構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的木霉屬菌株的方法，所述方法包括：a)用線性化或環(huán)狀dna轉(zhuǎn)化木霉屬細(xì)胞，其中誘導(dǎo)木霉屬細(xì)胞生產(chǎn)限制酶，其中該限制酶能夠在木霉屬細(xì)胞的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂(dsb)；并且b)選擇在a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的木霉屬菌株，其中用限制酶誘導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比高于不用限制酶誘導(dǎo)可獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比。

在另一個(gè)方面，本披露提供了改善木霉屬轉(zhuǎn)化體的穩(wěn)定性的方法，該方法包括使用線性化或環(huán)狀dna和限制酶的混合物轉(zhuǎn)化木霉屬細(xì)胞，其中所述限制酶能夠在木霉屬細(xì)胞的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂(dsb)，并且其中用限制酶處理所得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比高于不用限制酶處理可獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比。

在又另一個(gè)方面，本披露提供了改善木霉屬轉(zhuǎn)化體的穩(wěn)定性的方法，該方法包括使用線性化或環(huán)狀dna轉(zhuǎn)化木霉屬細(xì)胞，其中木霉屬細(xì)胞被誘導(dǎo)以生產(chǎn)能夠在木霉屬細(xì)胞的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂(dsb)的限制酶，并且其中用限制酶誘導(dǎo)所得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比高于不用限制酶誘導(dǎo)可獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比。

在段落[0047]中描述的方法的一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括將構(gòu)建體導(dǎo)入木霉屬細(xì)胞中，該構(gòu)建體在轉(zhuǎn)化步驟之前或期間一經(jīng)誘導(dǎo)即能生產(chǎn)限制酶。

在段落[0046]-[0048]中任一段描述的方法的一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括選擇遺傳穩(wěn)定的木霉屬轉(zhuǎn)化體。

在段落[0044]-[0049]中任一段描述的方法的一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括使用相同的線性化或環(huán)狀dna但不用限制酶處理或限制酶誘導(dǎo)來轉(zhuǎn)化相同的木霉屬細(xì)胞轉(zhuǎn)化前菌株。

在段落[0044]-[0050]中任一段描述的方法的某些實(shí)施例中，在相同條件下使用相同的轉(zhuǎn)化方法，并且在某些實(shí)施例中使用約相同數(shù)目的細(xì)胞和相同量的線性化或環(huán)狀dna，獲得用限制酶處理或誘導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比和不用限制酶處理或誘導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比。

在段落[0044]-[0051]中任一段描述的方法的某些實(shí)施例中，用限制酶處理或誘導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比高于不用限制酶處理或誘導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在具體實(shí)施例中，用限制酶處理或誘導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比高于不用限制酶處理或誘導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或6倍。

在段落[0044]-[0052]中任一段描述的方法的具體實(shí)施例中，用限制酶處理或誘導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比為至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在具體實(shí)施例中，在所有測(cè)試的轉(zhuǎn)化體中，用限制酶處理或誘導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比為至少50％、60％、70％、80％或90％。

在段落[0044]-[0053]中任一段描述的方法的一些實(shí)施例中，用限制酶處理或誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率比不用限制酶處理或誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在具體實(shí)施例中，用限制酶處理或誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率比不用限制酶處理或誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率高至少1倍、2倍、3倍或4倍。

在段落[008]-[0013]、[0022]、[0023]、[0025]、[0026]、[0035]、[0036]、[0038]-[0040]、和[0044]-[0054]中任一段描述的方法的一些實(shí)施例中，限制酶識(shí)別至少6個(gè)堿基對(duì)的限制位點(diǎn)。在一些實(shí)施例中，限制酶識(shí)別至少8個(gè)堿基對(duì)的限制位點(diǎn)。在具體實(shí)施例中，限制酶識(shí)別至少10個(gè)堿基對(duì)的限制位點(diǎn)。在具體實(shí)施例中，限制酶識(shí)別至少12個(gè)堿基對(duì)的限制位點(diǎn)。在具體實(shí)施例中，在該方法中使用至少兩種不同的限制酶。

在段落[008]-[0013]、[0022]、[0023]、[0025]、[0026]、[0035]、[0036]、[0038]-[0040]、和[0044]-[0055]中任一段描述的方法的某些實(shí)施例中，限制酶是大范圍核酸酶。在某些實(shí)施例中，限制酶是laglidadg歸巢大范圍核酸酶。在具體實(shí)施例中，限制酶選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：i-scei、i-crei、i-msoi、i-anii、i-dmii、和pi-pfui。

在段落[008]-[0013]、[0022]、[0023]、[0025]、[0026]、[0035]、[0036]、[0038]-[0040]、和[0044]-[0055]中任一段描述的方法的一些其他實(shí)施例中，限制酶是鋅指核酸酶(zfn)，轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(talen)或rna引導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶。

在段落[008]-[0013]、[0022]、[0023]、[0025]、[0026]、[0035]、[0036]、[0038]-[0040]、和[0044]-[0057]中任一段描述的方法的某些實(shí)施例中，限制酶能夠在轉(zhuǎn)化的木霉屬細(xì)胞的染色體dna中產(chǎn)生相容的粘性末端。

在段落[0044]-[0058]中任一段所述的方法的一些實(shí)施例中，用線性化dna轉(zhuǎn)化木霉屬細(xì)胞。在一些其他實(shí)施例中，用環(huán)狀dna轉(zhuǎn)化木霉屬細(xì)胞。

在段落[0044]-[0059]中任一段所述的方法的一些實(shí)施例中，線性化或環(huán)狀dna包含一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因。在某些實(shí)施例中，感興趣的基因編碼酶。在具體實(shí)施例中，感興趣的基因編碼半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、其變體、其功能片段或其兩種或更多種的混合物。在又其他具體實(shí)施例中，感興趣的基因編碼肽激素、生長(zhǎng)因子、凝血因子、趨化因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、抗體、受體、粘附分子、微生物抗原、其變體、其功能片段、或其兩種或更多種的混合物。

在段落[0044]-[0060]中任一段描述的方法的某些實(shí)施例中，線性化或環(huán)狀dna包含選擇標(biāo)記。在具體實(shí)施例中，選擇標(biāo)記是als1、amds、hygr、pyr2、pyr4、suca、博來霉素抗性標(biāo)記、殺稻瘟菌素抗性標(biāo)記、吡啶硫胺抗性標(biāo)記、氯嘧磺隆乙酯抗性標(biāo)記、新霉素抗性標(biāo)記、腺嘌呤途徑基因、色氨酸途徑基因、或胸苷激酶標(biāo)記。

在段落[0044]-[0061]中任一段描述的方法的一些實(shí)施例中，該方法不包括使用與木霉屬基因組序列同源的dna或rna序列。在一些實(shí)施例中，該方法不包括使用與至少20個(gè)、30個(gè)、40個(gè)、50個(gè)、100個(gè)、150個(gè)或200個(gè)核苷酸長(zhǎng)的木霉屬基因組序列同源的dna或rna序列。在某些實(shí)施例中，該方法不包括使用與至少150個(gè)或200個(gè)核苷酸長(zhǎng)的木霉屬基因組序列同源的dna序列。在某些實(shí)施例中，該方法不包括使用與至少20個(gè)、30個(gè)、40個(gè)或50個(gè)核苷酸長(zhǎng)的木霉屬基因組序列同源的rna序列。

在段落[0044]-[0061]中任一段描述的方法的一些實(shí)施例中，該方法包括使用與木霉屬基因組序列同源的dna或rna序列。在一些實(shí)施例中，該方法包括使用與至少150個(gè)、200個(gè)、300個(gè)或400個(gè)核苷酸長(zhǎng)的木霉屬基因組序列同源的dna序列。在具體實(shí)施例中，該方法包括使用與至少500個(gè)、600個(gè)、700個(gè)、800個(gè)、900個(gè)或1000個(gè)核苷酸長(zhǎng)的木霉屬基因組序列同源的dna序列。在具體實(shí)施例中，該方法包括使用與至少20個(gè)、30個(gè)、40個(gè)或50個(gè)核苷酸長(zhǎng)的木霉屬基因組序列同源的rna序列。在某些實(shí)施例中，與木霉屬基因組序列同源的dna或rna序列與同源區(qū)域的至少20個(gè)、30個(gè)、40個(gè)、50個(gè)、150個(gè)、200個(gè)、300個(gè)、400個(gè)、500個(gè)、600個(gè)、700個(gè)、800個(gè)、900個(gè)或1000個(gè)核苷酸的整個(gè)長(zhǎng)度具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性(或在rna的情況下，等同性)。

在段落[0044]-[0061]和[0063]中任一段描述的方法的一些實(shí)施例中，該方法包括使用與木霉屬基因組序列同源的dna序列，并且與木霉屬基因組序列同源的dna序列通過在被限制酶切割的位點(diǎn)處的同源重組來與木霉屬染色體dna重組。

在段落[0044]-[0064]中任一段所述的方法的某些實(shí)施例中，木霉屬菌株是里氏木霉、綠木霉、棘孢木霉、哈茨木霉、康氏木霉、長(zhǎng)柄木霉、綠色木霉、或深綠木霉菌株。在具體實(shí)施例中，木霉屬菌株是里氏木霉菌株。

在另一個(gè)方面，本披露提供使用段落[0044]-[0065]中任一段的方法獲得的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的木霉屬菌株。

在段落[0066]中描述的木霉屬菌株的一些實(shí)施例中，木霉屬菌株包含一種或多種感興趣的基因。在某些實(shí)施例中，感興趣的基因編碼酶。在具體實(shí)施例中，感興趣的基因編碼半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、其變體、其功能片段或其兩種或更多種的混合物。在又其他具體實(shí)施例中，感興趣的基因編碼肽激素、生長(zhǎng)因子、凝血因子、趨化因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、抗體、受體、粘附分子、微生物抗原、其變體、其功能片段、或其兩種或更多種的混合物。

在段落[0066]-[0067]中任一段所述的木霉屬菌株的某些實(shí)施例中，木霉屬菌株是里氏木霉、綠木霉、棘孢木霉、哈茨木霉、康氏木霉、長(zhǎng)柄木霉、綠色木霉、或深綠木霉菌株。在具體實(shí)施例中，木霉屬菌株是里氏木霉菌株。

在又另一個(gè)方面，本披露提供了表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括：a)使用段落[0067]-[0068]中任一段所述的木霉屬菌株，其中該感興趣的基因編碼感興趣的蛋白質(zhì)；并且b)從木霉屬菌株生產(chǎn)感興趣的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中，感興趣的蛋白質(zhì)是分泌性蛋白。

在另一個(gè)方面，本披露提供通過應(yīng)用段落[0044]-[0065]和[0069]中任一段所述的方法生產(chǎn)的感興趣的蛋白質(zhì)。

在又另一個(gè)方面，本披露提供了含有段落[0070]中描述的感興趣的蛋白質(zhì)的組合物。

在另一個(gè)方面，本披露提供了段落[0071]中所描述的組合物在木質(zhì)纖維素生物質(zhì)底物的水解、清潔應(yīng)用、谷物和淀粉加工、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、食品組合物或紡織品處理中的用途。

附圖簡(jiǎn)述

圖1.aclamy1表達(dá)質(zhì)粒ptrex3gm-aclamy1的載體nti圖譜。如在實(shí)例1中所述，該載體支持由里氏木霉纖維二糖水解酶1(cbh1)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子驅(qū)動(dòng)的來自基因組aclamy1基因的aclamy1表達(dá)。該載體攜帶amds可選擇標(biāo)記，該選擇標(biāo)記允許轉(zhuǎn)化體在乙酰胺作為唯一的氮源下生長(zhǎng)。

圖2.pentry-aclamy1的載體nti圖譜。載體已經(jīng)如在實(shí)例1中所述進(jìn)行設(shè)計(jì)。該載體充當(dāng)用于lr反應(yīng)的‘供體’質(zhì)粒。

圖3.用于aclamy1表達(dá)的aclamy1表達(dá)質(zhì)粒ptrex8gm-aclamy1的載體nti圖譜。該載體支持由里氏木霉纖維二糖水解酶1(cbh1)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子驅(qū)動(dòng)的來自基因組aclamy1基因的aclamy1表達(dá)。該載體攜帶pyr2可選擇標(biāo)記，該可選擇標(biāo)記允許轉(zhuǎn)化體在沒有補(bǔ)充尿苷的情況下生長(zhǎng)。

圖4a-4e.使用ptrex8gmaclamy1對(duì)木霉屬的轉(zhuǎn)化(圖4a)，在paci存在下使用ptrex8gm-aclamy1對(duì)木霉屬的轉(zhuǎn)化(圖4b)，與圖4b相同但是在柱純化除去paci后(圖4c)，使用ptrex8gm-aclamy1作為模板經(jīng)pcr擴(kuò)增的表達(dá)構(gòu)建體(圖4d)，或與圖4d相同的、添加paci的表達(dá)構(gòu)建體(圖4e)。

圖5.穩(wěn)定的木霉屬轉(zhuǎn)化體的α-淀粉酶活性

圖6.用i-scei限制位點(diǎn)構(gòu)建pbjp6。將約1.5kb5'utrcbh2、pcbhi和tcbh2分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增，通過融合pcr融合在一起，并且克隆到pbluescriptsk(+)的xbai和kpni位點(diǎn)以產(chǎn)生7.3kbpbjp4質(zhì)粒。將截短的gfp重復(fù)序列的合成序列插入pbjp4的單個(gè)ndei限制位點(diǎn)，并且選擇具有正確方向的gfp重復(fù)序列的質(zhì)粒并將其命名為pbjp5(8.6kb)。通過將由兩個(gè)i-scei限制位點(diǎn)包圍的pcr擴(kuò)增的構(gòu)巢曲霉pyrg標(biāo)記克隆到pbjp5的單個(gè)pmei位點(diǎn)來獲得具有i-scei限制位點(diǎn)的最終10kbpbjp6質(zhì)粒。

圖7.建立的體內(nèi)i-scei活性測(cè)定法的基本原理。星號(hào)(*)表示截短的gfp序列，并且用更加密集的陰影線盒顯示重復(fù)的gfp序列。

圖8.在里氏木霉p37δcbhipyrg-26的基因組中引入i-scei限制位點(diǎn)。(a)在里氏木霉基因組中的i-scei限制位點(diǎn)盒的圖。用垂直箭頭指出了用于進(jìn)行下面(b)-(d)的dna印跡的限制酶。將通過小圖a底部的條表示的三種不同的探針(p1、p2、p3)用于確認(rèn)完整構(gòu)建體的存在和拷貝數(shù)。圖中指出了預(yù)期的限制性消化片段/dna印跡條帶的大小。(b)-(d)9個(gè)轉(zhuǎn)化體(泳道1至9)和親本菌株(泳道10)的dna印跡分析。在小圖d的右側(cè)指出了泳道1-10中樣品的菌株名稱。(b)將菌株的基因組dna用xbai消化，然后與探針1雜交。當(dāng)存在于基因組中時(shí)，5.4kb條帶表示i-scei限制性盒。在左側(cè)的數(shù)字指出了正確條帶的大小。(c)將基因組dna用psti消化并與探針2雜交。6.3kb是整合的i-scei限制位點(diǎn)盒的預(yù)期條帶大小。(d)將基因組dna用xhoi消化并與探針3雜交。與探針3雜交的期望條帶大小為2.3kb。

圖9.體內(nèi)i-scei活性測(cè)試。預(yù)測(cè)i-scei的誘導(dǎo)將產(chǎn)生dsb，該dsb將導(dǎo)致尿苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型表型。在30℃下，將菌株點(diǎn)接種到用葡萄糖或乳糖作為碳源的基本培養(yǎng)基+/-尿苷上持續(xù)4天。在基于乳糖的培養(yǎng)基上，i-scei的表達(dá)誘導(dǎo)dsb，該dsb導(dǎo)致pyrg標(biāo)記環(huán)出并且該菌株隨后不能在不含尿苷的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。箭頭指出了沒有生長(zhǎng)的區(qū)域。

圖10.使用gfp的體內(nèi)i-scei活性測(cè)試。誘導(dǎo)i-scei表達(dá)導(dǎo)致pyrg標(biāo)記的切除和gfp的恢復(fù)，由綠色熒光菌絲指示。菌株在含有乳糖和尿苷的trmm上生長(zhǎng)以分別誘導(dǎo)和允許pyrg標(biāo)記的丟失。通過微分干涉差顯微鏡(dic)觀察木霉屬細(xì)胞的細(xì)胞外觀或通過熒光顯微鏡觀察木霉屬細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)(gfp)。

圖11.由i-scei介導(dǎo)的葡糖淀粉酶表達(dá)盒的靶向整合方法的基本原理。預(yù)期葡糖淀粉酶盒在i-scei著陸位點(diǎn)的靶向整合將導(dǎo)致als抗性、尿苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型和葡糖淀粉酶生產(chǎn)。

圖12.通過在里氏木霉中表達(dá)i-scei來增加轉(zhuǎn)化頻率。在乳糖/葡萄糖或葡萄糖板上的對(duì)照菌株(jp7.7)和表達(dá)i-scei的菌株jp7.7.12(jp7.7+pttt-i-scei)。經(jīng)由乳糖誘導(dǎo)i-scei增加轉(zhuǎn)化頻率。

圖13.在i-scei著陸位點(diǎn)用于靶向整合葡糖淀粉酶盒的所選轉(zhuǎn)化體進(jìn)行的dna印跡分析。(i)當(dāng)pjp8在i-scei著陸位點(diǎn)(在cbh2基因座處)整合或不整合(pbjp6仍然存在于cbh2基因座處)時(shí)，dna印跡的圖顯示預(yù)期的印跡大小。用條指出了用于進(jìn)行dna印跡的限制酶。使用兩(2)種不同的探針(pcbhi和tcbh2)來分別確認(rèn)5'側(cè)翼和3'側(cè)翼的整合。圖中指出了預(yù)期的條帶的大小。(ii)12個(gè)轉(zhuǎn)化體的dna印跡分析(泳道1至12)。(ii-a)轉(zhuǎn)化體的基因組dna用spei消化，然后與探針pcbhi雜交。5.5kb條帶表示pjp8盒在5’側(cè)翼處的同源整合，并且3.6kb是當(dāng)i-scei限制位點(diǎn)盒(pbjp6)仍然存在于cbh2基因座處時(shí)預(yù)期的大小。在左側(cè)的數(shù)字指出了條帶的大小。(ii-b)將基因組dna用bamhi消化并與探針tcbh2雜交。6.8kb是在3’側(cè)翼處的整合的pjp8的預(yù)期條帶大小并且3kb是當(dāng)未整合時(shí)的預(yù)期條帶大小。所選轉(zhuǎn)化體的pyrg表型和相對(duì)葡糖淀粉酶活性提供在緊挨印跡圖的表中。

圖14.在靶向(pyrg減)與非靶向轉(zhuǎn)化體之間的葡糖淀粉酶活性的比較。對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)化體顯示了pyrg表型(“pyrg-”指示靶向整合并且“pyrg+”指示非靶向整合)。親本菌株的葡糖淀粉酶背景活性由左側(cè)的實(shí)心“c”條表示?？招臈l表示從i-scei誘導(dǎo)條件表達(dá)葡糖淀粉酶的轉(zhuǎn)化體。陰影線條表示從i-scei非誘導(dǎo)條件表達(dá)葡糖淀粉酶的轉(zhuǎn)化體，并且虛線條表示對(duì)照轉(zhuǎn)化體。兩個(gè)水平條(緊挨“1.35”和“0.9”)限定了靶向整合轉(zhuǎn)化體的相對(duì)葡糖淀粉酶活性。

圖15.在i-scei著陸位點(diǎn)處的葡糖淀粉酶盒的靶向和非整合轉(zhuǎn)化體的dna印跡分析。dna印跡的設(shè)置與如在圖13中所述的相同。(a)轉(zhuǎn)化體的基因組dna用spei消化，然后與探針pcbhi雜交。當(dāng)pjp8整合在i-scei著陸位點(diǎn)的5’側(cè)翼處時(shí)，預(yù)期的正確印跡大小為5.5kb。(b)將基因組dna用bamhi消化并與探針tcbh2雜交。6.8kb是pjp8正確整合在i-scei著陸位點(diǎn)的3’側(cè)翼處的預(yù)期條帶大小。轉(zhuǎn)化體1至10靶向整合在i-scei著陸位點(diǎn)處(藍(lán)條限制)，并且顯示較少的葡糖淀粉酶表達(dá)的變異性。轉(zhuǎn)化體11至16是隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)化體(紅條限制)，并且具有高的葡糖淀粉酶表達(dá)的變異性，其中在i-scei著陸位點(diǎn)處具有pjp8盒的部分整合(轉(zhuǎn)化體11和14)或者盒的非整合(轉(zhuǎn)化體12、13和15)或多個(gè)拷貝的盒的隨機(jī)整合(轉(zhuǎn)化體16)。在最后一行印跡中將p37δcbhipyrg-26菌株用作對(duì)照，并且如預(yù)期的那樣，當(dāng)使用pcbhi(印跡a)時(shí)，該菌株沒有雜交。使用tcbh2作為探針的對(duì)照的預(yù)期印跡大小為6.9kb(印跡b)。

圖16.表達(dá)質(zhì)粒pttt-i-scei的質(zhì)粒圖譜。該質(zhì)粒支持由cbhi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)并且并以cbhi終止子結(jié)束的合成密碼子優(yōu)化基因中的i-scei的表達(dá)。該質(zhì)粒包含amds選擇標(biāo)記以支持真菌轉(zhuǎn)化體在乙酰胺作為唯一氮源下的生長(zhǎng)。由于載體上的端粒序列重復(fù)，質(zhì)粒在真菌細(xì)胞中自主維持。

圖17a和17b.轉(zhuǎn)化板的圖，顯示通過多種限制酶處理，穩(wěn)定的里氏木霉轉(zhuǎn)化體的百分比增加。不用任何限制酶處理(左小圖標(biāo)，記為“pcr”)，用20個(gè)單位的asisi處理(圖17a的中間小圖，標(biāo)記為“pcr+asisi”和圖17b的中間小圖，標(biāo)記為“asisi”)，或者用asisi、paci和swai中每一種的7個(gè)單位處理(圖17a的右小圖，標(biāo)記為“pcr+asisi+paci+swai”)或用asisi、paci和pmei中每一種的7個(gè)單位處理(圖17b的右小圖，標(biāo)記為“3種酶”)，用含有裂解纖維素單加氧酶(eg4)編碼序列的pcr片段轉(zhuǎn)化里氏木霉菌株。

詳細(xì)說明

i.概述

本披露涉及真菌宿主菌株和用于其創(chuàng)建和使用的重組dna構(gòu)建體。該真菌宿主菌株特別穩(wěn)定，并且可用于可靠或變異較小表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)。本披露進(jìn)一步涉及如此構(gòu)建的真菌宿主菌株、感興趣的蛋白質(zhì)和組合物的使用，該組合物包含通過使此類改良的真菌宿主菌株發(fā)酵制備的此類感興趣的蛋白質(zhì)。

本文描述的方法以改善的可靠性表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)或感興趣的變體。因此，術(shù)語“改善的可靠性”意指(1)至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)的轉(zhuǎn)化體是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體；或(2)至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)的轉(zhuǎn)化體按照預(yù)期表達(dá)超過背景表達(dá)水平的感興趣的蛋白質(zhì)或變體；或(3)以小于60％(例如，小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于2％)變化的表達(dá)水平表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)或變體。如上面(3)中或本文其他地方提及的術(shù)語“表達(dá)水平變化”是通過將最高和最低表達(dá)水平之間的差除以最高表達(dá)水平與背景表達(dá)水平之間的差異的值來定義或確定，其中所有測(cè)定用相同的構(gòu)建體和相同的感興趣的基因或變體進(jìn)行。

ii.定義

在描述本發(fā)明的菌株、組合物和方法之前，定義以下術(shù)語和短語。未定義的術(shù)語應(yīng)當(dāng)符合本領(lǐng)域中所使用的常規(guī)含義。

在提供了一系列值的情況下，應(yīng)理解每個(gè)中間值為到下限的十分之一單位(除非上下文清晰地另外指示)，該范圍的上限與下限之間以及在該陳述范圍內(nèi)的任何其他陳述的或中間值均被涵蓋在本發(fā)明的組合物和方法之內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可以被獨(dú)立地包括在所述較小的范圍內(nèi)，并且也被涵蓋在本發(fā)明的組合物和方法之內(nèi)，服從所陳述范圍中任何特別排除的限值。在所陳述的范圍包括一個(gè)或者全部?jī)蓚€(gè)限值的情況下，排除那些包括的限值的任一個(gè)或者全部?jī)蓚€(gè)的范圍也包括在本發(fā)明的組合物和方法中。

本文提供了某些范圍，其中數(shù)值前面是術(shù)語“約”。術(shù)語“約”在本文中用于為其后面的確切數(shù)字以及與該術(shù)語后面的數(shù)字接近或近似的數(shù)字提供文字支持。在確定數(shù)字是否接近或近似于具體敘述的數(shù)字時(shí)，接近或近似的未列舉的數(shù)字可以是在呈現(xiàn)其的上下文中提供具體敘述的數(shù)字的實(shí)質(zhì)性等值的數(shù)字。例如，關(guān)于數(shù)值，術(shù)語“約”是指數(shù)值的-10％至+10％的范圍，除非術(shù)語在上下文中另有具體定義。在另一個(gè)實(shí)例中，短語“約6的ph值”是指ph值為從5.4至6.6，除非ph值另有具體定義。

本文提供的標(biāo)題并非對(duì)本發(fā)明的組合物和方法的各個(gè)方面或?qū)嵤├M(jìn)行限制，這些方面或?qū)嵤├赏ㄟ^將說明書作為一個(gè)整體來參考而得到。因此，將說明書作為一個(gè)整體參考時(shí)，下面即將定義的術(shù)語被定義得更全面。

將本文件分為若干部分以便于閱讀；然而，讀者將領(lǐng)會(huì)的是，在一個(gè)部分中進(jìn)行的陳述可能適用于其他部分。以這種方式，用于本披露的不同部分的標(biāo)題不應(yīng)被解釋為限制。

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明組合物和方法所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然類似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以用于本發(fā)明組合物和方法的實(shí)踐或測(cè)試中，但現(xiàn)在將對(duì)代表性示例方法和材料進(jìn)行描述。

在本說明書中引用的所有公開物和專利都通過引用結(jié)合在此，就好像每個(gè)單獨(dú)的公開物或?qū)＠痪唧w地并單獨(dú)地指示為通過引用結(jié)合，并且通過引用結(jié)合在此從而結(jié)合引用的公開物來披露和描述這些方法和/或材料。任何公開物的引用內(nèi)容是針對(duì)其在申請(qǐng)日之前的披露，并且不能理解為承認(rèn)因?yàn)橄惹鞍l(fā)明而本發(fā)明組合物和方法不能獲得比這些公開物更早的申請(qǐng)日。此外，所提供的公開日期可能與實(shí)際公開日期不同，實(shí)際公開日期可能需要獨(dú)立地證實(shí)。

根據(jù)該詳細(xì)說明，適用以下縮寫和定義。應(yīng)當(dāng)注意單數(shù)形式“一個(gè)/一種(a/an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)個(gè)指示物，除非上下文中清楚地另外指出。因此，例如提及“酶”包括多個(gè)這樣的酶，并且提及“劑量”包括提及一個(gè)或多個(gè)劑量以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等效物，等等。

進(jìn)一步注意的是，權(quán)利要求書可以撰寫以排除任何可選擇的要素。因此，該陳述意在作為使用與權(quán)利要求要素的敘述有關(guān)的排他性術(shù)語例如“單獨(dú)”、“僅”等或利用“否定型”限定的前提基礎(chǔ)。

術(shù)語“重組”當(dāng)用于提及主題細(xì)胞、核酸、多肽/酶或載體時(shí)，表明受試者已經(jīng)從其天然狀態(tài)被修飾。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在天然(非重組)形式的細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的基因，或以不同于自然界發(fā)現(xiàn)的水平或在不同于自然界發(fā)現(xiàn)的條件下表達(dá)天然基因。重組核酸可以通過一個(gè)或多個(gè)核苷酸與天然序列不同，和/或可操作地連接到異源序列(例如異源啟動(dòng)子)、允許在表達(dá)載體中分泌等的信號(hào)序列。重組多肽/酶可以通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸與天然序列不同，和/或與異源序列融合。包含編碼感興趣的蛋白質(zhì)的核酸的載體是例如重組載體。

進(jìn)一步注意到，如本文使用的術(shù)語“基本上由……組成”是指一種組合物，其中該術(shù)語之后的一種或多種組分在存在其他已知的一種或多種組分的情況下為總體組合物的以重量計(jì)小于30％的總量，并且不會(huì)有助于或干擾一種或多種組分的作用或活性。

進(jìn)一步注意到，如本文所使用的術(shù)語“包括”意指包括但不限于在術(shù)語“包括”之后的一種或多種組分。在術(shù)語“包含”之后的組分是必需的或強(qiáng)制性的，但是包含一種或多種組分的組合物可以進(jìn)一步包括其他非強(qiáng)制性或可選擇的一種或多種組分。

還要注意的是，如本文所使用的術(shù)語“由……組成”意指包括且限于術(shù)語“由……組成”之后的一種或多種組分。因此，術(shù)語“由……組成”之后的一種或多種組分是必需的或強(qiáng)制性的，且組合物中不存在一種或多種其他組分。

如將對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在閱讀本披露時(shí)，本文描述和展示的單獨(dú)實(shí)施例中的每一個(gè)具有離散的組分和特征，這些組分和特征可以在不偏離本文所述的本發(fā)明組合物和方法的范圍或精神的情況下容易地與任何其他幾個(gè)實(shí)施例的任何一個(gè)的特征分離或組合?？梢园凑账鶖⑹龅氖录捻樞蚧虬凑者壿嬌峡尚械娜魏纹渌樞騺磉M(jìn)行任何敘述的方法。

如本文所使用的，術(shù)語“遺傳穩(wěn)定的菌株”是指與不穩(wěn)定的菌株相比其生長(zhǎng)速度更快。而且，使用許多絲狀真菌宿主(例如像木霉屬)，在固體培養(yǎng)基上形成具有光滑的而不是粗糙輪廓的圓形菌落可以用作區(qū)別特征。

如本文所使用的，術(shù)語“感興趣的蛋白質(zhì)”是指期望在絲狀真菌中表達(dá)的多肽(任選地以高水平和出于商業(yè)化的目的)。這樣的蛋白質(zhì)可以是酶、底物結(jié)合蛋白、表面活性蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白等。

如本文所使用的，術(shù)語“感興趣的基因”是指感興趣的蛋白質(zhì)的基因編碼序列。

如本文所使用的，術(shù)語“載體”是指設(shè)計(jì)用于在不同宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體。“表達(dá)載體”是指具有在外來細(xì)胞中整合并表達(dá)異源dna片段的能力的載體。許多原核和真核表達(dá)載體是可商購(gòu)的。合適的表達(dá)載體的選擇是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。

因此，“表達(dá)盒”或“表達(dá)載體”是重組或合成產(chǎn)生的具有允許特定核酸在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的一系列特定核酸元件的核酸構(gòu)建體。重組表達(dá)盒可以整合在質(zhì)粒、染色體、線粒體dna、質(zhì)體dna、病毒或核酸片段中。典型地，表達(dá)載體的重組表達(dá)盒部分包括，除了其他序列之外，待轉(zhuǎn)錄的核酸序列和啟動(dòng)子。

如本文所使用的，術(shù)語“質(zhì)粒”是指用作克隆載體的環(huán)狀雙鏈(ds)dna構(gòu)建體，并且其在許多細(xì)菌和一些真核生物中形成額外的染色體自復(fù)制遺傳元件。

如本文中可互換使用的，術(shù)語“選擇標(biāo)記”或“可選擇標(biāo)記”是指本身存在或引入細(xì)胞中的基因，該基因的表達(dá)賦予細(xì)胞在相應(yīng)的選擇試劑存在下或在相應(yīng)的選擇性生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的能力。如本文所使用的，術(shù)語“可選擇標(biāo)記編碼核苷酸序列”是指編碼這樣的選擇標(biāo)記或可選擇標(biāo)記的核苷酸序列。

如本文所使用的，術(shù)語“啟動(dòng)子”是指起著引導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄功能的核酸序列。通常啟動(dòng)子將適合于正在表達(dá)靶基因的宿主細(xì)胞。啟動(dòng)子與其他轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控核酸序列(也稱為“控制序列”)一起經(jīng)常用于表達(dá)給定的基因。通常，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列包括但不限于啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列、以及增強(qiáng)子或激活子序列。

如本文所使用的，術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換地使用，是指包含通過肽鍵連接的氨基酸殘基的任何長(zhǎng)度的聚合物。本文中使用用于氨基酸殘基的常規(guī)一字母或三字母代碼。聚合物可以是線性的或支化的，它可以包含修飾的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中斷。該術(shù)語還涵蓋已經(jīng)自然地或通過干預(yù)被修飾的氨基酸聚合物；這些修飾是例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；?、磷酸化或任何其他操縱或修飾，例如與標(biāo)記組分軛合。定義中還包括例如含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本領(lǐng)域已知的其他修飾的多肽。

如本文所使用的，“真菌”是包括微生物例如酵母和霉菌以及蕈類的大量真核生物體的任何成員。將這些生物分類為與植物、動(dòng)物、原生生物和細(xì)菌分離的一個(gè)界，真菌。一個(gè)主要區(qū)別是真菌細(xì)胞具有含有幾丁質(zhì)的細(xì)胞壁，這與植物和一些原生生物的含有纖維素的細(xì)胞壁不同，并且與細(xì)菌的細(xì)胞壁不同。

如本文所使用的，“子囊菌真菌菌株”是指真菌界中的子囊菌門中的任何生物體。示例性子囊菌真菌細(xì)胞包括但不限于盤菌亞門的絲狀真菌，例如木霉屬、曲霉屬和青霉屬物種。

如本文所使用的，“絲狀真菌”是指真菌門和卵菌門的所有絲狀形式。例如，絲狀真菌包括但不限于支頂孢屬、曲霉屬、翹孢霉屬、鐮刀菌屬、腐質(zhì)霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬(myceliophthora)、脈孢菌屬、柱霉屬(scytalidium)、梭孢殼屬、彎頸霉屬(tolypocladium)或木霉屬物種。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌可以是棘孢曲霉(aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(aspergillusawamori)、臭曲霉(aspergillusfoetidus)、日本曲霉(aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(aspergillusnidulans)、黑曲霉或米曲霉。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌是桿孢狀鐮孢(fusariumbactridioides)、禾谷鐮孢(fusariumcerealis)、克地鐮刀菌(fusariumcrookwellense)、大刀鐮刀菌(fusariumculmorum)、禾谷鐮刀菌(fusariumgraminearum)、禾鐮孢菌(fusariumgraminum)、異孢鐮刀菌(fusariumheterosporum)、合歡木鐮孢(fusariumnegundi)、尖孢鐮刀菌(fusariumoxysporum)、多枝鐮孢(fusariumreticulatum)、粉紅鐮刀菌(fusariumroseum)、接骨木鐮刀菌(fusariumsambucinum)、膚色鐮孢(fusariumsarcochroum)、擬分枝孢鐮刀菌(fusariumsporotrichioides)、硫色鐮刀菌(fusariumsulphureum)、圓鐮孢(fusariumtorulosum)、擬絲孢鐮刀菌(fusariumtrichothecioides)、或鐮孢霉(fusariumvenenatum)。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌是特異腐質(zhì)霉(humicolainsolens)、綿毛狀腐質(zhì)霉(humicolalanuginosa)、米黑毛霉(mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(myceliophthorathermophila)、粗糙鏈孢霉(neurosporacrassa)、嗜熱色串孢(scytalidiumthermophilum)、或土生梭孢殼(thielaviaterrestris)。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌是哈茨木霉(trichodermaharzianum)、康氏木霉(trichodermakoningii)、長(zhǎng)柄木霉(trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉，例如rl-p37(璽爾-奈斯(sheir-neiss)等人，應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)(appl.microbiol.biotechnology)，20(1984)pp.46-53；montenecourtb.s.，can.，1-20，1987)、qm9414(atccno.26921)、nrrl15709、atcc13631、56764、56466、56767或綠色木霉例如atcc32098和32086。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌是里氏木霉rutc30，作為里氏木霉atcc56765其可獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。與此相關(guān)，在一些實(shí)施例中，本披露提供了本文所述的絲狀真菌中的任一種的全細(xì)胞液體制劑。

“異源的”核酸構(gòu)建體或序列具有不是其被表達(dá)的細(xì)胞天然的或以天然形式存在的序列的一部分。關(guān)于控制序列，異源的是指在自然界中不起調(diào)節(jié)與其目前正在調(diào)節(jié)的基因表達(dá)相同的基因的功能的控制序列(即啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)。通常，異源的核酸序列對(duì)于它們存在的細(xì)胞或部分基因組不是內(nèi)源的，并且已經(jīng)通過感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔等添加到細(xì)胞中?！爱愒吹摹焙怂針?gòu)建體可以含有與在天然細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的控制序列/dna編碼序列組合相同或不同的控制序列/dna編碼序列組合。

如本文所使用的，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括任何真菌，無論是單細(xì)胞生物體、來源于多細(xì)胞生物體并且被置于組織培養(yǎng)物中的細(xì)胞、或作為多細(xì)胞生物體的一部分存在的細(xì)胞，其易于用根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。這樣的宿主細(xì)胞，例如酵母和其他真菌細(xì)胞可以用于復(fù)制dna并產(chǎn)生由如在本發(fā)明中使用的核苷酸序列編碼的多肽。合適的細(xì)胞通常是絲狀真菌或酵母。特別優(yōu)選的是來自絲狀真菌的細(xì)胞，該絲狀真菌優(yōu)選是曲霉屬例如黑曲霉和塔賓曲霉(a.tubingensis)。其他優(yōu)選的生物體包括米曲霉、泡盛曲霉、里氏木霉、綠色木霉和長(zhǎng)柄木霉中的任何一種。

如本文所使用的，“轉(zhuǎn)化的”意指已經(jīng)通過使用重組dna技術(shù)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。典型地，轉(zhuǎn)化通過將一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列插入細(xì)胞而發(fā)生。插入的核苷酸序列可以是異源核苷酸序列，即，對(duì)于待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不是天然的序列，例如融合蛋白。

術(shù)語“衍生的”涵蓋術(shù)語“起源的”、“獲得的”“可獲得的”和“創(chuàng)造的”，并且通常表示一種指定的材料在另一種指定的材料中找到它的起源或具有可以參考另一種指定材料描述的特征。

如本文所使用的，術(shù)語“基因”意指涉及產(chǎn)生多肽的dna的區(qū)段，該區(qū)段可以包括或可以不包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，例如，5'非翻譯區(qū)(5’utr)或“前導(dǎo)”序列以及3’utr或“尾部”序列，以及個(gè)體編碼區(qū)段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)。在其他實(shí)施例中，該基因編碼商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白質(zhì)或肽，例如酶，例如蛋白酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、纖維素酶、氧化酶和脂肪酶。感興趣的基因可以是天然存在的基因、突變基因或合成基因。

如本文中可互換使用的，術(shù)語“限制酶”、“限制性內(nèi)切核酸酶”或“位點(diǎn)特異性內(nèi)切核酸酶”是在稱為限制位點(diǎn)的特定識(shí)別核苷酸序列處或其附近切割dna的酶。限制酶通常分為三種類型，它們的區(qū)別在于它們的結(jié)構(gòu)不同，以及它們是否在其識(shí)別位點(diǎn)處切割其dna底物，或者識(shí)別和切割位點(diǎn)是否彼此分離。類型i可以從識(shí)別序列中在隨機(jī)位點(diǎn)處切割約1000或更多個(gè)堿基對(duì)。類型ii的切割序列與其識(shí)別序列重疊。類型iii從識(shí)別序列的約25個(gè)堿基對(duì)處切割dna。也在限制酶下分類的是大范圍核酸酶、鋅指核酸酶(zfn)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(talen)和crispr/cas，例如rna引導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶(例如cas9)。大范圍核酸酶是識(shí)別在基因組中非常罕見的約12-40個(gè)堿基對(duì)的大識(shí)別位點(diǎn)的天然存在的限制酶。大范圍核酸酶的實(shí)例包括歸巢大范圍核酸酶例如laglidadg家族，其實(shí)例包括i-scei、i-crei、i-msoi、i-anii、i-dmii和pi-pfui。鋅指核酸酶(zfn)是來自foki限制性內(nèi)切核酸酶的非特異性dna切割結(jié)構(gòu)域與鋅指蛋白的融合體。zfn二聚體誘導(dǎo)刺激dna損傷反應(yīng)途徑的靶向dna雙鏈斷裂(dsb)。設(shè)計(jì)的鋅指結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特異性將zfn引導(dǎo)至特定的基因組位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子(tale)核酸酶(talen)是foki切割結(jié)構(gòu)域和來源于tale蛋白的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合體。tale含有多個(gè)33-35個(gè)氨基酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域中每一個(gè)識(shí)別單個(gè)堿基對(duì)。像zfn一樣，talen誘導(dǎo)靶向的dsb，該dsb激活dna損傷反應(yīng)途徑并且使定制的改變成為可能。rna引導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶(例如cas9)是crispr/cas系統(tǒng)的一部分。crispr或成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列是包含多個(gè)短的正向重復(fù)的基因座，并且為細(xì)菌和古細(xì)菌提供獲得性免疫。crispr系統(tǒng)依賴crrna和tracrrna(用于入侵的外來dna的序列特異性沉默)。存在三種類型的crispr/cas系統(tǒng)。在ii型系統(tǒng)中，cas9用作rna引導(dǎo)的dna內(nèi)切核酸酶，該內(nèi)切核酸酶一經(jīng)crrna-tracrrna靶標(biāo)識(shí)別即切割dna。

為了切割dna，所有限制酶都進(jìn)行兩次切開，每次通過dna雙螺旋的單個(gè)糖-磷酸骨架(即單條鏈)。已經(jīng)詳細(xì)研究了超過3000種限制酶，并且這些酶中超過600種是可商購(gòu)的。這些酶通常在實(shí)驗(yàn)室中用于dna修飾，并且是分子克隆中的重要工具。例如，以下限制酶識(shí)別8個(gè)堿基對(duì)的限制位點(diǎn)，并且是可商購(gòu)的：paci、swai、pmei、asci、asisi、fsei、noti、srfi和sgfi。本文使用的限制酶包括天然存在的限制酶和合成的、雜交的或突變的限制酶，只要它們能夠在絲狀真菌的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂(dsb)即可。

如本文所使用的，術(shù)語“限制酶位點(diǎn)”、“限制位點(diǎn)”或“識(shí)別位點(diǎn)”是被各種限制酶識(shí)別的、在dna分子上含有特異性(長(zhǎng)度為從4-8個(gè)堿基對(duì)至12-40個(gè)堿基對(duì))核苷酸序列的位置。這些可以是回文序列(因?yàn)樵S多限制酶以同源二聚體結(jié)合)或不對(duì)稱的(針對(duì)定制設(shè)計(jì)的talen或znf核酸酶)，并且特定的限制酶可以在其識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)、附近某處、或遠(yuǎn)處例如超過1000bp的距離的兩個(gè)核苷酸之間切割序列。例如，常見的限制酶ecori識(shí)別回文序列g(shù)aattc，并且在頂部鏈和底部鏈上在g和a之間切割，在每一端留下aatt的突出端。突出端是沒有附接互補(bǔ)體的dna鏈的末端部分，也稱為粘性(sticky或cohesive)末端。然后可以將該突出端連接(參見dna連接酶)到一段具有互補(bǔ)突出端(也稱為相容的粘性末端(例如另一個(gè)ecori切割段))的dna。一些限制酶以不留下突出端(稱為平端)的方式在限制位點(diǎn)處切割dna。

如本文所使用的，術(shù)語“％同一性”與術(shù)語“％同源性”可互換使用，并且是指當(dāng)使用序列比對(duì)程序進(jìn)行比對(duì)時(shí)，編碼任何一個(gè)本發(fā)明多肽或本發(fā)明多肽的氨基酸序列的核酸序列之間的核酸或氨基酸序列同一性的水平。

iii.真菌宿主菌株和dna構(gòu)建體及其使用方法

本披露涉及真菌宿主菌株和用于其創(chuàng)建和使用的重組dna構(gòu)建體。與本領(lǐng)域已知的其他表達(dá)方法相比，真菌宿主菌株可以用于提供感興趣的基因或變體在這些宿主中以更高可靠性和/或更低變異性的表達(dá)水平表達(dá)。在具體實(shí)施例中，真菌宿主菌株可用于有效地靶向基因整合以便可靠或變異較小表達(dá)感興趣的基因。

1.使用限制酶介導(dǎo)的整合(remi)構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株

在第一方面，本披露提供構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株的方法，該方法包括：a)使用線性化dna和限制酶的混合物轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，其中該限制酶能夠在所述真菌菌株的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂；以及b)選擇在步驟a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株。

在第一方面，本披露還提供了構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的木霉屬菌株的方法，所述方法包括：a)使用線性化(也稱為“線性”)或環(huán)狀dna和限制酶(也稱為用限制酶“處理”)的混合物轉(zhuǎn)化木霉屬細(xì)胞，其中該限制酶能夠在木霉屬細(xì)胞的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂(dsb)；并且b)選擇在a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的木霉屬菌株，其中用限制酶處理的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比高于不用限制酶處理可獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比。

在第一方面，本披露還提供了構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的木霉屬菌株的方法，所述方法包括：a)用線性化或環(huán)狀dna轉(zhuǎn)化木霉屬細(xì)胞，其中誘導(dǎo)木霉屬細(xì)胞生產(chǎn)限制酶，其中該限制酶能夠在木霉屬細(xì)胞的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂(dsb)；并且b)選擇在a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的木霉屬菌株，其中用限制酶誘導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比高于不用限制酶誘導(dǎo)可獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比。

在第二方面，本披露提供了使用如上面第一方面所述的方法獲得的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株。

在第三方面，本披露提供了一種改善真菌轉(zhuǎn)化體的穩(wěn)定性的方法，該方法包括使用線性化dna和限制酶的混合物轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，其中該限制酶能夠在所述真菌菌株的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂。

在第三方面，本披露還提供了改善木霉屬轉(zhuǎn)化體的穩(wěn)定性的方法，該方法包括使用線性化或環(huán)狀dna和限制酶的混合物轉(zhuǎn)化木霉屬細(xì)胞，其中所述限制酶能夠在木霉屬細(xì)胞的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂(dsb)，并且其中用限制酶處理所得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比高于不用限制酶處理可獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比。

在第三方面，本披露還提供了改善木霉屬轉(zhuǎn)化體的穩(wěn)定性的方法，該方法包括使用線性化或環(huán)狀dna轉(zhuǎn)化木霉屬細(xì)胞，其中木霉屬細(xì)胞被誘導(dǎo)以生產(chǎn)能夠在木霉屬細(xì)胞的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂(dsb)的限制酶，并且其中用限制酶誘導(dǎo)所得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比高于不用限制酶誘導(dǎo)可獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比。

a.真菌菌株構(gòu)建的經(jīng)典方法

使用真菌菌株作為感興趣的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)宿主長(zhǎng)期以來一直被認(rèn)為是經(jīng)濟(jì)上可行的并且在一段時(shí)間廣泛用于商業(yè)環(huán)境中。針對(duì)真菌已經(jīng)開發(fā)了用于轉(zhuǎn)化和菌株構(gòu)建的不同遺傳方法，包括通過peg/原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(hinnen等人，1978)、電轉(zhuǎn)化(軽部(karube)等人，1985)、基因槍法(armaleo等人，1990)、根癌土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(atmt)(德格魯特(degroot)等人，1998)和rna干擾(rnai)技術(shù)(明石(akashi)等人，2005)的標(biāo)準(zhǔn)方法。

在某些實(shí)施例中，為了制備曲霉屬物種或肉座菌屬物種(hypocreasp.)(木霉屬物種)以用于轉(zhuǎn)化，制備了真菌菌絲體的原生質(zhì)體。參見坎貝爾(campbell)等人，現(xiàn)代遺傳學(xué)(curr.genet.)16:53-56；1989。菌絲體可以從發(fā)芽的營(yíng)養(yǎng)孢子獲得。使用消化細(xì)胞壁的酶處理菌絲體，產(chǎn)生原生質(zhì)體。然后，通過懸浮培養(yǎng)基中滲透穩(wěn)定劑的存在來保護(hù)原生質(zhì)體。合適的穩(wěn)定劑包括例如山梨糖醇、甘露糖醇、氯化鉀、硫酸鎂等。典型地，一種或多種穩(wěn)定劑的濃度可以在約0.8m和約1.2m之間(例如在約0.9m和約1.2m之間、在約1.0m和約1.2m之間、在約1.1m和約1.2m之間等)變化。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，將約1.2m的山梨糖醇用作懸浮培養(yǎng)基中的穩(wěn)定劑。將dna吸收到宿主菌株(例如曲霉屬物種或肉座菌屬物種(木霉屬物種))中常常取決于鈣離子濃度。通常在吸收溶液中使用約10mmcacl2和約50mmcacl2(例如，在約15mm和約45mm之間、在約20mm和約40mm之間、在約25mm和約35mm之間)。除了在吸收溶液中包含鈣離子之外，經(jīng)常包括的其他物質(zhì)是緩沖系統(tǒng)，例如te緩沖液(10mmtris，ph7.4；1mmedta)或10mmmops(ph6.0)緩沖液(嗎啉丙磺酸)和聚乙二醇(peg)。據(jù)信，該緩沖液中的聚乙二醇起到融合細(xì)胞膜的作用，從而允許培養(yǎng)基的內(nèi)容物被遞送到宿主菌株(例如曲霉屬物種或肉座菌屬物種)的細(xì)胞質(zhì)中，并且將質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。在某些實(shí)施例中，該融合過程保留下整合到宿主染色體中的多個(gè)拷貝的質(zhì)粒dna。

通常，將含有以10⁵至10⁶/ml、優(yōu)選2xl0⁵/ml的密度的已經(jīng)經(jīng)歷滲透性處理的曲霉屬物種原生質(zhì)體或細(xì)胞的懸浮液或細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化。類似地，將含有以10⁸至10⁹/ml、優(yōu)選2xl0⁸/ml的密度的已經(jīng)經(jīng)歷滲透性處理的肉座菌屬物種(木霉屬物種)原生質(zhì)體或細(xì)胞的懸浮液或細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化。將100μl體積的在合適的溶液(例如1.2m山梨糖醇；50mmcacl2)中的這些原生質(zhì)體或細(xì)胞與所希望的的dna混合。在一些實(shí)施例中，將大量的peg添加到吸收溶液中。例如，可以將從約0.1至約1體積的25％peg4000添加到原生質(zhì)體懸浮液中。在具體的實(shí)例中，將約0.25體積的25％peg4000添加到原生質(zhì)體懸浮液中。也可以將添加劑例如二甲亞砜、肝素、亞精胺、氯化鉀等添加到吸收溶液中并幫助轉(zhuǎn)化。

在某些實(shí)施例中，將混合物在約0℃下孵育約10分鐘至約30分鐘的時(shí)間?？梢韵蚧旌衔镏刑砑恿硗獾膒eg以進(jìn)一步增強(qiáng)所希望的基因或dna序列的吸收。在某些實(shí)施例中，能以轉(zhuǎn)化混合物的5至15倍的量添加25％peg4000；然而，更大和更小的體積也可能是合適的。例如，在一些實(shí)施例中，以轉(zhuǎn)化混合物的體積的10倍添加25％peg4000。在添加peg之后，將轉(zhuǎn)化混合物在室溫或冰上孵育，然后添加山梨糖醇和cacl2溶液。然后將原生質(zhì)體懸浮液進(jìn)一步添加到生長(zhǎng)培養(yǎng)基的熔融等分試樣中。該生長(zhǎng)培養(yǎng)基允許轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)。在本披露中，許多生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以合適地用于生長(zhǎng)所希望的轉(zhuǎn)化體。在某些實(shí)施例中，例如，如果選擇pyr+轉(zhuǎn)化體，則優(yōu)選使用不含尿苷的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。例如，將菌落轉(zhuǎn)移到尿苷耗盡的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上并在該培養(yǎng)基上純化。

在這個(gè)階段，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體可以通過其更快的生長(zhǎng)速度與不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體區(qū)分開來。而且，使用許多絲狀真菌宿主(例如像木霉屬)，在缺乏尿苷的固體培養(yǎng)基上形成具有光滑的而不是粗糙輪廓的圓形菌落可以用作區(qū)別特征。在一些實(shí)施例中，可以通過在固體非選擇性培養(yǎng)基(例如含有尿苷)上生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化體，從該培養(yǎng)基中收獲孢子并確定這些孢子的百分比來進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試和穩(wěn)定性的選擇。允許選擇的孢子在缺乏尿苷的選擇培養(yǎng)基上發(fā)芽并生長(zhǎng)。可以在所有測(cè)試的轉(zhuǎn)化體中計(jì)算穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比。

但是使用上述轉(zhuǎn)化方法，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比可能在5％和30％之間變化，這意味著必須篩選大量的轉(zhuǎn)化體以選擇最佳菌株。穩(wěn)定性頻率可能取決于所使用和在木霉屬菌株中的選擇標(biāo)記。為什么與一些其他真菌(如曲霉屬)相比木霉屬中不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的頻率很高仍然是未知的。由于這種高水平的不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體，篩選和選擇生產(chǎn)菌株的過程趨于非常費(fèi)力和耗時(shí)。因此，生產(chǎn)遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株以按降低的變異性表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)的可靠手段提供了明顯的優(yōu)點(diǎn)。

當(dāng)外源dna作為靶向基因置換整合進(jìn)染色體時(shí)，其涉及dnadsb(雙鏈斷裂)的細(xì)胞修復(fù)機(jī)制。dsb通過兩個(gè)主要途徑在基因組的維持中起關(guān)鍵作用：依賴于同源序列的hr(同源重組)途徑和不依賴于序列同源性的nhej途徑(kanaar等人，1998)。這兩種修復(fù)機(jī)制被認(rèn)為獨(dú)立工作，但揭示了功能競(jìng)爭(zhēng)(凡·戴克(vandyck)等人，1999)。在單細(xì)胞真核生物釀酒酵母(s.cerevisiae)中，hr是涉及修復(fù)dsb的主要途徑，而大多數(shù)絲狀真菌中hr的低頻率(5％)阻礙了靶向基因置換的研究(韋爾德(weld)等人，2006)。因此，需要通過消除nhej途徑增加hr途徑的方法來實(shí)現(xiàn)絲狀真菌中的高度有效的基因靶向。已經(jīng)開發(fā)了nhej缺陷型菌株以改善hr的效率，因?yàn)樵摶驅(qū)⒏菀椎亟?jīng)由hr在其內(nèi)源基因座上整合。盡管nhej缺陷型菌株的形態(tài)與野生型相似，但是突變體對(duì)腐草霉素、博來霉素、和甲磺酸甲酯/乙酯等幾種化學(xué)藥品更加敏感。因此，需要開發(fā)其他方法、系統(tǒng)或技術(shù)以便使感興趣的基因能以靶向的方式整合到真菌基因組中。

b.使用限制酶介導(dǎo)的整合(remi)構(gòu)建真菌菌株

基于peg-原生質(zhì)體系統(tǒng)的限制酶介導(dǎo)的整合(remi)最初在釀酒酵母中建立(schiest和皮特斯(petes)，1991)，并且已經(jīng)成功地應(yīng)用于幾種真菌植物病原體，例如異旋孢腔菌(cochliobolusheterostrophus)(魯(lu)等人，1994)和互隔交鏈孢霉(alternariaalternata)(田中(tanaka)等人，1999)。今天，remi技術(shù)已經(jīng)成功地產(chǎn)生更高數(shù)量或百分比的真菌突變體，這些突變體可用于鑒定致病性基因以及其他基因功能評(píng)估。例如，用優(yōu)化的remi方法處理捕獲線蟲的真菌少孢節(jié)叢孢菌(arthrobotrysoligospora)，得到34-175個(gè)轉(zhuǎn)化體/μg線性質(zhì)粒dna，以及總共超過2000個(gè)轉(zhuǎn)化體。另外，還鑒定了經(jīng)由remi在禾谷鐮刀菌突變文庫(kù)中篩選的11個(gè)有趣的突變體以及與小麥痂病毒性相關(guān)的另外兩個(gè)基因cbl1和msy1(相(seong)等人，2005)。此外，通過remi技術(shù)從尖孢鐮刀菌鑒定了與致病性或?qū)χ参锓烙衔锏目剐韵嚓P(guān)的幾種蛋白質(zhì)(duyvesteijn等人，2005；imazaki等人，2007；馬德里(madrid)等人，2003)?？傊梢酝ㄟ^remi可靠地獲得改善的突變體(轉(zhuǎn)化體)頻率和單拷貝插入率。

本披露提供了remi在迄今為止未被認(rèn)識(shí)和未應(yīng)用的背景中的使用，也就是說，將remi用于顯著增加(與轉(zhuǎn)化體的頻率對(duì)照)穩(wěn)定的木霉屬轉(zhuǎn)化體的百分比。實(shí)際上，與已預(yù)期的相反，當(dāng)將remi應(yīng)用于木霉屬時(shí)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化體的頻率更少。然而，在所制得的轉(zhuǎn)化體中，就這樣在降低的頻率下，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體的數(shù)量劇烈增加。

從另一個(gè)觀點(diǎn)來描述，當(dāng)在限制酶存在下用dna轉(zhuǎn)化木霉屬時(shí)，不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的數(shù)量劇烈下降，從而允許容易地選擇穩(wěn)定的菌落(圖4a-4e)。

在傳統(tǒng)的peg介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比可以在5％和30％之間變化。相比之下，當(dāng)將remi應(yīng)用于木霉屬peg介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化時(shí)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比增加至90％。因此，必須篩選以選擇最佳菌株的轉(zhuǎn)化體的數(shù)量可以顯著降低。

另外，當(dāng)應(yīng)用remi時(shí)，觀察到更高百分比的高生產(chǎn)轉(zhuǎn)化體。

在一些實(shí)施例中，用于該方法或與本文所述的真菌宿主菌株一起使用的限制酶由置于真菌宿主細(xì)胞中的表達(dá)盒產(chǎn)生。例如，表達(dá)盒可以合適地插入含有可選擇標(biāo)記和對(duì)高水平轉(zhuǎn)錄有用的序列的任何表達(dá)載體中。

考慮可以將限制酶的編碼區(qū)或其部分插入到這樣的通用型表達(dá)載體中，將其置于表達(dá)盒啟動(dòng)子和終止子序列的轉(zhuǎn)錄控制下。這樣的通用型表達(dá)載體的非限制性實(shí)例是曲霉屬中的prax。可以將感興趣的基因或變體基因或其一部分插入強(qiáng)glaa啟動(dòng)子的下游。這樣的通用型表達(dá)載體的非限制性實(shí)例是肉座菌屬中的ptrex3gm?？梢詫⒏信d趣的基因或變體基因或其一部分插入強(qiáng)cbhl啟動(dòng)子的下游。

在某些實(shí)施例中，在載體中，編碼限制酶或感興趣的蛋白質(zhì)的dna序列可以可操作地連接到在閱讀框中結(jié)構(gòu)基因上的轉(zhuǎn)錄和翻譯序列(例如合適的啟動(dòng)子序列和信號(hào)序列)上。啟動(dòng)子合適地是在特定宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何dna序列，并且可以來源于編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。可任選的信號(hào)肽可以提供感興趣的蛋白質(zhì)或變體的細(xì)胞外生產(chǎn)。編碼信號(hào)序列的dna優(yōu)選是與待表達(dá)的基因天然相關(guān)的dna。然而，考慮了來自任何合適來源(例如來自外切纖維二糖水解酶或來自木霉屬的內(nèi)切葡聚糖酶)的信號(hào)序列。

可以用來將編碼限制酶或感興趣的蛋白質(zhì)的dna序列連接到啟動(dòng)子上的試驗(yàn)方案，以及將這樣的構(gòu)建體插入合適的載體中是本領(lǐng)域已知的。

根據(jù)本文所述的已知技術(shù)，例如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、顯微注射、微孔化、基因槍轟擊等，可以將本文所述的dna載體或構(gòu)建體引入真菌宿主細(xì)胞中。

合適地與用此方法提供的本發(fā)明一起使用的真菌菌株可以是來自木霉屬，特別是里氏木霉(長(zhǎng)柄木霉)的菌株。然而，感興趣的基因還可以來源于任何其他合適的微生物，包括真菌，例如犁頭霉屬的物種(absidiaspp.)；支頂孢屬的物種(acremoniυmspp.)；agancusspp.、厭氧鞭菌屬的物種(anaeromycesspp)；曲霉屬的物種(aspergillusspp)，包括棘孢曲霉(a.auculeatus)、泡盛曲霉(a.awamon)、黃曲霉(a.flavus)、臭曲霉(a.foetidus)、反丁烯二酸曲霉(a.fumaricus)、煙曲霉(a.fumigatus)、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、土曲霉(a.terreus)和雜色曲霉(a.versicolor)；aeurobasidiumspp.；頭孢菌屬的物種(cephalosporumspp.)；毛殼菌屬的物種(chaetomiumspp.)；金孢子菌屬的物種(chrysosporiumspp)；鬼傘屬的物種(coprinusspp)；dactyllumspp.；鐮刀菌屬的物種(fusariumspp.)，包括f.conglomerans、拾胞鐮孢菌(f.decemcellulare)、爪哇鐮刀菌(f.javanicum)、f.lim、尖孢鐮刀菌(f.oxysporum)和腐皮鐮刀菌(f.solani)；膠枝霉屬的物種(gliocladiumspp.)；腐質(zhì)霉屬的物種(humicolaspp)，包括特異腐質(zhì)霉(h.insolens)和綿毛狀腐質(zhì)菌(h.lanuginosa)；毛霉屬的物種(mucorspp.)；脈孢菌屬的物種(neurosporaspp.)，包括粗糙脈孢菌(n.crassa)和好食鏈孢霉(n.sitophila)；新美鞭菌屬的物種(neocallimastixspp)；根囊鞭菌屬的物種(orpinomycesspp.)；青霉屬的物種；平革菌屬的物種(phanerochaetespp.)；射脈菌屬的物種(phlebiaspp.)；瘤胃壺菌屬的物種(piromycesspp.)；假單胞菌屬的物種；根霉屬的物種(rhizopusspp.)；裂褶菌屬的物種(schizophyllumspp.)；栓菌屬的物種(trametesspp)；木霉屬的物種，包括里氏木霉、里氏木霉(長(zhǎng)柄木霉)和綠色木酶(t.viride)；以及接霉屬的物種(zygorhynchusspp.)。類似地，可以設(shè)想感興趣的基因或其編碼的蛋白質(zhì)可以在細(xì)菌和酵母菌中找到，該細(xì)菌例如是芽孢桿菌屬的物種、纖維單胞菌屬的物種(cellulomonasspp.)；梭菌屬的物種(clostridiumspp.)、毀絲霉屬的物種(mysoliophthoraspp.)；高溫單孢菌屬的物種(thermomonosporaspp)；鏈霉菌屬的物種，產(chǎn)橄欖色鏈霉菌(s.olivochromogenes)；產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(fibrobactersuccinogenes)；并且該酵母菌包括念珠菌(candidatorresn)；c.parapsllosis；清酒假絲酵母(c.sake)；涎沫假絲酵母(c.zeylanoides)，小畢赤酵母(pichiaminuta)；黏紅酵母(rhodotorulaglutinis)；膠紅酵母(r.mucilaginosa)和紅擲孢酵母(sporobolomycesroseus)?？商娲兀信d趣的基因可以來源于其他來源，例如細(xì)菌。

c.真菌菌株中的靶向基因整合系統(tǒng)

在一個(gè)方面，本披露提供了真菌表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括：在第一部分，在染色體dna中含有至少一個(gè)限制酶位點(diǎn)的真菌宿主細(xì)胞；以及在第二部分，含有可操作以表達(dá)一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因的序列、一種選擇標(biāo)記和與所述染色體限制酶位點(diǎn)側(cè)翼的序列具有實(shí)質(zhì)同源性的序列的一種核酸分子，其中該同源序列引起導(dǎo)致該感興趣的基因的表達(dá)的同源重組事件。此外，本披露提供了使用上述方面的真菌表達(dá)系統(tǒng)的方法，該方法包括在能夠產(chǎn)生限制酶位點(diǎn)的限制酶存在下將所述核酸分子轉(zhuǎn)化到真菌宿主細(xì)胞中。

此外，本披露提供了通過使用真菌表達(dá)系統(tǒng)的方法獲得的轉(zhuǎn)化的或衍生的真菌菌株。

還另外，本披露提供了靶向基因整合的方法，該方法包括首先獲得在染色體dna中含有至少一個(gè)限制酶位點(diǎn)的真菌宿主細(xì)胞，以及含有可操作以表達(dá)一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因的序列、至少一種選擇標(biāo)記和與所述染色體限制酶位點(diǎn)側(cè)翼的序列具有實(shí)質(zhì)同源性的序列的一種核酸分子，其中該同源序列引起導(dǎo)致該感興趣的基因的表達(dá)的同源重組事件；然后在能夠產(chǎn)生限制酶位點(diǎn)的限制酶的存在下將第一步驟的核酸分子轉(zhuǎn)化到第一步驟的真菌宿主細(xì)胞中。

本披露提供了一種靶向基因整合系統(tǒng)，該靶向基因整合系統(tǒng)被開發(fā)用于闡明基因功能，包括在微生物和真核兩種基因組中鑒定基因產(chǎn)物的相互作用的蛋白質(zhì)伴侶。傳統(tǒng)上，用于確定基因功能的方法典型地涉及為感興趣的基因創(chuàng)建無效突變以評(píng)估生物體的表型，該評(píng)估通過比較使得感興趣的基因?yàn)闊o功能的時(shí)候的表型與感興趣的基因是有功能的時(shí)候的表型來進(jìn)行。使用由重組dna技術(shù)制得的基因破壞載體，通過基因破壞(也稱為基因敲除或基因替換)產(chǎn)生無效突變。在轉(zhuǎn)化到相關(guān)生物體中后，具有一個(gè)或多個(gè)被破壞的感興趣的基因的dna構(gòu)建體將通過同源重組整合到這樣的生物體的基因組中的一個(gè)或多個(gè)駐留位置，替換基因的功能性拷貝。如上所述的傳統(tǒng)方法對(duì)于一系列生物體中的基因的破壞是有效的，但是具有若干固有限制。例如，在多細(xì)胞真核生物(包括大多數(shù)真菌)中占優(yōu)勢(shì)的非同源末端連接(nhej)導(dǎo)致表達(dá)載體隨機(jī)地整合到基因組中。另外，即使在轉(zhuǎn)化體中，通常產(chǎn)生很大百分比的不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體，需要進(jìn)一步篩選轉(zhuǎn)化體以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。

另外，由于靶向整合事件的低效率，使用真菌系統(tǒng)(例如涉及里氏木霉的真菌系統(tǒng))用于鑒定具有較高比活性的蛋白質(zhì)或變體的高通量篩選是一個(gè)挑戰(zhàn)。在另一方面，長(zhǎng)期以來理解的是，為了提供對(duì)然后可以由真菌宿主生物表達(dá)或產(chǎn)生、接下來可以被應(yīng)用到工業(yè)用途中的蛋白質(zhì)/變體/酶的有意義的篩選，至關(guān)重要的是在最終將產(chǎn)生感興趣的蛋白質(zhì)/變體/酶的真菌系統(tǒng)或在相對(duì)密切相關(guān)的至少一個(gè)真菌系統(tǒng)中進(jìn)行這樣的高通量篩選。然而，在例如木霉屬系統(tǒng)的真菌系統(tǒng)中，受本領(lǐng)域技術(shù)人員喜愛的、含有突變的感興趣的基因的表達(dá)盒的隨機(jī)整合幾乎是不可避免的并且經(jīng)常發(fā)生，產(chǎn)生兩個(gè)變量(其相互作用導(dǎo)致非凡的復(fù)雜性)：1)表達(dá)水平；和2)感興趣的蛋白質(zhì)/變體/酶的活性。因此，經(jīng)由感興趣的基因靶向整合到基因組中的預(yù)定位點(diǎn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化體的蛋白質(zhì)表達(dá)的均一性的方法(例如本文所述的方法)是非常需要的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)活性可以與特征突變直接相關(guān)。

以前已經(jīng)進(jìn)行努力來降低表達(dá)水平的變異性。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)非同源末端連接(nhej)途徑(例如ku70、ku80或lig4)已經(jīng)失活的突變真菌菌株展示增加的同源整合頻率。不幸的是，由此獲得的轉(zhuǎn)化體的數(shù)量相當(dāng)?shù)汀Ａ硗?，已?jīng)報(bào)道，當(dāng)工業(yè)菌株中ku70的突變導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定時(shí)，它們有時(shí)是不需要的(阿烏(aw)和波利齊(polizzi)，2013)。

本披露表明，通過使用i-scei內(nèi)切核酸酶在里氏木霉基因組中的預(yù)定位點(diǎn)處產(chǎn)生雙鏈斷裂，在里氏木霉菌株中完整的nhej基因的靶向整合頻率得到改善。

在具體實(shí)例(實(shí)例2)中，構(gòu)建了重組的里氏木霉，以在cbh2基因座處含有i-scei限制位點(diǎn)，并且在i-scei(其在里氏木霉基因組中的預(yù)定位點(diǎn)處產(chǎn)生雙鏈斷裂的)存在下使用與i-scei限制位點(diǎn)側(cè)翼的序列具有實(shí)質(zhì)同源性的葡糖淀粉酶表達(dá)盒來轉(zhuǎn)化重組的里氏木霉。經(jīng)由雙交叉觀察到葡糖淀粉酶表達(dá)盒在目的位點(diǎn)處的靶向整合(圖11)。如表3中進(jìn)一步所示，68％的表達(dá)葡糖淀粉酶的轉(zhuǎn)化體(i-scei誘導(dǎo)的)以靶向方式整合，而與之相對(duì)，非誘導(dǎo)的i-scei構(gòu)建體僅為46％，并且對(duì)照構(gòu)建體為16％。

d.真菌菌株的發(fā)酵

在一個(gè)方面，本披露提供了在合適的培養(yǎng)基中發(fā)酵轉(zhuǎn)化的真菌菌株的方法，該轉(zhuǎn)化的真菌菌株已經(jīng)使用以下方法獲得，該方法包括：a)用線性化dna和限制酶的混合物轉(zhuǎn)化真菌的細(xì)胞，其中該限制酶能夠在真菌菌株的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂；以及b)選擇在步驟a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株。

在這一方面，本披露還提供了在合適的培養(yǎng)基中發(fā)酵轉(zhuǎn)化的真菌菌株的方法，該轉(zhuǎn)化的真菌菌株已經(jīng)使用以下方法獲得，該方法包括：a)使用線性化/線性或環(huán)狀dna和限制酶的混合物轉(zhuǎn)化木霉屬細(xì)胞，其中該限制酶能夠在木霉屬細(xì)胞的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂(dsb)；并且b)選擇在a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的木霉屬菌株，其中用限制酶處理的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比高于不用限制酶處理可獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比。

在同一方面，本披露還提供了在合適的培養(yǎng)基中發(fā)酵轉(zhuǎn)化的真菌菌株的方法，該轉(zhuǎn)化的真菌菌株已經(jīng)使用以下方法獲得，該方法包括：a)用線性化/線性或環(huán)狀dna轉(zhuǎn)化木霉屬細(xì)胞，其中誘導(dǎo)木霉屬細(xì)胞生產(chǎn)限制酶，其中該限制酶能夠在木霉屬細(xì)胞的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂(dsb)；并且b)選擇在a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的木霉屬菌株，其中用限制酶誘導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比高于不用限制酶誘導(dǎo)可獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比。

在另一個(gè)方面，本披露提供了表達(dá)感興趣的基因的方法，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中，在允許感興趣的基因表達(dá)的條件下，使例如根據(jù)在上述方面中已經(jīng)描述的那樣獲得的轉(zhuǎn)化的真菌菌株生長(zhǎng)和發(fā)酵。

在另外的方面，本披露提供了在合適的培養(yǎng)基中使轉(zhuǎn)化的或衍生的真菌菌株發(fā)酵的方法，由此使用如本文所述的方法和真菌表達(dá)系統(tǒng)獲得轉(zhuǎn)化的或衍生的真菌菌株。

在又另外的方面，本披露提供了表達(dá)感興趣的基因的方法，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中并且在允許感興趣的基因表達(dá)的條件下，使如本文提供的轉(zhuǎn)化的或衍生的真菌菌株生長(zhǎng)和發(fā)酵。由此獲得的轉(zhuǎn)化的或衍生的真菌菌株可以合適地使用如本文所述或提供的真菌表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)通常包括：在能夠產(chǎn)生合適的限制酶位點(diǎn)的限制酶存在下將特定核酸分子轉(zhuǎn)化到真菌宿主細(xì)胞中。

本領(lǐng)域熟知的任何發(fā)酵方法都可以合適用來使如本文提供的轉(zhuǎn)化的或衍生的真菌菌株發(fā)酵。在一些實(shí)施例中，真菌細(xì)胞在分批或連續(xù)發(fā)酵條件下生長(zhǎng)。

經(jīng)典的分批發(fā)酵是封閉的系統(tǒng)，其中在發(fā)酵開始時(shí)設(shè)定培養(yǎng)基的組成，并且該組成在發(fā)酵期間不改變。在發(fā)酵開始時(shí)，用一種或多種所希望的生物體接種培養(yǎng)基。換言之，整個(gè)發(fā)酵過程發(fā)生而自始至終沒有向發(fā)酵系統(tǒng)添加任何組分。

可替代地，分批發(fā)酵符合關(guān)于添加碳源的“分批”的資格。此外，通常在整個(gè)發(fā)酵過程中進(jìn)行嘗試來控制因素例如ph和氧氣濃度。典型地，分批系統(tǒng)的代謝物和生物質(zhì)組成不斷變化直到發(fā)酵停止的時(shí)間。在分批培養(yǎng)中，細(xì)胞通過靜態(tài)停滯期進(jìn)展到高生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，最后進(jìn)入生長(zhǎng)速率減少或停止的穩(wěn)定期。不經(jīng)處理，穩(wěn)定期中的細(xì)胞將最終死亡。通常，在對(duì)數(shù)期的細(xì)胞負(fù)責(zé)產(chǎn)物的大量生產(chǎn)。

標(biāo)準(zhǔn)分批系統(tǒng)的一個(gè)合適的變體是“補(bǔ)料分批發(fā)酵”系統(tǒng)。在典型的分批系統(tǒng)的這種變化中，隨著發(fā)酵的進(jìn)展，將底物以增量添加。當(dāng)已知分解代謝物抑制將抑制細(xì)胞的代謝時(shí)和/或在發(fā)酵培養(yǎng)基中希望具有有限量的底物的情況下，補(bǔ)料分批系統(tǒng)是有用的。在補(bǔ)料分批系統(tǒng)中實(shí)際底物濃度的測(cè)量是困難的，并且因此基于可測(cè)量因素(例如ph、溶解的氧和廢氣(例如co2)的分壓)的變化對(duì)其進(jìn)行估計(jì)。分批和補(bǔ)料分批發(fā)酵是本領(lǐng)域熟知的。

連續(xù)發(fā)酵是另一種已知的發(fā)酵方法。它是一個(gè)開放的系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，將定義的發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)添加到生物反應(yīng)器中，同時(shí)除去等量的條件培養(yǎng)基以用于處理。連續(xù)發(fā)酵通常將培養(yǎng)物保持在恒定的密度，其中將細(xì)胞主要維持在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)。連續(xù)發(fā)酵允許對(duì)一種或多種影響細(xì)胞生長(zhǎng)和/或產(chǎn)物濃度的因素進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，限制營(yíng)養(yǎng)素(例如碳源或氮源)可以維持在固定的速率，并允許調(diào)節(jié)所有其他參數(shù)。在其他系統(tǒng)中，影響生長(zhǎng)的許多因素可以不斷改變，而通過培養(yǎng)基濁度測(cè)量的細(xì)胞濃度保持不變。連續(xù)系統(tǒng)努力維持穩(wěn)定態(tài)的生長(zhǎng)條件。因此，由于轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基而引起的細(xì)胞損失應(yīng)當(dāng)與發(fā)酵中的細(xì)胞生長(zhǎng)速率相平衡。調(diào)節(jié)用于連續(xù)發(fā)酵過程的營(yíng)養(yǎng)素和生長(zhǎng)因子的方法以及最大化產(chǎn)物形成速率的技術(shù)在工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域中是熟知的。

e.由真菌菌株產(chǎn)生的感興趣的蛋白質(zhì)

在一個(gè)方面，本披露提供了由感興趣的基因編碼并且通過表達(dá)感興趣的基因的方法生產(chǎn)的感興趣的蛋白質(zhì)，該表達(dá)感興趣的基因的方法包括在允許該感興趣的基因表達(dá)的條件下在合適的培養(yǎng)基中使轉(zhuǎn)化的真菌菌株生長(zhǎng)和發(fā)酵，該菌株使用以下方法獲得，該方法包括：a)使用線性化dna和限制酶的混合物轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，其中該限制酶能夠在所述真菌菌株的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂；以及b)選擇在步驟a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的真菌菌株。

在這一方面，本披露還提供了由感興趣的基因編碼并且通過表達(dá)感興趣的基因的方法生產(chǎn)的感興趣的蛋白質(zhì)，該表達(dá)感興趣的基因的方法包括在允許該感興趣的基因表達(dá)的條件下在合適的培養(yǎng)基中使轉(zhuǎn)化的真菌菌株生長(zhǎng)和發(fā)酵，該菌株使用以下方法獲得，該方法包括：a)使用線性化/線性或環(huán)狀dna和限制酶的混合物轉(zhuǎn)化木霉屬細(xì)胞，其中該限制酶能夠在該木霉屬細(xì)胞的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂(dsb)；并且b)選擇在a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的木霉屬菌株，其中用限制酶處理的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比高于不用限制酶處理可獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比。

在同一方面，本披露還提供了由感興趣的基因編碼并且通過表達(dá)感興趣的基因的方法生產(chǎn)的感興趣的蛋白質(zhì)，該表達(dá)感興趣的基因的方法包括在允許該感興趣的基因表達(dá)的條件下在合適的培養(yǎng)基中使轉(zhuǎn)化的真菌菌株生長(zhǎng)和發(fā)酵，該菌株使用以下方法獲得，該方法包括：a)用線性化/線性或環(huán)狀dna轉(zhuǎn)化木霉屬細(xì)胞，其中該木霉屬細(xì)胞被誘導(dǎo)產(chǎn)生限制酶，其中該限制酶能夠在該木霉屬細(xì)胞的染色體dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂(dsb)；并且b)選擇在a)中產(chǎn)生的遺傳穩(wěn)定的、轉(zhuǎn)化的木霉屬菌株，其中用限制酶誘導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比高于不用限制酶誘導(dǎo)可獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比。

在另一個(gè)方面，本披露提供了由感興趣的基因編碼并且通過在合適的培養(yǎng)基中在允許感興趣的基因表達(dá)的條件下在衍生的真菌菌株中表達(dá)感興趣的基因的方法產(chǎn)生的感興趣的蛋白質(zhì)，該菌株通過使用真菌表達(dá)系統(tǒng)的方法獲得，該真菌表達(dá)系統(tǒng)在第一部分中包含在染色體dna中含有至少一個(gè)限制酶位點(diǎn)的真菌宿主細(xì)胞；并且在第二部分，含有可操作以表達(dá)一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因的序列、一種選擇標(biāo)記和與所述染色體限制酶位點(diǎn)側(cè)翼的序列具有實(shí)質(zhì)同源性的序列的一種核酸分子，其中該同源序列引起導(dǎo)致該感興趣的基因的表達(dá)的同源重組事件；由此在能夠產(chǎn)生限制酶位點(diǎn)的限制酶的存在下將第一部分的核酸分子轉(zhuǎn)化到真菌宿主細(xì)胞中。

感興趣的蛋白質(zhì)可以合適地是任何內(nèi)源和異源的蛋白質(zhì)。感興趣的蛋白質(zhì)可以含有一個(gè)或多個(gè)二硫鍵，或者可以是其功能形式是單體或多聚體的蛋白質(zhì)，即蛋白質(zhì)具有四級(jí)結(jié)構(gòu)并且由多個(gè)相同(同源的)或不相同的(異源的)亞基構(gòu)成，然而，感興趣的蛋白質(zhì)優(yōu)選是具有感興趣的性質(zhì)的蛋白質(zhì)。

感興趣的蛋白質(zhì)可以是感興趣的變體。感興趣的蛋白質(zhì)或感興趣的變體可以合適地是半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、或其變體、或這些酶或變體中的兩種或更多種的混合物。感興趣的蛋白質(zhì)或感興趣的變體蛋白質(zhì)的非限制性實(shí)例可以是涉及淀粉代謝的蛋白質(zhì)或酶或其變體；涉及糖原代謝的蛋白質(zhì)或酶或其變體；酶例如乙酰酯酶、氨基肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、凝乳酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、差向異構(gòu)酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內(nèi)切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠裂解酶、果膠乙酰酯酶、果膠解聚酶、果膠甲酯酶、果膠分解酶、過氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇異果甜蛋白、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(d-己糖：02-氧化還原酶，ec1.1.3.5)，其變體，以及這些酶或其變體的兩種或更多種的組合。

感興趣的蛋白質(zhì)或感興趣的變體還可以合適地是肽激素、生長(zhǎng)因子、凝血因子、趨化因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、抗體、受體、粘附分子、微生物抗原(例如，hbv表面抗原、hpve7等)或其變體或片段，或這樣的物質(zhì)、變體或片段中的兩種或更多種的混合物。

其他類型的感興趣的蛋白質(zhì)或變體可以是能夠?yàn)槭称坊蜃魑锾峁I(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蛋白質(zhì)或變體。非限制性實(shí)例包括可以抑制抗?fàn)I養(yǎng)因子形成的植物蛋白質(zhì)和具有更理想的氨基酸組成的植物蛋白質(zhì)(例如比非轉(zhuǎn)基因植物具有更高的賴氨酸含量)。

f.由此制成的蛋白質(zhì)性組合物的使用

在一個(gè)方面，本披露提供了包含感興趣的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)性組合物。蛋白質(zhì)性組合物使用本文提供的方法合適地生產(chǎn)。組合物包含由感興趣的基因編碼、使用本文所述的方法表達(dá)的感興趣的蛋白質(zhì)。該組合物可用于各種有用的工業(yè)應(yīng)用中，例如像用于生物質(zhì)水解、清潔應(yīng)用、谷物加工、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、食品組合物、紡織品處理等中。

例如，由此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)性組合物可以用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解中。木質(zhì)纖維素是世界上最大的可再生生物質(zhì)資源，主要由木質(zhì)素、纖維素和半纖維素構(gòu)成，其中后者中大部分是木聚糖。將木質(zhì)纖維素原料轉(zhuǎn)化成乙醇具有以下優(yōu)點(diǎn)：大量原料的即時(shí)可得性、避免燃燒或填埋材料的期望性、以及乙醇燃料的清潔性。木材、農(nóng)業(yè)殘留物、草本作物和市政固體廢物已經(jīng)被認(rèn)為是用于乙醇生產(chǎn)的原料。一旦木質(zhì)纖維素被轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖，例如葡萄糖，可發(fā)酵糖就容易被酵母發(fā)酵成乙醇。纖維素是單糖葡萄糖通過β-1,4-鍵共價(jià)連接的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解β-連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。木聚糖是由1,4-β-糖苷連接的d-吡喃木糖形成的多糖。木聚糖酶(例如內(nèi)切-1,4-β-木聚糖酶，ec3.2.1.8)水解木聚糖中的內(nèi)部β-1,4-木糖苷鍵以產(chǎn)生較小分子量的木糖和木糖低聚物。本披露為這樣的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)用途提供了轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞，該真菌細(xì)胞已經(jīng)被證明具有改善的轉(zhuǎn)化體穩(wěn)定性，作為感興趣的工業(yè)酶、變體和混合物的生產(chǎn)者是合適和有益的。

在另一個(gè)實(shí)例中，由此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)性組合物可以用于清潔應(yīng)用中。酶促清潔組分是受歡迎的，因?yàn)樗鼈兡軌蚍纸獬Ｒ?guī)化學(xué)洗滌劑不容易分解的土壤、污漬和其他雜物。可用于清潔的眾所周知的酶包括蛋白酶和淀粉酶，連同其他酶例如脂肪酶、果膠酶、甘露聚糖酶，甚至是某些纖維素酶，這些酶各自提供一組不同的功能。蛋白酶與基于蛋白質(zhì)的污漬相抗衡；淀粉酶對(duì)碳水化合物和淀粉起作用；并且脂肪酶分解例如脂質(zhì)或脂肪。本披露為在清潔應(yīng)用中的這樣的用途提供了轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞，該真菌細(xì)胞已經(jīng)被證明具有改善的轉(zhuǎn)化體穩(wěn)定性，作為感興趣的工業(yè)酶、變體和混合物的生產(chǎn)者是合適和有益的。

在另一個(gè)實(shí)例中，由此制得的蛋白質(zhì)性組合物可以用于谷物加工中。淀粉是植物中最常見的儲(chǔ)存碳水化合物，由植物本身以及由微生物和由高等生物使用。多種酶能夠催化淀粉水解。來自所有植物來源的淀粉以顆粒的形式發(fā)生，但是取決于植物來源的種類，淀粉呈現(xiàn)明顯不同的大小和物理特征。淀粉的酸水解在過去被廣泛使用，然而這一過程現(xiàn)在已經(jīng)在很大程度上被酶促加工所替換，已知所述酶促加工要求更少的耐腐蝕材料和其他益處，需要更少的加熱能量，并且比酸處理相對(duì)更容易控制。本披露為在淀粉降解和谷物加工中的這樣的用途提供了轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞，該真菌細(xì)胞已經(jīng)被證明具有改善的轉(zhuǎn)化體穩(wěn)定性，作為感興趣的工業(yè)酶、變體和混合物的生產(chǎn)者是合適和有益的。

在另一個(gè)實(shí)例中，由此制得的蛋白質(zhì)性組合物可以用于食品應(yīng)用中。由細(xì)菌、酵母和霉菌產(chǎn)生的酶數(shù)千年以來已經(jīng)用于食品應(yīng)用，以制作食品例如面包、奶酪、啤酒和葡萄酒。今天，酶被用于面包店、奶酪制作、淀粉加工、以及果汁和其他飲料的生產(chǎn)中，提供各種益處，例如改善的質(zhì)地、外觀和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，產(chǎn)生理想的香味和香氣等。食品酶典型地來源于動(dòng)物和植物(例如淀粉消化酶，即淀粉酶，可以從大麥種子發(fā)芽獲得)以及來自一系列有益微生物。酶被認(rèn)為是傳統(tǒng)基于化學(xué)的技術(shù)的可行和理想的替代品，在許多工藝中替代合成的化學(xué)藥品。酶可以幫助改善食品生產(chǎn)過程的環(huán)境性能，降低能源消耗并改善廢物或副產(chǎn)品的生物降解性。就其作用而言，酶比合成的化學(xué)藥品更具特異性，因此，酶促加工常常提供更少的副反應(yīng)和廢物或副產(chǎn)物，因此產(chǎn)生更高質(zhì)量的產(chǎn)品并降低污染的可能性。酶促加工通常也是唯一可行的加工。這方面的一個(gè)實(shí)例是濃縮蘋果清汁的生產(chǎn)，其依賴于酶(果膠酶)的使用。大多數(shù)食品酶由微生物例如芽孢桿菌屬、曲霉屬、鏈霉屬或克魯維酵母屬生產(chǎn)。本披露為在食品應(yīng)用中的這樣的用途提供了轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞，該真菌細(xì)胞已經(jīng)被證明具有改善的轉(zhuǎn)化體穩(wěn)定性，作為感興趣的工業(yè)酶、變體和混合物的生產(chǎn)者是合適和有益的。

在另一個(gè)實(shí)例中，由此制得的蛋白質(zhì)性組合物可以用于動(dòng)物飼料添加劑中。纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶和碳水化合物酶已經(jīng)廣泛用于動(dòng)物飼料工業(yè)。由于許多基于植物的飼料包含具有減少動(dòng)物生長(zhǎng)的抗?fàn)I養(yǎng)因子的物質(zhì)，所以添加到此類飼料中的酶通過降解纖維、蛋白質(zhì)、淀粉和植酸來改善這些抗?fàn)I養(yǎng)因子的可消化性，使它們更易被動(dòng)物消化，并且使得能夠使用更便宜和通常在本地生產(chǎn)的飼料，同時(shí)使肉、蛋或奶的生產(chǎn)力最大化。同時(shí)，添加到此類飼料中的酶還可以提供支持腸道健康和增強(qiáng)的動(dòng)物性能的益處。本披露為在動(dòng)物飼料應(yīng)用中的這樣的用途提供了轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞，該真菌細(xì)胞已經(jīng)被證明具有改善的轉(zhuǎn)化體穩(wěn)定性，作為感興趣的工業(yè)酶、變體和混合物的生產(chǎn)者是合適和有益的。

在又另外的實(shí)例中，由此制得的蛋白質(zhì)性組合物可以用于紡織品應(yīng)用中。酶已經(jīng)成為紡織品加工的一個(gè)不可分割的部分。在紡織品工業(yè)中存在兩個(gè)已確立起來的酶應(yīng)用。首先，酶(例如淀粉酶)通常用于預(yù)精整區(qū)域以用于退漿。第二，酶(例如纖維素酶)通常用于精整區(qū)域以用于軟化、生物石化和減少棉制品的起球傾向。其他酶例如像果膠酶、脂肪酶、蛋白酶、過氧化氫酶、木聚糖酶等也用于織物品加工。此外，有各種需要酶的應(yīng)用，包括牛仔布和非牛仔布的褪色、生物洗擦、生物磨光、羊毛精整、過氧化物去除、染料的脫色等(卡瓦科-保羅(cavaco-paulo)和古比茨(gubitz)，2003；舍利卡尼(chelikani)等人，2004；nalankilli，1998；申愛(shenai)，1990)。本披露為在紡織品應(yīng)用中的這樣的用途提供了轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞，該真菌細(xì)胞已經(jīng)被證明具有改善的轉(zhuǎn)化體穩(wěn)定性，作為感興趣的工業(yè)酶、變體和混合物的生產(chǎn)者是合適和有益的。

實(shí)例

根據(jù)以下實(shí)例可以進(jìn)一步理解本發(fā)明菌株、組合物和方法的方面，這些實(shí)例不應(yīng)被解釋為限制性的。材料和方法的修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。

本披露中使用的一些真菌(木霉屬)菌株和質(zhì)粒的概述(主要在本研究中構(gòu)建)顯示于下表1中：

實(shí)例1：使用remi進(jìn)行aclamy1表達(dá)

a.構(gòu)建aclamy1表達(dá)載體

1)ptrex3gm-aclamy1

此處用作模式感興趣的蛋白質(zhì)的酶aclamy1是指來源于棒曲霉(aspergillusclavatus)的酸穩(wěn)定的真菌α淀粉酶，該酶具有以下的氨基酸序列(其中信號(hào)序列為加粗斜體)(seqidno:1)：

mkllalttafallgkgvfgltpaewrgqsiyflitdrfartdgsttapcdlsqraycggswqgiikqldyiqgmgftaiwitpiteqipqdtaegsafhgywqkdiynvnshfgtaddiralskalhdrgmylmidvvanhmgyngpgastdfstftpfnsasyfhsycpinnyndqsqvencwlgdntvaladlytqhsdvrniwyswikeivgnysadglridtvkhvekdfwtgytqaagvytvgevldgdpaytcpyqgyvdgvlnypiyypllrafesssgsmgdlynminsvasdckdptvlgsfienhdnprfasytkdmsqakavisyvilsdgipiiysgqeqhysggndpynreaiwlsgysttselykfiattnkirqlaiskdssyltsrnnpfytdsntiamrkgsggsqvitvlsnsgsnggsytlnlgnsgyssganlvevytcssvtvgsdgkipvpmasglprvlvpaswmsgsglcgssstttlvtatttptgssssttlatavttptgscktattvpvvleesvrtsygenifisgsipqlgswnpdkavalsssqytssnplwavtldlpvgtsfeykflkkeqnggvawendpnrsytvpeacagtsqkvdsswr

aclamy1基因的核苷酸序列包含8個(gè)內(nèi)含子，該序列如下所示(seqidno:2)：

atgaagcttctagctttgacaactgccttcgccctgttgggcaaaggggtatttggtctaactccggccgaatggcggggccagtctatctacttcctgataacggaccggtttgctcgtacagatggctcaacaaccgctccatgtgatctcagccagagggttagtgatttcatcgtattctttgtcatgtgtcatgacgctgacgatttcaggcgtactgtggtggaagctggcagggtattatcaagcaagtaagcctactggtttccaattttgttgaattcctttctgactcggccagctcgattatatccaaggaatgggcttcactgctatttggatcacacccattacggagcaaatcccacaggataccgctgaaggatcagcattccacggctattggcagaaggatatgtgagtttccttataacattcactacgttttgctaatatagaacagttacaatgtcaactcccatttcggaaccgccgatgacattcgggcattgtccaaggcccttcacgacaggggaatgtacctgatgattgacgttgttgccaaccacatggtaggtgatatctcactgattgagttataccattcctactgacagcccgacctcaacaaaagggttacaatggacctggtgcctcgactgattttagcacctttaccccgttcaactctgcctcctacttccactcgtactgcccgatcaacaactataacgaccagtctcaggtagagaactgttggttgggagacaacactgtggctctggcagacctatacacccagcattcggatgtgcggaacatctggtacagctggatcaaagaaattgttggcaattactctggttagtaatccaatccaagtcccgtcccctggcgtctttcagaactaacagaaacagctgatggtctgcgtatcgacaccgtcaagcacgttgaaaaggatttctggactggctacacccaagctgctggtgtttataccgttggcgaggtattagatggggacccggcttatacctgcccctatcagggatatgtggacggtgtcctgaattatcccatgtgagttcaccctttcatatacagattgatgtactaaccaatcagctattatcccctcctgagagcgttcgaatcgtcgagtggtagcatgggtgatctttacaatatgatcaactctgtggcctcggattgtaaagaccccaccgtgctaggaagtttcattgagaaccatgacaatcctcgcttcgctaggtaggccaatactgacataggaaaggagaagaggctaactgttgcagctataccaaggatatgtcccaggccaaggctgttattagctatgtcatactatcggacggaatccccatcatctattctggacaggagcagcactactctggtggaaatgacccgtacaaccgcgaagctatctggttgtcgggttactctaccacctcagagctgtataaattcattgccaccacgaacaagatccgtcagctcgccatttcaaaggattcaagctatcttacttcacgagtatgtgttctggccagactcacactgcaatactaaccggtatagaacaatcccttctacactgatagcaacaccattgcaatgcgaaagggctccgggggctcgcaggtcatcactgtactttccaactctggttccaacggtggatcgtacacgctcaacttgggtaacagcggatactcgtctggagccaatctagtggaggtgtacacctgctcgtctgtcacggtcggttccgacggcaagatccccgtccccatggcatctggtcttccccgtgtccttgttccggcatcttggatgtccggaagtggattgtgcggcagctcttccaccactaccctcgtcaccgccaccacgactccaactggcagctcttccagcactaccctcgccaccgccgtcacgactccaactggtagctgcaaaactgcgacgaccgttccagtggtccttgaagagagcgtgagaacatcctacggcgagaacatcttcatctccggctccatccctcagctcggtagctggaacccggataaagcagtcgctctttcttccagccagtacacttcgtcgaatcctttgtgggccgtcactctcgacctccccgtgggaacttcgtttgaatacaaattcctcaagaaggagcagaatggtggcgtcgcttgggagaatgaccctaaccggtcttacactgttcccgaagcgtgtgccggtacctcccaaaaggtggacagctcttggaggtga

該蛋白質(zhì)具有67千道爾頓(kda)的計(jì)算質(zhì)量，并且與ec3.2.1.1類中的其他蛋白質(zhì)類似，能夠水解α-連接的較大多糖(例如淀粉)的α-鍵。如對(duì)pahbah(對(duì)羥基苯甲酸酰肼)作為底物測(cè)量的，最佳ph為4.5，而在ph3-7的寬范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)高酶活性。酶活性最佳的溫度為66℃。

設(shè)計(jì)了ptrex3gm-aclamy1載體以驅(qū)動(dòng)來自其天然編碼序列的aclamy1的表達(dá)，該aclamy1被置于強(qiáng)cbhi啟動(dòng)子的控制下。使用以下引物，采用pcr從棒曲霉染色體擴(kuò)增編碼aclamy1的aclamy1基因：

引物1(5’-ggggcggccgccaccatgaagcttctagctttgacaac-3’)(seqidno:3)；以及

引物2(5'-cccggcgcgccttatcacctccaagagctgtccac-3')(seqidno:4)。

用限制酶noti和asci消化之后，將pcr產(chǎn)物克隆到ptrex3gm表達(dá)載體中(如在美國(guó)公開申請(qǐng)2011/0136197a1中所述)，用相同的限制酶消化，并將所得的質(zhì)粒標(biāo)記為ptrex3gm-aclamy1。在圖1中提供了ptrex3gm-aclamy1的質(zhì)粒圖譜。在圖1中還提供了質(zhì)粒的功能元件的完整列表。

通過dna測(cè)序確認(rèn)aclamy1基因的序列。

2.pentry-aclamy1

為了構(gòu)建表達(dá)載體ptrex8gm-aclamyl1，根據(jù)供應(yīng)商(生命技術(shù)公司(lifetechnologies)，加利福尼亞州卡爾斯巴德(carlsbadca))的建議，經(jīng)由bp反應(yīng)，首先將棒曲霉(a.clavatus)amy1編碼片段從質(zhì)粒ptrex3gm-aclamy1(如上所述)重新克隆到pdonor221載體中。所得的pentry-aclamy1質(zhì)粒及其功能元件顯示于圖2中。

3.ptrex8gm-aclamy1

編碼棒曲霉α淀粉酶的entry載體dna片段經(jīng)由lr反應(yīng)進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到ptrex8gm中，產(chǎn)生質(zhì)粒ptrex8gm-aclamy1(圖3)。將ptrex8gm-aclamy1的功能元件列于圖3中。

通過對(duì)編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序來驗(yàn)證克隆。

b.異位表達(dá)的轉(zhuǎn)化

1.原生質(zhì)體制備

將木霉屬菌株的孢子接種到50ml的yeg培養(yǎng)基(5g/l酵母提取物，20g/l葡萄糖)中，并且在振搖培養(yǎng)箱(infors-ht公司，瑞士)中，在28℃下以180rpm的速度在250ml搖瓶中生長(zhǎng)過夜，移動(dòng)距離(throw)為50mm。在一些實(shí)驗(yàn)中，使用具有cbh1、cbh2、egl1和egl2基因缺失的里氏木霉菌株rl-p37的衍生物，在一些其他實(shí)驗(yàn)中，使用其他里氏木霉菌株。任何合適的木霉屬菌株將效勞于如本文披露的那些實(shí)驗(yàn)。

通過10min離心(3000g)收集發(fā)芽孢子，并用10ml的1.2mgso4、10mm磷酸鈉(ph5.8)洗滌兩次。將沉淀重新懸浮在補(bǔ)充有1.2g裂解酶(西格瑪公司(sigma)，密蘇里州圣路易斯(stlouismo))的40ml相同緩沖液中。

將其在振搖培養(yǎng)箱中于28℃下孵育，以100-200rpm的速度振搖直至形成原生質(zhì)體。

將懸浮液通過miracloth過濾以除去菌絲體，并且將等體積的0.6m山梨糖醇、0.1mtris-hcl(ph7.0)溫和地添加到原生質(zhì)體溶液的頂部。將其以4000rpm離心15min。

原生質(zhì)體發(fā)現(xiàn)于中間相中，然后將其小心收集并轉(zhuǎn)移到新管子中。根據(jù)需要重復(fù)該步驟，直到收集必需的原生質(zhì)體。將等體積的1.2m山梨糖醇、10mmcacl2、10mmtris-hcl(ph7.5)添加到原生質(zhì)體中。原生質(zhì)體以4000rpm、在4℃下沉淀15min，并且在1.2m山梨糖醇、10mmcacl2、10mmtris-hcl(ph7.5)中洗滌兩次。最后，將原生質(zhì)體重新懸浮在相同的緩沖液中至濃度為1x10⁸原生質(zhì)體/ml，并且每200μl原生質(zhì)體中添加50μl的25％peg6000、50mmcacl2、10mmtris-hcl(ph7.5)。然后將所得材料儲(chǔ)存在-80℃。

2.異位表達(dá)的轉(zhuǎn)化

在一些實(shí)驗(yàn)中，將pcr產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。將約5-20μg的dna(pcr產(chǎn)物)添加到200μl原生質(zhì)體中，并且在冰上孵育20min。之后，將轉(zhuǎn)化混合物轉(zhuǎn)移至室溫，并且添加2ml的25％peg6000、cacl2、10mmtris-hcl(ph7.5)和4ml的1.2m山梨糖醇、10mmcacl2、10mmtris-hcl(ph7.5)。

如果將限制酶介導(dǎo)的整合(remi)應(yīng)用于樣品，那么將20個(gè)單位的限制性內(nèi)切核酸酶添加到該樣品的dna中。

在一些其他實(shí)驗(yàn)中，將質(zhì)粒dna用于轉(zhuǎn)化木霉屬原生質(zhì)體，并且在一些情況下，使用限制性內(nèi)切核酸酶將質(zhì)粒dna線性化。在孵育消化混合物之后，質(zhì)粒dna未從限制性內(nèi)切核酸酶純化。

在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用以下引物獲得pcr片段，該pcr片段涵蓋來自質(zhì)粒ptrex8gm-aclamy1的從cbhi啟動(dòng)子穿過aclamy1編碼區(qū)至pyr2的3’部分的區(qū)域：

引物1：5’gagttgtgaagtcggtaatcccgctg(seqidno:5)；以及

引物2：3’cgatacacgcaccaggtaccccagtggggaagc(seqidno:6)。

不添加任何限制酶或者使用paci限制酶，使用pcbhi-aclamy1-pyr2pcr產(chǎn)物來轉(zhuǎn)化里氏木霉原生質(zhì)體。在補(bǔ)充有10mmnh4cl的amds培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體的尿苷原養(yǎng)型。為了制作該培養(yǎng)基，將2xamds溶液(30g/lkh2po4、20mm乙酰胺、1.2g/lmgso4*7h2o、1.2g/lcacl2*2h2o、0.48g/l檸檬酸*h2o、0.5g/lfeso4*7h2o、40mg/lznso4*7h2o、8mg/lcuso4.5h2o、3.5mg/lmnso4.h2o、2mg/lh3bo3(硼酸)、40g/l葡萄糖，ph4.5)與等體積的含有2m山梨糖醇的4％瓊脂混合。

木霉屬轉(zhuǎn)化的一個(gè)實(shí)例顯示于圖4a-4e中。圖4a、4c和4d顯示了在沒有remi的典型轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中里氏木霉轉(zhuǎn)化體的圖片和百分比—約10％-20％的轉(zhuǎn)化體在形態(tài)上是穩(wěn)定的。圖4b和4e顯示了在應(yīng)用remi的典型轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中里氏木霉轉(zhuǎn)化體的圖片和百分比-約80％-90％的轉(zhuǎn)化體在形態(tài)上是穩(wěn)定的

3.轉(zhuǎn)化體選擇

在葡萄糖/槐糖(sophorose)生產(chǎn)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后，用來自英國(guó)梅格澤姆公司(megazyme，uk)的α-淀粉酶活性試劑盒使用活性測(cè)定法分析發(fā)酵樣品中棒曲霉α淀粉酶的表達(dá)水平(“ceralpha方法”)。

平行地，通過sds-page分析(生命技術(shù)公司(lifetechnologies)，加利福尼亞州卡爾斯巴德(carlsbadca))來確認(rèn)表達(dá)。

c.木霉屬發(fā)酵和淀粉酶活性測(cè)定

將來自上述里氏木霉菌株rl-p37的衍生物的木霉屬轉(zhuǎn)化體接種在配置為從固體、多孔基質(zhì)釋放乳糖的24孔板中。每個(gè)孔含有1.25ml的nrel培養(yǎng)基(9g/l酪蛋白氨基酸、5g/l(nh4)2so4、4.5g/lkh2po4、1g/lmgso4*7h2o、1g/lcacl2*2h2o、33g/lpipps緩沖液(ph5.5)、0.25％里氏木霉微量元素(100％：175g/l檸檬酸(無水)、200g/lfeso4*7h2o、16g/lznso4*7h2o、3.2g/lcuso4.5h2o、1.4g/lmnso4.h2o、0.8g/lh3bo3(硼酸)、16g/l葡萄糖)。使用ceralpha方法(英國(guó)梅格澤姆公司(megazyme，uk))分析澄清的上清液的α-淀粉酶活性。

用對(duì)硝基苯基α-d-麥芽庚糖苷、加上過量的α-葡糖苷酶和葡糖淀粉酶阻斷ceralpha，用于測(cè)量谷物、真菌和細(xì)菌α-淀粉酶。將澄清的上清液在36mm乙酸鈉緩沖液(ph4.5)中稀釋100-500倍(這取決于預(yù)期的α-淀粉酶活性)。

可替代地，將澄清的上清液在10mmnacl、0.1mmcacl2、0.005％吐溫80的溶液中稀釋100-500倍(這將再次取決于預(yù)期的α-淀粉酶活性)。將四十(40)μl稀釋的澄清的上清液與等體積的ceralpha底物混合，并在28℃下孵育10min。通過添加100μl的200mm硼酸鈉溶液(ph10.2)來停止反應(yīng)。在405nm下測(cè)量吸光度并將其針對(duì)稀釋因子進(jìn)行校正，并且表示為每分鐘的α-淀粉酶活性。通過sds-page(生命技術(shù)公司(lifetechnologies)，加利福尼亞州卡爾斯巴德(carlsbadca))分析澄清的上清液。

圖5顯示了α-淀粉酶生產(chǎn)水平的差異。在活性paci酶的存在下獲得的穩(wěn)定的木霉屬irnaxyn1,3轉(zhuǎn)化體顯示出更高的絕對(duì)α-淀粉酶活性水平和更高數(shù)量的具有升高的α-淀粉酶表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。remi增加了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比(與不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體相比)，并且穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體也產(chǎn)生更高的α-淀粉酶滴度。

在限制酶sspi的存在下，使用另一種質(zhì)粒ptrex8gmagl2(表達(dá)α-半乳糖苷酶)，用里氏木霉irnaxyn1,3的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了這些結(jié)果。

一旦添加限制酶，不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的背景就顯著地下降，并且穩(wěn)定的α-半乳糖苷酶產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體的百分比增加。

實(shí)例2：使用i-scei來改善在里氏木霉中的靶向整合

a.構(gòu)建報(bào)告菌株來測(cè)量在里氏木霉中的i-scei活性

1.構(gòu)建i-scei著陸位點(diǎn)盒：方法

具有i-scei著陸位點(diǎn)的質(zhì)粒pbjp6被設(shè)計(jì)和構(gòu)建如下，并且如圖6所示。

分別使用引物gsp1和gsp2、pp1和pp2、gsp3和gsp4(表2)和本文下面的列表，從里氏木霉菌株qm6a的基因組dna(可公開獲得自各種來源，包括但不限于http://www.uniprot.org/taxonomy/431241)擴(kuò)增5’utrcbh2、pcbh1和tcbh2。使用phusiondna聚合酶(富酶泰斯公司(fermentas))將pcr片段融合，并克隆到pbluescriptsk(+)的xbai和kpni限制位點(diǎn)以產(chǎn)生質(zhì)粒pbjp4(圖6)。

另外，構(gòu)建另一個(gè)質(zhì)粒pgfprep以攜帶具有600-bp重疊的gfp序列(陰影線條區(qū))的編碼c末端截短的gfp(gfpn*或gfpδc)的dna片段(gfpn*-gfpc*構(gòu)建體)和編碼n-末端截短的gfp(gfpc*或δngfp)的dna片段。gfpn*-gfpc*構(gòu)建體基于ptilosarcus屬物種的gfp序列設(shè)計(jì)，并從德國(guó)的geneart公司合成訂購(gòu)。然后將gfpn*-gfpc*構(gòu)建體克隆到在cbhi啟動(dòng)子和cbhi終止子之間的pbjp4的ndei限制位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pbjp5。最終的pbjp6質(zhì)粒通過用兩個(gè)引物(fwpgan-isceipmei和revpgan-isceipmei)從質(zhì)粒擴(kuò)增構(gòu)巢曲霉的pyrg標(biāo)記、并且將其克隆到pbjp5的pmei位點(diǎn)(在gfpn*-gfpc*構(gòu)建體的兩個(gè)600-bp重疊的gfp序列之間)來獲得。將引物設(shè)計(jì)為在pcr擴(kuò)增期間在pyrg標(biāo)記的下游和上游摻入i-scei限制性位點(diǎn)和pmei位點(diǎn)，產(chǎn)生攜帶側(cè)翼有兩個(gè)i-scei位點(diǎn)的pyrg標(biāo)記的pcr擴(kuò)增片段。所得的質(zhì)粒pbjp6含有如圖6所示的5’utrcbh2-pcbh1-gfpn*-i-scei-pyrg-i-scei-gfpc*-tcbh2構(gòu)建體。通過限制性分析和測(cè)序來確認(rèn)pbjp6質(zhì)粒的序列。

在本實(shí)例中使用的引物序列提供如下并且還如表2所示。

gsp1(正向)5’-tctagaggctgtgcatttccgttctc-3’(seqidno:7)

gsp2(反向)5’-tggttacggcaacaaacctg-3’(seqidno:8)

pp1(正向)

5’-caggtttgttgccgtaaccaatttgcctgcttgaccgactg-3’(seqidno:9)

pp2(反向)

5’-ggaacgatgggtttgcgtccatatggggtaagtcacttacggcagc-3’(seqidno:10)

gsp3(正向)5’-ccatatggacgcaaacccatcgttcc-3’(seqidno:11)

gsp4(反向)5’-ggtaccggttcaccgccttatgtgag-3’(seqidno:12)

fwpgan-isceipmel(正向)

5’-ggtttaaacctagggataacagggtaattcgcccttgctctagataac-3’(seqidno:13)

revpgan-iscelpmel(反向)

5’-ggtttaaacctagggataacagggtaataattcgcccttgactagtgc-3’(seqidno:14)

gsp5(正向)5’-gcgatcgcacgcaaacccatcgttcc-3’(seqidno:15)

gps6(反向)5’-gcgatcgcggttcaccgccttatgtgag-3’(seqidno:16)

表2.在實(shí)例2中使用的引物。

2.設(shè)計(jì)標(biāo)記切除方法來監(jiān)測(cè)i-scei活性：機(jī)制

為了監(jiān)測(cè)里氏木霉中的大范圍核酸酶i-scei的活性，使用報(bào)告構(gòu)建體pbjp6，并且在圖8中描繪測(cè)定的方法。

如圖7的頂部圖解所描繪的，pbjp6包含5’utrcbh2-pcbh1-gfpn*-i-scei-pyrg-i-scei-gfpc*-tcbh2構(gòu)建體。包含5’utrcbh2和tcbh2，用于宿主細(xì)胞中cbh2基因座處的靶向整合。使用在選擇標(biāo)記pyrg側(cè)翼的兩個(gè)i-scei識(shí)別位點(diǎn)(上面描繪有剪刀的灰色框)來監(jiān)測(cè)i-scei的活性。

該策略的基本原理是在含有g(shù)fpn*-i-scei-pyrg-i-scei-gfpc*構(gòu)建體的里氏木霉菌株中活性i-scei的表達(dá)將導(dǎo)致pyrg標(biāo)記的切除和由gfp重復(fù)序列引起的雙鏈斷裂的修復(fù)(用陰影線框表示)。經(jīng)由重復(fù)，完美修復(fù)將導(dǎo)致表達(dá)gfp的尿苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株(pyrg-)(描繪于圖7中)。

3.構(gòu)建在cbh2基因座處具有i-scei限制位點(diǎn)的里氏木霉菌株：結(jié)果

用引物gsp1和gsp4(在圖6中所示的引物位置)pcr擴(kuò)增pbjp6，并且將如上所述用于監(jiān)測(cè)i-scei活性的7.5kbpcr產(chǎn)物/盒(5’utrcbh2-pcbh1-gfpn*-i-scei-pyrg-i-scei-gfpc*-tcbh2構(gòu)建體)通過peg介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到里氏木霉菌株p37δcbhipyrg^-26。

將尿苷原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化體純化并通過dna印跡分析其中整個(gè)盒整合在cbh2基因座處的轉(zhuǎn)化體?；诔醪皆\斷pcr(結(jié)果未顯示)，選擇9個(gè)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行dna印跡分析。三(3)個(gè)不同的探針用來選擇單拷貝轉(zhuǎn)化體并確認(rèn)在cbh2基因座處將完整盒適當(dāng)?shù)卣系交蚪M中。

dna印跡分析揭示了3個(gè)轉(zhuǎn)化體，它們?cè)赾bh2基因座處具有單拷貝的完整i-scei盒(jp7.7、jp7.9和jp7.12)(圖8)。

剩余的6個(gè)轉(zhuǎn)化體中，5個(gè)被顯示為具有多個(gè)拷貝的整合的盒(jp7.10、jp7.11、jp7.13、jp7.14、jp7.15)，或看起來不具有整合到基因組中的完整盒(jp7.8)。

將轉(zhuǎn)化體jp7.7用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

b.構(gòu)建i-scei表達(dá)構(gòu)建體

1.i-scei表達(dá)載體的構(gòu)建

創(chuàng)建了i-scei序列(基因庫(kù)登記號(hào)gu575293.1)的密碼子優(yōu)化的合成基因，用于在里氏木霉中的表達(dá)(geneart公司，德國(guó))。合成的i-scei核苷酸序列如下面所示(seqidno:17)：

atgaagaacatcaagaagaaccaggtcatgaacctcggccccaacagcaagctcctcaaggagtacaagagccagctcatcgagctcaacatcgagcagttcgaggccggcatcggcctcatcctcggcgacgcctacatccgcagccgcgacgagggcaagacctactgcatgcagttcgagtggaagaacaaggcctacatggaccacgtctgcctcctctacgaccagtgggtcctcagccccccccacaagaaggagcgcgtcaaccacctcggcaacctcgtcatcacctggggcgcccagaccttcaagcaccaggccttcaacaagctcgccaacctcttcatcgtcaacaacaagaagaccatccccaacaacctcgtcgagaactacctcacccccatgagcctcgcctactggttcatggacgacggcggcaagtgggactacaacaagaacagcaccaacaagagcatcgtcctcaacacccagagcttcaccttcgaggaggtcgagtacctcgtcaagggcctccgcaacaagttccagctcaactgctacgtcaagatcaacaagaacaagcccatcatctacatcgacagcatgagctacctcatcttctacaacctcatcaagccctacctcatcccccagatgatgtacaagctccccaacaccatcagcagcgagaccttcctcaagtaa

為了構(gòu)建i-scei表達(dá)載體，根據(jù)供應(yīng)商(美國(guó)生命技術(shù)公司(lifetechnologies，usa))的建議，經(jīng)由gateway重組將i-scei基因克隆到已公開的專利申請(qǐng)us20110020899中示例的端粒質(zhì)粒pttt中。使用cbhi基因的乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來誘導(dǎo)pttt質(zhì)粒中i-scei基因的表達(dá)。另外，pttt質(zhì)粒攜帶構(gòu)巢曲霉的amds選擇標(biāo)記，該標(biāo)記允許使用乙酰胺作為氮源在里氏木霉中轉(zhuǎn)化和選擇

在所得的表達(dá)盒pttt-i-scei(圖16)中，cbhi基因的乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)i-scei基因的表達(dá)。另外，pttt質(zhì)粒攜帶構(gòu)巢曲霉的amds選擇標(biāo)記，該標(biāo)記允許使用乙酰胺作為氮源在里氏木霉中轉(zhuǎn)化和選擇。

2.里氏木霉中的i-scei表達(dá)誘導(dǎo)在靶向染色體基因座處的dsb

將pttt-i-scei構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化含有著陸i-scei位點(diǎn)的菌株以及不含著陸i-scei位點(diǎn)的陰性對(duì)照菌株。轉(zhuǎn)化后，將amds陽性轉(zhuǎn)化體在含有葡萄糖和乙酰胺作為氮源的基本培養(yǎng)基上純化，并點(diǎn)接種于含有2％葡萄糖(非誘導(dǎo)條件)或2％乳糖(誘導(dǎo)條件)作為碳源的9cm培養(yǎng)皿中間。轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示于圖9中。

如在圖9中所示，在表達(dá)i-scei并含有i-scei盒的菌株中通過乳糖誘導(dǎo)產(chǎn)生顯示扇形形成的菌落。這些扇形用箭頭示出，指向沒有生長(zhǎng)的區(qū)域。該扇區(qū)被解釋為i-scei活性產(chǎn)生雙鏈斷裂，該雙鏈斷裂經(jīng)由gfp重復(fù)序列修復(fù)，該gfp重復(fù)序列導(dǎo)致pyrg標(biāo)記的丟失。

作為丟失了pyrg標(biāo)記的結(jié)果，這部分菌落將不再在沒有尿苷的平板上生長(zhǎng)，產(chǎn)生了扇形。如圖9中所示，當(dāng)乳糖用作碳源時(shí)，這些扇形大多存在，盡管在葡萄糖平板上也觀察到扇形，表明即使在葡萄糖上也表達(dá)了一些i-scei。

對(duì)于表達(dá)pttt-iscei的轉(zhuǎn)化體但不是對(duì)照菌株觀察到在乳糖上的扇區(qū)(圖9)。當(dāng)將尿苷添加到乳糖平板中時(shí)，不再有可見扇區(qū)，表明由于丟失pyrg標(biāo)記引起了扇形(圖9)。轉(zhuǎn)化體在乳糖平板上的扇區(qū)表明釀酒酵母i-scei在里氏木霉中表達(dá)并且有活性。

還在液體培養(yǎng)物中監(jiān)測(cè)了重組。轉(zhuǎn)化體在具有尿苷的基本培養(yǎng)基中的液體培養(yǎng)物中生長(zhǎng)，并且由槐糖誘導(dǎo)i-scei表達(dá)。所得轉(zhuǎn)化體的顯微鏡觀察顯示于圖10中。菌絲的熒光顯微鏡顯示gfp熒光，表明作為環(huán)出的結(jié)果的功能性gfp的重構(gòu)。在誘導(dǎo)后僅在含有i-scei表達(dá)盒(jp7.7.12、jp7.7.14和jp7.7.16)的菌株中觀察到gfp，結(jié)果進(jìn)一步表明i-scei在誘導(dǎo)時(shí)被積極表達(dá)(圖10)。

c.葡糖淀粉酶的改善的轉(zhuǎn)化和靶向整合效率

1.用于靶向整合的葡糖淀粉酶表達(dá)盒的構(gòu)建

將如在美國(guó)專利號(hào)us8138321中所述的、攜帶在cbhi啟動(dòng)子的控制下的里氏木霉的野生型葡糖淀粉酶基因的質(zhì)粒ptrex6gga/wt作為起始點(diǎn)，以構(gòu)建可以整合在i-scei著陸位點(diǎn)處的葡糖淀粉酶表達(dá)盒。

為了允許葡糖淀粉酶盒在i-scei著陸位點(diǎn)處的同源整合，將cbh2終止子區(qū)(tcbh2)克隆到ptrex6gga/wt中(圖11)。使用引物gsp5和gsp6(如表2中提供的)和qm6a的基因組dna作為模板，通過pcr獲得tcbh2。

將pcr產(chǎn)物用asisi消化，并克隆到ptrex6gga/wt的相同限制位點(diǎn)，以給出質(zhì)粒pjp8。10-kb葡糖淀粉酶表達(dá)盒用psii從pjp8切出，并用于轉(zhuǎn)化。經(jīng)由賦予氯嘧磺隆乙酯抗性的als標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)化體。

2.在i-scei表達(dá)下靶向整合的轉(zhuǎn)化頻率、穩(wěn)定性和效率

為了確定由i-scei介導(dǎo)的dsb(雙鏈斷裂)是否可以增加在里氏木霉中的轉(zhuǎn)化和重組效率，轉(zhuǎn)化葡糖淀粉酶表達(dá)盒，用于作為線性片段靶向整合到攜帶i-scei限制位點(diǎn)和i-scei表達(dá)盒(jp7.7.12)的菌株中。

將轉(zhuǎn)化體涂板在選擇培養(yǎng)基中，該選擇培養(yǎng)基含有氯嘧磺隆乙酯底物并含有葡萄糖(i-scei非誘導(dǎo)條件)或含有乳糖和葡萄糖(i-scei誘導(dǎo)條件)的混合物。作為陰性對(duì)照，還用相同量的線性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化僅攜帶i-scei限制位點(diǎn)而不攜帶i-scei表達(dá)盒(jp7.7)的菌株。接下來，分析在每組轉(zhuǎn)化中獲得的轉(zhuǎn)化體的穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)化結(jié)果和穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示于表3和圖12中。

表3.i-scei誘導(dǎo)對(duì)轉(zhuǎn)化體數(shù)目和穩(wěn)定性的影響

^a在分別稱為i-scei的誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)型表達(dá)的含有1％乳糖和1％葡萄糖的轉(zhuǎn)化平板(trmmsorb+尿苷+氯嘧磺隆乙酯)上的初級(jí)轉(zhuǎn)化體的數(shù)量。使用親本菌株jp7.7使用轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)照轉(zhuǎn)化。

^b在trmm+尿苷+氯嘧磺隆乙酯上純化初級(jí)轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體的穩(wěn)定性是由它們?cè)陔p重純化后在選擇性trmm中生長(zhǎng)的能力來定義的。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體在這些選擇平板上生長(zhǎng)良好。失敗的轉(zhuǎn)化體(不穩(wěn)定的)不生長(zhǎng)。

^c在基于微量滴定的生長(zhǎng)/活性測(cè)定中測(cè)試穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的葡糖淀粉酶活性。顯示高于背景的gla活性的轉(zhuǎn)化體被認(rèn)為是gla陽性轉(zhuǎn)化體。

^d通過在具有尿苷的trmm上或不含尿苷的trmm上接種每種轉(zhuǎn)化體的孢子來測(cè)試gla陽性轉(zhuǎn)化體的pyrg表型。當(dāng)在trmm+尿苷上生長(zhǎng)，但是在沒有尿苷的trmm上不生長(zhǎng)時(shí)，菌株被認(rèn)為是pyrg減(尿苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型)。

^eglaa表達(dá)和pyrg減菌株通過dna印跡進(jìn)行分析，并確認(rèn)了指示glaa表達(dá)盒在i-scei著陸位點(diǎn)處同源整合的整合模式。

在表3和圖12中的結(jié)果顯示，分別與非誘導(dǎo)條件和對(duì)照相比，i-scei誘導(dǎo)增加轉(zhuǎn)化體的數(shù)量超過三倍和六倍(表3)。另外，在i-scei誘導(dǎo)后幾乎所有的jp7.7.12轉(zhuǎn)化體都是穩(wěn)定的(90％)，而沒有i-scei誘導(dǎo)的情況下只有44％的jp7.7.12轉(zhuǎn)化體是穩(wěn)定的，并且只有53％或58％的陰性對(duì)照菌株jp7.7的轉(zhuǎn)化體(無i-scei表達(dá)盒)是穩(wěn)定的(表3)。這表明i-scei的表達(dá)增加了轉(zhuǎn)化效率，并還增加了轉(zhuǎn)化體的穩(wěn)定性。

通過在如上述實(shí)例中描述的24孔從多孔基質(zhì)中緩慢釋放乳糖的mtp中的nrel培養(yǎng)基上生長(zhǎng)純化的轉(zhuǎn)化體，從每組中篩選約40個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。在i-scei誘導(dǎo)條件下約55％的轉(zhuǎn)化體表達(dá)葡糖淀粉酶，而與之相對(duì)，非誘導(dǎo)i-scei條件和對(duì)照下分別為37％和30％。

隨后分析了表達(dá)葡糖淀粉酶的轉(zhuǎn)化體的pyrg表型。經(jīng)由雙交叉，葡糖淀粉酶表達(dá)盒在預(yù)期的基因座處的靶向整合預(yù)期將導(dǎo)致氯嘧磺隆乙酯抗性(als+)和pyrg標(biāo)記的損失，產(chǎn)生尿苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型(圖11)。

如表3中所示，當(dāng)i-scei被誘導(dǎo)時(shí)，68％的表達(dá)葡糖淀粉酶的轉(zhuǎn)化體以靶向方式整合，與之相對(duì)，在非誘導(dǎo)的i-scei和對(duì)照中分別僅為46％和16％。

所選擇的表達(dá)葡糖淀粉酶的pyrg減轉(zhuǎn)化體的dna印跡分析顯示它們?nèi)缢A(yù)期地，在i-scei著陸位點(diǎn)處含有g(shù)laa表達(dá)盒(圖13)。不表達(dá)葡糖淀粉酶或表達(dá)葡糖淀粉酶而不是pyrg減的菌株顯示出改變的整合模式(圖13)。

3.在靶向與非靶向整合之間葡糖淀粉酶表達(dá)的比較

為了將具有靶向整合的葡糖淀粉酶表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化體的葡糖淀粉酶活性的變異性與來源于隨機(jī)整合的那些進(jìn)行比較，將菌株在微量滴定板中生長(zhǎng)，并測(cè)試培養(yǎng)基的葡糖淀粉酶活性。

將每種轉(zhuǎn)化體在三個(gè)微量滴定板孔中單獨(dú)生長(zhǎng)，并測(cè)定該生物一式三份的平均葡糖淀粉酶活性，并且給出高度可重復(fù)的結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)偏差<10％。

如在圖14中所示，與葡糖淀粉酶盒的非靶向整合的表達(dá)相比，具有葡糖淀粉酶盒的靶向整合的轉(zhuǎn)化體顯示了更少的葡糖淀粉酶表達(dá)的變異性(在0.9和1.35之間的相對(duì)單位的葡糖淀粉酶活性)(圖14)。顯然，表達(dá)盒的非靶向整合產(chǎn)生了轉(zhuǎn)化體之間ga活性水平的顯著變化。

總之，該數(shù)據(jù)表明由i-scei產(chǎn)生的雙鏈斷裂刺激了含有感興趣的基因的盒的靶向整合，并增加了轉(zhuǎn)化體之間蛋白質(zhì)表達(dá)的均一性。

d.通過將i-scei直接添加到原生質(zhì)體混合物中產(chǎn)生dsb之后，葡糖淀粉酶表達(dá)盒的改善的轉(zhuǎn)化和靶向整合

1.經(jīng)由i-scei添加的靶向整合

還已經(jīng)通過將i-scei限制酶直接添加到攜帶i-scei限制位點(diǎn)的原生質(zhì)體(jp7.7)與線性化葡糖淀粉酶靶向整合的盒(pjp8)的混合物中來測(cè)試由i-scei介導(dǎo)的靶向整合。

簡(jiǎn)言之，向200μl的jp7.7原生質(zhì)體中添加不同量的i-scei酶加線性化pjp8盒，并在室溫下孵育15分鐘，接著在冰上孵育20分鐘。從賽默科技公司(thermoscientific)獲得i-scei。通過向原生質(zhì)體添加i-scei和dna混合物、1x終濃度的酶緩沖液(例如，采用270μl總體積的原始質(zhì)體、i-scei和dna混合物，添加30μl的10x酶緩沖液)，通過peg介導(dǎo)的原生質(zhì)體方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在孵育35min后，將原生質(zhì)體混合物涂板在含有10μm尿苷和5μg/ml氯嘧磺隆乙酯的轉(zhuǎn)化平板上。結(jié)果總結(jié)在表4中：

表4.i-scei添加對(duì)轉(zhuǎn)化效率和靶向整合的影響。

^a轉(zhuǎn)化平板(trmmsorb+尿苷+氯嘧磺隆乙酯)上的初級(jí)轉(zhuǎn)化體的數(shù)量。顯示了對(duì)于相同的原生質(zhì)體批次，能夠比較效率的初級(jí)轉(zhuǎn)化體的數(shù)量。顯示典型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

^b在trmm+尿苷+氯嘧磺隆乙酯上純化初級(jí)轉(zhuǎn)化體。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體在這些平板上生長(zhǎng)良好。

失敗的轉(zhuǎn)化體(不穩(wěn)定的)不生長(zhǎng)。

^c在基于微量滴定的生長(zhǎng)/活性測(cè)定中測(cè)試穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的葡糖淀粉酶活性。

顯示高于背景的gla活性的轉(zhuǎn)化體被認(rèn)為是gla陽性轉(zhuǎn)化體。

^d通過在具有尿苷的trmm上或不含尿苷的trmm上接種每種轉(zhuǎn)化體的孢子來測(cè)試gla陽性轉(zhuǎn)化體的pyrg表型。當(dāng)在trmm+尿苷上生長(zhǎng)，但是在沒有尿苷的trmm上不生長(zhǎng)時(shí)，菌株被認(rèn)為是pyrg減(尿苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型)。

^eglaa表達(dá)和pyrg減菌株通過dna印跡進(jìn)行分析，并確認(rèn)了指示glaa表達(dá)盒在i-scei著陸位點(diǎn)處同源整合的整合模式。

^f將轉(zhuǎn)化體直接涂板在含有尿苷、氯嘧磺隆乙酯培養(yǎng)基和0.8mg/ml5’氟-乳清酸(5’foa)的trmm-sorb上。在含有尿苷和als底物培養(yǎng)基的trmm上將菌落純化一次。

如表4所示，i-scei酶的直接添加增加了轉(zhuǎn)化頻率和靶向整合轉(zhuǎn)化體的數(shù)量。當(dāng)將100個(gè)單位的i-scei添加到原生質(zhì)體中時(shí)，獲得的轉(zhuǎn)化體數(shù)量增加了3倍。

當(dāng)添加i-scei時(shí)，發(fā)現(xiàn)大量的初級(jí)轉(zhuǎn)化體是穩(wěn)定的。

轉(zhuǎn)化體的數(shù)量和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的百分比兩者隨著i-scei濃度的增加而增加。在i-scei存在下，約75％的轉(zhuǎn)化體含有g(shù)la表達(dá)盒，而在i-scei不存在下，只有約25％的轉(zhuǎn)化體顯示葡糖淀粉酶活性。

在表達(dá)葡糖淀粉酶的大多數(shù)轉(zhuǎn)化體中，表達(dá)盒經(jīng)由同源重組事件整合(當(dāng)分別添加50個(gè)單位和100個(gè)單位的i-scei時(shí)分析了78％和85％的轉(zhuǎn)化體)。來自對(duì)照轉(zhuǎn)化(不添加i-scei)的表達(dá)葡糖淀粉酶的轉(zhuǎn)化體都不是靶向整合的(表4)。

通過在轉(zhuǎn)化平板中將i-scei添加與0.8mg/ml的foa組合，我們能夠直接選擇靶向的整合轉(zhuǎn)化體(表4)。在foa抗性轉(zhuǎn)化體純化之后，所有測(cè)試的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體表達(dá)葡糖淀粉酶，并且葡糖淀粉酶表達(dá)盒經(jīng)由同源重組在cbh2基因座處適當(dāng)整合(圖9)。

2.使用i-scei表達(dá)比較靶向與非靶向整合，葡糖淀粉酶表達(dá)的遺傳特征和比較

為了將具有靶向整合的葡糖淀粉酶表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化體的葡糖淀粉酶活性的變異性與來源于隨機(jī)整合的那些進(jìn)行比較，將菌株在微量滴定板中生長(zhǎng)，并測(cè)試培養(yǎng)基的葡糖淀粉酶活性。

如圖15所示，與隨機(jī)轉(zhuǎn)化體的表達(dá)相比，從添加i-scei獲得的具有葡糖淀粉酶盒的靶向整合的轉(zhuǎn)化體直接顯示更少的葡糖淀粉酶表達(dá)的變異性。通過使用foa選擇獲得的轉(zhuǎn)化體也顯示出相似的表達(dá)模式，表明foa的選擇和foa的可能突變效應(yīng)不影響葡糖淀粉酶的表達(dá)水平。

實(shí)例3：使用remi構(gòu)建其他穩(wěn)定的里氏木霉菌株

a.具有兩個(gè)不同dna片段的里氏木霉的轉(zhuǎn)化

構(gòu)建兩個(gè)不同的線性dna片段以表達(dá)另一種感興趣的蛋白質(zhì)，并通過共轉(zhuǎn)化將這些dna片段引入里氏木霉中。一個(gè)片段具有pyr2基因作為可選擇標(biāo)記，另一個(gè)片段具有amds基因作為可選擇標(biāo)記。不用任何限制酶或用限制酶swai或paci進(jìn)行轉(zhuǎn)化。由于兩種標(biāo)記的存在，同時(shí)選擇轉(zhuǎn)化體。進(jìn)行幾個(gè)轉(zhuǎn)化以確定與不添加限制酶相比在轉(zhuǎn)化期間包含多個(gè)量的不同限制酶的影響。以下是顯示獲得的轉(zhuǎn)化體的數(shù)量和穩(wěn)定的％的結(jié)果的總結(jié)。

表5.用兩種不同線性dna片段進(jìn)行里氏木霉共轉(zhuǎn)化的結(jié)果。

b.用多種限制酶處理的里氏木霉的轉(zhuǎn)化

為了看到使用多種限制酶對(duì)轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化體的穩(wěn)定性的影響，用含有裂解纖維素單加氧酶(eg4)編碼序列和pyr2可選擇標(biāo)記的pcr片段轉(zhuǎn)化里氏木霉菌株，該菌株未用任何限制酶處理、僅用20個(gè)單位的asisi處理、用asisi、paci和swai中每一種的7個(gè)單位處理、或者用asisi、paci和pmei中每一種的7個(gè)單位處理。根據(jù)如在上文所述的標(biāo)準(zhǔn)peg方案進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并將轉(zhuǎn)化體在含有1m山梨糖醇的基本培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)。結(jié)果顯示于圖17a和17b中。通過相同總量的限制酶消化，與僅用一種限制酶(50％)消化相比，用三種不同酶消化增加了穩(wěn)定的里氏木霉轉(zhuǎn)化體的百分比(至80％)，盡管它似乎降低轉(zhuǎn)化效率。

雖然前述組合物和方法已經(jīng)通過說明和實(shí)例的方式出于清楚理解的目的在一些細(xì)節(jié)方面進(jìn)行了描述，但是對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言根據(jù)本文的傳授內(nèi)容顯而易見的是可以對(duì)其進(jìn)行某些改變和修改而不偏離所附權(quán)利要求的精神或范圍。

因此，前面僅僅舉例說明了本發(fā)明組合物和方法的原理。將了解的是本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠設(shè)計(jì)不同的安排，這些不同的安排雖然沒有在此明確地描述或顯示，但體現(xiàn)本發(fā)明組合物和方法的原理并且被包括在其精神和范圍之內(nèi)。此外，本文敘述的所有實(shí)例和條件性語言主要旨在幫助讀者理解諸位發(fā)明人所貢獻(xiàn)的本發(fā)明的組合物和方法的原理和概念以推動(dòng)本領(lǐng)域發(fā)展，并且將被視為而不限于這些具體敘述的實(shí)例和條件。此外，本文中敘述本發(fā)明組合物和方法的原理、方面、以及實(shí)施例的所有陳述連同其具體實(shí)例旨在涵蓋其結(jié)構(gòu)和功能等效物兩者。另外，預(yù)期此類等效物包括當(dāng)前已知的等效物以及將來開發(fā)的等效物兩者，即不論結(jié)構(gòu)如何而執(zhí)行相同功能的任何開發(fā)的要素。因此，本發(fā)明的組合物和方法的范圍不是旨在受限于本文顯示和描述的示例性實(shí)施例。

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