本發(fā)明涉及car表達載體、導入了car表達載體的car表達t細胞、含有car表達t細胞的抗癌劑。

背景技術(shù)：

嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor，以下也稱為“car”)是將識別癌細胞的細胞表面抗原的單鏈抗體與誘導t細胞活化的信號轉(zhuǎn)導區(qū)融合而得到的人工嵌合蛋白質(zhì)。如圖1所示，通過向不具有腫瘤反應性的通常的末梢血t細胞(末梢血t淋巴細胞)導入編碼car的基因，從而得以能夠大量地制備能夠表達car的car表達t細胞(以下，也簡稱為“car-t細胞”)。該car-t細胞具有腫瘤反應性，能夠不依賴與主要組織相容性基因復合體(mhc)的相互作用而導致癌細胞的損傷。

利用car-t細胞的施予的癌癥免疫療法(更具體而言、從患者采集t細胞、將編碼car的基因?qū)胨鰐細胞進行擴增、然后再次植入患者的療法(參見非專利文獻1))，目前正在全世界開展臨床試驗，在白血病、淋巴瘤等造血系統(tǒng)惡性腫瘤等中得到了呈現(xiàn)有效性的結(jié)果。

近年來，進行了各種car-t細胞的研究。例如，提出了：含有經(jīng)修飾的自體人t細胞的醫(yī)藥組合物，所述自體人t細胞含有編碼由cd19抗原結(jié)合區(qū)、跨細胞膜區(qū)、4-1bb共同刺激信號區(qū)、和cd3ζ信號區(qū)組成的car的核酸(參見專利文獻1)；表達1種或多種在治療上有效的抗標簽(tag)嵌合抗原受體(at-car)的t細胞群，其和能與癌細胞結(jié)合并且?guī)в?個或多個標簽的蛋白質(zhì)的配合物同時或分別地施予至受試體，并與所述帶有標簽的蛋白質(zhì)結(jié)合，誘導癌細胞死亡(參見專利文獻2)；含有編碼包含人抗體139的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、細胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨細胞膜結(jié)構(gòu)域、及細胞內(nèi)t細胞信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的核酸的細胞(參見專利文獻3)；含有編碼嵌合抗原受體的核酸序列的細胞，其中，所述該嵌合抗原受體包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨細胞膜結(jié)構(gòu)域、共同刺激信號轉(zhuǎn)導區(qū)及含有seqidno：24的氨基酸序列的cd3ζ信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域(參見專利文獻4)；由基因工程制備的cd19特異性t細胞，其中，在細胞表面膜上表達及保有cd19特異性嵌合受體，所述嵌合受體由用于實現(xiàn)免疫細胞的效應器功能的細胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域、至少1個跨細胞膜結(jié)構(gòu)域及至少1個細胞外結(jié)構(gòu)域組成，細胞外結(jié)構(gòu)域包含cd19特異性受體(參見專利文獻5)；導入了編碼嵌合抗原受體的核酸的嵌合抗原受體表達細胞，所述嵌合抗原受體含有糖皮質(zhì)激素誘導的腫瘤壞死因子受體(gitr)的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域作為細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(參見專利文獻6)。

然而，迄今為止的技術(shù)中，下述問題尚未解決：car-t細胞在生物體內(nèi)的存活效率較低，或者由car-t細胞誘導的內(nèi)源性t細胞的活化、向腫瘤局部的蓄積不充分的問題；car-t細胞的活性被經(jīng)由pd-l1/pd-1途徑(其為癌細胞具有的腫瘤免疫逃逸機制)的免疫抑制信號及癌癥微環(huán)境中分泌的tgf-β、il-10等免疫抑制因子抑制的問題。因此，存在無法呈現(xiàn)充分的治療效果的癌癥種類、病例，需要制備更有效的car-t細胞、及用于制備所述car-t細胞的表達載體。

現(xiàn)有技術(shù)文獻

專利文獻

專利文獻1：美國專利申請公開第2014/0106449號說明書

專利文獻2：日本特表2014-504294號公報

專利文獻3：日本特表2014-516510號公報

專利文獻4：日本特表2014-507118號公報

專利文獻5：日本特開2011-004749號公報

專利文獻6：國際公開第2013/051718號小冊子

非專利文獻

非專利文獻1：中澤洋三信州醫(yī)志(日文：中沢洋三信州醫(yī)誌)61(4)：197～203(2013)

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在以往的car-t細胞中，實施了通過使car的信號轉(zhuǎn)導區(qū)中含有cd28、4-1bb、cd3ζ等來提高t細胞的激活性能的措施，但利用car-t細胞的內(nèi)源性t細胞的免疫誘導效果、對于腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制機制的抵抗性沒有被充分地強化，利用car-t細胞的治療尚未對實體癌獲得效果。因此，本發(fā)明的課題在于，提供免疫誘導效果和抗腫瘤活性高的car-t細胞、及用于制備該car-t細胞的car表達載體，所述car-t細胞在t細胞中既表達car同時還表達t細胞的免疫功能促進因子。

用于解決課題的手段

本申請的發(fā)明人基于在利用了car-t細胞的癌癥免疫療法中達成更優(yōu)異的免疫誘導效果、抗腫瘤活性的目的，嘗試了car-t細胞的改良。在此過程中，著眼于作為促進t細胞的免疫功能的因子的細胞因子、趨化因子、信號調(diào)控蛋白，構(gòu)建了既表達car同時還表達上述促進t細胞的免疫功能的因子的載體。將所述表達載體導入t細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可制備具有較之以往的car-t細胞而言更優(yōu)異的免疫誘導效果、抗腫瘤活性的car-t細胞，從而完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明涉及下文公開的內(nèi)容。

(1)car表達載體，其含有編碼嵌合抗原受體(car)的核酸及編碼t細胞的免疫功能促進因子的核酸，其特征在于，所述編碼所述免疫功能促進因子的核酸為：編碼白細胞介素7的核酸及編碼ccl19的核酸、編碼針對shp-1的顯性負性突變體的核酸、或編碼針對shp-2的顯性負性突變體的核酸。

(2)如上述(1)所述的car表達載體，其特征在于，編碼免疫功能促進因子的核酸為編碼白細胞介素7的核酸及編碼ccl19的核酸。

(3)如上述(2)所述的car表達載體，其特征在于，編碼car的核酸與編碼t細胞的免疫功能促進因子的核酸介由編碼自切割肽(self-cleavage)的序列連接。

(4)如上述(2)或(3)所述的car表達載體，其特征在于，編碼白細胞介素7的核酸與編碼ccl19的核酸介由編碼自切割肽的序列連接。

(5)如上述(1)～(4)中任一項所述的car表達載體，其特征在于，編碼car的核酸含有編碼下述單鏈抗體的多肽的核酸，所述單鏈抗體識別fitc或cd20。

(6)如上述(1)～(5)中任一項所述的car表達載體，其特征在于，編碼car的核酸含有編碼cd8的跨細胞膜區(qū)的多肽的核酸。

(7)如上述(1)～(6)中任一項所述的car表達載體，其特征在于，編碼car的核酸含有編碼cd28的細胞內(nèi)區(qū)、4-1bb的細胞內(nèi)區(qū)、及cd3ζ的細胞內(nèi)區(qū)的多肽的核酸。

(8)car表達t細胞，其中導入了以下(a)或(b)所示的載體：

(a)上述(1)～(7)中任一項所述的car表達載體；

(b)含有編碼car的核酸及編碼白細胞介素7的核酸的car表達載體、和含有編碼car的核酸及編碼ccl19的核酸的car表達載體；

(9)抗癌劑，其含有上述(8)所述的car表達t細胞和藥學上允許的添加劑。

發(fā)明的效果

通過使用本發(fā)明的car表達載體，能夠制造兼具存活能力、淋巴細胞蓄積能力、腫瘤細胞損傷活性的car-t細胞、對于癌癥微環(huán)境中的免疫抑制具有抵抗性的car-t細胞。通過利用上述car-t細胞實施針對癌癥患者的免疫療法，從而能夠獲得可期待強效的癌癥治療效果、對于難治性·進行性的癌癥仍然有效的癌癥免疫療法。

附圖說明

圖1是表示car的結(jié)構(gòu)及利用car-t細胞的癌癥免疫療法的基本體系的圖。

圖2是表示表達car、白細胞介素7(il-7)及ccl19的載體的圖。

圖3是表示通過流式細胞術(shù)對抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞中的car表達水平進行確認的結(jié)果-1的圖。左側(cè)為car未染色、右側(cè)為car染色。

圖4是表示通過流式細胞術(shù)對抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞中的car表達水平進行確認的結(jié)果-2的圖。

圖5是表示通過流式細胞術(shù)對抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞中的car表達水平進行確認的結(jié)果的圖。

圖6是表示通過elisa對抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞的細胞上清液中的il-7及ccl19的濃度進行測定的結(jié)果-1的圖。

圖7是表示通過elisa對抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞的細胞上清液中的il-7及ccl19的濃度進行測定的結(jié)果-2的圖。

圖8是表示通過elisa對抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的細胞上清液中的il-7及ccl19的濃度進行測定的結(jié)果的圖。

圖9是表示刺激抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞、培養(yǎng)3天、5天、7天后的細胞數(shù)量的圖。

圖10是表示刺激抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞、培養(yǎng)3天、5天、7天后的存活率的圖。

圖11是表示刺激抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞、培養(yǎng)5天后的細胞數(shù)量的圖。

圖12是表示對抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞進行的t細胞遷移試驗的結(jié)果-1的圖。

圖13是表示對抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞進行的t細胞遷移試驗的結(jié)果-2的圖。

圖14是表示對抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞進行的樹突細胞遷移試驗的結(jié)果的圖。

圖15是表示抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞進行的t細胞遷移試驗的結(jié)果的圖。

圖16是表示對抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞的t細胞增殖能力進行研究的結(jié)果(刺激后第5天)的圖。

圖17是表示對抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞的t細胞增殖能力進行研究的結(jié)果(刺激后第3天、第7天)的圖。

圖18是表示對抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞中的cd127表達進行研究的結(jié)果的圖。

圖19是表示對抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞中的ccr7表達進行研究的結(jié)果的圖。

圖20是表示對將抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞施予至荷癌小鼠的情況下的腫瘤體積變化進行研究的結(jié)果的圖。

圖21是表示對將抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞施予至荷癌小鼠的情況下的小鼠存活率進行研究的結(jié)果的圖。

圖22是表示對向在皮下接種p815-hcd20后施予環(huán)磷酰胺的小鼠施予了抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的情況下的小鼠存活率進行研究的結(jié)果的圖。

圖23是表示對向在皮下接種p815-hcd20后施予環(huán)磷酰胺的小鼠施予了抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的情況下的小鼠的腫瘤體積進行研究的結(jié)果的圖。

圖24是將圖23中的cpa+7×19的圖的縱軸的數(shù)值縮小至1/10而得到的圖。

圖25是表示將向皮下接種了p815-hcd20的小鼠施予了抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的情況下的腫瘤組織進行h&e染色并觀察的結(jié)果的圖。

圖26是表示向皮下接種了p815-hcd20的小鼠施予了抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的情況下的腫瘤組織進行免疫組織化學分析而得到的結(jié)果的圖。

圖27表示對圖26中的利用熒光染色標記的陽性區(qū)域進行定量而得到的結(jié)果的圖。

圖28是表示對向皮下接種了p815-hcd20的小鼠施予了抗人cd20car-il-7表達t細胞、抗人cd20car-ccl19表達t細胞、或抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的情況下的腫瘤體積進行研究的結(jié)果的圖。

圖29(a)是表示表達car和shp1(含有2個src同源區(qū)的磷酸酶-1，srchomologyregion2domain-containingphosphatase-1，)的顯性負性突變體的載體的圖。(b)是表示表達car和shp2(含有2個src同源區(qū)的磷酸酶-2，srchomologyregion2domain-containingphosphatase-2)的顯性負性突變體的載體的圖。

圖30(a)是表示對抗人cd20car-shp1dn表達t細胞進行細胞損傷活性試驗得到的結(jié)果的圖。(b)是表示對抗人cd20car-shp2dn表達t細胞進行細胞損傷活性試驗得到的結(jié)果的圖。

圖31是表示將p815-hcd20和抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞在fitc綴合利妥昔單抗(rituximab)的存在下混合、對腫瘤細胞損傷活性進行調(diào)查的結(jié)果的圖。

圖32是表示將p815-hcd20和抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞混合而對腫瘤細胞損傷活性進行調(diào)查的結(jié)果的圖。

圖33是表示向皮下接種了p815-hcd20的小鼠施予抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞，針對白細胞表面的表型，通過流式細胞術(shù)分析cd4、cd8、cd44、cd62l而得到的結(jié)果的圖。

圖34是表示將脾臟的白細胞與用絲裂霉素c處理的p815-hcd20共同培養(yǎng)4天進行刺激，用流式細胞術(shù)對t細胞的增殖進行調(diào)查的結(jié)果的圖。

具體實施方式

本發(fā)明的car表達載體含有編碼嵌合抗原受體(car)的核酸及編碼t細胞的免疫功能促進因子的核酸，對于該car表達載體而言，只要所述編碼免疫功能促進因子的核酸是編碼白細胞介素7的核酸及編碼ccl19的核酸、編碼針對shp-1的顯性負性突變體的核酸、或編碼針對shp-2的顯性負性突變體的核酸則沒有特別限制，所謂嵌合抗原受體，是指將識別癌細胞的細胞表面抗原的單鏈抗體和誘導t細胞的活化的信號轉(zhuǎn)導區(qū)介由跨細胞膜區(qū)融合而得到的人工嵌合蛋白質(zhì)。

本發(fā)明中，作為編碼car的核酸，只要是編碼構(gòu)成car的多肽的核酸則沒有特別限制，包括編碼識別癌細胞的細胞表面抗原的單鏈抗體、跨細胞膜區(qū)、及誘導t細胞的活化的信號轉(zhuǎn)導區(qū)的多肽的核酸。

作為car中的單鏈抗體，可舉出來自單克隆抗體的抗原結(jié)合位點的輕鏈可變區(qū)及重鏈可變區(qū)(scfv)組成、且在輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)之間具有接頭(linker)肽的寡肽或多肽。

作為上述單鏈抗體識別的癌細胞的細胞表面抗原，可以是針對癌細胞及其前體細胞特異性表達的生物體分子、由于細胞的癌化而新確認到表達的生物體分子、或在癌細胞中與正常細胞相比表達水平升高的生物體分子，可舉出cd20、egfr、fitc、cd19、cd22、cd33、psma、gd2、egfrvariant、ror1、c-met、her2、cea、間皮素(mesothelin)、gm2、cd7、cd10、cd30、cd34、cd38、cd41、cd44、cd74、cd123cd133、cd171、muc16、muc1、cs1(cd319)、il-13ra2、bcma、lewisy、iggkappa鏈、葉酸受體-α、psca、epcam。

t細胞活化信號轉(zhuǎn)導區(qū)是在上述單鏈抗體識別癌細胞的細胞表面抗原時能夠向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導信號的區(qū)域，優(yōu)選含有選自cd28、4-1bb(cd137)、gitr、cd27、ox40、hvem、cd3ζ、fcreceptor-associatedγchain的細胞內(nèi)區(qū)的多肽中的至少1種或2種以上，更優(yōu)選含有cd28、4-1bb、及cd3ζ這3種的細胞內(nèi)區(qū)的多肽。

各細胞內(nèi)區(qū)的多肽可以介由含有2～10個氨基酸的寡肽接頭或多肽接頭被連接，作為所述接頭序列，可舉出甘氨酸-絲氨酸連續(xù)序列。

作為本發(fā)明中的跨細胞膜區(qū)，可舉出來自cd8、t細胞受體的α、β鏈、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、gitr的跨細胞膜區(qū)的多肽，可優(yōu)選舉出人cd8跨細胞膜區(qū)的多肽。介由該跨細胞膜區(qū)，car被固定于t細胞的細胞膜。

在上述跨細胞膜區(qū)中，可含有由任意的寡肽或多肽組成、長度為1～100氨基酸、優(yōu)選為10～70氨基酸的鉸鏈區(qū)。作為鉸鏈區(qū)，可舉出人cd8的鉸鏈區(qū)。

另外，在識別癌細胞的細胞表面抗原的單鏈抗體與跨細胞膜區(qū)、跨細胞膜區(qū)與t細胞活化信號轉(zhuǎn)導區(qū)之間，可設(shè)置由任意的寡肽或多肽組成的間隔區(qū)。作為間隔區(qū)的長度，可舉出1～100個氨基酸，優(yōu)選為10～50個氨基酸，作為該間隔區(qū)，可舉出甘氨酸-絲氨酸連續(xù)序列。

本發(fā)明中，作為編碼t細胞的功能促進因子的核酸，只要是編碼il-7的核酸及編碼ccl19的核酸(以下，也稱為“本申請的核酸1”)、編碼針對shp-1的顯性負性突變體的核酸(以下，也稱為“本申請的核酸2”)、或編碼針對shp-2的顯性負性突變體的核酸(以下，也稱為“本申請的核酸3”)則沒有特別限制，可含有復數(shù)的上述本申請的核酸1～3的各核酸，具體而言，可以是含有本申請的核酸1及本申請的核酸2、本申請的核酸1及本申請的核酸3、本申請的核酸2及本申請的核酸3、本申請的核酸1及本申請的核酸2及本申請的核酸3的核酸。

需要說明的是，作為本申請的核酸1中的編碼il-7的核酸及編碼ccl19的核酸，含有編碼il-7的核酸和編碼ccl19的核酸即可，相對于編碼il-7的核酸而言，編碼ccl19的核酸可配置在上游，也可配置在下游。

作為編碼針對shp1的顯性負性突變體的核酸，只要是編碼顯性作用于shp1、且能夠阻礙shp1的作用的shp1突變體的核酸則沒有特別限制，可舉出編碼下述突變體的核酸，所述突變體含有shp1的氨基酸序列中的至少1個氨基酸被其他的氨基酸取代而得到的氨基酸序列、且能夠阻礙shp1的作用。另外，作為編碼針對shp2的顯性負性突變體的核酸，只要是編碼顯性作用于shp2、且能夠阻礙shp2的作用的shp2突變體的核酸則沒有特別限制，可舉出編碼下述突變體的核酸，所述突變體含有shp2的氨基酸序列中的至少1個氨基酸被其他的氨基酸取代而得到的氨基酸序列、且能夠阻礙shp2的作用。

本發(fā)明的car表達載體中，在編碼嵌合抗原受體的核酸與編碼t細胞的免疫功能促進因子的核酸之間、含有復數(shù)條本申請的核酸1、本申請的核酸2、本申請的核酸3的情況下的各核酸之間、本申請的核酸1中的編碼il-7的核酸與編碼ccl19的核酸之間，只要能夠使各核酸表達，則可含有任意的核酸，優(yōu)選介由編碼自切割肽(2a肽)、或ires(內(nèi)部核糖體進入位點，internalribozymeentrysite)的序列、優(yōu)選為編碼2a肽的序列而連接。通過利用上述序列進行連接，能夠使各核酸效率良好地表達。

所謂2a肽，是指來自病毒的自切割肽，其特征在于，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，序列號1表示的氨基酸序列中的g-p之間(距c末端1殘基的位置)被切割(szymczaketal.,expertopin.biol.ther.5(5):627-638(2005))。因此，隔著2a肽而組入其前后的核酸在細胞內(nèi)彼此獨立地表達。

作為上述2a肽，優(yōu)選為來自小核糖核酸病毒、輪狀病毒、昆蟲病毒、口蹄疫病毒或錐蟲病病毒的2a肽，更優(yōu)選為序列號2所示的來自小核糖核酸病毒的2a肽(f2a)。

對于編碼嵌合抗原受體的核酸而言，可基于編碼針對癌細胞的細胞表面抗原的單鏈抗體、跨細胞膜區(qū)、及t細胞激活信號轉(zhuǎn)導區(qū)的多肽的堿基序列，利用化學合成的方法、通過pcr進行擴增的方法等已知的技術(shù)進行制備。需要說明的是，可對選擇用于編碼氨基酸的密碼子進行改造，從而優(yōu)化核酸在目標宿主細胞中的表達。

編碼針對癌細胞的細胞表面抗原的單鏈抗體、跨細胞膜區(qū)、及t細胞激活信號轉(zhuǎn)導區(qū)的多肽的堿基序列的信息可通過檢索已知的文獻、ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等數(shù)據(jù)庫而適當獲得。

例如，編碼t細胞激活信號轉(zhuǎn)導區(qū)中的cd28、4-1bb、及cd3ζ的跨細胞膜區(qū)的多肽的堿基序列的信息可通過檢索ncbi等數(shù)據(jù)庫而適當獲得，對于人cd28而言，可列舉注冊為genbank編號：nm＿006139.2(更新日：2014年5月10日)的序列，對于人4-1bb而言，可列舉注冊為genbank編號：nm＿001561.5(更新日：2014年3月16日)的序列，對于人cd3ζ而言，可列舉注冊為genbank編號：nm＿000734.3(更新日：2014年8月12日)的序列。

另外，編碼人cd8的跨細胞膜區(qū)的多肽的堿基序列的信息可通過檢索ncbi等數(shù)據(jù)庫而適當獲得，可列舉注冊為genbank編號：nm＿001768.6(更新日：2014年5月10日)的序列。

此外，對于編碼單鏈抗體的多肽的堿基序列的信息而言，可制備識別靶細胞表面抗原的單克隆抗體，用edman法等已知的方法確定該單克隆抗體的氨基酸序列，基于該氨基酸序列獲得信息。作為單克隆抗體的制備方法，可舉出使用雜交瘤進行制備的方法、利用基因工程手段通過含有抗體基因的表達載體將宿主轉(zhuǎn)化進行制備的方法、通過將轉(zhuǎn)基因動物用所期望的抗原免疫進行制備的方法。

作為編碼t細胞的免疫功能促進因子的核酸，編碼il-7的核酸及編碼ccl19的核酸、編碼針對shp-1的顯性負性突變體的核酸、或編碼針對shp-2的顯性負性突變體的核酸可基于各核酸的堿基序列，利用化學合成的方法、通過pcr進行擴增的方法等已知的技術(shù)進行制備。需要說明的是，可對選擇用于編碼氨基酸的密碼子進行改造，從而優(yōu)化核酸在目標宿主細胞中的表達。

編碼il-7的核酸及編碼ccl19的核酸、編碼針對shp-1的顯性負性突變體的核酸、或編碼針對shp-2的顯性負性突變體的核酸的信息可通過檢索已知的文獻、ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等數(shù)據(jù)庫而適當獲得。

作為編碼il-7的核酸，可根據(jù)導入本發(fā)明的car表達載體的細胞的種類而適當選擇，例如，可舉出編碼人il-7的氨基酸序列(序列號3)的核酸，只要具有il-7的細胞增殖率的亢進作用即可，可使用與序列號3所示的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選為85％以上、更優(yōu)選為90％以上、進一步優(yōu)選為95％以上、最優(yōu)選為98％以上的同一性的堿基序列。

作為編碼ccl19的核酸，可根據(jù)導入本發(fā)明的car表達載體的細胞的種類而適當選擇，例如，可舉出編碼人ccl19的氨基酸序列(序列號4)的核酸，只要具有ccl19的t細胞遷移作用即可，可使用與序列號4所示的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選為85％以上、更優(yōu)選為90％以上、進一步優(yōu)選為95％以上、最優(yōu)選為98％以上的同一性的堿基序列。

作為編碼針對shp-1的顯性負性突變體的核酸，可根據(jù)導入本發(fā)明的car表達載體的細胞的種類而適當選擇，例如，可舉出編碼針對人shp-1的顯性負性突變體的氨基酸序列(序列號5)的核酸，只要具有針對shp-1的顯性負性突變體的阻礙shp-1的作用即可，可使用與序列號5所示的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選為85％以上、更優(yōu)選為90％以上、進一步優(yōu)選為95％以上、最優(yōu)選為98％以上的同一性的堿基序列。需要說明的是，序列號5中，第453位的絲氨酸為突變位點。

作為編碼針對shp-2的顯性負性突變體的核酸，可根據(jù)導入本發(fā)明的car表達載體的細胞的種類而適當選擇，例如，可舉出編碼針對人shp-2的顯性負性突變體的氨基酸序列(序列號6)的核酸，只要具有針對shp-2的顯性負性突變體的阻礙shp-2的作用即可，可使用與序列號6所示的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選為85％以上、更優(yōu)選為90％以上、進一步優(yōu)選為95％以上、最優(yōu)選為98％以上的同一性的堿基序列。需要說明的是，序列號6中，第459位的絲氨酸為突變位點。

作為本發(fā)明的car表達載體，可以是直鏈狀，也可以是環(huán)狀，可以是質(zhì)粒等非病毒載體，也可以是病毒載體，還可以是利用轉(zhuǎn)座子的載體。另外，上述載體中可含有啟動子、終止子等調(diào)控序列、耐藥基因、報告基因等篩選標記序列。通過在啟動子序列的下游以可發(fā)揮作用的方式配置編碼car的核酸、編碼t細胞的免疫功能促進因子的核酸，可將各核酸效率良好地轉(zhuǎn)錄。另外，通過含有標記基因，能夠容易地確認編碼嵌合抗原受體的核酸的表達。

另外，本發(fā)明的car表達載體中可含有編碼自殺基因的核酸，該自殺基因的位置沒有特別限制，可在用于使編碼il-7的核酸、編碼ccl19的核酸、編碼針對shp-1的顯性負性突變體的核酸、或編碼針對shp-2的顯性負性突變體的核酸表達的啟動子的下游、隔著編碼2a肽或ires的序列配置在上述各核酸的上游或下游，也可配置在其他的啟動子的下游。通過使本發(fā)明的car表達載體含有編碼自殺基因的核酸，可根據(jù)癌癥的治療過程，例如在腫瘤消失時施予激活自殺基因的功能的藥物，從而控制生物體內(nèi)的car表達t細胞數(shù)量。

作為自殺基因，可舉出以下的文獻中記載的單純皰疹病毒的胸苷激酶(hsv-tk)、誘導性半胱天冬酶9(induciblecaspase9)等，作為激活這些基因的功能的藥物，對于前者可舉出更昔洛韋(ganciclovir)，對于后者可舉出作為誘導二聚物(chemicalinductionofdimerization:cid)的ap1903(cooperlj.,et.al.cytotherapy.2006；8(2):105-17.,jensenm.c.et.al.biolbloodmarrowtransplant.2010sep；16(9):1245-56.,jonesbs.frontpharmacol.2014nov27；5:254.,minagawak.,pharmaceuticals(basel).2015may8；8(2):230-49.,bole-richarde.,frontpharmacol.2015aug25；6:174)。

作為上述病毒載體，可舉出逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體，可優(yōu)選舉出逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、pmsgv載體(tamadaketal.,clincancerres18:6436-6445(2002))，可更優(yōu)選舉出pmscv載體(takarabio公司制)。若使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，則導入基因被組入宿主細胞的基因組中，因此能夠長期且穩(wěn)定地表達。

作為本發(fā)明的car表達t細胞，只要是(a)導入上述本發(fā)明的car表達載體而得到的t細胞、(b)將含有編碼car的核酸及編碼白細胞介素7的核酸的car表達載體(car-il-7表達載體)、和含有編碼car的核酸及編碼ccl19的核酸的car表達載體(car-ccl19表達載體)中的至少2個載體導入而得到的t細胞則沒有特別限制，作為將本發(fā)明的car表達載體、car-il-7表達載體和car-ccl19表達載體導入t細胞的方法沒有特別限制，可舉出利用病毒感染法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、顯微注射法、電穿孔法等已知的方法來導入的方法，可優(yōu)選舉出病毒感染法。需要說明的是，上述car-il-7表達載體只要含有編碼car的核酸及編碼白細胞介素7的核酸即可，上述car-ccl19表達載體只要含有編碼car的核酸及編碼ccl19的核酸即可，與本發(fā)明的car表達載體同樣地，只要能夠使各核酸表達，則可含有編碼2a肽、ires、或自殺基因的核酸等其他的核酸。

作為病毒感染法，可舉出將本發(fā)明的car表達載體和包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至gp2-293細胞(takarabio公司制)、plat-gp細胞(cosmo·bio公司制)、pg13細胞(atcccrl-10686)、pa317細胞(atcccrl-9078)等包裝細胞中制備重組病毒、用該重組病毒使t細胞感染的方法，也可使用retroviruspackagingkiteco(takarabio公司制)等市售的試劑盒實施。

對于本發(fā)明的car表達載體向t細胞的導入的確認，可通過利用流式細胞術(shù)、northern印跡法、southern印跡法、rt-pcr等pcr、elisa、western印跡法調(diào)查car的表達、調(diào)查插入載體的標記基因的表達來進行確認。

作為t細胞，可舉出來自人的t細胞、來自狗、貓、豬、小鼠等非人哺乳動物的t細胞。另外，t細胞可從血液、骨髓液等體液、脾臟、胸腺、淋巴結(jié)等組織、或浸潤原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌性腹水等癌癥組織的免疫細胞中分離、純化而得到。作為該t細胞，可舉出αβt細胞、γδt細胞、cd8⁺t細胞、cd4⁺t細胞、腫瘤浸潤t細胞、記憶t細胞、幼稚t細胞、nkt細胞。

在本發(fā)明的car表達t細胞中，表達的單鏈抗體位于細胞外，通過具有該單鏈抗體，car表達t細胞能夠識別在癌細胞的表面上表達的腫瘤相關(guān)抗原(taa)。

另外，本發(fā)明的car表達t細胞中，可與上述本發(fā)明的car表達載體一同導入含有編碼自殺基因的核酸的載體。

對于本發(fā)明的抗癌劑而言，只要含有本發(fā)明的car表達t細胞和藥學上允許的添加劑則沒有特別限制，作為上述添加劑，可舉出生理鹽水、緩沖生理鹽水、細胞培養(yǎng)基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇及它們的組合、穩(wěn)定劑、可溶劑及表面活性劑、緩沖劑及防腐劑、等滲劑、填充劑、以及潤滑劑。

本發(fā)明的抗癌劑可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法施予至需要癌癥治療的受試體，作為施予方法，可舉出向靜脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、動脈內(nèi)、髓內(nèi)、心臟內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑液囊內(nèi)、頭蓋內(nèi)、髓腔內(nèi)、及蛛網(wǎng)膜下(髓液)的注射。

關(guān)于施予的抗癌劑中含有的本發(fā)明的car表達t細胞的量，可根據(jù)癌癥的種類、位置、重癥度、接受治療的受試體的年齡、體重及狀態(tài)等適當調(diào)節(jié)，可優(yōu)選舉出一次施予中為1×10⁴～1×10¹⁰個，優(yōu)選為1×10⁵～1×10⁹個，更優(yōu)選為5×10⁶～5×10⁸個。

對于施予的抗癌劑而言，可1天4次、3次、2次或1次、隔1天、隔2天、隔3天、隔4天、隔5天、每周1次、隔7天、隔8天、隔9天、每周2次、每月1次或每月2次地獨立施予。

對于本發(fā)明的抗癌劑而言，作為后述的癌癥治療方法中的癌癥，可舉出腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、皮膚癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、陰道癌、頸部癌、子宮癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、脾臟癌、肺癌、氣管癌、支氣管癌、結(jié)腸癌、小腸癌、胃癌、食道癌、膽囊癌、精巢癌、卵巢癌等癌癥、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織、血管組織及造血組織的癌癥，以及，軟骨肉瘤、ewing肉瘤、惡性血管內(nèi)皮瘤、惡性神經(jīng)鞘瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤等肉瘤、肝母細胞瘤、髓母細胞瘤、腎母細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、胰母細胞瘤、胸膜肺母細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤等母細胞瘤、胚細胞腫瘤、淋巴瘤、白血病。

可將本發(fā)明的抗癌劑與其他抗癌劑合用。作為其他的抗癌劑，可舉出環(huán)磷酰胺、苯達莫司汀、異環(huán)磷酰胺、達卡巴嗪(dacarbazine)等烷基化藥物、噴司他丁(pentostatin)、氟達拉濱(fludarabine)、克拉屈濱(cladribine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、依諾他濱(enocitabine)等代謝拮抗藥、利妥昔單抗、西妥昔單抗、曲妥單抗(trastuzumab)等分子靶向藥物、伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)、達沙替尼(dasatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、曲美替尼(trametinib)等激酶抑制劑、硼替佐米(bortezomib)等蛋白酶體抑制劑、環(huán)孢菌素、他克莫司等鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑、伊達比星(idarubicin)、多柔比星、絲裂霉素c等抗癌性抗生素、依立替康、依托泊苷(etoposide)等植物生物堿、順鉑、奧沙利鉑(oxaliplatin)、卡鉑(carboplatin)等鉑制劑、他莫昔芬、比卡魯胺(bicalutamide)等激素療法藥物、干擾素、nivolumab、pembrolizumab等免疫調(diào)節(jié)藥，可優(yōu)選舉出烷基化藥物或代謝拮抗藥，可進一步優(yōu)選舉出環(huán)磷酰胺。

作為上述“將本發(fā)明的抗癌劑與其他抗癌劑合用”的方法，可舉出在使用其他的抗癌劑進行處理后使用本發(fā)明的抗癌劑的方法、同時使用本發(fā)明的抗癌劑和其他的抗癌劑的方法、使用本發(fā)明的抗癌劑進行處理后使用其他的抗癌劑的方法，可優(yōu)選舉出使用其他的抗癌劑進行處理后使用本發(fā)明的抗癌劑的方法。另外，將本發(fā)明的抗癌劑與其他抗癌劑合用時，在進一步提高癌癥的治療效果的同時，可減少各抗癌劑的施予次數(shù)或施予量，從而能夠降低各抗癌劑導致的副作用。另外，本發(fā)明的抗癌劑可含有上述其他的抗癌劑。

作為本發(fā)明的其他形式1，可舉出1)癌癥的治療方法，其特征在于，將本發(fā)明的car表達t細胞施予至需要癌癥治療的患者，2)用作抗癌劑的本發(fā)明的car表達t細胞，3)本發(fā)明的car表達t細胞在抗癌劑的制備中的用途。

此外，作為本發(fā)明的其他形式2，可舉出包含本發(fā)明的car表達載體、用于制備car表達t細胞的試劑盒，作為該試劑盒，只要包含本發(fā)明的car表達載體則沒有特別限制，可包含用于制備car表達t細胞的說明書、用于將本發(fā)明的car表達載體導入t細胞的試劑。

實施例1

[表達il-7及ccl19t的細胞的制備]

(t細胞的免疫功能促進因子的選擇)

在生物體內(nèi)至少存在數(shù)百種能夠調(diào)控t細胞的功能的分子。發(fā)明人基于迄今為止的見解、經(jīng)驗，從龐大的組合中選擇il-7和ccl19作為用于進一步提高car-t細胞的抗腫瘤效果的調(diào)控分子，并且，選擇并非單獨、而是2個的組合、即il-7和ccl19的組合，制備了既表達該t細胞的免疫功能促進因子同時還表達car的載體。

需要說明的是，上述il-7是對于t細胞的存活而言必需的細胞因子，由骨髓、胸腺、淋巴器官·組織的基質(zhì)細胞等非造血細胞產(chǎn)生。另一方面，幾乎確認不到t細胞自身的產(chǎn)生能力。

另外，上述ccl19主要由淋巴結(jié)的樹突細胞、巨噬細胞產(chǎn)生，具有介由作為其受體的ccr7引發(fā)t細胞、b細胞、成熟的樹突細胞的遷移的功能。

(表達il-7及ccl19的抗fitccar表達載體的制備)

人工合成編碼包含抗fitcscfv、小鼠cd8跨膜區(qū)、小鼠cd28-4-1bb-cd3ζ細胞內(nèi)信號基序的抗fitccar的抗fitccardna片段(序列號7)、編碼序列號1所示的2a肽(f2a)和與其接續(xù)的限制性內(nèi)切酶位點(mcs)的f2a-mcsdna片段(序列號8)、編碼小鼠il-7(不含終止密碼子)及其后續(xù)的f2a和小鼠ccl19的il-7-f2a-ccl19dna片段(序列號9)。在序列號7中，第1～819位為編碼抗fitcscfv的多肽的序列，第829～1074位為編碼小鼠cd8跨膜區(qū)的多肽的序列，第1075～1197位為編碼小鼠cd28的細胞內(nèi)區(qū)的多肽的序列，第1198～1332位為編碼4-1bb的細胞內(nèi)區(qū)的多肽的序列，第1333～1674位為編碼cd3ζ的細胞內(nèi)區(qū)的多肽的序列。另外，在序列號9中，第1～462位為編碼il-7的序列，第463～537位為編碼f2a的序列，第538～864位為編碼ccl19的序列。

為了制備表達car、il-7及ccl19car的載體，將上述抗fitccardna片段與上述f2a-mcsdna片段連接，制備抗fitccar-f2a-mcs構(gòu)建體(construct)。接著，將制備的構(gòu)建體克隆至pmsgv逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體(tamadaketal.,clincancerres18:6436-6445(2002))，制備含有抗fitccar-f2a-mcs的pmsgv載體。經(jīng)過限制性內(nèi)切酶(nsii及sali)處理及連接，將上述il-7-f2a-ccl19dna片段插入該pmsgv載體的mcs，得到含有抗fitccar-f2a-il-7-f2a-ccl19的pmsgv載體(il-7/ccl19表達-抗fitccar載體)。將得到的載體的配置圖示于圖2。另外，作為對照，將抗fitccardna片段克隆至pmsgv逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體，制備含有抗fitccar的pmsgv載體(對照抗fitccar載體)。

(導入了il-7/ccl19表達-抗fitccar載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備)

為了小鼠t細胞的轉(zhuǎn)導，制備逆轉(zhuǎn)錄病毒。使用lipofectamine2000或3000(lifetechnologies公司制)，將上述的il-7/ccl19表達-抗fitccar載體或?qū)φ湛筬itccar載體、和pcl-eco質(zhì)粒(imgenex公司制)轉(zhuǎn)染至gp2-293包裝細胞株(takarabio公司制)，由此制備導入了il-7/ccl19表達-抗fitccar載體或?qū)φ湛筬itccar載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒。在轉(zhuǎn)染起48小時后回收含有上述逆轉(zhuǎn)錄病毒的上清液。

作為上述gp2-293細胞的培養(yǎng)液，使用了添加了10％fcs、100u/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素的dmem。另外，作為后述的實施例中使用的t細胞的培養(yǎng)液，使用了添加了10％fcs、100u/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素、50mm的2-巰基乙醇、2mm的l-谷氨酰胺的rpmi-1640。

(小鼠t細胞的轉(zhuǎn)導)

為了小鼠t細胞的轉(zhuǎn)導，將來自脾臟及淋巴結(jié)的3×10⁶個純化的小鼠t細胞用經(jīng)過固相化的抗cd3單克隆抗體(3μg/ml)、抗cd28單克隆抗體(1μg/ml)、il-2(100iu/ml)活化48小時。接著，將上述中制備的含有導入了il-7/ccl19表達-抗fitccar載體或?qū)φ湛筬itccar載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒的上清液與在用25μg/ml的retronectin(注冊商標：takarabio公司制)包被的培養(yǎng)皿中活化后的上述的小鼠t細胞(1×10⁶細胞/ml)混合，以1500rpm離心2小時后，在il-2(100iu/ml)的存在下培養(yǎng)6小時。為了從培養(yǎng)液中除去逆轉(zhuǎn)錄病毒，回收小鼠t細胞，移至含有il-2(100iu/ml)的新的增殖培養(yǎng)液(rpmi)，進而培養(yǎng)42小時，得到導入了il-7/ccl19表達-抗fitccar載體的小鼠t細胞(抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞)或?qū)肓藢φ湛筬itccar載體的小鼠t細胞(抗fitccar表達t細胞)。

(表達il-7及ccl19的抗cd20car表達載體的制備)

在上述的il-7/ccl19表達-抗fitccar載體的制備中，將序列號7所示的序列中含有的抗fitcscfv區(qū)域的序列替換為由lifetechnologies公司基于利妥昔單抗的序列合成的抗人cd20scfv(序列號10)的序列，除此以外，使用同樣的方法制備含有抗人cd20car-f2a-il-7-f2a-ccl19的pmsgv載體(il-7/ccl19表達-抗人cd20car載體)。同樣地，在上述的對照抗fitccar載體的制備中，將序列號7所示的序列中含有的抗fitcscfv區(qū)域的序列置換為上述抗人cd20scfv(序列號10)的序列，除此以外，使用同樣的方法制備含有抗人cd20car的pmsgv載體(對照抗人cd20car載體)。將該il-7/ccl19表達-抗人cd20car載體或?qū)φ湛谷薱d20car載體用與上述同樣的方法導入小鼠t細胞，制備抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞或抗人cd20car表達t細胞。

實施例2

[利用流式細胞術(shù)的car表達測定]

(流式細胞術(shù)分析)

利用雙色流式細胞術(shù)對識別作為模型抗原的fitc的car的表達水平進行了分析。在fitc綴合葡聚糖和別藻藍蛋白(apc)綴合抗cd8單克隆抗體(53-6.7affymetrix公司制)的存在下培養(yǎng)制備的抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞。流式細胞儀使用ec800(索尼公司制)，數(shù)據(jù)分析使用flowjosoftware(treestar公司制)。

另外，利用雙色流式細胞術(shù)對識別人cd20的car的表達水平進行了分析。使用經(jīng)過生物素標記的蛋白l及apc綴合鏈親和素對制備的抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞進行了分析。

(結(jié)果)

將結(jié)果示于圖3～5。圖3中，左側(cè)為car未染色(不添加fitc綴合葡聚糖)的抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞，右側(cè)為car染色(添加fitc綴合葡聚糖)的抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞的結(jié)果，圖4中，“轉(zhuǎn)導(-)”為未轉(zhuǎn)導的t細胞，“cont.”為抗fitccar表達t細胞，“7×19”為抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞，圖5中，“轉(zhuǎn)導(-)”為未轉(zhuǎn)導的t細胞，“cont.”為抗人cd20car表達t細胞，“7×19”為抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的結(jié)果。另外，圖中的數(shù)值表示各細胞群所占的百分比。如圖3～5所示的那樣，在抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞、抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞中，確認到car的表達。

實施例3

[il-7、ccl19的分泌]

(抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞的培養(yǎng)上清液中的il-7、ccl19濃度的測定-1)

將制備的抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞或抗fitccar表達t細胞用1μg/ml固相化的fitc綴合曲妥單抗刺激，培養(yǎng)3天，回收上清液，使用市售的elisa試劑盒(r&dsystems公司制)測定il-7及ccl19的濃度。將結(jié)果示于圖6。

(結(jié)果)

如圖6所示的那樣，在培養(yǎng)上清液中，檢測到il-7為300pg/ml以上，ccl19為75pg/ml以上。因此，確認到抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞表達il-7及ccl19、且表達的il-7及ccl19被分泌至細胞外。需要說明的是，在對照的抗fitccar表達t細胞中，il-7、ccl19均為檢測限以下(未檢測到)。

(抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞的培養(yǎng)上清液中的il-7、ccl19濃度的測定-2)

利用固相化的fitc綴合曲妥單抗或抗cd3單克隆抗體，在進行刺激和無刺激的情況下，培養(yǎng)3、5、7天后，使用elisa試劑盒測定il-7及ccl-19的濃度。將結(jié)果示于圖7。圖7中，白色柱表示沒有刺激，灰色柱表示有利用fitc綴合曲妥單抗的刺激，黑色柱表示有利用抗cd3單克隆抗體的刺激。另外，“cont.”表示抗fitccar表達t細胞，“7×19”表示抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞。

(結(jié)果)

由圖7可見，除了培養(yǎng)3天以外，在培養(yǎng)5天、7天的情況下，在抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞中，il-7及ccl-19也被分泌至細胞外。

(抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的培養(yǎng)上清液中的il-7、ccl19濃度的測定)

進而，對于制備的抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞或抗人cd20car表達t細胞，同樣地利用經(jīng)過絲裂霉素c處理的p815肥大細胞瘤、實施了基因重組從而能夠表達人cd20的p815肥大細胞瘤(p815-hcd20)、或固相化的抗cd3單克隆抗體，在進行刺激、無刺激的情況下，培養(yǎng)3天或5天，然后使用elisa試劑盒測定il-7及ccl-19的濃度。將結(jié)果示于圖8。圖8中，白色柱表示沒有刺激，斜線柱表示存在利用經(jīng)過絲裂霉素c處理的815的刺激，黑色柱表示存在利用p815-hcd20的刺激，灰色柱表示存在利用固相化的抗cd3單克隆抗體的刺激。另外，“cont.”表示抗人cd20car表達t細胞，“7×19”表示抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞。

(結(jié)果)

由圖8可見，在抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞中，il-7及ccl-19也被分泌至細胞外。

實施例4

[car表達t細胞的細胞數(shù)量、存活率]

(抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞的細胞數(shù)量、存活率)

對于由抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞產(chǎn)生的il-7、ccl19是否發(fā)揮生物性功能、呈現(xiàn)免疫誘導效果進行了研究。將制備的抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞或抗fitccar表達t細胞用1μg/ml的固相化的fitc綴合曲妥單抗進行刺激，培養(yǎng)3天、5天、7天，回收細胞和上清液。利用臺盼藍的染色對細胞數(shù)量和存活率進行分析。將結(jié)果示于圖9、10。圖9、10中，黑色柱表示抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞，白色柱表示抗fitccar表達t細胞，橫軸表示培養(yǎng)天數(shù)。另外，通過學生t檢驗(student’st-test)研究了統(tǒng)計學上的顯著差異(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.005,p<0.001)。

(結(jié)果)

如圖9、10所示的那樣，抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞的細胞增殖、存活率均亢進，可見，由抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞產(chǎn)生的l-7、ccl19發(fā)揮了生物性功能。

(抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的細胞數(shù)量)

將含有抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞(4×10⁵個)的試樣在大鼠igg2a同型對照、抗cd127單克隆中和抗體、或抗ccr7單克隆中和抗體的存在下用絲裂霉素c和p815-hcd20刺激。培養(yǎng)5天，利用臺盼藍調(diào)查活細胞的絕對數(shù)量。需要說明的是，cd127為il-7的受體，ccr7為ccl19的受體。將結(jié)果示于圖11。圖11中，“iso.cntrl.”為在大鼠igg2a同型對照的存在下用p815-hcd20刺激的情況，“抗cd127”為在抗cd127單克隆中和抗體的存在下用p815-hcd20刺激的情況，“抗ccr7”為在抗ccr7單克隆中和抗體的存在下用p815-hcd20刺激的情況。圖11中，黑色柱表示抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞，白色柱表示抗人cd20car表達t細胞。另外，各數(shù)據(jù)以3個孔(well)的平均±標準偏差表示，*表示p<0.05，表示p<0.001。

(結(jié)果)

如圖11所示的那樣，在抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞中，細胞數(shù)量增加，細胞增殖率亢進，以及，細胞增殖被抗cd127抑制，由此可見，細胞增殖率的亢進介由作為il-7的受體的cd127而發(fā)揮作用。

實施例5

[t細胞遷移試驗]

(利用抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞的t細胞遷移試驗)

利用使用了transwell的細胞遷移試驗，研究了ccl19的遷移引發(fā)效果。關(guān)于應答側(cè)t細胞的遷移性，使用96孔的transwell(注冊商標)小室(chamber)(cornigcostar公司制)，使細胞通過孔徑為5μm的聚碳酸酯過濾器遷移來進行測定。具體而言，在小室的下層，將抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞或抗fitccar表達t細胞用1μg/ml的固相化的fitc綴合曲妥單抗刺激3天。應答側(cè)t細胞利用脾臟、淋巴結(jié)通過macs(注冊商標)(miltenyibiotec公司制)的陰性選擇制備。應答側(cè)t細胞用cytotellblue(aatbioquest公司制)標記，在上層培養(yǎng)3小時。用流式細胞術(shù)調(diào)查細胞從小室的上層向下層的遷移。將結(jié)果示于圖12。圖12中，黑色柱表示抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞，白色柱表示抗fitccar表達t細胞，縱軸表示遷移至下層的小室的應答側(cè)t細胞的絕對數(shù)量(以下的圖13、14中相同)。另外，通過學生t檢驗研究了統(tǒng)計學上的顯著差異(*p<0.05)。

(結(jié)果)

如圖12所示的那樣，較之抗fitccar表達t細胞而言，抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞中的更多的t細胞遷移至下層。在移入car表達t細胞等淋巴細胞的療法中，施予的t細胞導致的癌細胞損傷自然是重要的，除此以外，將原本存在于癌癥患者體內(nèi)的內(nèi)源性t細胞(＝宿主側(cè)免疫細胞)活化、發(fā)動其攻擊癌細胞也是重要的。為此，從提高免疫治療效果的觀點考慮，優(yōu)選的是，不僅僅單純地從外部移入具有抗腫瘤活性的淋巴細胞，而是利用某些手段，引發(fā)移入的t細胞與內(nèi)源性t細胞的積極的相互作用，從而使內(nèi)源性t細胞在癌變部位蓄積。由圖12的結(jié)果可見，抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞具有使內(nèi)源性t細胞蓄積的能力，因此能夠誘導移入的t細胞與內(nèi)源性t細胞的積極的相互作用。

(利用抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞的t細胞或樹突細胞的遷移試驗)

在transwell的下層小室中，利用固相化的fitc綴合曲妥單抗或抗cd3單克隆抗體刺激含有抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞或抗fitccar表達t細胞的試樣(5×10⁵個)。在第3天將用cytotellblue染色的4×10⁵個t細胞置于上層，孵育3小時或5小時。同樣地，用固相化的fitc綴合曲妥單抗刺激各試樣，在第3天將用cytotellblue染色的4×10⁵個樹突細胞置于上層，孵育3小時。用流式細胞術(shù)分析從上層遷移至下層的各應答側(cè)細胞。將結(jié)果示于圖13、14。圖13、14中，黑色柱表示抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞，白色柱表示抗fitccar表達t細胞。需要說明的是，在圖13、14及后述的圖15中，各數(shù)據(jù)以3個孔(well)的平均±標準偏差表示，*表示p<0.05,**表示p<0.01，表示p<0.001，表示p<0.00001，表示p<5×10^-5。

(結(jié)果)

由圖13、14的結(jié)果可見，抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞的使內(nèi)源性t細胞及樹突細胞蓄積的能力高。

(利用抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的t細胞遷移試驗)

在transwell的下層小室中，將含有抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞(1×10⁵個)的試樣與用絲裂霉素c處理的p815-hcd20共培養(yǎng)。在第3天將用cytotellblue染色的4×10⁵個t細胞置于上層，在大鼠igg2a同型對照、抗cd127單克隆抗體、或抗ccr7單克隆抗體的存在下孵育3小時。用流式細胞術(shù)分析從上層遷移至下層的各應答側(cè)t細胞。將結(jié)果示于圖15。圖15中，“iso.cntrl.”表示在大鼠igg2a同型對照的存在下用p815-hcd20刺激的情況，“抗cd127”在抗cd127單克隆中和抗體的存在下用p815-hcd20刺激的情況，“抗ccr7”表示在抗ccr7單克隆中和抗體的存在下用p815-hcd20刺激的情況。圖15中，黑色柱表示抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞，白色柱表示抗人cd20car表達t細胞。

(結(jié)果)

由圖15的結(jié)果可見，在抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞中，使內(nèi)源性t細胞蓄積的能力也高，以及，內(nèi)源性t細胞的蓄積被抗ccr7抑制，由此可見，內(nèi)源性t細胞的蓄積介由作為ccl19的受體的ccr7而發(fā)揮作用。

另外，由圖9～15的結(jié)果可見，il-7導致抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞、抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞高效地增殖，存活率也高，并且，ccl19導致t細胞、樹突細胞在癌變部位蓄積，二者具有上述對于免疫誘導不可或缺的重要效果，并具有優(yōu)異的免疫誘導效果。即，由此可知，通過使“il-7”和“ccl19”這2個調(diào)控分子在car表達t細胞中表達，能夠提高該t細胞的增殖能力、存活率、免疫誘導效果。

實施例6

[t細胞的增殖能力]

將含有抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞及作為對照的抗fitccar表達t細胞的試樣(5×10⁵個)用cytotellblue(aatbioquest公司制)染色，并利用固定化的fitc綴合曲妥單抗刺激后，用流式細胞術(shù)進行分析。將刺激開始后第5天的結(jié)果示于圖16，將第3天、第7天的結(jié)果示于圖17。圖16中，直方圖的數(shù)值表示細胞分裂數(shù)量，圖16、17中，圓形圖的數(shù)值表示各細胞分裂數(shù)在白細胞總體中占據(jù)的部分(0、1、2、3、大于4的細胞分裂數(shù)量)的比例。

(結(jié)果)

由圖16、17的結(jié)果可見，較之抗fitccar表達t細胞而言，抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞的增殖能力升高。

實施例7

[t細胞、樹突細胞、及car表達t細胞中的cd127或ccr7的表達]

用流式細胞術(shù)，對未被刺激的脾臟t細胞(幼稚t細胞：naivet細胞)、將脾臟t細胞與抗cd3單克隆抗體、抗cd28單克隆抗體及il-2共同培養(yǎng)2天進行刺激而得到的細胞(活化t細胞)、未被刺激的脾臟中的樹突細胞(樹突細胞)、及使用與實施例1的“小鼠t細胞的轉(zhuǎn)導”同樣的方法激活而制備的抗fitccar表達t細胞(cont.)和抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞(7×19)進行分析，調(diào)查cd127或cdr7的表達。需要說明的是，t細胞為cd3⁺cd19^-的細胞群，抗fitccar表達t細胞、抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞為對于fitc綴合葡聚糖珠為陽性的細胞群、樹突細胞為cd11c⁺的細胞群。將調(diào)查cd127表達的結(jié)果示于圖18，將調(diào)查ccr7表達結(jié)果的結(jié)果示于圖19。圖中，數(shù)值表示陽性的百分率(％)，“cont.”表示抗fitccar表達t細胞，“7×19”表示抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞。

(結(jié)果)

如圖18所示的那樣，可見，cd127在活化t細胞中的表達比幼稚t細胞明顯降低，但在抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞中比活化t細胞更多，進一步地，恢復到幼稚t細胞以上的水平。另外，如圖19所示的那樣，可見，對于ccr7的表達而言，在抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞中表達由于活化而降低，但維持了相對于幼稚t細胞而言為約67％的表達。以往已知，t細胞活化后，cd127或ccr7的表達降低至1/2～1/3。因此，可認為即使制備了表達il-7、ccl19的car表達t細胞，仍然會由于car表達t細胞活化而導致il-7及ccl19的作用降低。因此，通常很難期待通過使car表達t細胞表達il-7及ccl19來提高car表達t細胞的免疫誘導效果、抗腫瘤活性。在本試驗中，在將脾臟t細胞活化后第2天，也發(fā)現(xiàn)cd127或ccr7的表達暫時降低。然而，確認到在抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞中，cd127或ccr7的表達在第4天恢復。這表示，使car表達t細胞表達il-7及ccl19對于免疫誘導效果、抗腫瘤活性的強化是有用的。

實施例8

[小鼠腫瘤模型中的治療效果]

(抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞向小鼠的施予)

向荷癌小鼠(dba/2小鼠)皮下接種5×10⁵個經(jīng)過基因重組從而能夠表達人cd20的p815肥大細胞瘤(p815-hcd20)。3天后，向上述小鼠靜脈內(nèi)施予3×10⁶個抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞或抗人cd20car表達t細胞。作為對照，設(shè)定接種上述p815肥大細胞瘤后未處理(未施予car表達t細胞)的非治療組。每周測定2次小鼠的腫瘤體積、存活率。在腫瘤體積分析中，根據(jù)各實驗組算出標準偏差。對于3個組的統(tǒng)計性顯著差異，在腫瘤體積分析中利用學生t檢驗進行研究，在存活率的調(diào)查中利用時序檢驗(log-ranktest)進行研究(*p<0.05,**p<0.01)。

將小鼠的腫瘤體積變化的結(jié)果示于圖20，將小鼠的存活率的結(jié)果示于圖21。圖20、21中，○表示施予了抗人cd20car表達t細胞的情況，●表示施予了抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的情況，◇表示作為非治療組而沒有施予car表達t細胞的情況。另外，圖20的橫軸表示將細胞施予至小鼠靜脈內(nèi)后經(jīng)過的天數(shù)，縱軸表示腫瘤體積(mm³)，圖21的橫軸表示將細胞施予至小鼠靜脈內(nèi)后經(jīng)過的周數(shù)，縱軸表示存活率(％)。

(結(jié)果)

如圖20、21所示的那樣，在施予了抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的情況下，較之施予了抗人cd20car表達t細胞的情況、沒有施予car表達t細胞的情況而言，確認到腫瘤體積的減少效果、存活率的提高(存活時間的延長效果)。因此，可知抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞具有優(yōu)異的抗腫瘤活性。

(抗癌劑及抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞向小鼠的接種)

向小鼠皮下接種5×10⁵個p815-hcd20。在接種后第10天將作為抗癌劑的環(huán)磷酰胺(cpa，100mg/kg)施予至腹腔內(nèi)，在第14天將1×10⁶個抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞或抗人cd20car表達t細胞施予至靜脈內(nèi)。將小鼠的存活率的結(jié)果示于圖22，將腫瘤的體積的結(jié)果示于圖23、24。圖22～24中，橫軸為皮下接種p815-hcd20后的天數(shù)(將向小鼠皮下接種p815-hcd20當天設(shè)為0天)，縱軸為存活率(圖22)，腫瘤體積(腫瘤的長軸×(腫瘤的短軸)²/2(mm³))(圖23、24)，“未處理”為未處理組，“cpa”為僅施予cpa的組，“cpa+cont.”為在施予cpa后施予抗人cd20car表達t細胞的組，“cpa+7×19”為在施予cpa后施予抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的組，表示小鼠死亡。需要說明的是，圖24為將圖23中的cpa+7×19的圖的縱軸的數(shù)值縮小至1/10而得到的圖。

(結(jié)果)

如圖22所示的那樣，可見通過將本發(fā)明的抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞與抗癌劑聯(lián)合使用，存活率變得極高。另外，通過如圖23、24所示的那樣將本發(fā)明的抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞與抗癌劑合用，可見腫瘤完全地消失。需要說明的是，如圖24所示的那樣，腫瘤體積在皮下接種p815-hcd20后第10天成為最大，此時的短徑為4.86mm～7.25mm，長徑為5.92mm～8.39mm，換算成腫瘤體積為69.91mm³～220.50mm³，平均為140.02mm³。上述結(jié)果也表明，暫時增殖的腫瘤經(jīng)過利用抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的治療而消失。需要說明的是，與其他的抗癌劑合用時，從能夠進一步提高利用本發(fā)明的car表達t細胞的抗腫瘤活性的觀點考慮，優(yōu)選的是，如上述方法那樣，首先利用其他的抗癌劑降低淋巴細胞的細胞數(shù)量，然后施予抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞。利用該方法能夠強化car表達t細胞的生物體內(nèi)平衡(homeostasis)。

實施例9

[向腫瘤組織的浸透效果]

向小鼠皮下接種5×10⁵個p815-hcd20。在接種后第3天，施予1×10⁶個抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞，在接種后第21天切割腫瘤組織。將各組織分成兩半。其中一半進行蘇木精·曙紅(h&e)染色，另一半用于免疫組織化學分析。在免疫組織化學分析中，作為一抗，使用抗cd4及抗cd8的單克隆抗體的組合、或抗cd3及抗dec205的單克隆抗體的組合實施。另外，作為二抗，使用了alexafluor(商標注冊)488綴合抗大鼠igg2a(綠)及alexafluor(商標注冊)647綴合抗大鼠igg2b(紅)。細胞核用dapi(青)進行染色。h&e染色試樣及經(jīng)過免疫標記的片段的顯微鏡觀察以×100或×200的倍率進行。需要說明的是，cd4及cd8為t細胞的標記，dec205為樹突細胞的標記。將h&e染色的結(jié)果示于圖25，將免疫組織化學分析的結(jié)果示于圖26(a)、(b)。另外，將使用雜交細胞計數(shù)程序(hybridcellcountprogram)(keyence公司制)將圖26(a)、(b)的數(shù)據(jù)中的各利用熒光染色(cd4染色(紅)、cd8染色(綠)、cd3染色(紅)、dec205染色(綠)、cd3及dec205的共存(黃))標記的陽性區(qū)域定量而得到的結(jié)果分別示于圖27(a)、(b)。圖25～27中，“未處理”為未處理組，“cont.”為用抗人cd20car表達t細胞進行處理的組，7×19為用抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞進行處理的組。

(結(jié)果)

根據(jù)圖25的結(jié)果，在用抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞進行處理時，觀察到壞死進展(用箭頭示出的區(qū)域)、核消失的區(qū)域。此外，由圖26(a)、27(a)的結(jié)果可見，通過用抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞進行處理，t細胞浸潤至癌組織內(nèi)，以及，由圖26(b)、27(b)的結(jié)果可見，通過用抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞進行處理，樹突細胞與t細胞一同浸潤至癌組織內(nèi)。

實施例10

[利用il-7和ccl19的組合的腫瘤治療效果]

向dba/2小鼠皮下接種5×10⁵個p815-hcd20。在接種后第3天，將1×10⁶個抗人cd20car表達t細胞、作為免疫功能促進因子僅表達il-7(不表達ccl19)的抗人cd20car-il-7表達t細胞、作為免疫功能促進因子僅表達ccl19(不表達il-7)的抗人cd20car-ccl19表達t細胞、或表達il-7及ccl19的抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞施予至靜脈內(nèi)。作為對照，設(shè)置沒有施予不表達il-7及ccl19的car表達t細胞的小鼠組。在施予后第10天測定腫瘤的長軸、短軸，用與上述同樣的方法算出腫瘤的體積(mm³)。將結(jié)果示于圖28。圖28中，“未處理”表示沒有施予car表達t細胞的情況，“對照car”表示施予了抗人cd20car表達t細胞的情況，“il-7car”表示施予了抗人cd20car-il-7表達t細胞的情況，“ccl19car”表示施予了抗人cd20car-ccl19表達t細胞的情況，“il-7/ccl19car”表示施予了抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的情況。

需要說明的是，抗人cd20car-il-7表達t細胞通過下述方法得到：制備含有抗人cd20car-f2a-il-7的pmsgv載體(il-7表達-抗人cd20car載體)，用與實施例1的“小鼠t細胞的轉(zhuǎn)導”同樣的方法導入小鼠t細胞。同樣地，抗人cd20car-ccl19表達t細胞通過下述方法得到：制備含有抗人cd20car-f2a-ccl19的pmsgv載體(ccl19表達-抗人cd20car載體)，用與實施例1的“小鼠t細胞的轉(zhuǎn)導”同樣的方法導入小鼠t細胞。各載體的制備按照實施例1的“表達il-7及ccl19的抗fitccar表達載體的制備”、“表達il-7及ccl19的抗cd20car表達載體的制備”的方法實施。il-7編碼的序列使用了序列號9中的第1～462位和與其連續(xù)的終止密碼子序列，ccl19編碼的序列使用了序列號9中的第538～864位的序列。將結(jié)果示于圖28。

(結(jié)果)

如圖28所示的那樣，施予了抗人cd20car-il-7表達t細胞、抗人cd20car-ccl19表達t細胞的情況下，僅具有與施予了對照(control)的抗人cd20car表達t細胞的情況相比幾乎同等或較低的腫瘤增殖抑制效果，但施予抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞后，腫瘤幾乎消失。由此可見，盡管il-7、ccl19各自單獨幾乎不具有腫瘤增殖抑制效果，但通過將il-7和ccl19組合，能夠得到極高的腫瘤增殖抑制效果。

實施例11

[利用⁵¹cr釋放測定得到的腫瘤細胞損傷活性-1]

(t細胞的免疫功能促進因子的選擇)

在癌組織的微環(huán)境中，將抑制性信號向免疫細胞轉(zhuǎn)導，抗腫瘤免疫反應受到阻礙，從而使免疫療法的效果減弱。抑制信號經(jīng)由shp-1、shp-2轉(zhuǎn)導向免疫細胞。因此，在針對癌癥的t細胞療法中，通過使t細胞自身產(chǎn)生阻礙shp-1、shp-2的作用的顯性負性突變體，能夠強化抗腫瘤效果。因此，制備既表達阻礙shp-1、shp-2的作用的顯性負性突變體和同時還表達car的載體，對腫瘤細胞損傷活性進行了調(diào)查。

(表達shp1或shp2的顯性負性突變體的car表達載體的制備)

編碼含有第453位的催化性半胱氨酸殘基向絲氨酸的突變(c453s)的小鼠shp1顯性負性突變體(shp1dn)的dna片段通過利用pcr的位點特異性突變導入法制備，編碼含有第459位的催化性半胱氨酸殘基向絲氨酸的突變(c459s)的小鼠shp2顯性負性突變體(shp2dn)的dna片段使用了由lifetechnologies公司合成的dna片段。將編碼小鼠shp1dn的堿基序列示于序列號11，將編碼小鼠shp2dn的堿基序列示于序列號12。序列號11中第1357～1359位、及序列號12中第1375～1377位的3個堿基為突變位點。將編碼shp1dn或shp2dn的dna片段插入實施例2的il-7/ccl19表達-抗人cd20car載體制備過程中的含有抗人cd20scfvcar-f2a-mcs的pmsgv載體的mcs，分別得到shp1dn表達-抗人cd20car載體、shp2dn表達-抗人cd20car載體。將得到的載體的配置圖示于圖29。

(小鼠t細胞的轉(zhuǎn)導)

將上述shp1dn表達-抗人cd20car載體、shp2dn表達-抗人cd20car載體使用與實施例1同樣的方法導入小鼠t細胞，分別得到抗人cd20car-shp1dn表達t細胞、抗人cd20car-shp2dn表達t細胞。作為對照，使用了實施例1中制備的抗人cd20car表達t細胞。

(利用⁵¹cr釋放測定得到的腫瘤細胞損傷活性)

利用標準的4小時⁵¹cr釋放測定，對car表達t細胞對于腫瘤的細胞損傷活性進行測定。作為靶腫瘤細胞，使用了表達人cd20的p815(p815-hcd20)。采集上述腫瘤細胞，在100μcina2⁵¹cro4的存在下，于37℃培養(yǎng)1小時，然后洗滌3次。然后，作為效應器t細胞，與抗人cd20car表達t細胞、抗人cd20car-shp1dn表達t細胞、或抗人cd20car-shp2dn表達t細胞共培養(yǎng)。使效應器/靶之比為0.6、1.25、2.5、5、10。將上述細胞在含有10％的triton-x(sigma-aldrich公司制)的培養(yǎng)液或僅在培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，測定靶細胞的最大釋放量和自然釋放量。上清液的⁵¹cr釋放使用topcount閃爍計數(shù)器(perkinelmer公司制)進行測定。特異性損傷的比例使用式：特異性損傷(％)＝[(試驗釋放量-自然釋放量)/(最大釋放量-自然釋放量)]×100算出。將結(jié)果示于圖30。圖30(a)中，○為抗人cd20car表達t細胞，●為抗人cd20car-shp1dn表達t細胞，圖30(b)中，○為抗人cd20car表達t細胞，●為抗人cd20car-shp2dn表達t細胞。另外，橫軸以e/t比表示效應器(t細胞)與靶(腫瘤細胞)之比，縱軸表示特異性損傷(％)。通過學生t檢驗研究了統(tǒng)計學上的顯著差異(*p<0.05)。

如圖30所示的那樣，可見，抗人cd20car-shp1dn表達t細胞、抗人cd20car-shp2dn表達t細胞較之抗人cd20car表達t細胞而言，具有明顯更高的腫瘤細胞損傷活性。

實施例12

[利用⁵¹cr釋放測定得到的腫瘤細胞損傷活性-2]

在未標記(ab，空心)或fitc綴合(fitc-ab，涂黑)利妥昔單抗的存在下，將p815-hcd20(1×10⁴個/孔)以使效應器/靶(e/t)比例成為0.15625、0.3125、0.625、2.5、5、10的方式與抗fitccar表達t細胞(cont，圓形)或抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞(7×19，方形)一同混合，用與上述同樣的方法測定上清液的⁵¹cr釋放，算出損傷活性的比例。將結(jié)果示于圖31。圖31中，在fitc綴合利妥昔單抗的存在下，將與抗fitccar表達t細胞一同混合的情況以“●”表示，將在未標記的利妥昔單抗的存在下與抗fitccar表達t細胞一同混合的情況以“○”表示，將在fitc綴合利妥昔單抗的存在下與抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞一同混合的情況以“■”表示，將在未標記的利妥昔單抗的存在下與抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞一同混合的情況以“□”表示。

另外，將815-hcd20(1×10⁴個/孔)以使效應器/靶(e/t)比例成為0.3125、0.625、2.5、5、10、20的方式與抗人cd20car表達t細胞或抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞一同混合，用與上述同樣的方法測定上清液的⁵¹cr釋放，算出損傷活性的比例。將結(jié)果示于圖33。圖32中，將與抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞一同混合的情況以“●”表示，將與抗人cd20car表達t細胞一同混合的情況以“○”表示。

(結(jié)果)

如圖31、32所示的那樣，可見，抗fitccar-il-7/ccl19表達t細胞的每1個細胞的腫瘤細胞損傷活性維持在與抗fitccar表達t細胞同等的水平，同樣地，抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的每1個細胞的腫瘤細胞損傷活性維持在與抗人cd20car表達t細胞同等的水平。

實施例13

[生物體內(nèi)的car表達t細胞的存活和向記憶t細胞的分化]

(流式細胞術(shù)分析)

向dba/2小鼠皮下接種5×10⁵個p815-hcd20。在接種后第10天將作為抗癌劑的環(huán)磷酰胺(cpa、100mg/kg)施予至腹腔內(nèi)，在第14天將1×10⁶個抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞或抗人cd20car表達t細胞施予至靜脈內(nèi)。在car表達t細胞施予后第21天從脾臟或腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)(腋下、上臂、鼠蹊)分離白細胞。對于白細胞表面的表型，將使用流式細胞術(shù)分析cd4、cd8、cd44、cd62l得到的結(jié)果示于圖33。另外，將脾臟的白細胞與用絲裂霉素c處理的p815-hcd20共同培養(yǎng)4天進行刺激，用流式細胞術(shù)調(diào)查t細胞的增殖的結(jié)果示于圖34。使用生物素標記的蛋白l及apc綴合鏈親和素對car的表達進行了確認。圖33中的數(shù)字表示cd4⁺t細胞、cd8⁺t細胞的各門區(qū)(gateregion)(cd62l⁺cd44^-為幼稚t細胞、cd62l⁺cd44⁺為中央記憶t細胞、cd62l^-cd44⁺為效應器記憶t細胞)的比例，圖34中的數(shù)字表示蛋白l陽性t細胞的比例。另外，在圖33、34中，“cont.”表示抗人cd20car表達t細胞，“7×19”表示抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞。

(結(jié)果)

如圖33、34所示的那樣，可見，在施予了抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞的小鼠中，記憶t細胞在脾臟及淋巴結(jié)中增加，或存活于小鼠內(nèi)的抗人cd20car-il-7/ccl19表達t細胞在與人cd20表達腫瘤細胞共培養(yǎng)后大幅度增殖。綜合圖21、22的存活率的結(jié)果考慮，可認為本發(fā)明的car表達t細胞在施予其的生物體內(nèi)高效存活，并具有通過形成記憶t細胞而殺滅癌細胞、提高存活率的能力，從而表示其對于預防癌癥的復發(fā)也是有效的。

產(chǎn)業(yè)上的可利用性

通過使用本發(fā)明的car表達載體，能夠制備兼具存活能力及淋巴細胞蓄積能力的car-t細胞、具有對于癌癥微環(huán)境中的免疫抑制的抵抗性的car-t細胞，因此，可在癌癥免疫療法的領(lǐng)域中利用。