專利名稱:用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒的包裝細胞系及應用的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及一種能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associated virus,AAV)的包裝細胞系及其用途,特別涉及將AAV全基因組但不包含其兩端反向重復序列(Inverted terminalrepeats,ITRs)的191~4484核苷酸共約4.3kb序列,克隆于以EB病毒復制子為基礎的自主復制型載體而產(chǎn)生的AAV-EBV嵌合質(zhì)粒型載體轉(zhuǎn)染細胞系A549,經(jīng)抗性選擇,所建立的細胞系AE1201。細胞系AE1201能表達AAV基因組編碼的蛋白,以提供反式功能用于包裝攜帶外源基因的重組腺病毒伴隨病毒(recombrant adeno-associated virus,rAAV)的基因組,從而可用于生產(chǎn)rAAV。
AAV屬于微小病毒科,它的基因組是單鏈DNA,由4682個核苷酸組成,兩端各有145個核苷酸的反向重復序列,是AAV基因組的復制起點和與復制及整合相關的順式序列元件的所在,病毒基因組的編碼信息按蛋白的功能可分成兩部分,左端(Rep區(qū))編碼與病毒復制、轉(zhuǎn)錄必需的蛋白,右端(Cap區(qū))編碼病毒結構蛋白。
AAV是非自主復制的病毒,它的產(chǎn)毒性復制需要有輔助病毒如腺病毒ADV或單純皰疹病毒HSV的協(xié)助才能進行。當輔助病毒不存在時,AAV感染人細胞后,病毒DNA以很高的頻率整合于宿主染色體的特定位置,建立隱性感染,不產(chǎn)生子代病毒;但當宿主細胞被腺病毒或單純皰疹病毒感染時,可將AAV從整合于染色體的原病毒狀態(tài)激活,并從中拯救出來,從而破壞了AAV的隱性感染,復制產(chǎn)生子代AAV毒粒。
AAV分子生物學的一個重要特點是,用克隆于大腸桿菌質(zhì)粒的AAV全基因組,轉(zhuǎn)染細胞,當有腺病毒或單純皰疹病毒感染時,質(zhì)粒中的AAV基因組也可被拯救出來,產(chǎn)生野生型的AAV毒粒。這一特性構成了制備重組AAV病毒載體的理論基礎。
含AAV全基因組的質(zhì)粒,通過遺傳工程的方法,去除了基因組中用于編碼病毒蛋白的部分或全部序列元件,僅保留AAV基因組中兩端的ITRs,插入了相當于被刪去AAV基因片段大小的外源DNA,可得到含外源基因的重組AAV病毒表達載體質(zhì)粒(I);同時,除去克隆化AAV全基因組兩端的ITRs,保留其編碼病毒蛋白的全部基因序列,可得到用于輔助重組AAV載體包裝的助手包裝質(zhì)粒(II),它轉(zhuǎn)染細胞后,在輔助病毒如ADV或HSV存在時,可表達與AAV輔助和包裝必需的病毒蛋白,但由于缺失了復制必需的順式元件,不能進行復制和包裝出野生型AAV毒粒。而當感染了輔助病毒的細胞共轉(zhuǎn)染I和II這兩種質(zhì)粒時,(轉(zhuǎn)染方法可以是磷酸鈣共沉淀法或脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染),助手包裝質(zhì)粒II表達的反式蛋白,識別重組AAV病毒表達載體質(zhì)粒I中AAV的ITRs順式作用元件,將重組AAV兩端的ITRs連同外源基因一起從質(zhì)粒I中拯救出來,進行復制和包裝出重組AAV病毒顆粒。采用化學或物理手段除去和滅活輔助病毒,得到的重組AAV毒粒可作為一種轉(zhuǎn)導性載體,通過病毒感染的方式將外源基因?qū)氲郊毎校⒖烧嫌谒拗魅旧w中而得到穩(wěn)定的表達。與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比,重組AAV載體能轉(zhuǎn)導有絲分裂后細胞和分化終端細胞,AAV具有超感染的特性,可進行重復感染,同時在人類至今還未發(fā)現(xiàn)與AAV直接相關的疾病,這些特點使它在人類疾病的基因治療領域中具有應用前景。
目前制備重組AAV毒粒的方法基本上是按上述原理進行,也就是采用兩種不同的AAV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞,一種載體提供AAV的反式作用蛋白,另一種提供復制和包裝必需的順式序列元件和外源基因,在輔助病毒的協(xié)助下,獲得攜帶外源基因的AAV毒粒。
為提高重組AAV載體的包裝效率,Samulski將克隆化野生型AAV基因組的兩端ITRs用腺病毒5型基因組兩端的重復序列所取代,獲得AAV包裝質(zhì)粒pAd8(Samulski et alHelperfree stocks of recombinant adeno-associated virusnormal intergration does not require viral geneexpression.J.Virology 633822-3828),雖然ADV的末端重復能允許被導入已感染ADV的細胞中的pAd8按腺病毒復制的機制進行有限的擴增,但還未能離開上述的工作模式,盡管這過程相對簡單,但操作起來仍較為繁瑣。表現(xiàn)為由于沒有獲得一種能支持重組AAV復制和包裝的細胞系的存在,每次操作都需要將兩種載體共轉(zhuǎn)染細胞,由于共轉(zhuǎn)染兩種載體同時到大量的細胞個體的頻率較低,因此也影響到產(chǎn)生重組AAV病毒的效率。
Lebkowski等人(Applied Immune Science,Inc.)提出了一種改進,將帶外源基因的重組AAV載體克隆于自主復制的EB復制子載體中,轉(zhuǎn)化細胞后,細胞內(nèi)可維持多拷貝的重組AAV載體的存在,該轉(zhuǎn)化細胞感染上一種將AAV全基因組的蛋白編碼序列重組于腺病毒E3區(qū)的重組腺病毒時,該重組腺病毒不僅能提供輔助病毒的功能,同時也表達出AAV包裝所必需的反式蛋白,使細胞中多拷貝存在的,位于EB載體上的帶外源基因的重組AAV基因組可被包裝出重組AAV病毒顆粒(US5173414,US5354678)。這過程看起來相當簡化,但使用起來對于克隆不同外源基因的重組AAV載體,都需要分別轉(zhuǎn)染細胞,獲得不同的轉(zhuǎn)化細胞系后,才能進一步用重組腺病毒感染來包裝出重組病毒。
將AAV基因組的所有編碼病毒蛋白的序列元件轉(zhuǎn)化到細胞,構建出一種能提供包裝重組AAV的反式包裝細胞系,能提供一種可行的包裝重組AAV的簡單通用的包裝體系,Vincint等將AAV的基因組轉(zhuǎn)化Hela細胞,獲得整合了AAV基因組的包裝細胞系,但包裝重組病毒的效率很低,可能是受制于該轉(zhuǎn)化細胞系中AAV基因組的低拷貝數(shù)和整合于受體細胞染色體中的AAV基因組的低效率表達所致(Vincint et alReplication and packaging ofHIV envelope genes in a novel adeno-associated virus vector,Vaccine 90353-359)。
本發(fā)明的目的是,提供一種能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒的包裝細胞系,它含有不包括兩端包裝信號ITRs的AAV全基因組編碼序列,在輔助病毒存在時,能支持攜帶外源基因的重組AAV載體包裝成重組AAV病毒顆粒。它的構建是由載體pEB-AAV轉(zhuǎn)染細胞A549后,在潮霉素B選擇壓力下獲得一種能高效提供反式包裝重組AAV病毒的所有病毒蛋白的包裝細胞系,我們將其命名為細胞系AE1201。AAV的全基因組蛋白編碼信息在AE1201細胞染色體外以多拷貝的附加子形式穩(wěn)定存在并自主復制,當此包裝細胞系感染輔助病毒后,自主復制載體上的AAV的編碼蛋白基因就能表達,如再轉(zhuǎn)染進該細胞系含外源基因的重組AAV載體質(zhì)粒,就能從質(zhì)粒中拯救出來并包裝成重組病毒。
本發(fā)明的特點是,包裝細胞系AE1201中所含的自主復制載體pEB-AAV是采用EB病毒復制子載體荷載AAV的基因組序列。EB病毒復制子載體能游離于人細胞染色體外自主復制,能以較高的頻率轉(zhuǎn)染細胞,很容易通過抗藥性篩選得到轉(zhuǎn)化細胞系,只要培養(yǎng)液中加以抗生素壓力,就能維持EB復制子載體在細胞中穩(wěn)定存在,這樣,AAV的基因不需整合到宿主細胞的染色體上,作為載體上目標基因,其表達由于處于附加子的環(huán)境,能保證AAV基因組中所有編碼蛋白質(zhì)的表達,不受細胞染色體的影響。
本發(fā)明的用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒包裝細胞系所使用的自主復制載體,由以下DNA元件組成1,AAV病毒蛋白編碼序列AAV基因組191--4484核苷酸。
2,EB病毒質(zhì)粒型復制子OriP及其反式作用因子EBNA-I。
3,真核細胞抗性選擇標志(潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)。
4,大腸桿菌質(zhì)粒骨架(包括大腸桿菌復制子和氨芐青霉素抗性β內(nèi)酰胺酶基因)。
本發(fā)明用于構建可生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒的包裝細胞系的原始質(zhì)粒有pEB-AAV顏子穎等,中國專利申請?zhí)?6 105366.6,中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,登記入冊的編號為CGMCC NO.0266)。
本發(fā)明用于構建可生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒的包裝細胞系的原始細胞有
人肺癌細胞系A549(ATCC CCL185)。
用質(zhì)粒pEB-AAV轉(zhuǎn)染人肺癌細胞系A549,經(jīng)潮霉素選擇,挑取克隆,擴大培養(yǎng),即可建立能實施AAV包裝功能的細胞系。我們將由此建立的細胞系命名為AE1201。此細胞系細胞可用含潮霉素100-400μg的1640或DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),并維持其對重組AAV的包裝功能。
細胞系AE1201中由于含有自主復制載體pEB-AAV,因而在輔助病毒如腺病毒或單純皰疹病毒誘導時,能表達AAV基因組編碼的蛋白,并用于包裝攜帶外源基因的重組AAV基因組,產(chǎn)生重組AAV病毒顆粒。此細胞系細胞已于1997年1月9日保存于中國典型培養(yǎng)物保存中心,登記如冊的編號為CCTCCC97001。
以下實施例對本發(fā)明的用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒的包裝細胞系的制備和用途作了詳細說明,但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。在實施例中,所用的重組AAV載體質(zhì)粒pAAVlac是AAV原始質(zhì)粒pSub201(J.Virology,633822-3828,1989)AAV編碼病毒蛋白部分4.3kb XbaII片段為一片段大小相同的β半乳糖苷酶的表達單位所取代,A549細胞是人肺癌細胞系(ATCC CCL185)。
荷載AAV的結構基因的自主復制型載體pEB-AAV是將AAV的基因組中191-4484的序列克隆于EB病毒復制子載體中。
實施例1質(zhì)粒的制備。
大腸桿菌DH5α/pEB-AAV接種于200ml LB培養(yǎng)液,37℃培養(yǎng)24小時,離心收菌體,加5ml溶液I(50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris-HCl,10mmol/LEDTA,pH8.0)重懸菌體,冰浴下加10ml溶液II(0.2mol/L NaOH,1%SDS),5分鐘后加7.5ml溶液III(100ml中含5mol/L乙酸鉀60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml)混勻,15000rpm離心1 5分鐘,上清加0.6倍體積異丙醇沉淀。沉淀以2ml TE溶液(10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA,pH5.0)溶解,等體積酚-氯仿-異戊醇(24∶24∶1,v/v)抽提除蛋白質(zhì),然后在Sepharose 4B柱(15.0×1.0cm)凝膠過濾,收集流出的質(zhì)粒峰,經(jīng)乙醇沉淀和洗鹽后,溶于純水中即可。
實施例2AAV反式包裝細胞系AE1201的建立。
A549細胞以加10%的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),傳代于100mm培養(yǎng)皿,當細胞呈70%匯片時,pEB-AAV采用Lipofectin試劑(BRL公司),以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導入細胞,2-3天后,按1∶4稀傳細胞于含200μg潮霉素B的培養(yǎng)液中,期間隔2、3天換新鮮的含潮霉素的培養(yǎng)液,除去死細胞,2-3周后長出細胞集落,挑出細胞集落擴增,獲得質(zhì)粒pEB-AAV在其中以附加子形式存在,并隨細胞分裂周期自主復制的AAV反式包裝細胞系AE1201。這個細胞系的傳代培養(yǎng)應使用含100-400μg潮霉素B的1640或DMEM培養(yǎng)液,以確保質(zhì)粒在細胞傳代過程的維持。
實施例3利用構建的反式包裝細胞系AE1201制備重組AAV病毒顆粒。
實施例2所獲的細胞系在使用時不加潮霉素B,傳代于100mm培養(yǎng)皿,當細胞呈40%匯片時,接種5型腺病毒(ADV5),接種的感染復數(shù)(multiplicity of infection,mio)可在1-5,感染2-4小時后,將10μg重組質(zhì)粒采用Lipofectin試劑(BRL公司),以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導入細胞,或以磷酸鈣共沉淀法導入細胞,1天后,更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),2-3天后,當細胞出現(xiàn)明顯的細胞毒效應時,可收獲混合了輔助病毒ADV5的重組AAV。收毒時,細胞培養(yǎng)液和細胞都回收,反復凍融或以超聲處理使細胞完全裂解,離心去掉細胞碎片,56℃加熱1小時以滅活腺病毒,再經(jīng)0.22μm醋酸纖維膜過濾除菌,得到可用于轉(zhuǎn)導細胞的重組AAVlac。
實施例4重組AAV病毒顆粒轉(zhuǎn)導培養(yǎng)人細胞系。
實施例3所獲的帶報道基因β半乳糖苷酶的重組腺病毒伴隨病毒顆粒AAVlac可用于感染培養(yǎng)細胞系,在培養(yǎng)的A549細胞感染AAVlac,48小時后,以細胞化學的方法檢測β半乳糖苷酶的表達,(Somatic Cell Mol.Genet.,13(3),253-265,1987),細胞以磷酸鈉緩沖液洗滌2遍,加入含X-Gal的染色液,30分鐘或更長時間后觀察,可見被感染細胞因外源基因的表達而呈藍色,其典型的轉(zhuǎn)導效率為當病毒滴度為107時,感染培養(yǎng)有106個細胞的培養(yǎng)皿,可見培養(yǎng)皿的細胞全部變藍。
實施例5含質(zhì)粒pEB-AAV的包裝細胞系AE1201用于擴增重組AAV。
實施例2所獲的細胞系AE1201在使用時不加潮霉素B,傳代于100mm培養(yǎng)皿,當細胞呈80%匯片時,感染從實施例3所獲的帶報道基因β半乳糖苷酶的重組腺病毒伴隨病毒顆粒AAVlac,24小時后,感染接種5型腺病毒(ADV5),接種的感染復數(shù)(multiplicity ofinfection,mio)可在1-5,再過24-72小時后,當細胞出現(xiàn)明顯的細胞毒效應時,可收獲混合了輔助病毒ADV5的重組AAVlac。收毒時,細胞培養(yǎng)液和細胞都回收,反復凍融或以超聲處理使細胞完全裂解,離心去掉細胞碎片,56℃加熱1小時以滅活腺病毒,再經(jīng)0.22μm醋酸纖維膜過濾除菌,得到可用于轉(zhuǎn)導細胞的重組AAVlac,經(jīng)此過程,可使AAVlac的滴度進一步提高。
權利要求
1,能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associated virus,AAV)的包裝細胞系AE1201,其特征在于含有能反式提供AAV基因組編碼蛋白的EB病毒自主復制型載體pEB-AAV,pEB-AAV由下列DNA元件組成1,AAV病毒蛋白編碼序列AAV基因組191-4484核苷酸;2,EB病毒質(zhì)粒型復制子OriP及其反式作用因子EBNA-I;3,真核細胞抗性選擇標志(潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因);4,大腸桿菌質(zhì)粒骨架(包括大腸桿菌復制子和氨芐青霉素抗性β內(nèi)酰胺酶基因)。
2,能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associated virus,AAV)的包裝細胞系,是由載體pEB-AAV轉(zhuǎn)染人肺癌細胞系A549,經(jīng)潮霉素壓力選擇所建立的。其特征在于,只要培養(yǎng)液中加以潮霉素壓力,pEB-AAV在細胞系AE1201中就能以附加子的形式穩(wěn)定存在,并自主復制。載體上的目標基因表達處于附加子環(huán)境,保證了AAV基因組中所有編碼基因的表達不受細胞染色體的影響。
3,能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associated virus,AAV)的包裝細胞系AE1201,其特征在于在腺病毒或單純皰疹病毒誘導時,細胞能表達AAV基因組編碼的蛋白,以提供反式功能用于包裝攜帶外源基因的重組AAV基因組,用于生產(chǎn)重組AAV病毒顆粒。
4,根據(jù)權利要求1和2和3,能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒的包裝細胞系AE1201,其特征在于,將細胞系轉(zhuǎn)染克隆了外源基因的重組AAV質(zhì)粒載體,在輔助病毒存在時,可支持重組腺病毒伴隨病毒基因組的包裝,產(chǎn)生攜帶外源基因的重組AAV病毒顆粒。
5,根據(jù)權利要求1和2和3,能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒的包裝細胞系AE1201,其特征在于,細胞系用攜帶外源基因的重組AAV轉(zhuǎn)導后,在輔助病毒存在時,可用于進一步擴增攜帶外源基因的重組AAV病毒顆粒。
6,根據(jù)權利要求1和2和3和4和5,能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒的包裝細胞系AE1201,其特征在于可在助手包裝質(zhì)粒不存在時,也能與外加的輔助病毒一起,用于生產(chǎn)或擴增攜帶外源基因的重組AAV病毒顆粒。
全文摘要
能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒(AAV)的包裝細胞系AE1201,是用EB病毒復制子載體pEB-AAV轉(zhuǎn)染人肺癌細胞系A549,經(jīng)抗性篩選構建的AAV結構基因以多拷貝附加子形式穩(wěn)定存在并自主復制的AAV反式包裝細胞系。EB病毒復制子載體pEB-AAV含有AAV基因組編碼所有病毒蛋白基因的191~4484核苷酸序列元件、EB病毒質(zhì)粒型復制子及其反式作用因子、真核細胞抗性選擇標志、以及帶大腸桿菌復制子和氨芐青霉素抗性基因的大腸桿菌質(zhì)粒骨架。細胞系AE1201在輔助的腺病毒或單純皰疹病毒誘導時,能表達AAV基因組編碼的蛋白,以提供反式功能用于包裝攜帶外源基因的AAV基因組,用于生產(chǎn)重組AAV病毒顆粒。
文檔編號C12N15/64GK1177006SQ9711509
公開日1998年3月25日 申請日期1997年8月4日 優(yōu)先權日1997年8月4日
發(fā)明者姚二梅, 顏子潁, 侯云德 申請人:病毒基因工程國家重點實驗室