本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，更具體涉及一種西門利克森林病毒復制子及其在稀疏或精細神經(jīng)元標記中的應用。

背景技術(shù)：

人腦是自然界中最為復雜的系統(tǒng)之一,而神經(jīng)網(wǎng)絡是大腦行使功能的基礎，神經(jīng)網(wǎng)絡的正常連接，使得機體產(chǎn)生正常的生理活動，如認知、學習、記憶和恐懼等；神經(jīng)網(wǎng)絡的異常往往導致神經(jīng)疾病的出現(xiàn)，尚無有效手段來治療這些神經(jīng)疾病。目前，正常生理活動和致病機制均不清楚，主要的原因在于腦神經(jīng)網(wǎng)絡連接信息的缺乏。因此，開展腦神經(jīng)環(huán)路的研究而繪制高精度的腦功能連接圖譜，對于了解人的生理活動和致病機制具有重要的意義。

西門利克森林病毒(Semliki forest virus，SFV)屬于披膜病毒科甲病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，長度約為12kb?；蚪M編碼的多聚蛋白可切割成4個結(jié)構(gòu)蛋白(C、P62、6K和E1)和4個非結(jié)構(gòu)蛋白(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)。塞姆利基森林病毒具有廣泛的宿主范圍，包括：人、鼠、猴等，能夠感染神經(jīng)系統(tǒng)，一方面不利于人類的健康和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，另一方面，這種感染特性可以使得其成為介導外源基因到宿主體內(nèi)的載體，另外，西門利克森林病毒感染腦神經(jīng)系統(tǒng)的特性使其成為具備解析神經(jīng)環(huán)路的能力。但是因為存在一系列工藝和技術(shù)改造方面的問題，所以目前其還沒有應用到細胞精細形態(tài)的描繪、靈長類神經(jīng)環(huán)路的標記等方面。而本發(fā)明通過一系列的條件優(yōu)化、系統(tǒng)的改造和升級，獲得了一種高效且穩(wěn)定的具有單次感染特性的表達綠色熒光蛋白的SFV系統(tǒng)，明確了其在非人靈長類神經(jīng)環(huán)路應用方面的效果，為開展腦科學研究提供了良好的工具系統(tǒng)。

隨著分子生物學的不斷發(fā)展，科學家已經(jīng)能夠通過反向遺傳學的手段來定向改造病毒，為深入開展相關的病毒學研究提供了良好的工具。因此，本發(fā)明分別采用不同的技術(shù)途徑獲得了一種高效且穩(wěn)定的具有單次感染特性的表達綠色熒光蛋白的SFV系統(tǒng)。將在神經(jīng)細胞和非神經(jīng)細胞精細形態(tài)的描繪、靈長類和非靈長類解析腦神經(jīng)環(huán)路、病毒抗原表位分析和藥物(如抗體藥物)篩選、疫苗和診斷試劑的研發(fā)、動物模型的建立和病毒復制與致病機制的分析等方面具有廣泛的應用價值和前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種西門利克森林病毒復制子，該復制子為含有熒光蛋白基因和SEQ ID NO.4所示序列的pSFV-replicon。該復制子可用于西門利克森林病毒類病毒顆粒的制備。

本發(fā)明還有一個目的在于提供了一種西門利克森林病毒復制子的應用，包括利用該復制子制備西門利克森林病毒類病毒顆粒，或利用制備出的病毒樣顆粒在稀疏或精細標記神經(jīng)元中的應用，同時，該復制子還可用于蛋白表達、基因治療、神經(jīng)細胞精細形態(tài)的描繪、神經(jīng)環(huán)路的解析、靈長類神經(jīng)細胞的標記、神經(jīng)環(huán)路稀疏標記、病毒抗原表位分析和藥物(如抗體藥物)篩選、疫苗和診斷試劑的研發(fā)、動物模型的建立和病毒復制與致病機制的分析等方面具有廣泛的應用價值。

為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種用于在體稀疏精細標記神經(jīng)元的西門利克森林病毒復制子，該復制子為含有熒光蛋白基因和SEQ ID NO.4所示序列的pSFV-replicon。

優(yōu)選的，使用BamHI+XhoI酶切pSFV-replicon(Lundstrom,K et al.,(2003)Mol.Ther.7,202-209.)，然后采用Vazyme同源重組試劑盒將SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4片段插入到pSFV-replicon，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101，PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為pSFV-replicon-EGFP，其序列為SEQ ID NO:8所示。一種用于在體稀疏精細標記神經(jīng)元的西門利克森林病毒復制子的應用，包括：

1.西門利克森林病毒復制子制備表達綠色熒光蛋白的單次感染性的西門利克森林病毒類病毒顆粒，包括制備出的激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒或未激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒。

2.西門利克森林病毒復制子制備出的病毒樣顆粒在制備稀疏或精細標記神經(jīng)元中藥物的應用，所述的病毒樣顆粒在鼠腦中的有效感染數(shù)目為1-50個，優(yōu)選感染數(shù)目為1-15個。

所述應用特別適用于鼠腦神經(jīng)細胞中的稀疏或精細標記。

本發(fā)明提供的一種在體稀疏精細標記神經(jīng)元的西門利克森林病毒復制子的制備方法也適合于與西門利克森林病毒同科的病毒的構(gòu)建，例如委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)和辛德畢斯病毒(Sindbis virus,SINV)。西門利克森林病毒復制子或其制備出的病毒樣顆粒不僅可用于在體稀疏精細標記神經(jīng)元，還可用于非人靈長類神經(jīng)細胞的快速標記，蛋白表達、基因治療、神經(jīng)環(huán)路的解析、神經(jīng)環(huán)路稀疏標記、病毒抗原表位分析和藥物(如抗體藥物)篩選、疫苗和診斷試劑的研發(fā)、動物模型的建立和病毒復制與致病機制的分析。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果：

1.本發(fā)明提供了一種高效、便捷的表達外源蛋白的類西門利克森林病毒的顆粒，該平臺制備的病毒具有可視化的特點，便于開展相關的研究。

2.本發(fā)明對于開展在體稀疏且精細標記神經(jīng)元具有重要價值，同時對于其他應用性研究(如蛋白表達、基因治療、非人靈長類神經(jīng)細胞的標記、神經(jīng)環(huán)路標記、藥物篩選、抗原表位分析、新型疫苗和診斷試劑等)和基礎性研究(如復制、包裝和致病機制等)具有重要的現(xiàn)實意義和廣泛的應用價值。

3.本發(fā)明對于開展在fMOST進行全腦成像方面具有重要價值。

4.本發(fā)明制備的類病毒顆粒能夠在數(shù)天的時間內(nèi)快速標記鼠神經(jīng)細胞。

5.解析神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)是開展腦科學研究的基礎，良好用于神經(jīng)環(huán)路標記的工具對于解析神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)具有重要意義。SFV能夠感染人和鼠等動物的神經(jīng)細胞，具有作為神經(jīng)環(huán)路標記的潛力。本發(fā)明不僅能夠用于非靈長類動物，而且還能用于靈長類動物的腦科學研究。

附圖說明

圖1為一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒的構(gòu)建和制備示意圖。

A：一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒復制子的構(gòu)建示意圖；

B：一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒的制備示意圖。

圖2為一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒表達熒光示意圖。

A：未轉(zhuǎn)染RNA的細胞；

B：共轉(zhuǎn)染pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA的BHK21細胞表達綠色熒光蛋白。

圖3為一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒單次感染細胞。

A：未激活的類病毒顆粒感染BHK21細胞后表達綠色熒光蛋白；

B：未激活的類病毒顆粒感染BHK21細胞后收集的上清感染BHK21細胞，沒有熒光蛋白的表達，即沒有病毒產(chǎn)生；

C：激活的類病毒顆粒感染BHK21細胞后表達綠色熒光蛋白；

D：激活的類病毒顆粒感染BHK21細胞后收集的上清感染BHK21細胞，沒有熒光蛋白的表達，即沒有病毒產(chǎn)生。

圖4為一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒生長曲線。

A：未激活的類病毒顆粒感染BHK21細胞后表達綠色熒光蛋白；

B：不同時間收集的未激活的類病毒顆粒的滴度分析；

A：激活的類病毒顆粒感染BHK21細胞后表達綠色熒光蛋白；

B：不同時間收集激活的類病毒顆粒的滴度分析。

圖5為一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒在鼠腦內(nèi)不同時間的標記情況。

A：未激活的類病毒顆粒注射到鼠腦后3、6、12和24小時的表達情況；

B：激活的類病毒顆粒注射到鼠腦后3、6、12和24小時的表達情況。

圖6為一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒在鼠腦內(nèi)稀疏標記神經(jīng)元的情況。

A：不同劑量的未激活類病毒顆粒注射到鼠腦后稀疏標記神經(jīng)元；

B：不同劑量的激活類病毒顆粒注射到鼠腦后稀疏標記神經(jīng)元。

圖7為一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒在鼠腦內(nèi)標記神經(jīng)元的精細形態(tài)。

A：未激活的類病毒顆粒注射到鼠腦后標記神經(jīng)元的精細形態(tài)；

B：激活的類病毒顆粒注射到鼠腦后標記神經(jīng)元的精細形態(tài)。

圖8為一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒在標記鼠腦后在fMOST成像系統(tǒng)中的應用。

A：未激活的類病毒顆粒注射到鼠腦后能夠達到fMOST成像的要求，可以清晰的顯示神經(jīng)元的形態(tài)；

B：激活的類病毒顆粒注射到鼠腦后能夠達到fMOST成像的要求，可以清晰的顯示神經(jīng)元的形態(tài)。

具體實施方式

本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領域的常規(guī)技術(shù)。

實施例1：

一種西門利克森林病毒復制子，通過下述步驟制備得到：

①以pEGFP-N2(Invitrogen公司)為模板擴增EGFP基因，其序列為SEQ ID NO:1，使用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物擴增片段SEQ ID NO:1；以pSFV-replicon(Lundstrom,K et al.,(2003)Mol.Ther.7,202-209.)為模板擴增capsid的N端102bp(即C34)，其序列為SEQ ID NO:4，使用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物擴增片段SEQ ID NO:4；按常規(guī)方式檢測回收擴增出的DNA片段。C34和EGFP之間通過F2A連接，其序列為SEQ ID NO:7，其序列包含在引物SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:2中。

PCR的反應體系均為50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μM Forward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNA Polymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。擴增條件為：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃60s，72℃10min，16℃10min，30個循環(huán)；

使用BamHI和XhoI酶切pSFV-replicon(Lundstrom,K et al.,(2003)Mol.Ther.7,202-209.)，然后采用Vazyme同源重組試劑盒將SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4片段插入到SFV復制子質(zhì)粒 Ubc-SFV-replicon，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101，PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為pSFV-replicon-EGFP，其序列為SEQ ID NO:8所示。

實施例2：

一種西門利克森林病毒復制子在制備表達綠色熒光蛋白的單次感染性的西門利克森林病毒類病毒顆粒中的應用：

用NruI分別酶切pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper(Berglund,P et al.,(1993)Biotechnology 11,916-920.)，使用MEGAscript SP6Transcription Kit分別體外轉(zhuǎn)錄酶切后的pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper為RNA，并轉(zhuǎn)染BHK21細胞，37℃，5％(v/v)CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通過倒置熒光顯微鏡觀察細胞狀態(tài)和熒光表達，在感染后的不同時間收集病毒上清。

圖2中A：沒有轉(zhuǎn)染RNA的BHK21細胞，作為實驗的對照；

圖2中B：共轉(zhuǎn)染pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA的BHK21細胞，1天后即可產(chǎn)生綠色的熒光信號，表明依賴于西門利克森林病毒復制子能高效快速表達外源蛋白。

收集的病毒上清的一部分分裝后，-80保存?zhèn)溆?即為未激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒)用于以下實驗；

另一部分，使用終濃度為500μg/ml的α-chymotrypsin(Sigma)在37度處理收集的上清30min，然后加入終濃度為250μg/ml aprotinin(Sigma)，-80度保存?zhèn)溆?激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒)。檢測不同時間點收集病毒的滴度，選擇滴度最高的病毒用于以下實驗。

實施例3：

西門利克森林病毒復制子制備出的西門利克森林病毒類病毒顆粒具有單次感染性：

分別分析激活和未激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒的單次感染的特性，一方面，取10μl未激活的類病毒顆粒感染BHK21細胞，在感染后1天觀察綠色熒光的表達情況，并收集培養(yǎng)基上清。取收集的培養(yǎng)基上清100μl感染BHK21細胞，感染后不同時間觀察熒光的表達情況；另一方面，取1μl類病毒顆粒感染BHK21細胞，在感染后1天觀察綠色熒光的表達情況，并收集培養(yǎng)基上清。取收集的培養(yǎng)基上清100μl感染BHK21細胞，感染后不同時間觀察熒光的表達情況。

圖3中A：攜帶EGFP基因的未激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒感染BHK21細胞后表達綠色熒光蛋白，表明本發(fā)明能夠用于體外表達外源蛋白，具有在體內(nèi)的應用價值，但是表達綠色熒光蛋白的細胞數(shù)目較少。

圖3中B：將圖3中A的感染BHK21細胞后收集的上清再次感染新制備的BHK21細胞， 不同時間觀察,無熒光信號，表明該病毒樣顆粒具有單次感染細胞的特點。

圖3中C：攜帶EGFP基因的激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒感染BHK21細胞后表達綠色熒光蛋白，表明本發(fā)明能夠用于體外表達外源蛋白，具有在體內(nèi)的應用價值，表達綠色熒光蛋白的細胞數(shù)目很多。

圖3中D：將圖3中C的感染BHK21細胞后收集的上清再次感染新制備的BHK21細胞，不同時間觀察，無熒光信號，表明該病毒樣顆粒具有單次感染細胞的特點。

實施例4：

西門利克森林病毒復制子制備出的西門利克森林病毒類病毒顆粒生長曲線分析：

分別取不同時間點收集的未激活和激活的類病毒顆粒10μl感染BHK21細胞(進行10倍比的西施)，在感染后2天觀察綠色熒光的表達情況，并計數(shù)熒光細胞的數(shù)量，計算病毒的滴度。

圖4中A：攜帶EGFP基因的未激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒感染BHK21細胞后表達綠色熒光蛋白。不同時間收集的病毒均能感染BHK21細胞，并表達綠色熒光蛋白，表明本發(fā)明能夠用于體外表達外源蛋白，具有在體內(nèi)的應用價值。

圖4中B：攜帶EGFP基因的未激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒在BHK21細胞中的生長曲線。在將pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA共轉(zhuǎn)染BHK21細胞后1天，病毒滴度即達到5×10²FFU/ml，而后逐漸升高，轉(zhuǎn)染后3天，滴度到達3.5×10⁴FFU/ml。該數(shù)據(jù)對于選擇最佳的時間收集攜帶EGFP的西門利克森林病毒類病毒顆粒具有重要意義。

圖4中C：攜帶EGFP基因的激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒感染BHK21細胞后表達綠色熒光蛋白。不同時間收集的病毒均能感染BHK21細胞，并表達綠色熒光蛋白，表明本發(fā)明能夠用于體外表達外源蛋白，具有在體內(nèi)的應用價值。

圖4中D：攜帶EGFP基因的激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒在BHK21細胞中的生長曲線。在將pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA共轉(zhuǎn)染BHK21細胞后1天，病毒滴度即達到7×10⁶FFU/ml，而后逐漸升高，轉(zhuǎn)染后3天，滴度到達1.8×10⁸FFU/ml。該數(shù)據(jù)對于選擇最佳的時間收集攜帶EGFP的西門利克森林病毒類病毒顆粒具有重要意義。

實施例5：

攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆?？焖贅擞浭竽X神經(jīng)元(不同時間標記神經(jīng)元的情況)：

取2μl未激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒(病毒滴度是3.5×10⁴FFU/ml)定位注射到鼠(2月齡)丘腦腹后內(nèi)側(cè)核，感染后3、6、12和24小時后麻醉動物，分別用0.9％(V/V) 生理鹽水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出腦組織浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后將腦組織先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；將腦組織底部切平，置于底座上包埋冰凍1h后切片；取腦片后使用熒光顯微鏡觀察。未激活的類病毒顆粒注射到丘腦腹后內(nèi)側(cè)核6h后即可觀察到明顯的熒光信號，表明未激活的類病毒顆粒能夠在鼠腦內(nèi)感染神經(jīng)元并能表達表達綠色熒光蛋白，隨著時間的延長(12和24h)，熒光的表達數(shù)量增加(圖5中A)。

取0.1μl激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒(病毒滴度是1.8×10⁸FFU/ml)定位注射到鼠(2月齡)丘腦腹后內(nèi)側(cè)核，感染后3、6、12和24小時后麻醉動物，分別用0.9％(V/V)生理鹽水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出腦組織浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后將腦組織先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；將腦組織底部切平，置于底座上包埋冰凍1h后切片；取腦片后使用熒光顯微鏡觀察。激活的類病毒顆粒注射到丘腦腹后內(nèi)側(cè)核6h后即可觀察到明顯的熒光信號，表明激活的類病毒顆粒能夠在鼠腦內(nèi)感染神經(jīng)元并能表達表達綠色熒光蛋白，隨著時間的延長(12和24h)，熒光的表達數(shù)量增加(圖5中B)。

實施例6：

攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒在鼠腦內(nèi)稀疏標記神經(jīng)元的精細形態(tài)：

取0.1、0.5和1μl未激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒(病毒滴度是3.5×10⁴FFU/ml)定位注射到鼠(2月齡)丘腦腹后內(nèi)側(cè)核，感染后24小時后麻醉動物，分別用0.9％(V/V)生理鹽水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出腦組織浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后將腦組織先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；將腦組織底部切平，置于底座上包埋冰凍1小時后切片；取腦片后使用熒光顯微鏡觀察。未激活的類病毒顆粒注射到丘腦腹后內(nèi)側(cè)核24小時后即可見明顯的熒光信號，表明未激活的類病毒顆粒能夠在鼠腦內(nèi)感染神經(jīng)元并能表達表達綠色熒光蛋白。隨著注射劑量的減少，標記的神經(jīng)元的數(shù)目逐漸減少，呈現(xiàn)出稀疏標記的狀態(tài)(圖6中A)，能夠標記神經(jīng)元的精細形態(tài)(圖7中A)。

取0.3μl經(jīng)過1:20000稀釋的激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒(稀釋前病毒滴度是1.8×10⁸FFU/ml)定位注射到鼠(2月齡)丘腦腹后內(nèi)側(cè)核，感染后24小時后麻醉動物，分別用0.9％(V/V)生理鹽水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出腦組織浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后將腦組織先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；將腦組織底部切平，置于底座上包埋冰凍1小時后切片；取腦片 后使用熒光顯微鏡觀察。激活的類病毒顆粒注射到丘腦腹后內(nèi)側(cè)核24小時后可見明顯的熒光信號，表明激活的類病毒顆粒能夠在鼠腦內(nèi)感染神經(jīng)元并能表達表達綠色熒光蛋白。病毒標記的狀態(tài)為稀疏標記(圖6中B)，能夠標記神經(jīng)元的精細形態(tài)(圖7中B)。

1月齡～12月齡的鼠腦，無論是激活還是未激活的病毒顆粒，只要鼠腦中有效感染的病毒粒為1-50個，均能產(chǎn)生上述相同的精細標記的效果。

實施例7：

攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒在標記鼠腦后滿足fMOST成像要求：

取0.5μl未激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒(病毒滴度是3.5×10⁴FFU/ml)定位注射到鼠(2月齡)皮層，感染后48小時后麻醉動物，分別用0.9％(V/V)生理鹽水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出腦組織浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后將腦組織先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天。取腦組織使用fMOST儀器觀察熒光蛋白的情況。熒光的亮度能夠滿足fMOST的成像要求(圖8中A)。

取0.3μl經(jīng)過1:20000稀釋的激活的西門利克森林病毒類病毒顆粒(稀釋前病毒滴度是1.8×10⁸FFU/ml)定位注射到鼠皮層，感染后48小時后麻醉動物，分別用0.9％(V/V)生理鹽水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出腦組織浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后將腦組織先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天。取腦組織使用fMOST儀器觀察熒光蛋白的情況。熒光的亮度能夠滿足fMOST的成像要求(圖8中B)。

最后，還需要注意的是，上述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，并且以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國科學院武漢物理與數(shù)學研究所

<120> 一種西門利克森林病毒復制子及其在稀疏或精細神經(jīng)元標記中的應用

<130> 一種西門利克森林病毒復制子及其在稀疏或精細神經(jīng)元標記中的應用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccttctcaag ctggcgggag acgtcgagtc caaccctggg ccaatggtga gcaagggcg 59

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggatcgacta gtgaactcga gttacttgta cagctcgtcc atgcc 45

<210> 4

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaattaca tccctacgca aacgttttac ggccgccggt ggcgcccgcg cccggcggcc 60

cgtccctggc cgttgcaggc cactccggtg gctcccgtcg tc 102

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aatacacaga attctgattg gatccaccat gaattacatc cctacgcaaa 50

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctcccgccag cttgagaagg tcaaaattca acagctgccc ggggacgacg ggagccacc 59

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cagctgttga attttgacct tctcaagctg gcgggagacg tcgagtccaa ccctgggcca 60

<210> 8

<211> 11471

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatggcggat gtgtgacata cacgacgcca aaagattttg ttccagctcc tgccacctcc 60

gctacgcgag agattaacca cccacgatgg ccgccaaagt gcatgttgat attgaggctg 120

acagcccatt catcaagtct ttgcagaagg catttccgtc gttcgaggtg gagtcattgc 180

aggtcacacc aaatgaccat gcaaatgcca gagcattttc gcacctggct accaaattga 240

tcgagcagga gactgacaaa gacacactca tcttggatat cggcagtgcg ccttccagga 300

gaatgatgtc tacgcacaaa taccactgcg tatgccctat gcgcagcgca gaagaccccg 360

aaaggctcgt atgctacgca aagaaactgg cagcggcctc cgggaaggtg ctggatagag 420

agatcgcagg aaaaatcacc gacctgcaga ccgtcatggc tacgccagac gctgaatctc 480

ctaccttttg cctgcataca gacgtcacgt gtcgtacggc agccgaagtg gccgtatacc 540

aggacgtgta tgctgtacat gcaccaacat cgctgtacca tcaggcgatg aaaggtgtca 600

gaacggcgta ttggattggg tttgacacca ccccgtttat gtttgacgcg ctagcaggcg 660

cgtatccaac ctacgccaca aactgggccg acgagcaggt gttacaggcc aggaacatag 720

gactgtgtgc agcatccttg actgagggaa gactcggcaa actgtccatt ctccgcaaga 780

agcaattgaa accttgcgac acagtcatgt tctcggtagg atctacattg tacactgaga 840

gcagaaagct actgaggagc tggcacttac cctccgtatt ccacctgaaa ggtaaacaat 900

cctttacctg taggtgcgat accatcgtat catgtgaagg gtacgtagtt aagaaaatca 960

ctatgtgccc cggcctgtac ggtaaaacgg tagggtacgc cgtgacgtat cacgcggagg 1020

gattcctagt gtgcaagacc acagacactg tcaaaggaga aagagtctca ttccctgtat 1080

gcacctacgt cccctcaacc atctgtgatc aaatgactgg catactagcg accgacgtca 1140

caccggagga cgcacagaag ttgttagtgg gattgaatca gaggatagtt gtgaacggaa 1200

gaacacagcg aaacactaac acgatgaaga actatctgct tccgattgtg gccgtcgcat 1260

ttagcaagtg ggcgagggaa tacaaggcag accttgatga tgaaaaacct ctgggtgtcc 1320

gagagaggtc acttacttgc tgctgcttgt gggcatttaa aacgaggaag atgcacacca 1380

tgtacaagaa accagacacc cagacaatag tgaaggtgcc ttcagagttt aactcgttcg 1440

tcatcccgag cctatggtct acaggcctcg caatcccagt cagatcacgc attaagatgc 1500

ttttggccaa gaagaccaag cgagagttaa tacctgttct cgacgcgtcg tcagccaggg 1560

atgctgaaca agaggagaag gagaggttgg aggccgagct gactagagaa gccttaccac 1620

ccctcgtccc catcgcgccg gcggagacgg gagtcgtcga cgtcgacgtt gaagaactag 1680

agtatcacgc aggtgcaggg gtcgtggaaa cacctcgcag cgcgttgaaa gtcaccgcac 1740

agccgaacga cgtactacta ggaaattacg tagttctgtc cccgcagacc gtgctcaaga 1800

gctccaagtt ggcccccgtg caccctctag cagagcaggt gaaaataata acacataacg 1860

ggagggccgg ccgttaccag gtcgacggat atgacggcag ggtcctacta ccatgtggat 1920

cggccattcc ggtccctgag tttcaggctt tgagcgagag cgccactatg gtgtacaacg 1980

aaagggagtt cgtcaacagg aaactatacc atattgccgt tcacggaccc tcgctgaaca 2040

ccgacgagga gaactacgag aaagtcagag ctgaaagaac tgacgccgag tacgtgttcg 2100

acgtagataa aaaatgctgc gtcaagagag aggaagcgtc gggtttggtg ttggtgggag 2160

agctaaccaa ccccccgttc catgaattcg cctacgaagg gctgaagatc aggccgtcgg 2220

caccatataa gactacagta gtaggagtct ttggggttcc gggatcaggc aagtctgcta 2280

ttattaagag cctcgtgacc aaacacgatc tggtcaccag cggcaagaag gagaactgcc 2340

aggaaatagt caacgacgtg aagaagcacc gcggactgga catccaggca aaaacagtgg 2400

actccatcct gctaaacggg tgtcgtcgtg ccgtggacat cctatatgtg gacgaggctt 2460

tcgcttgcca tcccggtact ctgctagccc taattgctct tgttaaacct cggagcaaag 2520

tggtgttatg cggagacccc aagcaatgcg gattcttcaa tatgatgcag cttaaggtga 2580

acttcaacca caacatctgc actgaagtat gtcataaaag tatatccaga cgttgcacgc 2640

gtccagtcac ggccatcgtg tctacgttgc actacggagg caagatgcgc acgaccaacc 2700

cgtgcaacaa acccataatc atagacacca caggacagac caagcccaag ccaggagaca 2760

tcgtgttaac atgcttccga ggctgggtaa agcagctgca gttggactac cgtggacacg 2820

aagtcatgac agcagcagca tctcagggcc tcacccgcaa aggggtatac gccgtaaggc 2880

agaaggtgaa tgaaaatccc ttgtatgccc ctgcgtcgga gcacgtgaat gtactgctga 2940

cgcgcactga ggataggctg gtgtggaaaa cgctggccgg cgatccctgg attaaggtcc 3000

tatcaaacat tccacagggt aactttacgg ccacattgga agaatggcaa gaagaacacg 3060

acaaaataat gaaggtgatt gaaggaccgg ctgcgcctgt ggacgcgttc cagaacaaag 3120

cgaacgtgtg ttgggcgaaa agcctggtgc ctgtcctgga cactgccgga atcagattga 3180

cagcagagga gtggagcacc ataattacag catttaagga ggacagagct tactctccag 3240

tggtggcctt gaatgaaatt tgcaccaagt actatggagt tgacctggac agtggcctgt 3300

tttctgcccc gaaggtgtcc ctgtattacg agaacaacca ctgggataac agacctggtg 3360

gaaggatgta tggattcaat gccgcaacag ctgccaggct ggaagctaga cataccttcc 3420

tgaaggggca gtggcatacg ggcaagcagg cagttatcgc agaaagaaaa atccaaccgc 3480

tttctgtgct ggacaatgta attcctatca accgcaggct gccgcacgcc ctggtggctg 3540

agtacaagac ggttaaaggc agtagggttg agtggctggt caataaagta agagggtacc 3600

acgtcctgct ggtgagtgag tacaacctgg ctttgcctcg acgcgacgtc acttggttgt 3660

caccgctgaa tgtcacaggc gccgataggt gctacgacct aagtttagga ctgccggctg 3720

acgccggcag gttcgacttg gtctttgtga acattcacac ggaattcaga atccaccact 3780

accagcagtg tgtcgaccac gccatgaagc tgcagatgct tgggggagat gcgctacgac 3840

tgctaaaacc cggcggcagc ctcttgatga gagcttacgg atacgccgat aaaatcagcg 3900

aagccgttgt ttcctcctta agcagaaagt tctcgtctgc aagagtgttg cgcccggatt 3960

gtgtcaccag caatacagaa gtgttcttgc tgttctccaa ctttgacaac ggaaagagac 4020

cctctacgct acaccagatg aataccaagc tgagtgccgt gtatgccgga gaagccatgc 4080

acacggccgg gtgtgcacca tcctacagag ttaagagagc agacatagcc acgtgcacag 4140

aagcggctgt ggttaacgca gctaacgccc gtggaactgt aggggatggc gtatgcaggg 4200

ccgtggcgaa gaaatggccg tcagccttta agggagaagc aacaccagtg ggcacaatta 4260

aaacagtcat gtgcggctcg taccccgtca tccacgctgt agcgcctaat ttctctgcca 4320

cgactgaagc ggaaggggac cgcgaattgg ccgctgtcta ccgggcagtg gccgccgaag 4380

taaacagact gtcactgagc agcgtagcca tcccgctgct gtccacagga gtgttcagcg 4440

gcggaagaga taggctgcag caatccctca accatctatt cacagcaatg gacgccacgg 4500

acgctgacgt gaccatctac tgcagagaca aaagttggga gaagaaaatc caggaagcca 4560

tagacatgag gacggctgtg gagttgctca atgatgacgt ggagctgacc acagacttgg 4620

tgagagtgca cccggacagc agcctggtgg gtcgtaaggg ctacagtacc actgacgggt 4680

cgctgtactc gtactttgaa ggtacgaaat tcaaccaggc tgctattgat atggcagaga 4740

tactgacgtt gtggcccaga ctgcaagagg caaacgaaca gatatgccta tacgcgctgg 4800

gcgaaacaat ggacaacatc agatccaaat gtccggtgaa cgattccgat tcatcaacac 4860

ctcccaggac agtgccctgc ctgtgccgct acgcaatgac agcagaacgg atcgcccgcc 4920

ttaggtcaca ccaagttaaa agcatggtgg tttgctcatc ttttcccctc ccgaaatacc 4980

atgtagatgg ggtgcagaag gtaaagtgcg agaaggttct cctgttcgac ccgacggtac 5040

cttcagtggt tagtccgcgg aagtatgccg catctacgac ggaccactca gatcggtcgt 5100

tacgagggtt tgacttggac tggaccaccg actcgtcttc cactgccagc gataccatgt 5160

cgctacccag tttgcagtcg tgtgacatcg actcgatcta cgagccaatg gctcccatag 5220

tagtgacggc tgacgtacac cctgaacccg caggcatcgc ggacctggcg gcagatgtgc 5280

atcctgaacc cgcagaccat gtggacctgg agaacccgat tcctccaccg cgcccgaaga 5340

gagctgcata ccttgcctcc cgcgcggcgg agcgaccggt gccggcgccg agaaagccga 5400

cgcctgcccc aaggactgcg tttaggaaca agctgccttt gacgttcggc gactttgacg 5460

agcacgaggt cgatgcgttg gcctccggga ttactttcgg agacttcgac gacgtcctgc 5520

gactaggccg cgcgggtgca tatattttct cctcggacac tggcagcgga catttacaac 5580

aaaaatccgt taggcagcac aatctccagt gcgcacaact ggatgcggtc gaggaggaga 5640

aaatgtaccc gccaaaattg gatactgaga gggagaagct gttgctgctg aaaatgcaga 5700

tgcacccatc ggaggctaat aagagtcgat accagtctcg caaagtggag aacatgaaag 5760

ccacggtggt ggacaggctc acatcggggg ccagattgta cacgggagcg gacgtaggcc 5820

gcataccaac atacgcggtt cggtaccccc gccccgtgta ctcccctacc gtgatcgaaa 5880

gattctcaag ccccgatgta gcaatcgcag cgtgcaacga atacctatcc agaaattacc 5940

caacagtggc gtcgtaccag ataacagatg aatacgacgc atacttggac atggttgacg 6000

ggtcggatag ttgcttggac agagcgacat tctgcccggc gaagctccgg tgctacccga 6060

aacatcatgc gtaccaccag ccgactgtac gcagtgccgt cccgtcaccc tttcagaaca 6120

cactacagaa cgtgctagcg gctgccacca agagaaactg caacgtcacg caaatgcgag 6180

aactacccac catggactcg gcagtgttca acgtggagtg cttcaagcgc tatgcctgct 6240

ccggagaata ttgggaagaa tatgctaaac aacctatccg gataaccact gagaacatca 6300

ctacctatgt gaccaaattg aaaggcccga aagctgctgc cttgttcgct aagacccaca 6360

acttggttcc gctgcaggag gttcccatgg acagattcac ggtcgacatg aaacgagatg 6420

tcaaagtcac tccagggacg aaacacacag aggaaagacc caaagtccag gtaattcaag 6480

cagcggagcc attggcgacc gcttacctgt gcggcatcca cagggaatta gtaaggagac 6540

taaatgctgt gttacgccct aacgtgcaca cattgtttga tatgtcggcc gaagactttg 6600

acgcgatcat cgcctctcac ttccacccag gagacccggt tctagagacg gacattgcat 6660

cattcgacaa aagccaggac gactccttgg ctcttacagg tttaatgatc ctcgaagatc 6720

taggggtgga tcagtacctg ctggacttga tcgaggcagc ctttggggaa atatccagct 6780

gtcacctacc aactggcacg cgcttcaagt tcggagctat gatgaaatcg ggcatgtttc 6840

tgactttgtt tattaacact gttttgaaca tcaccatagc aagcagggta ctggagcaga 6900

gactcactga ctccgcctgt gcggccttca tcggcgacga caacatcgtt cacggagtga 6960

tctccgacaa gctgatggcg gagaggtgcg cgtcgtgggt caacatggag gtgaagatca 7020

ttgacgctgt catgggcgaa aaacccccat atttttgtgg gggattcata gtttttgaca 7080

gcgtcacaca gaccgcctgc cgtgtttcag acccacttaa gcgcctgttc aagttgggta 7140

agccgctaac agctgaagac aagcaggacg aagacaggcg acgagcactg agtgacgagg 7200

ttagcaagtg gttccggaca ggcttggggg ccgaactgga ggtggcacta acatctaggt 7260

atgaggtaga gggctgcaaa agtatcctca tagccatggc caccttggcg agggacatta 7320

aggcgtttaa gaaattgaga ggacctgtta tacacctcta cggcggtcct agattggtgc 7380

gttaatacac agaattctga ttggatccac catgaattac atccctacgc aaacgtttta 7440

cggccgccgg tggcgcccgc gcccggcggc ccgtccctgg ccgttgcagg ccactccggt 7500

ggctcccgtc gtccccgggc agctgttgaa ttttgacctt ctcaagctgg cgggagacgt 7560

cgagtccaac cctgggccaa tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc 7620

catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg 7680

cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct 7740

gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg 7800

ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt 7860

ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa 7920

gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga 7980

cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat 8040

ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga 8100

cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt 8160

gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga 8220

gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat 8280

ggacgagctg tacaagtaac tcgagttcac tagtcgatcc cgcggccgct ttcgaaccta 8340

ggcaagcatg cgggcccagt gggtaattaa ttgaattaca tccctacgca aacgttttac 8400

ggccgccggt ggcgcccgcg cccggcggcc cgtccctggc cgttgcaggc cactccggtg 8460

gctcccgtcg tccccgactt ccaggcccag cagatgcagc aactcatcag cgccgtaaat 8520

gcgctgacaa tgagacagaa cgcaattgct cctgctagga gcttaattcg acgaataatt 8580

ggatttttat tttattttgc aattggtttt taatatttcc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 8640

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaactaga aatcgcgatt 8700

tctagtctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 8760

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 8820

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 8880

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 8940

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgaccctc aagtcaaagg 9000

gggcgaaacc cgacaggact ataaaaatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcggg 9060

cgctctcctg ttccaaccct gccgcttacc ggatacctgt ccccctttct cccttcggga 9120

agcggggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 9180

tccaagctgg gctgtgtgca caaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 9240

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 9300

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 9360

cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 9420

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 9480

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 9540

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 9600

gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 9660

aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 9720

gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 9780

gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 9840

cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 9900

gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 9960

gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 10020

ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 10080

tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 10140

ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 10200

cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 10260

accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 10320

cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 10380

tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 10440

cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 10500

acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 10560

atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 10620

tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 10680

aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 10740

cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 10800

atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 10860

cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca 10920

gagcagattg tactgagagt gcaccattcg acgctctccc ttatgcgact cctgcattag 10980

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acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat 11160

ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta 11220

gaggatctgg ctagcgatga ccctgctgat tggttcgctg accatttccg ggtgcgggac 11280

ggcgttacca gaaactcaga aggttcgtcc aaccaaaccg actctgacgg cagtttacga 11340

gagagatgat agggtctgct tcagtaagcc agatgctaca caattaggct tgtacatatt 11400

gtcgttagaa cgcggctaca attaatacat aaccttatgt atcatacaca tacgatttag 11460

gtgacactat a 11471