L-精氨酸生產(chǎn)能力提高的棒狀桿菌屬微生物以及利用其的l-精氨酸的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及L-精氨酸生產(chǎn)能力提高的重組棒狀桿菌屬微生物以及利用該微生物 生產(chǎn)L-精氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] L-精氨酸以游離狀態(tài)包含于植物種子或大蒜，其被用作氨基酸類增強劑，也廣泛 被利用于藥品、食品等。其作為醫(yī)藥用，用于肝功能促進(jìn)劑、腦功能促進(jìn)劑、男性不孕治療 劑、綜合氨基酸制劑等，作為食品用，用于生鮮凍（確今i號）添加劑、健康飲料添加劑、高血 壓患者的食鹽代替用，從而成為最近受到注目的物質(zhì)。
[0003] 棒狀桿菌（Corynebacterium)屬微生物通過環(huán)形步驟途徑實現(xiàn)L-精氨酸的 生物合成，L-精氨酸從L-谷氨酸經(jīng)由N-乙酰谷氨酸（N-acetylglutamate)、N-乙酰 谷氨酰磷酸（N-acetylglutamylphosphate)、N_ 乙酰谷氨酸半酸（N-acetylglutamate semialdehyde)、N-乙酰鳥氨酸（N-acetylornithine)、鳥氨酸（ornithine)、瓜氨酸 (citrulline)以及精氨琥J白酸（argininosuccinate)而合成。
[0004] 此外，已知谷氨酸棒狀桿菌受到細(xì)胞內(nèi)精氨酸的反饋抑制（feedback inhibition)(VeharySakanyanetal，Microbiology，142:9_108，1996)，從而已知在生產(chǎn) 高收率的L-精氨酸方面存在局限。
[0005] 池田等報告了在精氨酸發(fā)酵時瓜氨酸蓄積于發(fā)酵培養(yǎng)基上（ApplEnviron Microbiol. 2009Mar；75 (6):1635-41.Epub2009Jan9)〇
[0006] 在上述生物合成過程中，瓜氨酸與天冬氨酸（aspartate)結(jié)合而成為精氨琥 I白酸，釋放富馬酸（fumarate)而成為精氨酸。在此，天冬氨酸氨裂解酶（aspartate ammonia-lyase，aspA)是由富馬酸和氨合成天冬氨酸的酶（圖1)，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (aspartateaminotransferase，aspB)是具有通過從天冬氨酸、谷氨酸、氨基丁酸等多種 L-氨基酸將氨基轉(zhuǎn)移到a_酮戊二酸、a_酮異戊酸等酮酸來合成多種L-氨基酸的催化劑 功能的酶。
[0007] Menkel等報告了將大腸桿菌的aspA導(dǎo)入棒狀桿菌型微生物時增加天冬氨酸的可 用性，從而增加L-賴氨酸的生產(chǎn)（APPLIEDANDENVIRONMENTALMICR0BI0L0GY，Mar. 1989， p.684-688)。
[0008] 因此，本發(fā)明人等確認(rèn)了，通過使天冬氨酸氨裂解酶和/或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 的表達(dá)增強來增加與瓜氨酸結(jié)合的天冬氨酸的流入，能夠提供L-精氨酸的生產(chǎn)能力提高 的棒狀桿菌屬微生物，從而完成本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于，提供L-精氨酸的生產(chǎn)能力提高的棒狀桿菌屬微生物。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于，提供利用上述棒狀桿菌屬微生物生產(chǎn)L-精氨酸的方法。
[0011] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供因天冬氨酸氨裂解酶的活性增強而L-精氨酸生 產(chǎn)能力提高的棒狀桿菌屬微生物。
[0012] 本發(fā)明還提供通過培養(yǎng)上述棒狀桿菌屬微生物生產(chǎn)L-精氨酸的方法。
[0013] 本發(fā)明提供因天冬氨酸氨裂解酶活性增強或在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步地天冬氨酸氨基 轉(zhuǎn)移酶的活性增強而L-精氨酸生產(chǎn)能力提高的重組棒狀桿菌屬微生物，上述重組棒狀桿 菌屬微生物由于能夠以高收率生產(chǎn)L-精氨酸，因此可以在工業(yè)上有效利用。
【附圖說明】
[0014] 圖1表示由瓜氨酸合成精氨酸的途徑以及由富馬酸合成天冬氨酸的途徑。
【具體實施方式】
[0015] 下面，詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0016] 本發(fā)明提供L-精氨酸的生產(chǎn)能力提高的棒狀桿菌屬微生物。
[0017] 本發(fā)明中，上述用語"L-精氨酸生產(chǎn)能力（L-arginineproductivity) "是指，在 培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的棒狀桿菌屬微生物時，使L-精氨酸蓄積于培養(yǎng)基的能力。這樣的 L-精氨酸生產(chǎn)能力可以是棒狀桿菌屬微生物的野生型菌株的特性、或者通過人工突變而添 加或增強的特性。
[0018]例如，為了賦予L-精氨酸的生產(chǎn)能力，可以將棒狀桿菌屬微生物育種成對精氨酸 羥肟酸具有耐性；可以育種成對琥珀酸具有營養(yǎng)要求性或者對核酸堿基(H筆內(nèi):)同 系物具有耐性；可以育種成無法使精氨酸進(jìn)行物質(zhì)代謝，對精氨酸拮抗劑和刀豆氨酸具有 耐性，且對賴氨酸具有營養(yǎng)要求性；可以育種成對精氨酸、精氨酸羥肟酸、高精氨酸、D-精 氨酸和刀豆氨酸具有耐性，或者對精氨酸羥肟酸和6-氮尿嘧啶具有耐性；可以育種成對刀 豆氨酸具有耐性。
[0019] 此外，通過按照使編碼L-精氨酸生物合成酶的基因的表達(dá)增強的方式對棒狀桿 菌屬微生物進(jìn)行變形，可以賦予L-精氨酸的生產(chǎn)能力。L-精氨酸生物合成酶的例子包括： N-乙酰谷氨酰磷酸還原酶（argC)、鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（argj)、N-乙酰谷氨酸激酶（argB)、 乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（argD)、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶（argF)、精氨琥珀酸合成酶（argG)、精 氨琥珀酸裂解酶（argH)和氨基甲酰磷酸合成酶。這些精氨酸生物合成酶存在于Arg操 縱子（argCJBDFRGH)上，由被argR編碼的精氨酸阻抑物調(diào)節(jié)（JBacteriol.2002Dec; 184(23) : 6602-14.)。由此，通過精氨酸阻抑物的弱化（US2002-0045223)、或者使上述生物 合成相關(guān)基因中的一個以上基因過表達(dá)，可以賦予L-精氨酸生產(chǎn)能力。
[0020] 在本發(fā)明中，具有L-精氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌屬微生物只要具有生產(chǎn)L-精氨 酸的能力就沒有特別限制。優(yōu)選地，可以為能夠生產(chǎn)L-精氨酸的谷氨酸棒狀桿菌，更優(yōu)選 地，可以為谷氨酸棒狀桿菌KCCM10741 (韓國專利注冊號0791659)以及谷氨酸棒狀桿菌 ATCC21831。
[0021] 作為用于實現(xiàn)上述目的的一個方案，本發(fā)明提供因天冬氨酸氨裂解酶的活性增強 而L-精氨酸生產(chǎn)能力提高的棒狀桿菌屬微生物。
[0022] 天冬氨酸氨裂解酶（aspartateammonia-lyase，aspA)是由富馬酸和氨合成天冬 氨酸的酶，因此可以通過使上述天冬氨酸氨裂解酶的表達(dá)增強而增加天冬氨酸的合成，借 助于增加的天冬氨酸而提高L-精氨酸的生產(chǎn)率。
[0023] 在本發(fā)明中，上述天冬氨酸氨裂解酶只要是具有上述活性的酶，就可以使用來源 于任何微生物的酶，優(yōu)選地，可以使用來源于埃希氏菌屬微生物或棒狀桿菌型微生物的酶， 更優(yōu)選地，可以使用來源于大腸桿菌或谷氨酸棒狀桿菌的酶。具體地說，上述天冬氨酸氨裂 解酶可以具有以序列號21或序列號22記載的氨基酸序列。具有上述序列號21的氨基酸 序列的來源于棒狀桿菌屬微生物的天冬氨酸氨裂解酶由具有以序列號23記載的堿基序列 的aspA(NCgll446)編碼，具有上述序列號22的氨基酸序列的來源于埃希氏菌屬微生物的 天冬氨酸氨裂解酶由具有以序列號24記載的堿基序列的aspA(NCBIGENEID: 12933698) 編碼。
[0024] 只要是本發(fā)明中公開的具有天冬氨酸氨裂解酶的活性的蛋白質(zhì)，則相對于上 述蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有80%以上、優(yōu)選為90%以上、更優(yōu)選為95%以上、特別優(yōu)選 為97%以上的同源性的天冬氨酸氨裂解酶也包含于本發(fā)明。相對于上述氨基酸序列 的同源性例如可以使用根據(jù)文獻(xiàn)的算法BLAST[參考：Karlin和Altschul，Pro.Natl. Acad.Sci.USA, 90,5873(l"3)]或利用皮爾遜（Pearson)的FASTA[參考：Methods Enzymol.，183,63(1990)]來確定?；谶@樣的算法BLAST，開發(fā)出被稱為BLASTN或BLASTX 的程序[參考：http://www.ncbi.nlm.nih.gov] 〇
[0025] 作為用于實現(xiàn)上述目的的另一個方案，本發(fā)明提供進(jìn)一步地天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 的活性增強的棒狀桿菌屬微生物。