腸出血性大腸桿菌(EHEC)是能引起人的出血性腹瀉和腸炎的一群大腸埃希氏菌，其以O(shè)157:H7血清型為代表菌株。

背景技術(shù)：

近年來，食源性致病菌—大腸桿菌0157:H7己成為世界性公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重危害人類健康，造成大量經(jīng)濟(jì)損失，并對(duì)社會(huì)穩(wěn)定和環(huán)境安全造成極大程度的負(fù)面影響據(jù)報(bào)道，僅在美國每年由于大腸桿菌0157:H7引起的食源性疾病即達(dá)73,000例，造成經(jīng)濟(jì)損失0.7億美元/年。出血性大腸桿菌主要包括O157:H7、O26:Hll和0111:NM，其中血清型0157是引起出血性結(jié)腸炎的主要致病菌，據(jù)報(bào)道，90％的溶血性尿毒綜合征病例都是由其亞型0157:H7引起，因此有關(guān)大腸桿菌0157:H7的研究受到普遍關(guān)注。大腸桿菌0157:H7對(duì)人的致病力強(qiáng)，感染劑量低，感染載體含菌量達(dá)10個(gè)/g以上即可引起感染。病菌侵入人體后，可以引起出血性或非出血性腹瀉、輕度發(fā)熱或無發(fā)熱、出血性結(jié)腸炎(Hemorrhagic colitis)和溶血性尿毒綜合癥(Hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板減少紫癜(Thromboric thromobocytopenic purpura,TTP)等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。

如何消除大腸桿菌0157:H7對(duì)食品的污染，減少或切斷病原菌可能的傳播途徑，已成為世界范圍內(nèi)亟待解決的問題之一。研究表明，牛、豬等大家畜是大腸桿菌0157:H7的主要寄存宿主，致病菌常通過廄肥污染的生肉及其制品或奶制品進(jìn)入食物鏈，造成人群感染，而誤食污染動(dòng)物糞便的成品蔬菜已成為當(dāng)前0157:H7流行病感染爆發(fā)的又一主要原因，因此牛及其飼養(yǎng)環(huán)境是大腸桿菌0157:H7的主要寄居場所及重要的傳播源。建立切實(shí)可行的飼養(yǎng)場控制策略可以有效地從源頭上降低甚至完全消除大腸桿菌0157:H7的流行,減少和切斷致病菌通過食物鏈和環(huán)境污染等途徑傳播,降低大腸桿菌0157:H7傳染疾病的發(fā)生和流行，值得注意的是,與人被感染的情況不同，絕大多數(shù)排泄或攜帶病原菌的牛都不表現(xiàn)任何明顯的臨床癥狀，這就為預(yù)防感染和臨床診治帶來巨大挑戰(zhàn)。隨著抗生素應(yīng)用于食源性動(dòng)物所帶來的一系列諸如抗生素殘留，多重耐藥菌株的層出不 窮以及耐藥性轉(zhuǎn)移等弊端的出現(xiàn)，尋找有效、綠色、安全、無公害的抗菌或抑菌制劑替代抗生素控制動(dòng)物及生產(chǎn)加工過程中大腸桿菌0157:H7勢(shì)在必行。"

噬菌體是一種可以感染細(xì)菌的病毒,裂解性噬菌體在感染細(xì)菌后,能引起宿主細(xì)胞破裂,利用這一特性可以將噬菌體應(yīng)用于抗菌治療"在抗生素發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用之前，人們就已經(jīng)開始嘗試應(yīng)用噬菌體防治細(xì)菌感染，并取得了一系列可喜的成果。20世紀(jì)四十年代后，由于人們發(fā)現(xiàn)抗生素能夠有效治療多種細(xì)菌性疾病，因此噬菌體療法的研究被取而代之。隨著抗生素抗性問題的不斷出現(xiàn)，應(yīng)用抗生素進(jìn)行抗菌治療面臨著巨大挑戰(zhàn)，尋找安全綠色的抗生素替代品日益成為研發(fā)的方向和重點(diǎn)。近年來，有關(guān)噬菌體作為抗菌制劑的研究受到普遍關(guān)注"噬菌體作為一種抗菌劑，具有特異性強(qiáng)、自我增殖快、來源廣等一些其它抗菌劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，而且天然、綠色、安全，是一種極具開發(fā)和應(yīng)用前景的生物防治手段。大量研究顯示，噬菌體己經(jīng)成功地應(yīng)用于人、家畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物以及農(nóng)作物細(xì)菌性感染的防治，并在食品保鮮和抗微生物污染方面彰顯優(yōu)勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：針對(duì)目前防治EHEC O157:H7引起的動(dòng)物腹瀉及中毒事件時(shí)，使用藥物及相關(guān)治療措施不能夠有效控制該病的傳播等問題，提供一種新的能夠特異性裂解EHEC O157:H7的噬菌體及其應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的是開發(fā)新的并且有用的對(duì)EHEC具有實(shí)質(zhì)裂解潛力的噬菌體分離液，所述噬菌體分離液可以單獨(dú)合用或混合使用以預(yù)防因EHEC O157:H7引起的動(dòng)物腹瀉以及養(yǎng)殖過程中畜舍環(huán)境引起的污染。

本發(fā)明的另一目地是提供所述的噬菌體制品在各種畜禽養(yǎng)殖過程中的飼料、墊料、飼喂用器具表面的EHEC O157:H7裂解潛力。

本發(fā)明的另一目的是提供消毒動(dòng)物飼喂過程中的EHEC污染或畜舍環(huán)境的方法，所述方法包括使用如上述描述的對(duì)EHEC具有裂解潛力的至少一種或組合的噬菌體制劑。

本發(fā)明還涉及用于選擇如以上描述的對(duì)EHEC具有實(shí)質(zhì)裂解潛力的噬菌體分離物的方法。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是根據(jù)本發(fā)明選擇的噬菌體制品對(duì)引起動(dòng)物腹瀉的主要病原EHEC及相關(guān)大腸桿菌具有宿主范圍廣的特點(diǎn)，且所述的噬菌體制品是無毒的，可以安全地用于動(dòng)物腹瀉的預(yù)防和治療中。

本發(fā)的優(yōu)點(diǎn)是根據(jù)本發(fā)明將純化的噬菌體作為食品添加劑，在配料時(shí)加入10⁵pfu/ml或10⁵pfu/g濃度的純化的噬菌體，用于防止食品儲(chǔ)存過程中腸出血性大腸桿菌的生存和繁殖。

本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是提供了有助于消毒、清潔和凈化畜舍環(huán)境中工作表面以及地面、墻壁等等的活性消毒用品，能夠防止EHEC的污染和過度生長。

本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是提供了有助于消毒、清潔和凈化動(dòng)物毛皮中及加工過程等等的活性消毒用品，能夠防止EHEC的污染和過度生長。

附圖說明

圖1噬菌體vB_ECM_M1E電鏡照片；

圖2是不同溫度對(duì)噬菌體的影響；

圖3是不同pH對(duì)噬菌體的影響；

圖4噬菌體在生肉及牛奶中的殺菌結(jié)果，其中A.生肉，B.牛奶。

具本實(shí)施方式

本發(fā)明試驗(yàn)用噬菌體宿主菌EHEC O157:H7購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心，保藏號(hào)G1M1.707。

本發(fā)明試驗(yàn)用LB培養(yǎng)基等培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

實(shí)施例1、噬菌體的分離制備

本發(fā)明樣品采自養(yǎng)豬廠清洗場地污水，經(jīng)雙層濾紙過濾，5000×g.min^-1離心10min，0.22μm濾膜過濾上清。

取50ml過濾上清，加入2ml噬菌體宿主菌EHEC O157:H7過夜培養(yǎng)物，加入20ml LB培養(yǎng)基，室溫作用30min，再放置于37℃培養(yǎng)12～16h。次日，取上述培養(yǎng)物以14000×g.min^-1離心30min，取上清；14000×g.min^-1再次離心20min， 取上清加入0.1％氯仿，形成噬菌體原液。

取噬菌體原液0.1ml，進(jìn)行10倍稀釋，取10²、10⁴和10⁶稀釋液各0.1ml與過夜培養(yǎng)的宿主菌液0.1ml混勻，室溫作用15min后，加入約5ml 0.7％LB培養(yǎng)基，混勻后迅速傾倒入LB培養(yǎng)基平板上層，搖勻平置5min，待其凝固，置于37℃溫箱培養(yǎng)12h后觀察，獲得形成噬菌斑的雙層平板。

實(shí)施例2、噬菌體的純化及透射電鏡分析

取2ml新鮮培養(yǎng)的宿主菌，離心，0.4ml LB培養(yǎng)基重懸，加0.1ml噬菌體(以實(shí)施例1獲得的單個(gè)噬菌體培養(yǎng)物與宿主菌分別按照1:1、1:10和1:100的比例)。加麥芽糖(0.2％)，MgSO₄(10mM)，37℃溫育20min，使噬菌體顆粒吸附于宿主菌；加入100ml LB液體培養(yǎng)基，其中含有麥芽糖(0.2％)，MgSO₄(10mM)，37℃搖震培養(yǎng)9-12h；加0.1ml氯仿，37℃繼續(xù)搖震培養(yǎng)10-20min，獲得裂解液。

將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管，離心8000×g.min^-1，去細(xì)菌碎片，取上清液；加RNase A、DNaseⅠ至1μg/ml，37℃溫育30min；加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，搖勻至溶解，冰浴1h或4℃過夜；4℃離心10000×g.min^-1 20min，去上清液；加2ml SM液，充分洗溶管壁及沉淀，室溫作用1h；通過加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸液中的PEG和細(xì)胞碎片，溫和振蕩30s；4℃，3000×g.min^-1離心15min以分離有機(jī)相和親水相，回收含有噬菌體顆粒的親水相，獲得純化的噬菌體，雙層平板檢測(cè)純化噬菌體(見圖1)。

純化的噬菌體命名為vB_ECM_MIE，于2016年9月29日保藏于中國武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO：M 2016539，分類命名為腸出血性大腸桿菌O157：H7噬菌體vB_ECM_MIE Entero-hemorrhagicEscherichia coli O157:H7phage vB_ECM_MIE。

實(shí)施例3、溫度及pH對(duì)噬菌體穩(wěn)定性的影響

分別取0.1ml 1×10⁸pfu/ml純化噬菌體于40℃～90℃水浴作用1h，將樣品冰浴冷卻后測(cè)其效價(jià)；分別取pH 2.0～9.0的蛋白胨水和2×10⁸pfu/ml純化噬菌體等量混合，37℃水浴作用2h后測(cè)其效價(jià)。

結(jié)果表明，如圖2所示，噬菌體在20℃～50℃作用1h后，其活性無明顯變化；60℃作用1h，活性有所降低；70℃作用后，效價(jià)降低至初始效價(jià)的50％以下；至90℃，幾乎失活。

噬菌體經(jīng)不同pH作用后結(jié)果如圖3，噬菌體在pH6.0～8.0作用后，其效價(jià)均在10⁸pfu/ml，其活性無明顯變化；當(dāng)pH分別6.0和9.0時(shí)，其效價(jià)降至5×10⁷pfu/ml以下；而當(dāng)在2.0～4.0以及10.0時(shí)，已檢測(cè)不到噬菌體。

實(shí)施例4、噬菌體在環(huán)境中的滅菌實(shí)驗(yàn)

將宿主菌分別調(diào)整至10⁵cfu/ml 30ml；同樣將相應(yīng)噬菌體調(diào)整為10⁸pfu/ml30ml。將容器(體積2000cm×1500cm×3560cm，透明塑料箱)進(jìn)行紫外殺菌，箱體四角及中心部位5個(gè)位置分別放置5個(gè)去蓋的LB固體平板，先噴灑細(xì)菌30ml，15min后噴灑30ml噬菌體，其中對(duì)照組中僅噴灑宿主菌。分別在噴灑結(jié)束后3h，加蓋取出平板，并置于37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

表1噬菌體的空間抑菌效力

**:p<0.01:噬菌體組與對(duì)照組比較

實(shí)施例5、噬菌體在生豬肉中的抑菌效果

噬菌體在食品中的滅菌效果研究即食性食品(火腿腸)，將其切成面積約為2cm×2cm的小塊(約1g)，將肉塊過火焰滅菌；制備5×10⁵cfu/mL EHEC菌液；制備5×10⁸pfu/mL濃度的噬菌體。將宿主菌菌液以20μL(1×10⁴cfu/mL)滴于肉塊表面，約30min后，滴50μL噬菌體稀釋液，同時(shí)設(shè)立宿主菌對(duì)照以及PBS對(duì)照；將制備好的樣品分別置于4℃，分別于1d、2d、3d檢測(cè)宿主菌數(shù)量變化情況。

將巴氏殺菌牛奶，分成3組，A組接種宿主菌10⁴cfu/mL于試管中，同時(shí)加 入10⁷pfu/mL噬菌體，B組中僅加入10⁴cfu/mL宿主菌作為對(duì)照，C組中加入相同體積PBS作為對(duì)照，將各組置于4℃，分別于1d、2d、3d檢測(cè)宿主菌數(shù)量變化情況。

噬菌體在生肉及牛奶中的殺菌結(jié)果如圖4所示，將噬菌體以高感染復(fù)數(shù)作用于生肉中的EHEC，4℃作用1天后，宿主菌數(shù)量已降至檢測(cè)水平以下(見圖4A)；第2天，仍未檢測(cè)到EHEC，而此時(shí)EHEC對(duì)照組中數(shù)量有所升高；至第3天，檢測(cè)組與對(duì)照組宿主菌數(shù)量呈顯著性差異，表明噬菌體能夠有效殺滅宿主菌。同樣在巴氏殺菌牛奶中，第1天已檢測(cè)不到宿主菌EHEC；而對(duì)照組中宿主菌數(shù)量卻有顯著上升趨勢(shì)(見圖4B)。由此可見，噬菌體無論在固態(tài)還是液態(tài)食品中均能有效殺滅EHEC。