專利名稱：腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體豬瘟疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬瘟疫苗，尤其涉及腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體豬瘟疫苗， 本發(fā)明還涉及該豬瘟疫苗的構(gòu)建方法以及其在預(yù)防豬瘟中應(yīng)用，屬于豬瘟防制領(lǐng)域
背景技術(shù)：
(Classical swine fever, CSF)(Classical swine fever virus, CSFV)引起的一種烈性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列入須申報(bào)的OIE疫 病名錄(OIE-listed notifiable diseases)，給許多國(guó)家的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。 CSFV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為12. 3kb，僅含一個(gè)大的開放閱讀框架 (ORF)，由其編碼的多聚蛋白經(jīng)細(xì)胞和病毒自身的蛋白酶水解為4種結(jié)構(gòu)蛋白及8種非結(jié) 構(gòu)蛋白。其中E2囊膜糖蛋白是CSFV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是CSFV的主要保護(hù)性抗原，可誘導(dǎo) 中和抗體的產(chǎn)生，是開發(fā)新型豬瘟疫苗的首選靶蛋白(VoigtH，Merant C，Wienhold D，et al.Efficient priming against classical swinefever with a safe glycoprotein E2 expressing Orf virus recombinant(0RFV VrV-E2). Vaccine,2007,25(31) :5915_26.)。目前，免疫接種和撲殺感染豬是控制豬瘟的主要策略。豬瘟兔化弱毒疫苗(C株) 是最常用的疫苗，主要用于豬瘟流行地區(qū)，但無豬瘟國(guó)家一般避免使用疫苗。C株疫苗通常 可以提供良好的免疫效力，但是很難用血清學(xué)方法將野毒感染豬與疫苗免疫豬進(jìn)行有效的 區(qū)分(Zhao J J，Cheng D，Li N，et al. Evaluation of a multiplex real-time RT-PCR for quantitative and differential detection of wild-typeviruses and C-strain vaccine of classical swine fever virus.Vet Microbiol，2008，126(1-3) :l_10.)o 另 夕卜，弱毒疫苗的生產(chǎn)、保存條件要求很高以及其他的安全因素等，使得研究人員們一直致 力于新型、高效、安全的豬瘟標(biāo)記疫苗的研究。但目前的新型豬瘟疫苗都存在免疫原性 差(抗體水平或細(xì)胞免疫應(yīng)答低)、免疫效力低(不能完全阻止病毒血癥)、成本高(免 疫劑量高、需要多次免疫)的問題(TerpstraC，Wensvoort G. The protective value of vaccine-induced neutralisingantibody titres in swine fever. Vet Microbiol,1988, 16(2) :123-128·)。因此，研制適于鑒別診斷的安全、有效豬瘟疫苗具有重要現(xiàn)實(shí)意義。目前，一些研 究小組致力于研制新型豬瘟標(biāo)記疫苗，如病毒活載體疫苗、亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗以 及DNA疫苗等。腺病毒載體是一類常用表達(dá)載體，具有高效遞送外源基因的能力，在基因表達(dá)、基 因治療、載體疫苗等方面得到了廣泛應(yīng)用(Eloit M. Defective adenoviruses as virus vectors for veterinaryvaccines. Vet Res, 1995,26(3) :207_208.)。腺病毒載體是高 效傳遞和表達(dá)外源基因的載體，其遞送的復(fù)制子轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，復(fù)制子RNA具有感染性，可 直接作為mRNA，翻譯合成的非結(jié)構(gòu)蛋白nsPl-4為復(fù)制轉(zhuǎn)錄酶，復(fù)制/轉(zhuǎn)錄酶控制載體 RNA在胞漿中高水平復(fù)制，亞基因組mRNA可以高水平表達(dá)外源基因(Tatsis N, Ertl H C. Adenovirusesas vaccine vectors. Mol Ther，2004，10 (4) :616_629·)。同時(shí)其 RNA 復(fù)制酶合成大量雙鏈RNA (dsRNA)復(fù)制中間體，激活RNase L和RNA依賴的蛋白激酶(PKR)， 導(dǎo)致被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡，dsRNA還可激活并誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)的成熟，增加DC等抗原遞 呈細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的攝取。dsRNA還可被天然免疫受體(如Toll-like受體3，TLR-3)識(shí) 另Ij，產(chǎn)生高水平的I型干擾素(IFN-α和IFN-β)或其它細(xì)胞因子(Ferreira T B,Alves P M, Aunins J G, et al. Use of adenoviralvectors as veterinary vaccines. Gene Ther, 2005，Suppl l:S73-83·)。 為了克服基因工程疫苗的蛋白表達(dá)量低、免疫原性差等缺點(diǎn)，研究者開發(fā)了 甲病毒復(fù)制子載體，這類載體宿主范圍廣，對(duì)樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞具有很強(qiáng)的趨向 性，并且能夠刺激內(nèi)部免疫受體(Hammond J Μ, Jansen E S，Morrissy C J, et al. A prime-boostvaccination strategy using naked DNA followed by recombinant poreineadenovirus protects pigs from classical swine fever. Vet Microbiol, 2001,80 :101-119.)，攜帶的外源基因表達(dá)量高，體內(nèi)不存在抗病毒載體的抗體，并且 通過不同的免疫策略，例如與細(xì)胞因子或共刺激分子等共表達(dá)的方式，可以提高疫苗 白勺 雙胃(MacDonald G H, JohnstonR E. Role of dendritic cell targeting in Venezuelan equine encephalitisvirus pathogenesis. J Virol,2000, 74:914_922 ; Higgsa S, Powersa A M, Olsona K E.Alphavirus expression systems. Applications to mosquitovector studies,1993,9(12) .444-452 ；Atkins G J, Sheahan B J, Liljestrom P. Manipulation of the Semliki Forest Virus genome and itspotential for vaccine construction. Mol Biotechnol, 1996, 533-38 ；Tubulekas I, Berglund P, Fleeton Μ, et al. Alphavirus expression vectorsand their use as recombinant vaccines -.a minireview. Gene, 1997，190 :191_195.)。但這類疫苗的缺點(diǎn)是進(jìn)入體內(nèi)細(xì)胞的效率很低。 基因槍可以有效地將這種甲病毒復(fù)制子載體疫苗遞送到體內(nèi)，高效地發(fā)揮疫苗的作用，但 高費(fèi)用及非廣泛適用性限制了其使用。本發(fā)明人先前研究證實(shí)，表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組腺病毒活載體疫苗rAdV_E2 可保護(hù)豬只抵抗致死性豬瘟病毒的攻擊(Sun Y，Liu D F，Wang Y F，et al. Generation and efficacy evaluation of arecombinant adenovirus expressing the E2 protein of classical swinefever virus. Res Vet Sci，2010，88 (1) :77_82.)。以塞姆利基森林病 毒(SFV)為代表的甲病毒復(fù)制子是另一種常用表達(dá)載體，具有高效表達(dá)外源基因的能力， 是研發(fā)新型疫苗的重要技術(shù)平臺(tái)(Atkins G J, Sheahan B J, Liljestrom P. Manipulation of the Semliki Forest Virusgenome and its potential for vaccine construction. Mol Biotechnol，1996，5 :33-38.)。此前本發(fā)明人構(gòu)建了一種SFV復(fù)制子載體豬瘟疫苗 PSFV1CS-E2，該疫苗可誘導(dǎo)較弱的體液免疫應(yīng)答和較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，免疫豬可抵抗 豬瘟強(qiáng)毒的攻擊(Li N, Qiu H J, Zhao JJ, et al. A Semliki Forest virus replicon vectored DNA vaccine expressing the E2glycoprotein of classical swine fever virus protects pigs from lethalchallenge. Vaccine,2007,25 (15) 2907-2912 ；Zhao H P, Sun J F, Li N, et al.Assessment of the cell-mediated immunity induced by alphavirusreplicon-vectored DNA vaccines against classical swine fever in a mousemodel. Vet Immunol Immunopatho 1，2009，129 :57_65.)。雖然這兩種疫苗能提供臨床 保護(hù)，但與C株疫苗相比，存在一定差距，主要表現(xiàn)在免疫應(yīng)答水平偏低且不均衡、不能完全阻止豬瘟病毒血癥。因此，如何提高現(xiàn)有豬瘟基因工程疫苗的免疫效力是一大技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的豬瘟載體疫苗所存在的進(jìn)入體內(nèi) 細(xì)胞效率低或在體內(nèi)的表達(dá)效率低的缺陷，利用具有高效遞送能力的腺病毒載體去運(yùn)送具 有高效表達(dá)能力的甲病毒復(fù)制子載體，構(gòu)建一種基于腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體的豬 瘟疫苗。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種基于腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體的重組腺病毒(rAdV-SFV_E2)豬瘟疫 苗，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No. 4146。分類命名是遞送表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的甲病毒 復(fù)制子的重組腺病毒；保藏時(shí)間是2010年9月8日；保藏單位是中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微 生物研究所。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建上述重組腺病毒 (rAdV-SFV-E2)的方法，包括以下步驟(1)將含有SFV非結(jié)構(gòu)蛋白基因nsPl-4和CSFV E2基因的片段插入到腺病毒轉(zhuǎn)移 載體中得到重組腺病毒穿梭載體；(2)將獲得的重組穿梭載體線性化后，電轉(zhuǎn)化至含有腺病毒骨架載體AdEasy-I的 感受態(tài)菌中，得到重組腺病毒質(zhì)粒；(3)將重組腺病毒質(zhì)粒純化后線性化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，得到 重組腺病毒rAdV-SFV-E2。其中，步驟(1)中所述的腺病毒穿梭載體優(yōu)選為pShuttle-CMV ；步驟(2)中所述 的感受態(tài)菌優(yōu)選是BJ5183 ；步驟(3)中所述的細(xì)胞優(yōu)選是HEK293細(xì)胞。本領(lǐng)域通常認(rèn)為腺病毒載體和甲病毒復(fù)制子載體是兩類不兼容的表達(dá)載體，迄今 無人嘗試構(gòu)建二者的嵌合載體疫苗。本發(fā)明人通過試驗(yàn)意外地發(fā)現(xiàn)，相比于單獨(dú)的腺病毒 載體疫苗或甲病毒復(fù)制子載體疫苗，將腺病毒載體和甲病毒復(fù)制子載體嵌合在一起所得到 的嵌合載體豬瘟疫苗，彌補(bǔ)了各自的不足，發(fā)揮了各自的優(yōu)勢(shì)，誘導(dǎo)了均衡的體液免疫和細(xì) 胞免疫應(yīng)答，其免疫效果有了出乎意料的顯著提高。也即是說，本發(fā)明將腺病毒載體和甲病 毒復(fù)制子載體嵌合在一起，二種載體并不是簡(jiǎn)單的相互疊加，二者嵌合在一起后有了協(xié)同 和疊加效應(yīng)，使得嵌合載體豬瘟疫苗的免疫保護(hù)效果得以大幅提升。迄今為止，在腺病毒載體中插入的外源基因片段一般是2_4kb左右(即腺病毒基 因組的1/10左右)，最長(zhǎng)的不過是7kb，而本發(fā)明腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體插入的外 源基因序列長(zhǎng)達(dá)10kb，不僅其克隆位點(diǎn)很難選擇，而且將其包裝到腺病毒基因組中也是相 當(dāng)艱難的，在實(shí)施過程中，本發(fā)明人嘗試了多種不同的重組病毒構(gòu)建方法，付出大量的時(shí)間 和勞動(dòng)才最終獲得成功。本發(fā)明利用基因轉(zhuǎn)移能力極強(qiáng)的腺病毒去遞送表達(dá)CSFV E2蛋白的甲病毒復(fù)制子 構(gòu)建了高效表達(dá)CSFV E2蛋白的腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體疫苗，間接免疫熒光試驗(yàn) 和Western blot證實(shí)，本發(fā)明嵌合載體疫苗(重組腺病毒rAdV-SFV_E2)可以高效表達(dá)外 源基因。家兔免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，rAdV-SFV_E2免疫組免疫后1周抗體持續(xù)升高，免疫后4周抗體阻斷率就可達(dá)80%，顯示了良好的體液免疫效果。攻毒后，該免疫組所有家兔 均沒有發(fā)生定型熱，在其脾臟中也沒有檢到病毒RNA，家兔得到完全保護(hù)。中和試驗(yàn)顯示， rAdV-SFV-E2免疫兔產(chǎn)生了高滴度的豬瘟特異性抗體，后來又在家兔上對(duì)rAdV-SFV_E2進(jìn) 行了免疫劑量的試驗(yàn)，106TCID50rAdV-SFV-E2免疫后10天就可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的豬瘟抗 體。在淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，rAdV-SFV-E2免疫組更是顯示了強(qiáng)大的細(xì)胞免疫應(yīng)答，其淋巴 細(xì)胞增殖水平明顯高于C株。 將rAdV-SFV-E2以IO7TCID5tl/頭劑量接種豬2次，間隔3周，同時(shí)用豬瘟兔化弱 毒疫苗(C株)、表達(dá)E2基因的重組腺病毒rAdV-E2、甲病毒復(fù)制子載體疫苗PSFV1CS_E2、 不含外源基因的甲病毒復(fù)制子載體PSFVICS和不含有外源基因的嵌合載體病毒 rAdV-SFV-empty作為對(duì)照，免疫后12周用致死劑量的豬瘟強(qiáng)毒石門株進(jìn)行攻擊。結(jié)果表 明，rAdV-SFV-E2免疫組(η = 5)所有免疫豬在加強(qiáng)免疫后均產(chǎn)生了豬瘟特異性抗體，并于 加強(qiáng)免疫后4周達(dá)到峰值，抗體一直持續(xù)10周以上，攻毒后免疫豬均未出現(xiàn)任何臨床癥狀， 和C株免疫豬一樣得到完全保護(hù)；rAdV-E2免疫組(η = 5)和PSFV1CS_E2免疫組(η = 5) 分別有3頭豬出現(xiàn)發(fā)熱、病毒血癥和輕微的豬瘟病理變化，而rAdV-SFV-empty免疫組(η = 5)和pSFVlCS免疫組(η = 5)豬只在攻毒前一直沒有檢測(cè)到豬瘟特異性抗體，攻毒后全部 出現(xiàn)典型的豬瘟臨床癥狀和嚴(yán)重的病毒血癥，剖檢時(shí)可見典型豬瘟病理變化，這表明嵌合 載體疫苗可以完全保護(hù)豬只抵抗豬瘟強(qiáng)毒的攻擊，與C株的免疫效力相當(dāng)。這種全新的疫 苗策略結(jié)合了腺病毒載體與甲病毒復(fù)制子載體的優(yōu)點(diǎn)，為新型疫苗研制開拓了新的思路和 途徑。在本發(fā)明中，rAdV-SFV-E2及C株疫苗免疫豬只后均誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，攻毒 后免疫豬得到了完全的保護(hù)，沒有產(chǎn)生任何的豬瘟臨床癥狀和典型的豬瘟病理變化，也未 出現(xiàn)病毒血癥，在rAdV-SFV-E2免疫組中部分豬抗體不是特別高，但是卻完全抵抗了豬瘟 強(qiáng)毒的攻擊，這說明了甲病毒/腺病毒嵌合載體豬瘟疫苗確實(shí)發(fā)揮了兩種載體的優(yōu)勢(shì)，彌 補(bǔ)了各自的不足，誘導(dǎo)了均衡的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。應(yīng)用腺病毒載體高效的基因轉(zhuǎn)移能力去遞送甲病毒復(fù)制子疫苗，使得免疫劑量也 大大減少。在本發(fā)明中，我們用IO7TCID5tl的重組腺病毒rAdV-E2免疫豬兩次，免疫豬不能 完全抵抗豬瘟強(qiáng)毒的攻擊(部分豬發(fā)病)，而用107TCID5(1rAdV-SFV-E2免疫豬兩次，該嵌合 載體疫苗誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答和完全的免疫保護(hù)，其免疫效力顯然優(yōu)于常規(guī)腺病毒載體 疫苗rAdV-E2。通過腺病毒載體遞送表達(dá)CSFV E2蛋白的甲病毒復(fù)制子疫苗，既能發(fā)揮腺病 毒載體的高效轉(zhuǎn)移外源基因的能力，又能發(fā)揮甲病毒復(fù)制子載體自我復(fù)制后高效表達(dá)外源 基因及其誘導(dǎo)強(qiáng)大細(xì)胞免疫應(yīng)答的優(yōu)勢(shì)，這種策略可以將PSFV1CS-E2和rAdV-E2的優(yōu)點(diǎn)合 二為一，大大增強(qiáng)了疫苗的免疫效力，極具開發(fā)應(yīng)用前景?？傊?，本發(fā)明嵌合載體疫苗rAdV-SFV_E2在家兔和豬體上，能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的 免疫反應(yīng)，對(duì)豬瘟病毒強(qiáng)毒的攻擊提供完全的保護(hù)。這種策略給新型豬瘟基因工程疫苗帶 來了希望，也給其它疫苗的研究開辟了新的途徑。


圖1重組轉(zhuǎn)移載體pShuttle-SFV-E2和嵌合載體疫苗rAdV-SFV_E2結(jié)構(gòu)示意圖。圖2間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)重組腺病毒rAdV-SFV-E2感染HEK293細(xì)胞中E2蛋白表達(dá)。圖3用Western blot分析E2蛋白在重組腺病毒rAdV-SFV_E2感染的HEK293細(xì) 胞中的表達(dá)。1 :rAdV-E2 ；2 :rAdV-SFV-E2 ；3 :rAdV-SFV-empty0圖4重組腺病毒疫苗免疫豬產(chǎn)生的抗體滴度。圖5用WST-8試驗(yàn)檢測(cè)免疫豬產(chǎn)生的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1材料與方法1. 1載體、細(xì)胞、生化試劑表達(dá)CSFV E2蛋白的甲病毒復(fù)制子DNA疫苗PSFV1CS-E2由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建(此載體 由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建，其構(gòu)建方法如下以塞姆利基森林病毒(SFV)復(fù)制子為基礎(chǔ)， 加入了 CMV啟動(dòng)子、SV40Poly(A)信號(hào)以及多克隆位點(diǎn))。腺病毒載體系統(tǒng)包括腺病毒骨 架載體pAdEasy-Ι和腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV以及大腸桿菌BJ5183感受態(tài)菌均購(gòu)自 Stratagene公司；大腸桿菌JM109、DH5 α感受態(tài)細(xì)胞由本研究組保存。ΗΕΚ293細(xì)胞(購(gòu)于 中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心)用含有10%胎牛血清和適量抗生素的DMEM培養(yǎng)基(Gibco BRL公司)進(jìn)行培養(yǎng)。非限制性內(nèi)切酶BsiwI、sPeI、PmeI和PacI均為NEBBioLabs產(chǎn)品。豬 瘟兔化弱毒疫苗(C株)由哈爾濱維科生物技術(shù)公司生產(chǎn)。針對(duì)豬瘟病毒E2蛋白的單克隆 抗體 HQ06 由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室制備(Peng,W. P.，Hou，Q. ,Xia,Ζ. H.，Chen，D. ,Li,N. ,Sun,Y.， Qiu,H. J. Identification of a conserved linear B-cell epitope at the N-terminusof the E2 glycoprotein of Classical swine fever virus by phage-displayedrandom peptide library. Virus Res, 2008，135，267-272.)。1. 2腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體疫苗的構(gòu)建以 pSFVlCS-E2 為模板，用引物 P5NCRB2C1S(5' -GAC AGA TCTATC GAT GGC GGA TGT GTG ACA TAC-3')和PH3SplSulR(5' -ATTMG CTT ACT AGT GGA TCC GTA CGA CAC GTG ACG TC-3')通過PCR擴(kuò)增得到518bp的SFV 5'非編碼區(qū)(NCR)，經(jīng)BglII和HindIII酶切 后插入pShuttle-CMV中，得到重組質(zhì)粒pSFV-NCR(目的是在腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV 中引入克隆位點(diǎn)BsiwI和SpeI)，用BsiwI和SpeI從PSFV1CS_E2切下9kb的片段(含有SFV 非結(jié)構(gòu)蛋白基因nsPl-4和CSFV E2基因)，插入pSFV_NCR中，得到pShuttle_SFV_E2 (圖 1)。將獲得的重組穿梭載體pShuttle-SFV-E2用PmeI線性化后，電轉(zhuǎn)化至含有腺病 毒骨架載體AdEasy-I的BJ5183感受態(tài)菌中，得到重組腺病毒質(zhì)粒pAdV-SFV_E2，純化后用 PacI線性化，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，從而包裝成重組腺病毒 rAdV-SFV-E2 (圖1)。按相同方法構(gòu)建重組腺病毒rAdV-SFV-empty (其中插入不含有E2基 因的甲病毒復(fù)制子載體)。
1. 3間接免疫熒光試驗(yàn)將rAdV-SFV-E2感染HEK293細(xì)胞通過IFA檢測(cè)CSFV E2蛋白的表達(dá)，用 rAdV-E2(Sun Y, Liu D F, Wang Y F, et al. Generation andefficacy evaluation of a recombinant adenovirus expressing the E2protein of classical swine fever virus. Res Vet Sci，2010，88 (1) :77_82.)感染 HEK293 細(xì)胞作為陽性對(duì)照，rAdV-SFV-empty 感 染細(xì)胞作為陰性對(duì)照，用冷丙酮固定載玻片上的被感染細(xì)胞8min，加入抗CSFV E2蛋白 的單克隆抗體HQ06，置于濕盒中37°C作用45min，用PBS洗滌后，加入FITC標(biāo)記羊抗鼠 IgG(Sigma公司，美國(guó))，置于濕盒中37°C作用45min，用PBS洗滌后，置于倒置熒光顯微鏡 下觀察。1. 4ffestern blot
將感染rAdV-SFV_E2的HEK 293細(xì)胞用細(xì)胞裂解液處理后通過Western blot分析 CSFV E2蛋白的表達(dá)，同時(shí)用感染rAdV-E2的HEK293細(xì)胞作為陽性對(duì)照，用rAdV-SFV-empty 感染的HEK293細(xì)胞作為陰性對(duì)照，收取離心后的裂解液上清進(jìn)行SDS-PAGE，之后轉(zhuǎn)印到硝 酸纖維素膜上，用近紅外雙色激光成像系統(tǒng)(Odyssey)進(jìn)行Western blot分析，一抗為抗 E2蛋白的單克隆抗體HQ06，二抗為近紅外染料標(biāo)記的抗鼠IgG(Li-COR)。1. 5 免疫將購(gòu)自無CSFV豬場(chǎng)的30頭5周齡左右的仔豬，用IDEXX豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑 盒(IDEXX，北京)(基于豬瘟病毒中和性單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒)及熒光定量PCR 檢測(cè)為陰性后，隨機(jī)將其分為6組，每組5只，其中A組經(jīng)后腿肌肉注射接種IO7TCID5tl(ImL) 的重組腺病毒rAdV-SFV-E2 (嵌合載體疫苗)，B組免疫1頭份商品化的豬瘟兔化弱毒疫苗 (C株)，C組經(jīng)后腿肌肉注射接種IO7TCID5tl(ImL)的重組腺病毒rAdV_E2 (普通腺病毒疫苗) (SunY,Liu D F,Wang Y F,et al. Generation and efficacy evaluation of arecombinant adenovirus expressing the E2 protein of classical swinefever virus. Res Vet Sci，2010，88(1) :77_82.)，D 組免疫 100 μ g (ImL) pSFVlCS_E2 (Li N, Qiu H J, Zhao J J, et al. A Semliki Forest virusreplicon vectored DNA vaccine expressing the E2 glycoprotein ofclassical swine fever virus protects pigs from lethal challenge. Vaccine, 2007,25 (15) 2907-2912 ；Zhao H P, Sun J F, Li N, et al. Assessment ofthe cell-mediated immunity induced by alphavirus replicon-vectoredDNA vaccines against classical swine fever in a mouse model. VetImmunol Immunopathol,2009, 129 57-65), E 組免疫 100 μ g(ImL)pSFVlCS (Li N, Qiu H J, Zhao J J, et al. A Semliki Forest virusreplicon vectored DNA vaccine expressing the E2 glycoprotein ofclassical swine fever virus protects pigs from lethal challenge. Vaccine,2007, 25(15) =2907-2912), F 組經(jīng)后腿肌肉注射接種 IO7TCID5tl(ImL)rAdV-SFV-empty。首免 3 周 后，以同樣劑量同樣途徑進(jìn)行加強(qiáng)免疫。1. 6 攻毒當(dāng)抗體上升到最高滴度并維持?jǐn)?shù)周后，通過頸部肌肉注射ImLCSFV石門株強(qiáng)毒 (購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)(IO6TCID5cZmL)，對(duì)所有豬只進(jìn)行攻毒。攻毒后，每天記錄所有 豬的直腸溫度和臨床變化；將病死豬及處死豬進(jìn)行病理剖檢，同時(shí)采集各臟器，進(jìn)行組織病 理學(xué)檢查及免疫組化檢測(cè)。
1. 7抗體檢測(cè)免疫前、免疫后每周及攻毒后每隔2d (攻毒后0 15d)，采血分離血清，用CSFV抗 體檢測(cè)試劑盒(IDEXX，北京)檢測(cè)CSFV特異性中和抗體產(chǎn)生情況1.8WST-8試劑檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖按常規(guī)方法分離PBMC (Peng W P, Hou Q, Xia Z H, et al. Identification of a conserved linear B—cell epitope at the N—terminus ofthe E2 glycoprotein of Classical swine fever virus by phage—displayedrandom peptide library. Virus Res, 2008，135，267-272.)。將新鮮分離的PBMC計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞用RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì) 胞濃度至IO7個(gè)/mL。將上述制備的淋巴細(xì)胞懸液混勻加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入淋巴 細(xì)胞懸液100 μ L。將每組淋巴細(xì)胞懸液設(shè)3個(gè)重復(fù)，分別用CSFV刺激。將細(xì)胞置于37°C， 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后，每孔加入10 μ L WST-8試劑(購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所)，混勻 后繼續(xù)培養(yǎng)4h，測(cè)定OD45tlnm值，計(jì)算刺激指數(shù)(Si) = OD (刺激孔)/OD (空白對(duì)照孔)。1. 9用熒光定量RT-PCR檢測(cè)血液中病毒含量攻毒前及攻毒后不同時(shí)間采集抗凝血，用TRIzoI試劑提取總??？離，溶于仙口!^ DEPC處理的滅菌雙蒸水中，取20 μ L反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用已報(bào)道的熒光定量RT-PCR方 法(Zhao J J, Cheng D, Li N, et al. Evaluation of a multiplex real-time RT-PCR for quantitative anddifferential detection of wild-type viruses and C-strain vaccine ofclassical swine fever virus. Vet Microbiol, 2008,126 (1-3) :1-10·)，檢測(cè) 試驗(yàn)豬攻毒后CSFV病毒載量。2試驗(yàn)結(jié)果2. 1E2蛋白在重組腺病毒感染細(xì)胞中的表達(dá)重組腺病毒rAdV-SFV-E2傳至第5代后，于24_48h內(nèi)出現(xiàn)典型細(xì)胞病變(細(xì)胞 變大、變圓、聚集成葡萄串樣)。提取不同代次重組腺病毒基因組，用PCR能夠檢測(cè)到目的 基因E2的存在(結(jié)果未顯示)。用間接免疫熒光試驗(yàn)及Western blot證實(shí)E2蛋白在 rAdV-SFV-E2感染的HEK293細(xì)胞中得到表達(dá)(圖2和圖3)。2. 2抗CSFV特異性抗體首次免疫后3周，在rAdV-SFV_E2和C株免疫組各有一頭豬抗體轉(zhuǎn)為陽性，加強(qiáng)免 疫后1周，rAdV-SFV-E2、rAdV-E2和C株免疫組所有豬的抗體均為陽性，平均抗體阻斷率分 別為54. 57%,34. 69%和58. 55%，隨后這三組的抗體逐漸升高，并于加強(qiáng)免疫后3周抗體 達(dá)到峰值，抗體一直持續(xù)到攻毒前(免疫后12周)。至攻毒時(shí)，rAdV-SFV-E2、rAdV_E2和 C株免疫組各組的平均抗體阻斷率分別為76. 57%,41. 78%和75. 72%, PSFV1CS_E2在攻 毒前平均抗體阻斷率接近于陽性閾值。攻毒后抗體短暫下降，隨后迅速上升，至攻毒后第9 天，上述4組抗體阻斷率均上升至80%以上。而rAdV-SFV-empty和pSFVlCS免疫組自始至 終沒有檢測(cè)到豬瘟特異性抗體(圖4)。2. 3特異性淋巴細(xì)胞增殖為了評(píng)價(jià)免疫后所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，WST-8試劑檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)了免疫豬攻 毒前后的淋巴細(xì)胞經(jīng)特異性抗原(豬瘟病毒石門株)刺激后的增殖反應(yīng)。結(jié)果表明，攻毒 前rAdV-SFV-E2免疫豬的脾細(xì)胞經(jīng)CSFV刺激后，淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)略高于C株免疫組 的，達(dá)到2，攻毒后淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)超過了 3，高于其他各免疫組，而rAdV-SFV-empty和pSFVlCS對(duì)照組沒有產(chǎn)生任何特異性淋巴細(xì)胞增殖(圖5)。2. 4攻毒后免疫豬保護(hù)情況在免疫后12w用CSFV石門株強(qiáng)毒對(duì)所有豬進(jìn)行攻擊。攻毒后，rAdV-SFV_E2和 C株免疫組所有豬沒有出現(xiàn)任何臨床癥狀，rAdV-E2和PSFV1CS-E2免疫組各有3頭豬出 現(xiàn)短暫的體溫升高，不過2-4天后就恢復(fù)正常，rAdV-SFV-empty和pSFVlCS免疫組所有 豬出現(xiàn)嚴(yán)重豬瘟臨床癥狀，從攻毒第2天起一直稽留高熱，體溫升高至41-42°C，精神沉 郁、食欲下降以致廢絕、怕冷、嗜睡；病初便秘，隨后出現(xiàn)糊狀或水樣并混有血液的腹瀉，大 便惡臭；結(jié)膜炎、口腔粘膜不潔、齒齦和唇內(nèi)以及舌體上可見有潰瘍或出血斑；后期鼻端、 唇、耳、四腳、腹下及腹內(nèi)側(cè)等處皮膚上有出血點(diǎn)或出血斑等豬瘟的典型癥狀。對(duì)攻毒期 間所有豬發(fā)熱頻率進(jìn) 行了統(tǒng)計(jì)，各組情況如下(表1) :rAdV-SFV-E2(0/75)、C株(0/75)、 rAdV-E2 (10/75)、pSFVlCS-E2 (8/75)、pSFVlCS (33/43)禾口 rAdV-SFV-empty (29/33)。 pSFVlCS和rAdV-SFV-empty免疫豬在攻毒后第6天逐漸死亡，至攻毒后第9天所有豬全 部死亡。對(duì)病死豬及免疫保護(hù)豬剖檢顯示，pSFVlCS和rAdV-SFV-empty免疫組所有豬出 現(xiàn)典型的豬瘟病理變化扁桃體出血、有壞死灶，淋巴結(jié)腫大、出血，呈大理石狀，脾臟有梗 死灶，腎臟有大量出血點(diǎn)，形似麻雀蛋，膀胱有多個(gè)出血點(diǎn)，回盲瓣扣狀腫等，rAdV-E2和 PSFV1CS-E2免疫組有個(gè)別豬的淋巴結(jié)、扁桃體、脾臟出項(xiàng)輕微的病理變化，而rAdV-SFV-E2 和C株免疫組所有豬都沒有豬瘟病理變化。表1免疫豬攻毒后臨床癥狀統(tǒng)計(jì)
\ ■ ---- - 1 ■‘
試驗(yàn)分組發(fā)熱最早出現(xiàn)發(fā)熱發(fā)熱頻次存活
(>40.5 °C)時(shí)間(天)
rAdV-SFV-E20/5-0/755/5
C 株0/5-0/755/5
rAdV-E23/5310/755/5
pSFVlCS-E23/5212/755/5
pSFVlCS5/5133/430/5
rAdV-SFV-empty 5/5 129/330/5 --.__■_■——------ \2. 5免疫豬攻毒后血液中病毒載量的檢測(cè)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR對(duì)試驗(yàn)豬攻毒前及攻毒后第l、3、6、9、12、15d血液中病毒 RNA含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，rAdV-SFV-E2和C株免疫組所有豬在攻毒后均沒有檢測(cè)出 了 CSFV RNA, rAdV-E2和pSFVlCS_E2各有2頭豬在攻毒后3天和6天檢出了少量病毒RNA， pSFVlCS和rAdV-SFV-empty對(duì)照組所有豬在攻毒后第3d直到死亡都檢出了 CSFV RNA,最高含量達(dá)到了 IO6拷貝/μ L以上(表2)。表2實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)攻毒后免疫豬血液中豬瘟病毒RNA含量(copies/ μ L)
權(quán)利要求
一種基于腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體的重組腺病毒豬瘟疫苗，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No.4146。
2.—種構(gòu)建權(quán)利要求1所述重組腺病毒豬瘟疫苗的方法，包括以下步驟(1)將含有塞姆利基森林病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因nsPl-4和豬瘟病毒E2基因的片段插入 到腺病毒穿梭載體中得到重組腺病毒穿梭載體；(2)將獲得的重組穿梭載體線性化后，電轉(zhuǎn)化至含有腺病毒骨架載體AdEasy-I的感受 態(tài)菌中，得到重組腺病毒質(zhì)粒；(3)將重組腺病毒質(zhì)粒純化后線性化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，得到重組腺病毒。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述腺病毒穿梭載體是pShuttle-CMV。
4.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的感受態(tài)菌是BJ5183。
5.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述的細(xì)胞是HEK293細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1所述的重組腺病毒在制備防制豬瘟的生物制品中的用途。
7.一種防制豬瘟的疫苗組合物，其特征在于，包括預(yù)防或治療上有效量的權(quán)利要求1 所述的重組腺病毒疫苗和免疫制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體豬瘟疫苗及其應(yīng)用。本發(fā)明利用基因轉(zhuǎn)移能力極強(qiáng)的腺病毒來遞送表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的甲病毒復(fù)制子載體，構(gòu)建了高效表達(dá)CSFV E2蛋白的腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體疫苗，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No.4146；本發(fā)明嵌合載體疫苗通過腺病毒載體遞送表達(dá)CSFV E2蛋白的甲病毒復(fù)制子載體疫苗，既能發(fā)揮腺病毒載體的高效轉(zhuǎn)移外源基因的能力，又能發(fā)揮甲病毒復(fù)制子載體自我復(fù)制后高效表達(dá)外源基因及其誘導(dǎo)強(qiáng)大細(xì)胞免疫應(yīng)答的優(yōu)勢(shì)，大大增強(qiáng)了疫苗的免疫效力，免疫劑量也大大減少。本發(fā)明嵌合載體疫苗在豬體上能誘導(dǎo)高水平的免疫反應(yīng)，可對(duì)致死性豬瘟病毒強(qiáng)毒的攻擊提供完全的保護(hù)。
文檔編號(hào)C12N15/861GK101966341SQ20101029757
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者仇華吉, 孫元, 李娜, 李宏宇 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所