本發(fā)明涉及一種具有生產(chǎn)l-精氨酸能力的棒狀桿菌屬微生物和使用其生產(chǎn)l-精氨酸的方法。
背景技術：
l-精氨酸為廣泛用于氨基酸補充劑、藥物、食品等中的氨基酸，并且需要開發(fā)在相關行業(yè)中高效的l-精氨酸生產(chǎn)。
通過常規(guī)生物發(fā)酵法生產(chǎn)l-精氨酸的方法是直接從碳源和氮源生產(chǎn)l-精氨酸的方法，且已報道了各種方法，包括使用由短桿菌或棒狀桿菌屬微生物誘導的修飾菌株的方法、使用通過細胞融合而成為具有增強的氨基酸生產(chǎn)能力的細菌細胞系的方法等。最近，報道了使用遺傳重組菌株的方法，其中抑制精氨酸生物合成操縱子argr的表達的基因被滅活(美國專利號7,160,705)，以及使用argf在精氨酸操縱子中過表達的方法(韓國專利號10-0854234)等。特別地，控制精氨酸操縱子的argr中的缺失已被認為是精氨酸生產(chǎn)中的重要因素。
根據(jù)迄今已知的事實，在棒狀桿菌屬微生物中，參與精氨酸生物合成的argcjbdfr基因以操縱子的形式構成，并且通過細胞內(nèi)精氨酸進行反饋抑制(veharysakanyan等，微生物學，142:9-108，1996)，因此對其高產(chǎn)量l-精氨酸生產(chǎn)施加了限制。
技術實現(xiàn)要素：
技術問題
因此，本發(fā)明的發(fā)明人在致力于提高l-精氨酸產(chǎn)量的同時，發(fā)現(xiàn)l-精氨酸可以通過增強精氨酸操縱子和鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的活性，在通常已知為重要因素的精氨酸阻遏物(argr)中沒有任何缺失的情況下，以比親本l-精氨酸生產(chǎn)菌株更高產(chǎn)量地生產(chǎn)l-精氨酸，從而完成本發(fā)明。
技術問題
本發(fā)明的目的為提供一種具有生產(chǎn)l-精氨酸能力的棒狀桿菌屬微生物。
本發(fā)明的另一個目的為提供使用棒狀桿菌屬微生物生產(chǎn)l-精氨酸的方法。
技術效果
可以使用根據(jù)本發(fā)明的具有增強活性的精氨酸操縱子和鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶(argf或argf2)的生產(chǎn)l-精氨酸的棒狀桿菌屬微生物以較高產(chǎn)率來生產(chǎn)l-精氨酸。此外，以高產(chǎn)率生產(chǎn)的l-精氨酸可以有效地用于人類藥物和藥物工業(yè)。
具體實施方式
在實現(xiàn)上述目的的一方面，本發(fā)明提供一種具有增強活性的精氨酸操縱子和鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的、能夠生產(chǎn)l-精氨酸的棒狀桿菌屬微生物。
在本發(fā)明中，精氨酸操縱子是由參與l-精氨酸生物合成機制的酶組成的操縱子，特別地，精氨酸操縱子由構成l-精氨酸生物合成的循環(huán)步驟的酶組成。具體地，精氨酸操縱子由n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶(argc)、n-乙酰谷氨酸轉(zhuǎn)移酶(argj)、n-乙酰谷氨酸激酶(argb)、乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(argd)、鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶(argf)和精氨酸阻遏物(argr)組成，這些酶參與l-精氨酸生物合成的連續(xù)酶反應。
構成精氨酸操縱子的這些酶使用l-谷氨酸作為前體參與最終的l-精氨酸生物合成。n-乙酰谷氨酸轉(zhuǎn)移酶(argj)使用l-谷氨酸作為前體合成n-乙酰谷氨酸，且其可以為由argj基因編碼的。特別地，乙酰基是通過將n-乙酰鳥氨酸分解成l-鳥氨酸而獲得的。已知n-乙酰谷氨酸轉(zhuǎn)移酶參與屬于棒狀桿菌屬的微生物中l(wèi)-精氨酸生物合成的再循環(huán)反應。
生產(chǎn)的n-乙酰谷氨酸通過n-乙酰谷氨酸激酶(argb)被合成為n-乙酰谷氨酰磷酸，adp通過消耗atp作為輔酶生產(chǎn)，且可以為由argb基因編碼的。由于已知由最終產(chǎn)物l-精氨酸進行反饋抑制，通過l-精氨酸釋放反饋抑制的修飾是已知的，并且有報道使用其可以提高l-精氨酸的生產(chǎn)率(中國專利號102021154和氨基酸.2012年7月；43(1)：255-66.doi：10.1007/s00726-011-1069-x.epub2011年9月8日)。
n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶(argc)在大腸桿菌或酵母中也稱為乙酰谷氨酸半醛脫氫酶，且可以由argc基因編碼。通過該酶將n-乙酰谷氨酰磷酸轉(zhuǎn)化為n-乙酰谷氨酸5-半醛。nadph用作輔酶以提供能量。使用l-谷氨酸作為氨基酸供體，將生產(chǎn)的n-乙酰谷氨酸5-半醛轉(zhuǎn)化為n-乙酰鳥氨酸，并且該反應由乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(argd)介導。乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶可由argd基因編碼。轉(zhuǎn)化的n-乙酰鳥氨酸通過n-乙酰谷氨酸轉(zhuǎn)移酶(argj)的再循環(huán)反應，將其乙?；f送至l-谷氨酸，并作為l-鳥氨酸反應。
鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶(argf)通常稱為鳥氨酸氨甲酰水解酶，并且可以由argf或argf2基因編碼。l-鳥氨酸與氨基甲酰磷酸結合以形成l-瓜氨酸，并生產(chǎn)作為副反應產(chǎn)物的磷酸酯。通過上述的與精氨酸操縱子分開存在的精氨基琥珀酸合酶(argg)和精氨基琥珀酸裂解酶(argh)的酶反應，最終將生產(chǎn)的l-瓜氨酸合成為l-精氨酸。l-精氨酸通過總共8個生物合成步驟來合成，在本發(fā)明中，通過強化精氨酸操縱子(argcjbdfr)的活性來誘導l-精氨酸生產(chǎn)率的增強。
構成精氨酸操縱子的酶可以包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要它們具有上述活性，具體地，酶可以為來自棒狀桿菌屬微生物的蛋白質(zhì)。更具體地，n-乙酰谷氨酸轉(zhuǎn)移酶(argj)可以包括seqidno：19的氨基酸序列或與該序列具有至少70％、特別是80％、更特別是90％或更高同源性的氨基酸序列。n-乙酰谷氨酸激酶(argb)可以包括seqidno：21的氨基酸序列或與該序列具有至少70％、特別是80％、更特別是90％或更高同源性的氨基酸序列。此外，在相應的酶的情況下，可以引入本領域中已知的修飾，以通過精氨酸釋放反饋抑制。n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶(argc)可以包括seqidno：23的氨基酸序列或與該序列具有至少70％、特別是80％、更特別是90％或更高同源性的氨基酸序列。乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(argd)可包括seqidno：25的氨基酸序列或與該序列具有至少70％、特別是80％、更特別是90％或更高同源性的氨基酸序列。鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶(argf)可以包括seqidno：1或seqidno：3的氨基酸序列，或者可以包括與seqidno：1或seqidno：3的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。具體地，鳥氨酸氨基甲?；D(zhuǎn)移酶(argf)可以包括與seqidno：1或seqidno：3的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高同源性的氨基酸序列。此外，顯而易見的是，在一個或多個氨基酸殘基中包括缺失、修飾、取代或添加的氨基酸序列落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要它們與上述蛋白質(zhì)具有同源性并且具有與上述蛋白質(zhì)基本上相同或相應的生物活性即可。
如本文所用，術語“同源性”是指用于比較的兩個氨基酸序列或核苷酸序列之間的相似性程度，并且它們的同源性可以通過裸眼或使用生物信息學算法的比較來確定，其通過比對要對比的序列來提供同源性程度的分析結果。兩個氨基酸序列之間的同源性可以以百分比表示。有用的自動算法可以用于威斯康星州遺傳學軟件包(美國威斯康星州遺傳學電腦集團，麥迪遜)的gap、bestfit、fasta和tfasta計算機軟件模塊中。其它有用的算法和比對的同源性測定已經(jīng)在軟件中自動化，例如fastp、blast、blast2、psiblast和clustalw。
在本發(fā)明中，精氨酸操縱子活性的增強可以指精氨酸操縱子中存在的酶中的至少一種酶的活性的增強，然而，其不包括單獨的argr基因的單一增強。例如，精氨酸操縱子活性的增強可以指通過增強精氨酸操縱子中存在的一種酶的啟動子來增強操縱子中存在的所有酶的活性，并具體地，可以指通過增強n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶的啟動子來增強整個操縱子的活性。另外，在本發(fā)明中，對構成精氨酸操縱子的酶中至少一種酶進行編碼的基因的表達的增加也可以被認為是精氨酸操縱子活性的增強。
如本文所用，術語活性的“增強”是指提供沒有具蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)的特定活性的微生物，或者提高具有蛋白質(zhì)活性的微生物的細胞內(nèi)活性等，并且指與蛋白質(zhì)的內(nèi)在活性相比，蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)活性的增加。如本文所用，術語內(nèi)在活性是指屬于棒狀桿菌屬的微生物在天然或預修飾狀態(tài)下具有的酶的活性狀態(tài)。
為了增強或增加酶的活性，可以應用本領域中已知的各種方法。盡管它們不限于此，但方法的示例可以包括：通過進一步將包含編碼相應酶的核苷酸序列的多核苷酸插入染色體中或?qū)⒍嗪塑账釋胼d體系統(tǒng)等以增加編碼酶的核苷酸序列的復制數(shù)量的方法、用強啟動子代替酶啟動子的方法，并具體地，可以包括在啟動子上引入修飾的方法、以及通過遺傳修飾將酶修飾為具有強活性的酶的方法。
本發(fā)明中的具體實例可以包括：通過修飾或取代啟動子，將存在于精氨酸操縱子中的酶啟動子修飾為與內(nèi)源啟動子相比較強的啟動子的方法。可以連接具有核苷酸取代修飾的改良啟動子或異源啟動子來代替內(nèi)源酶的啟動子，并且異源啟動子的示例可以包括pcj7啟動子(韓國專利號10-0620092)、lyscp1啟動子(韓國專利號10-0930203)、ef-tu啟動子、groel啟動子、acea啟動子、aceb啟動子等，但不限于此。
如本文所用，術語“啟動子”是指編碼區(qū)上游的非編碼核酸序列，其包括聚合酶結合區(qū)，且具有轉(zhuǎn)錄啟動到啟動子下游基因的mrna的活性，即，其中聚合酶結合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的dna區(qū)域，并且位于mrna轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)的5'區(qū)域。
在本發(fā)明中，可以使用本領域公知的各種方法進行鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶活性的增強，并且它們與上述相同。具體地，可以通過將包含編碼鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸的表達載體(vector)轉(zhuǎn)化到細菌菌株中來實現(xiàn)增強，但不限于此。
如本文所用，術語“轉(zhuǎn)化”是指將dna引入宿主中，從而使插入的dna可復制為染色體外因子或通過染色體整合。具體地，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可以通過在將包含上述dna的載體轉(zhuǎn)化到宿主細胞中后，在載體內(nèi)具有啟動子活性的核酸分子的序列和內(nèi)源靶基因的啟動子區(qū)域中的序列之間的同源重組插入染色體中，或可以以質(zhì)粒的形式保留。
本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化方法可以包括能夠?qū)⒑怂釋爰毎娜魏畏椒ǎ⑶铱梢愿鶕?jù)每個宿主細胞選擇和進行本領域中已知的任何適當?shù)臉藴始夹g。例如，可以使用電穿孔、磷酸鈣(capo4)沉淀、氯化鈣(cacl2)沉淀、顯微注射、聚乙二醇(peg)法、deae-葡聚糖法、陽離子脂質(zhì)體法、乙酸鋰/dmso法等，但是該方法不限于此。
如本文所用，術語“棒狀桿菌屬(corynebacteriumsp.)微生物”可以指屬于具有l(wèi)-精氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌屬的所有菌株，例如谷氨酸棒狀桿菌、產(chǎn)氨棒狀桿菌、熱產(chǎn)氨棒狀桿菌、黃色短桿菌、發(fā)酵短桿菌等，但不限于此。具體地，可以使用谷氨酸棒狀桿菌，但是微生物不限于此。
另一方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)l-精氨酸的方法，包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)棒狀桿菌屬的l-精氨酸生產(chǎn)微生物。
在本發(fā)明中，微生物培養(yǎng)可以根據(jù)本領域中公知的方法進行，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基的ph等條件可以適當?shù)卣{(diào)整。已知的培養(yǎng)方法詳細地描述于參考文獻(chmiel；bioprozesstechnik1.einfuhrungindiebioverfahrenstechnik(gustavfischerverlag，stuttgart，1991)和storhas；bioreaktorenundperiphereeinrichtungen(viewegverlag，braunschweig/wiesbaden，1994)。此外，培養(yǎng)方法可以包括分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和補料分批培養(yǎng)，具體地，培養(yǎng)可以通過分批方法或補料分批或重復補料分批方法連續(xù)進行，但不限于此。
使用的培養(yǎng)基應當適當?shù)貪M足特定菌株的所需條件。用于各種微生物的培養(yǎng)基是已知的(例如，“manualofmethodsforgeneralbacteriology”fromamericansocietyforbacteriology(washingtond.c.，usa，1981))。包含在培養(yǎng)基中的碳源可以包括糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和纖維素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)、有機酸(例如乙酸)等。這些材料可以單獨或作為混合物使用，但不限于此。包含在培養(yǎng)基中的氮源可以包括含氮有機化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麥芽提取物、玉米漿、大豆粉末和尿素)和無機化合物(例如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨)，這些材料也可以單獨或作為混合物使用，但不限于此。培養(yǎng)基中所含的磷源可以包括磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或其等價的含鈉鹽，但不限于此。培養(yǎng)基可以含有生長必需的金屬鹽(例如，硫酸鎂或硫酸鐵)，并且除了上述材料之外，還可以使用基本的生長促進材料例如氨基酸和維生素。另外，可以將適當?shù)那绑w進一步加入到培養(yǎng)基中。上述待供應的材料可以在培養(yǎng)期間立即或適當?shù)靥砑拥脚囵B(yǎng)基中。
培養(yǎng)基的ph可以使用堿性化合物(例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)適當調(diào)節(jié)。
發(fā)泡可以使用消泡劑例如脂肪酸聚乙二醇酯調(diào)節(jié)?？梢酝ㄟ^將氧氣或含氧氣體混合物例如空氣引入培養(yǎng)基中以維持需氧條件。培養(yǎng)溫度可以為20℃至45℃，并具體為25℃至40℃?？梢岳^續(xù)培養(yǎng)直至獲得所需l-氨基酸產(chǎn)量的最大量，并具體為10小時至160小時。l-精氨酸可以釋放到培養(yǎng)基中或可以保持包含在細胞中。
同時，包括培養(yǎng)上述微生物的本發(fā)明的l-精氨酸的生產(chǎn)方法可以進一步包括在培養(yǎng)過程中回收l-精氨酸的步驟。也就是說，本發(fā)明的l-精氨酸的制備方法可以包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)棒狀桿菌屬微生物，并從微生物和培養(yǎng)基中回收l-精氨酸?；厥站彼岬牟襟E可以意指使用本領域中廣泛已知的回收精氨酸的方法從細胞或培養(yǎng)基中分離精氨酸?；厥誰-精氨酸的方法可以包括離心分離、過濾、萃取、噴霧、干燥、蒸發(fā)、沉淀、結晶、電泳、分級溶解、色譜(例如離子交換、親和、疏水性、尺寸排除和高性能液相色譜)等，但不限于此。
實施例
在下文中，將參考以下實施例更詳細地描述本發(fā)明。然而，這些實施例僅用于說明的目的，并且本發(fā)明不受這些實施例的限制。
實施例1：具有增強的精氨酸操縱子的載體的構建
為了增強微生物染色體上的精氨酸操縱子，構建了缺失n-乙酰谷氨酰磷酸還原酶(argc)的自啟動子并用不同的啟動子取代的載體。使用lyscp1(韓國專利號10-0930203中公開的seqidno：18)作為取代啟動子，其具有強的表達誘導活性。
首先，使用谷氨酸棒狀桿菌(保藏號：atcc13869)的野生型菌株的染色體dna作為模板，以及引物對seqidno：13(sf_pargc_pr_pdc融合引物；5'-cgagctcggtacccgggcaaagaatacggcttccttggc-3')和seqidno：14(sr_pargc_pr_xbai-xhoi-bamhi融合/限制酶引物；5'-ctggatcctcgagtctagagacgggttagacatgcaaaa-3')和引物對seqidno：15(sf_pargc_pr_spei-scai-bamhi融合/限制酶引物；5'-gactcgaggatccagtactagtatgataatcaaggttgcaat-3')和seqidno：16(sr_pargc_pr_pdc融合引物；5'-tgcaggtcgactctagggtaacgccttctttcaaag-3')，通過初級聚合酶鏈式反應(pcr)擴增dna片段。pcr反應的具體條件如下：通過使用pcr裝置(bio-radc1000熱循環(huán)儀)和pfu聚合酶(macrogen)在95℃下變性10分鐘，在55℃下退火30秒，并在72℃下延伸1分鐘，并且重復28個循環(huán)以進行pcr反應。
使用片段dna純化試劑盒(geneall)純化由此獲得的初級pcr片段，然后通過將其與已經(jīng)通過用xmai-xbai限制性酶消化而制備的pd載體混合以將三個dna片段連接。使用融合克隆試劑盒(clontech)，使連接的dna片段在50℃下進行反應10分鐘，從而構建pd-rargc_pr載體。
以如下方式進行取代啟動子的插入：使用pdz-lyscp1(韓國專利號10-0930203)作為模板，以及引物對seqidno：5(sf_plyscp1_xhoi-xbai融合引物；5'-ccgtctctagactcgagccatcttttggggtgcgg-3')和seqidno：6(sr_plyscp1_spei融合引物；5'-ttgattatcatactagtctttgtgcacctttcgat-3')擴增lyscp1啟動子，并通過將它們與已經(jīng)通過用xhoi-spei限制酶消化而制備的pd-pargc_pr載體混合以連接。pcr和融合克隆的方法與上述相同，最后通過所述方法構建pd-pargc::lyscp1載體。
實施例2：具有增強的鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的載體的構建
為了增強精氨酸生物合成酶之一的鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶，構建了重組表達載體。使用p117-cj7-gfp(韓國專利號10-0620092)作為模板載體，并通過用ecorv-xbai限制酶處理而除去模板載體中編碼gfp的核苷酸序列，并且插入來源于谷氨酸棒狀桿菌atcc13869的野生型菌株argf和argf2(韓國專利號10-0830290)。
使用谷氨酸棒狀桿菌(保藏號：atcc13869)的野生型菌株的染色體dna作為模板，以及引物對seqidno：7(sf_argf_ecorv融合引物；5'-acgaaaggaaacactcgatatcatgacttcacaaccacaggt-3')和seqidno：8(sr_argf_xbai融合引物；5'-gccaaaacagctctagattacctcggctggtgggcca-3')，通過pcr擴增argf基因的dna片段。通過使用pfu聚合酶在95℃下變性10分鐘，在55℃下退火30秒，和在72℃下延伸2分鐘，并重復28個循環(huán)以進行pcr反應。將如此獲得的pcr片段純化并與已經(jīng)用ecorv-xbai限制酶處理的p117-cj7-gfp混合，并通過融合克隆法連接，從而構建了重組表達載體p117-pcj7-argf。
使用谷氨酸棒狀桿菌(保藏號：atcc13032)的野生型菌株的染色體dna作為模板，使用引物對seqidno：9(sf_argf2_ecorv融合引物；5'-acgaaaggaaacactcgatatcatggccagaaaacatctgct-3')和seqidno：10(sr_argf2_xbai融合引物；5'-gccaaaacagctctagactacgcattgatcgaccgag-3')和pfu聚合酶(macrogen)，通過在95℃下變性10分鐘，在55℃下退火30秒，并使用pfu聚合酶在72℃下延伸2分鐘，重復28個循環(huán)以進行pcr，通過pcr擴增argf2基因。將如此獲得的pcr片段純化并與已經(jīng)用ecorv-xbai限制酶處理的p117-cj7-gfp混合，并通過融合克隆試劑盒連接，從而構建了重組表達載體p117-pcj7-argf2。
此外，構建了可同時表達argf和argf2基因的重組表達載體。將如此構建的表達載體p117-pcj7-argf用noti處理，然后將p117-pcj7-argf2插入其中。具體地，使用重組質(zhì)粒p117-pcj7-argf2作為模板，以及seqidno：11(sf_pcj7_argf2_noti融合引物；5'-cctttttgcggcggccgcagaaacatcccagcgctact-3')和seqidno：12(sr_argf2_noti融合引物：5'-caccgcggtggcgcggtggcggccgccgcaaaaaggccatccgtca-3')引物和pfu聚合酶，通過在95℃下變性10分鐘，在55℃下退火30秒并在72℃下延伸2.5分鐘，并重復28個循環(huán)，從而進行pcr反應。將如此獲得的pcr片段純化并與已經(jīng)用noti限制酶處理的p117-pcj7-argf混合，并通過融合克隆試劑盒連接，最后構建了重組表達載體p117-pcj7-argf/pcj7-argf2。
實施例3：其中插入有重組載體的菌株的構建
3-1.插入具有增強的精氨酸操縱子的載體
為了將棒狀桿菌染色體上的精氨酸操縱子的自啟動子pd-pargc::lyscp1替換，將實施例1中構建的重組載體轉(zhuǎn)化到現(xiàn)有的精氨酸生產(chǎn)棒狀桿菌菌株，從而構建插入有重組載體的棒狀桿菌菌株。具體地，通過將實施例1中構建的重組載體pd-pargc::lyscp1轉(zhuǎn)化到現(xiàn)有的kccm10741p(韓國專利號10-07916590)和atcc21831的產(chǎn)精氨酸菌株中，將lyscp1啟動子序列插入染色體中，由此通過同源重組用載體的啟動子序列置換親本菌株具有的自啟動子序列。
在進行轉(zhuǎn)化時，首先通過電脈沖法(applmicrobiolbiotechnol.1999oct；52(4)：541-5)將重組載體插入kccm10741p和atcc21831中，并通過重組在其染色體上插入的菌株的同源序列在含有25mg/l卡那霉素的培養(yǎng)基中選擇。使選擇的初級菌株進行雜交，從而選擇那些用lyscp1啟動子取代啟動子并除去載體的菌株。通過使用引物對seqidno：5和seqidno：6的pcr確認最終轉(zhuǎn)化菌株中啟動子取代的存在，并將菌株命名為kccm10741p_δpargc::lyscp1和atcc21831_δpargc::lyscp1。
3-2、插入具有增強的鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶的載體
通過電脈沖法將實施例2中構建的重組表達載體p117-pcj7-argf、p117-pcj7-argf2、和p117-pcj7-argf/pcj7-argf2插入到菌株kccm10741p_δpargc::lyscp1和atcc21831_δpargc::lyscp1，在含有25mg/l卡那霉素的培養(yǎng)基中選擇，并且最終構建進一步表達argf、argf2和argf/argf2的菌株。該菌株被命名為kccm10741p_δpargc::lyscp1_pcj7-argf、kccm10741p_δpargc::lyscp1_pcj7-argf2、kccm10741p_δpargc::lyscp1_pcj7-argf/pcj7-argf2、atcc21831_δpargc::lyscp1_pcj7-argf、atcc21831_δpargc::lyscp1_pcj7-argf2和atcc21831_δpargc::lyscp1_pcj7-argf/pcj7-argf2，而其中，在2013年12月9日，根據(jù)布達佩斯條約在韓國微生物保藏中心(kccm)，將kccm10741p_δpargc::lyscp1_pcj7-argf2改名為ca06-2044，登記號為kccm11498p。
實施例4：構建菌株的評價
為了使用谷氨酸棒狀桿菌kccm10741p_δpargc::lyscp1、kccm10741p_δpargc::lyscp1_pcj7-argf、kccm10741p_δpargc::lyscp1_pcj7-argf2、kccm10741p_δpargc::lyscp1_pcj7-argf/pcj7-argf2、atcc21831_δpargc::lyscp1、atcc21831_δpargc::lyscp1_pcj7-argf、atcc21831_δpargc::lyscp1_pcj7-argf2和atcc21831_δpargc::lyscp1_pcj7-argf/pcj7-argf2(實施例3中構建的精氨酸生產(chǎn)菌株)來檢查精氨酸操縱子和鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的增強對精氨酸生產(chǎn)能力的影響，將它們進行如下所示培養(yǎng)。具體地，將作為親本菌株的谷氨酸棒狀桿菌kccm10741p和atcc21831用作對照，將菌株的鉑圈分別接種到含有25ml(6％葡萄糖、3％硫酸銨、0.1％磷酸鉀、0.2％七水硫酸鎂、1.5％玉米漿(csl)、1％氯化鈉、0.5％酵母提取物和100μg/l生物素，ph7.2)生產(chǎn)培養(yǎng)基的250ml角擋板燒瓶上，并在30℃下在200rpm下溫育48小時。培養(yǎng)完成時，通過hplc測量l-精氨酸產(chǎn)量，將結果示于下表1中。
[表1]
通過親本菌株和重組菌株確認精氨酸生產(chǎn)能力
如上表1中所示，與對照相比，其中編碼精氨酸操縱子和鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶的基因同時增強的菌株顯示出的精氨酸產(chǎn)生能力最大增加50％。此外，通過引入argf、argf2或argf和argf2，解決了單獨的精氨酸操縱子(kccm10741p_δpargc::lyscp1和atcc21831_δpargc::lyscp1)的增強中所示的精氨酸濃度和鳥氨酸濃度的增加，并最終顯示精氨酸濃度增加的結果。
從前述內(nèi)容，本發(fā)明所屬的本領域技術人員將能夠理解的是，在不改變本發(fā)明的技術概念或本質(zhì)特征的情況下，本發(fā)明可以以其它具體形式實施。在這點上，本文中公開的示例性實施例僅用于說明性目的，而不應被解釋為限制本發(fā)明的范圍。相反，本發(fā)明旨在不僅覆蓋示例性實施方式，而且覆蓋可以包括在由所附權利要求限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種替代、修改、等同和其它實施方式。
<110>cj第一制糖株式會社
<120>用于生產(chǎn)l-精氨酸的棒狀桿菌屬微生物和使用其的l-精氨酸生產(chǎn)方法
<130>opa15238
<150>kr10-2014-0137794
<151>2014-10-13
<150>kr10-2015-0076311
<151>2015-05-29
<160>26
<170>kopatentin2.0
<210>1
<211>319
<212>prt
<213>谷氨酸棒狀桿菌argf
<400>1
metthrserglnproglnvalarghispheleualaaspaspaspleu
151015
thrproalagluglnalagluvalleuthrleualaalalysleulys
202530
alaalaprophesergluargproleugluglyprolysservalala
354045
valleupheasplysthrserthrargthrargpheserpheaspala
505560
glyilealahisleuglyglyhisalailevalvalaspserglyser
65707580
serglnmetglylysglygluthrleuglnaspthralaalavalleu
859095
serargtyrvalglualailevaltrpargthrtyralahisserasn
100105110
phehisalametalagluthrserthrvalproleuvalasnserleu
115120125
seraspaspleuhisprocysglnileleualaaspleuglnthrile
130135140
valgluasnleuserproglugluglyproalaglyleulysglylys
145150155160
lysalavaltyrleuglyaspglyaspasnasnmetalaasnsertyr
165170175
metileglyphealathralaglymetaspileserileilealapro
180185190
gluglypheglnproargalagluphevalgluargalaglulysarg
195200205
glyglngluthrglyalalysvalvalvalthraspserleuaspglu
210215220
valalaglyalaaspvalvalilethraspthrtrpvalsermetgly
225230235240
metgluasnaspglyileaspargthrthrprophevalprotyrgln
245250255
valasnaspgluvalmetalalysalaasnaspglyalailepheleu
260265270
hiscysleuproalatyrargglylysgluvalalaalaservalile
275280285
aspglyproalaserlysvalpheaspglualagluasnargleuhis
290295300
alaglnlysalaleuleuvaltrpleuleualahisglnproarg
305310315
<210>2
<211>960
<212>dna
<213>谷氨酸棒狀桿菌argf
<400>2
atgacttcacaaccacaggttcgccatttcctggctgatgatgatctcacccctgcagag60
caggcagaggttttgaccctagccgcaaagctcaaggcagcgccgttttcggagcgtcca120
ctcgagggaccaaagtccgttgcagttctttttgataagacttcaactcgtactcgcttc180
tccttcgacgcgggcatcgctcatttgggtggacatgccatcgtcgtggattccggcagc240
tcacagatgggtaagggcgagaccctgcaggacaccgcagctgtattgtcccgctacgtg300
gaagcaattgtgtggcgcacctacgcacacagcaatttccacgccatggcggagacgtcc360
actgtgccactggtgaactccttgtccgatgatctgcacccatgccagattctggctgat420
ctgcagaccatcgtggaaaacctcagccctgaagaaggcccagcaggccttaagggtaag480
aaggctgtgtacctgggcgatggcgacaacaacatggccaactcctacatgattggcttt540
gccaccgcgggcatggatatctccatcatcgctcctgaagggttccagcctcgtgcggaa600
ttcgtggagcgcgcggaaaagcgtggccaggaaaccggcgcgaaggttgttgtcaccgac660
agcctcgacgaggttgccggcgccgatgttgtcatcaccgatacctgggtatccatgggt720
atggaaaacgacggcatcgatcgcaccacacctttcgttccctaccaggtcaacgatgag780
gtcatggcgaaagctaacgacggcgccatcttcctgcactgccttcctgcctaccgcggc840
aaagaagtggcagcctccgtgattgatggaccagcgtccaaagttttcgatgaagcagaa900
aaccgcctccacgctcagaaagcactgctggtgtggctgctggcccaccagccgaggtaa960
<210>3
<211>274
<212>prt
<213>谷氨酸棒狀桿菌argf2
<400>3
metalaarglyshisleuleuserleualaasptrpasnargglyglu
151015
leuglualaleuphegluleualagluglntyrglualaglyglygly
202530
proargpheaspglyalaalaalametphepheproprothrserleu
354045
argthrargleuserphegluargglyalathralametglyleugln
505560
proilethrpheproseraspserleuasplysaspgluaspleuval
65707580
aspvalvalglytyrleuserglntrpalaaspvalvalvalvalarg
859095
hisproglnleuthralaleuglnargleualaseralaaspalaala
100105110
provalileasnalametthrsergluasnhisprocysgluvalleu
115120125
seraspleutyralaleuserarghishisaspileseralaleuarg
130135140
tyrleuphevalglyglyaspglyasnilealaargalatrptrpglu
145150155160
alaalaglnalapheglyleuglumetargglnsercysprogluglu
165170175
leuargvalvalglymetprotrpglugluasnleuprohisalaile
180185190
alaseralaaspvalvalleuthraspglyproglyarghisalaglu
195200205
leuleugluprotyrargvalthralaalaleuleuaspargalapro
210215220
argglyvalargleualaprocyspropropheileargglyargglu
225230235240
valseralaaspalailegluhisproalaphevalglytyrserphe
245250255
lysarghisleumetprovalglnglnalaileleualaargserile
260265270
asnala
<210>4
<211>825
<212>dna
<213>谷氨酸棒狀桿菌argf2
<400>4
atggccagaaaacatctgctctccctggcagactggaacagaggcgagcttgaggcatta60
ttcgagctcgcggagcagtatgaagctggcggtgggccacgattcgatggtgccgcggcg120
atgttcttcccgccgacgagtttgcgtacacggctctcattcgagcgtggggcaacggca180
atgggactccagccgatcacgttcccgtcagacagcctggacaaggacgaagatctcgtc240
gacgtcgtcggctatctctcgcagtgggctgatgtcgttgtcgtccgacacccgcaattg300
acggcgcttcagcggttggcgtcagcggatgcagcgcccgtgatcaacgcgatgacgagt360
gagaaccatccgtgcgaagtcctctcggacttgtatgcgctgtctcgtcaccatgacatt420
tcggccctgcggtacctgtttgtcggtggcgatggcaacatcgccagggcctggtgggag480
gcggcccaagcgttcggcctcgagatgcggcagagttgtcctgaagagctgcgtgtcgtc540
gggatgccgtgggaggagaacctgccgcatgcaattgcatcagcggatgtcgtgctgacg600
gatgggccaggtagacatgcggagttactcgagccgtatcgtgtgaccgctgcgttgttg660
gatcgcgcgccccgtggagtgcggctcgcgccctgcccgccgttcatccgcgggcgcgaa720
gtgagcgccgatgcgatcgagcatccggcgttcgtcgggtactcgttcaagcgtcatctc780
atgccggttcagcaggcgattctggctcggtcgatcaatgcgtag825
<210>5
<211>35
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>sf_plyscp1_xhoi-xbai引物
<400>5
ccgtctctagactcgagccatcttttggggtgcgg35
<210>6
<211>35
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>sr_plyscp1_spei引物
<400>6
ttgattatcatactagtctttgtgcacctttcgat35
<210>7
<211>42
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>sf_argf_ecorv引物
<400>7
acgaaaggaaacactcgatatcatgacttcacaaccacaggt42
<210>8
<211>37
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>sr_argf_xbai引物
<400>8
gccaaaacagctctagattacctcggctggtgggcca37
<210>9
<211>42
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>sf_argf2_ecorv引物
<400>9
acgaaaggaaacactcgatatcatggccagaaaacatctgct42
<210>10
<211>37
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>sr_argf2_xbai引物
<400>10
gccaaaacagctctagactacgcattgatcgaccgag37
<210>11
<211>38
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>sf_pcj7_argf2_noti引物
<400>11
cctttttgcggcggccgcagaaacatcccagcgctact38
<210>12
<211>38
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>sr_argf2_noti引物
<400>12
caccgcggtggcggccgccgcaaaaaggccatccgtca38
<210>13
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>sf_pargc_pr_pdc引物
<400>13
cgagctcggtacccgggcaaagaatacggcttccttggc39
<210>14
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>sr_pargc_pr_xbai-xhoi-bamhi引物
<400>14
ctggatcctcgagtctagagacgggttagacatgcaaaa39
<210>15
<211>42
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>sf_pargc_pr_spei-scai-bamhi引物
<400>15
gactcgaggatccagtactagtatgataatcaaggttgcaat42
<210>16
<211>36
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>sr_pargc_pr_pdc引物
<400>16
tgcaggtcgactctagggtaacgccttctttcaaag36
<210>17
<211>317
<212>dna
<213>谷氨酸棒狀桿菌cj7啟動子
<400>17
agaaacatcccagcgctactaatagggagcgttgaccttccttccacggaccggtaatcg60
gagtgcctaaaaccgcatgcggcttaggctccaagataggttctgcgcggccgggtaatg120
catcttctttagcaacaagttgaggggtaggtgcaaataagaacgacatagaaatcgtct180
cctttctgtttttaatcaacatacaccaccacctaaaaattccccgaccagcaagttcac240
agtattcgggcacaatatcgttgccaaaatattgtttcggaatatcatgggatacgtacc300
caacgaaaggaaacact317
<210>18
<211>353
<212>dna
<213>谷氨酸棒狀桿菌lyscp1啟動子
<400>18
ccatcttttggggtgcggagcgcgatccggtgtctgaccacggtgccccatgcgattgtt60
aatgccgatgctagggcgaaaagcacggcgagcagattgctttgcacttgattcagggta120
gttgactaaagagttgctcgcgaagtagcacctgtcacttttgtctcaaatattaaatcg180
aatatcaatatatggtctgtttattggaacgcgtcccagtggctgagacgcatccgctaa240
agccccaggaaccctgtgcagaaagaaaacactcctctggctaggtagacacagtttatt300
gtggtagagttgagcgggtaactgtcagcacgtagatcgaaaggtgcacaaag353
<210>19
<211>388
<212>prt
<213>谷氨酸棒狀桿菌argj
<400>19
metalalyslysglyilethralaprolysglyphevalalaserala
151015
thrthralaglyilelysalaserglyasnproaspmetalaleuval
202530
valasnglnglyproglupheseralaalaalavalphethrargasn
354045
argvalphealaalaprovallysvalserarggluasnvalalaasp
505560
glyglnileargalavalleutyrasnalaglyasnalaasnalacys
65707580
asnglyleuglnglyglulysaspalaarggluservalserhisleu
859095
alaglnasnleuglyleugluaspseraspileglyvalcysserthr
100105110
glyleuileglygluleuleuprometasplysleuasnthrglyile
115120125
aspglnleuthralagluglyalaleuglyaspasnglyalaalaala
130135140
alalysalailemetthrthraspthrvalasplysgluthrvalval
145150155160
phealaaspglytrpthrvalglyglymetglylysglyvalglymet
165170175
metalaproserleualathrmetleuvalcysleuthrthraspala
180185190
servalthrglnglumetalaglnilealaleualaasnalathrala
195200205
valthrpheaspthrleuaspileaspglyserthrserthrasnasp
210215220
thrvalpheleuleualaserglyalaserglyilethrprothrgln
225230235240
aspgluleuasnaspalavaltyralaalacysseraspilealaala
245250255
lysleuglnalaaspalagluglyvalthrlysargvalalavalthr
260265270
valvalglythrthrasnasngluglnalaileasnalaalaargthr
275280285
valalaargaspasnleuphelyscysalametpheglyserasppro
290295300
asntrpglyargvalleualaalavalglymetalaaspalaaspmet
305310315320
gluproglulysileservalphepheasnaspglnalavalcysleu
325330335
aspserthrglyalaproglyalaarggluvalaspleuserglyala
340345350
aspileaspvalargileaspleuglythrserglygluglyglnala
355360365
thrvalargthrthraspleuserphesertyrvalgluileasnser
370375380
alatyrserser
385
<210>20
<211>1167
<212>dna
<213>谷氨酸棒狀桿菌argj
<400>20
atggccaaaaaaggcattaccgcgccgaaaggcttcgttgcttctgcaacgaccgcgggt60
attaaagcttctggcaatcctgacatggcgttggtggttaaccagggtccagagttttcc120
gcagcggccgtgtttacacgcaaccgagttttcgcagcgcctgtgaaggtgagccgggag180
aacgttgctgatggccagatcagggctgttttgtacaacgctggtaatgctaatgcgtgt240
aatggtctgcagggtgagaaggatgctcgtgagtctgtttctcatctagctcaaaatttg300
ggcttggaggattccgatattggtgtgtgttccactggtcttattggtgagttgcttccg360
atggataagctcaatacaggtattgatcagctgaccgctgagggcgctttgggtgacaat420
ggtgcagctgctgccaaggcgatcatgaccactgacacggtggataaggaaaccgtcgtg480
tttgctgatggttggactgtcggcggaatgggcaagggcgtgggcatgatggcgccgtct540
cttgccaccatgctggtctgcttgaccactgatgcatccgttactcaggaaatggctcag600
attgcgctggctaatgctacggccgttacgtttgacaccctggatattgatggatcaacc660
tccaccaatgacaccgtgttcctgctggcatctggcgctagcggaatcaccccaactcag720
gatgaactcaacgatgcggtgtacgcagcttgttctgatatcgcagcgaagcttcaggct780
gatgcagagggggtgaccaagcgcgttgctgtgacagtggtgggaaccaccaacaacgag840
caggcgatcaatgcggctcgcacggttgctcgtgacaatttgttcaagtgcgcaatgttt900
ggatctgatccaaactggggtcgcgtgttggctgcagtcggcatggctgatgctgatatg960
gaaccagagaagatttctgtgttcttcaatgatcaagcagtatgccttgattccactggc1020
gctcctggtgctcgtgaggtggatctttccggcgctgacattgatgtccgaattgatttg1080
ggcaccagtggggaaggccaggcaacagttcgaaccactgacctgagcttctcctacgtg1140
gagatcaactccgcgtacagctcttaa1167
<210>21
<211>317
<212>prt
<213>谷氨酸棒狀桿菌argb
<400>21
metasnaspleuilelysaspleuglysergluvalargalaasnval
151015
leualaglualaleuprotrpleuglnhispheargasplysileval
202530
valvallystyrglyglyasnalametvalaspaspaspleulysala
354045
alaphealaalaaspmetvalpheleuargthrvalglyalalyspro
505560
valvalvalhisglyglyglyproglnileserglumetleuasnarg
65707580
valglyleuglnglygluphelysglyglypheargvalthrthrpro
859095
gluvalmetaspilevalargmetvalleupheglyglnvalglyarg
100105110
aspleuvalglyleuileasnserhisglyprotyralavalglythr
115120125
serglygluaspalaglyleuphethralaglnlysargmetvalasn
130135140
ileaspglyvalprothraspileglyleuvalglyaspileileasn
145150155160
valaspalaserserleumetaspileileglualaglyargilepro
165170175
valvalserthrilealaproglygluaspglyglniletyrasnile
180185190
asnalaaspthralaalaglyalaleualaalaalaileglyalaglu
195200205
argleuleuvalleuthrasnvalgluglyleutyrthrasptrppro
210215220
asplysserserleuvalserlysilelysalathrgluleugluala
225230235240
ileleuproglyleuaspserglymetileprolysmetglusercys
245250255
leuasnalavalargglyglyvalseralaalahisvalileaspgly
260265270
argilealahisservalleuleugluleuleuthrmetglyglyile
275280285
glythrmetvalleuproaspvalpheasparggluasntyrproglu
290295300
glythrvalphearglysaspasplysaspglygluleu
305310315
<210>22
<211>954
<212>dna
<213>谷氨酸棒狀桿菌argb
<400>22
atgaatgacttgatcaaagatttaggctctgaggtgcgcgcaaatgtcctcgctgaggcg60
ttgccatggttgcagcatttccgcgacaagattgttgtcgtgaaatatggcggaaacgcc120
atggtggatgatgatctcaaggctgcttttgctgccgacatggtcttcttgcgcaccgtg180
ggcgcaaaaccagtggtggtgcacggtggtggacctcagatttctgagatgctaaaccgt240
gtgggtctccagggcgagttcaagggtggtttccgtgtgaccactcctgaggtcatggac300
attgtgcgcatggtgctctttggtcaggtcggtcgcgatttagttggtttgatcaactct360
catggcccttacgctgtgggaacctccggtgaggatgccggcctgtttaccgcgcagaag420
cgcatggtcaacatcgatggcgtacccactgatattggtttggtcggagacatcattaat480
gtcgatgcctcttccttgatggatatcatcgaggccggtcgcattcctgtggtctctacg540
attgctccaggcgaagacggccagatttacaacatcaacgccgataccgcagcgggtgct600
ttggctgcagcgattggtgcagaacgcctgctggttctcaccaatgtggaaggtctgtac660
accgattggcctgataagagctcactggtgtccaagatcaaggccaccgagctggaggcc720
attcttccgggacttgattccggcatgattccaaagatggagtcttgcttgaatgcggtg780
cgtgggggagtaagcgctgctcatgtcattgacggccgcatcgcgcactcggtgttgctg840
gagcttttgaccatgggtggaattggcacgatggtgctgccggatgtttttgatcgggag900
aattatccggaaggcaccgtttttagaaaagacgacaaggatggggaactgtaa954
<210>23
<211>347
<212>prt
<213>谷氨酸棒狀桿菌argc
<400>23
metthrilelysvalalailealaglyalaserglytyralaglygly
151015
gluileleuargleuleuleuglyhisproalatyralaserglyglu
202530
leugluileglyalaleuthralaalaserthralaglyserthrleu
354045
glygluleumetprohisileproglnleualaaspargvalilegln
505560
aspthrthralagluthrleualaglyhisaspvalvalpheleugly
65707580
leuprohisglypheseralagluilealaleuglnleuglyproasp
859095
valthrvalileaspcysalaalaasppheargleuglnasnalaala
100105110
asptrpglulysphetyrglysergluhisglnglythrtrpprotyr
115120125
glyileprogluileproglyhisargglualaleuargglyalalys
130135140
argvalalavalproglycyspheprothrglyalathrleualaleu
145150155160
leuproalavalglnalaglyleuilegluproaspvalservalval
165170175
serilethrglyvalserglyalaglylyslysalaservalalaleu
180185190
leuglysergluthrmetglyserleulysalatyrasnthrsergly
195200205
lyshisarghisthrprogluilealaglnasnleuglygluvalser
210215220
asplysprovallysvalserphethrprovalleualaproleupro
225230235240
argglyileleuthrthralathralaproleulysgluglyvalthr
245250255
alagluglnalaargalavaltyrglugluphetyralaglngluthr
260265270
phevalhisvalleuprogluglyalaglnproglnthrglnalaval
275280285
leuglyserasnmetcyshisvalglnvalgluileaspglugluala
290295300
glylysvalleuvalthrseralaileaspasnleuthrlysglythr
305310315320
alaglyalaalavalglncysmetasnleuservalglypheaspglu
325330335
alaalaglyleuproglnvalglyvalalapro
340345
<210>24
<211>1044
<212>dna
<213>谷氨酸棒狀桿菌argc
<400>24
atgacaatcaaggttgcaatcgcaggagccagtggatatgccggcggagaaatccttcgt60
ctccttttaggccatccagcttatgcatctggtgaactagaaatcggagcactcaccgcg120
gcatcaaccgcaggcagcacgctcggtgaattgatgccacacattccgcagttggcggat180
cgtgttattcaagacaccacagctgaaactctagccggtcatgatgtcgtatttctagga240
cttccacacggattctctgcagaaattgcacttcagctcggaccagatgtcacagtgatt300
gactgtgcagctgactttcgtctgcaaaatgctgcagattgggagaagttctacggctca360
gagcaccagggaacatggccttatggcattccagaaataccaggacaccgcgaggctctt420
cgtggtgctaagcgtgtagcagtgccaggatgtttcccaaccggtgcaaccttggctctt480
cttcctgcggttcaagcgggacttatcgagccagatgtttccgtagtgtccatcaccggc540
gtatcaggtgcaggtaagaaagcatctgttgcactacttggctcggaaaccatgggttca600
ctcaaggcgtacaacacctccggaaagcaccgccacaccccggaaattgcccagaacctc660
ggcgaagtcagcgacaagccagtcaaggtgagcttcaccccagtgcttgcaccgttacct720
cgcggaattctcaccactgcaaccgcacctttgaaagaaggcgttaccgcagagcaggct780
cgcgcagtatatgaagagttctatgcacaggaaaccttcgtgcatgttcttccagaaggt840
gcacagccacaaacccaagcagttcttggctccaacatgtgccacgtgcaggtagaaatt900
gatgaggaagcaggcaaagtccttgttacctccgcaatcgataacctcaccaagggaact960
gccggcgccgctgttcagtgcatgaacttaagcgttggctttgatgaggcagcaggcctg1020
ccacaggtcggcgtcgcaccttaa1044
<210>25
<211>391
<212>prt
<213>谷氨酸棒狀桿菌argd
<400>25
metserthrleugluthrtrpproglnvalileileasnthrtyrgly
151015
thrproprovalgluleuvalserglylysglyalathrvalthrasp
202530
aspglnglylysvaltyrileaspleuleualaglyilealavalasn
354045
alaleuglyhisalahisproalaileileglualavalthrasngln
505560
ileglyglnleuglyhisvalserasnleuphealaserargproval
65707580
valgluvalalaglugluleuilelysargpheserleuaspaspala
859095
thrleualaalaglnthrargvalphephecysasnserglyalaglu
100105110
alaasnglualaalaphelysilealaargleuthrglyargserarg
115120125
ileleualaalavalhisglyphehisglyargthrmetglyserleu
130135140
alaleuthrglyglnproasplysargglualapheleuprometpro
145150155160
serglyvalgluphetyrprotyrglyaspthrasptyrleuarglys
165170175
metvalgluthrasnprothraspvalalaalailepheleuglupro
180185190
ileglnglygluthrglyvalvalproalaprogluglypheleulys
195200205
alavalarggluleucysaspglutyrglyileleumetilethrasp
210215220
gluvalglnthrglyvalglyargthrglyaspphephealahisgln
225230235240
hisaspglyvalvalproaspvalvalthrmetalalysglyleugly
245250255
glyglyleuproileglyalacysleualathrglyargalaalaglu
260265270
leumetthrproglylyshisglythrthrpheglyglyasnproval
275280285
alacysalaalaalalysalavalleuservalvalaspaspalaphe
290295300
cysalagluvalthrarglysglygluleuphelysgluleuleuala
305310315320
lysvalaspglyvalvalaspvalargglyargglyleumetleugly
325330335
valvalleugluargaspvalalalysglnalavalleuaspglyphe
340345350
lyshisglyvalileleuasnalaproalaaspasnileileargleu
355360365
thrproproleuvalilethraspglugluilealaaspalavallys
370375380
alailealagluthrileala
385390
<210>26
<211>1176
<212>dna
<213>谷氨酸棒狀桿菌argd
<400>26
atgagcacgctggaaacttggccacaggtcattattaatacgtacggcaccccaccagtt60
gagctggtgtccggcaagggcgcaaccgtcaccgatgaccagggcaaagtctacatcgac120
ttgctcgcgggcatcgcagtcaacgcgttgggccacgcccacccggcgatcatcgaggcg180
gtcaccaaccagatcggccaacttggtcacgtctcaaacttgttcgcatccaggcccgtc240
gtcgaggtcgccgaggagctcatcaagcgtttttcgcttgacgacgccaccctcgccgcg300
caaacccgggttttcttctgcaactcgggcgccgaagcaaacgaggctgctttcaagatt360
gcacgcttgactggtcgttcccggattctggctgcagttcatggtttccacggccgcacc420
atgggttccctcgcgctgactggccagccagacaagcgtgaagcattcctgccaatgcca480
agcggtgtggagttctacccttacggcgacaccgattacttgcgcaaaatggtagaaacc540
aacccaacggatgtggctgctatcttcctcgagccaatccagggtgaaacgggcgttgtt600
ccagcacctgaaggattcctcaaggcagtgcgcgagctgtgcgatgagtacggcatcttg660
atgatcaccgatgaagtccagactggcgttggccgtaccggcgatttctttgcacatcag720
cacgatggcgttgttcccgatgtggtgaccatggccaagggacttggcggcggtcttccc780
atcggtgcttgtttggccactggccgtgcagctgaattgatgaccccaggcaagcacggc840
accactttcggtggcaacccagttgcttgtgcagctgccaaggcagtgctgtctgttgtc900
gatgacgctttctgcgcagaagttacccgcaagggcgagctgttcaaggaacttcttgcc960
aaggttgacggcgttgtagacgtccgtggcaggggcttgatgttgggcgtggtgctggag1020
cgcgacgtcgcaaagcaagctgttcttgatggttttaagcacggcgttattttgaatgca1080
ccggcggacaacattatccgtttgaccccgccgctggtgatcaccgacgaagaaatcgca1140
gacgcagtcaaggctattgccgagacaatcgcataa1176