本發(fā)明涉及禽流感疫苗和診斷抗原所用種毒的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒引起的一種家禽和野禽的傳染病。禽流感病毒根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同，可分為16個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型。高致病性禽流感是由某些H5或H7亞型禽流感病毒引起的嚴(yán)重威脅禽類的烈性傳染病。有些高致病性禽流感病毒還能引起人的感染、發(fā)病，甚至死亡。

2003年以來(lái)，H5N1亞型高致病性禽流感一直在包括中國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行，不但給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重威脅著人類的健康。除了不斷加強(qiáng)和完善流感監(jiān)測(cè)以外，疫苗仍然是防控AI的重要手段。2005年，我國(guó)開始實(shí)施針對(duì)禽流感的大規(guī)模強(qiáng)制性免疫政策，并取得了顯著成效。隨著病毒的不斷變異，疫苗也從Re-1更新到Re-4和Re-5，到目前的Re-6和Re-7。所有這些疫苗都是通過(guò)PR8(A/PR/8/34)的六個(gè)內(nèi)部基因和流行毒株的HA和NA兩個(gè)外部基因重組而成。由于PR8病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的高親和力，出于安全性考慮，所有PR8重組而來(lái)的這些疫苗只能制成滅活疫苗使用。滅活疫苗主要通過(guò)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生來(lái)保護(hù)機(jī)體免受病毒攻擊，病毒在抗體免疫壓力下變異速度會(huì)加快，使得病毒更難以預(yù)防和控制。本專利提供了一種新的禽流感疫苗和診斷抗原所用種毒的制備方法。種毒，作為疫苗生產(chǎn)的“種子”，是疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵所在。配套的診斷抗原是疫苗質(zhì)量控制和疫苗使用效果評(píng)價(jià)的必要材料，而種毒是配套的血凝試驗(yàn)或血凝抑制試驗(yàn)診斷抗原生產(chǎn)的必要材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本專利首次確定利用冷適應(yīng)株流感病毒A/Ann Arbor/6/60(AAca)的六個(gè)內(nèi)部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)和流行毒株的外部基因(HA和NA)，通過(guò)反向遺傳操作技術(shù)，禽流感疫苗和診斷抗原所需種毒。反向遺傳操作技術(shù)是指通過(guò)某個(gè)或某些人工構(gòu)建的質(zhì)粒， 轉(zhuǎn)染特定的細(xì)胞，產(chǎn)生所希望獲得的病毒的一種技術(shù)。利用冷適應(yīng)株流感病毒A/Ann Arbor/6/60(AAca)和反向遺傳技術(shù)制備禽流感疫苗和診斷抗原所需種毒具有更高的安全性，并保持效價(jià)高、匹配性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，制備的弱毒疫苗或滅活疫苗安全可靠，免疫后能夠產(chǎn)生較強(qiáng)免疫力，能夠有效預(yù)防禽流感的流行和傳播，降低本病造成的經(jīng)濟(jì)損失，降低對(duì)人類健康的威脅，具有重要的公共衛(wèi)生意義，有著廣闊的應(yīng)用前景。

本專利首次確定用反向遺傳技術(shù)制備禽流感疫苗過(guò)程中所需病毒骨架的六個(gè)內(nèi)部基因序列。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。

實(shí)施例中所述的表達(dá)A/Ann Arbor/6/60(AAca)病毒六個(gè)內(nèi)部基因的重組質(zhì)粒由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心構(gòu)建保存，293T細(xì)胞購(gòu)自QbioGene公司；脂質(zhì)體Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司。

實(shí)施例1

重組H5亞型禽流感病毒(rH5/AAca)的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

1、人工合成與克隆A/Ann Arbor/6/60(AAca)六個(gè)內(nèi)部基因

按照本發(fā)明指定的PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因序列(SEQ ID NO.1～NO.6)，采用人工合成的方法，將其插入到雙向表達(dá)載體(能同時(shí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒RNA和mRNA)中，制得pH-PB2、pH-PB1、pH-PA、pH-NP、pH-M、pH-NS質(zhì)粒。

2、H5亞型禽流感病毒表面基因的克隆

擴(kuò)增H5亞型禽流感病毒HA和NA表面基因，并對(duì)HA基因進(jìn)行分子修飾，去除與H5亞型禽流感病毒致病力有關(guān)的HA蛋白裂解位點(diǎn)處的多個(gè)堿性氨基酸，使其獲得低致病性禽流感病毒的分子特征(即將-PLRERRRKR-突變?yōu)?PQRETR-)，將其插入到雙向表達(dá)載體中， 制得pH-mHA和質(zhì)粒pH-NA。

3、重組H5亞型禽流感病毒的包裝與鑒定

表達(dá)A/Ann Arbor/6/60(AAca)病毒的6個(gè)內(nèi)部基因重組表達(dá)質(zhì)粒，與表達(dá)H5亞型禽流感病毒HA和NA基因重組質(zhì)粒，經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)尿囊腔接種于10日齡SPF雞胚，每胚0.1mL，每個(gè)樣品接種兩個(gè)胚，置35℃培養(yǎng)至72h，收集尿囊液，用國(guó)際獸疫局(OIE)推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)鑒定病毒。HI陽(yáng)性尿囊液，用雞胚傳代的第2代尿囊液提取RNA、RT-PCR擴(kuò)增HA和NS基因片段進(jìn)行測(cè)序。未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的RNA用PCR擴(kuò)增。RT-PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果表明，拯救的病毒為重組H5亞型禽流感病毒，未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的RNA用PCR無(wú)擴(kuò)增條帶。獲得重組病毒命名為rH5/AAca。

4、疫苗生產(chǎn)所需病毒的增殖方法

以無(wú)菌生理鹽水1∶10000倍稀釋rH5/AAca病毒，經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.1mL/胚，收獲培養(yǎng)72h后的存活雞胚尿囊液，測(cè)定HA效價(jià)，病毒尿囊液HA效價(jià)為2⁹，且無(wú)菌檢驗(yàn)合格。

5、疫苗生產(chǎn)所需的病毒滅活方法

將收獲的尿囊液中加入福爾馬林至終濃度0.2％，2-8℃滅活48h，每隔2h搖勻一次。滅活48h后，每個(gè)病毒樣品接種10枚雞胚，每胚0.1mL，孵化72h后測(cè)定HA效價(jià)，無(wú)血凝性的尿囊液再盲傳一代。第二代仍無(wú)血凝性判為病毒完全滅活。結(jié)果病毒尿囊液雞胚傳代2次均無(wú)產(chǎn)生血凝性，滅活完全。

6、滅活疫苗的質(zhì)量檢測(cè)

按《獸醫(yī)生物制品規(guī)程》的方法制備rH5/AAca株油乳劑滅活疫苗并進(jìn)行疫苗的無(wú)菌試驗(yàn)、物理性狀、安全性檢測(cè)。各項(xiàng)指標(biāo)符合《獸醫(yī)生物制品規(guī)程》的規(guī)定。

7、疫苗的免疫效力試驗(yàn)

將50只21日齡SPF雞隨機(jī)分為5組，每組10只。第1-4組肌肉接種質(zhì)量檢測(cè)合格的rH5/AAca禽流感疫苗，免疫劑量分別為0.05、0.1、0.3、0.5mL/只，第5組為空白對(duì)照組，隔離飼養(yǎng)。免疫后2周和3周，采血測(cè)定H5亞型禽流感病毒抗體水平。免疫后3周用同源H5亞型高致病性禽流感病毒攻毒，判定疫苗的免疫保護(hù)效果(表1)。

H5亞型禽流感病毒滅活疫苗的不同免疫劑量對(duì)免疫效力的影響試驗(yàn)結(jié)果表明，所研制的疫苗免疫劑量為0.1mL/只就可使免疫雞群在免疫后3周就可以獲得對(duì)H5病毒的保護(hù)。從抗體產(chǎn)生水平來(lái)看，0.3mL/只免疫劑量組雞的抗體水平明顯高于0.1mL組，且0.3mL組抗體水平保持穩(wěn)定上升。多重比較表明，0.3與0.5mL組抗體效價(jià)變化差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明同樣條件下選用0.3mL/只劑量接種能達(dá)到理想的防疫效果。

表1重組H5亞型禽流感病毒油乳劑滅活疫苗的免疫效力試驗(yàn)

注：*分母表示試驗(yàn)雞數(shù)，分子表示死亡的雞只數(shù)。

8、H5亞型禽流感病毒作為診斷抗原的方法

H5亞型禽流感病毒的增殖方法同步驟4。H5亞型禽流感病毒的增殖方法同步驟4、滅活方法同步驟5。用此滅活病毒進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)相匹配的疫苗免疫效果(HI抗體滴度)，如步驟7所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心

<120> 禽流感疫苗和診斷抗原所用種毒的制備方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2341

<212> DNA

<213> Influenza virus

<400> 1

agcgaaagca ggtcaattat attcaatatg gaaagaataa aagaactacg gaatctgatg 60

tcgcagtctc gcactcgcga gatactaaca aaaaccacag tggaccatat ggccataatt 120

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t 2341

<210> 2

<211> 2341

<212> DNA

<213> Influenza virus

<400> 2

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<210> 3

<211> 2233

<212> DNA

<213> Influenza virus

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aaggagaata gattcatcga gattggagtg acaaggaggg aagtccacat atactatctt 420

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accagactat tcaccataag acaagaaatg gctagcagag gcctctggga ttcctttcat 600

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<212> DNA

<213> Influenza virus

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aggatgatgg aaggtgcaaa accagaagaa gtgtccttcc aggggcgggg agtcttcgag 1440

ctctcggacg aaaaggcaac gaacccgatc gtgccctctt ttgacatgag taatgaagga 1500

tcttatttct tcggagacaa tgcagaggag tacgacaatt aaggaaaaaa tacccttgtt 1560

tctact 1566

<210> 5

<211> 1027

<212> DNA

<213> Influenza virus

<400> 5

agcgaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct 60

ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt 120

tgctgggaaa aacaccgatc ttgaggctct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180

gtcacctctg actaagggga ttttgggatt tgtattcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240

aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgccctcaat gggaatgggg atccaaataa 300

catggacaga gcagttaaac tgtatagaaa gcttaagagg gagataacat tccatggggc 360

caaagaaata gcgctcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata 420

caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggtcttaggc ctggtatgtg caacctgtga 480

acagattgct gactcccagc ataggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact 540

aataagacat gagaacagaa tggttctggc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat 600

ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ccaggcaaat 660

ggtgcaggca atgagagtta ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc taaaaaatga 720

tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacgattcaa 780

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cttctacgga aggagtacca gagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg 960

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<213> Influenza virus

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caggccctct ttgtatcaga atggaccagg caatcatgga taagaacatc atattgaaag 420

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