本發(fā)明涉及微藻中天然活性物質(zhì)的提取，具體涉及一種發(fā)狀念珠藻胞外多糖的分離純化方法，屬于生物制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

發(fā)狀念珠藻，俗稱發(fā)菜，隸屬藍(lán)藻門，念珠藻科，念珠藻屬，是一種具有獨特功能的可食用藍(lán)藻，主要分布在分布于我國西北部干旱及半干旱地區(qū)。發(fā)菜生長過程中分泌一種膠狀物質(zhì)到胞外，以保護(hù)其細(xì)胞免受干旱和紫外線傷害，其主要成分為多糖。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)菜多糖是一種非硫酸化酸性多糖，由葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖四種中性單糖和葡萄糖醛酸組成。發(fā)菜多糖能阻斷病毒對寄主細(xì)胞的吸附，阻止病毒在寄主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，對單純皰疹病毒、流感病毒、人巨細(xì)胞病毒等多種具封套的病毒均具有抗病毒作用。另外，發(fā)菜多糖還具有清除自由基活性，抑制癌細(xì)胞生長，增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力等多種功能。

自2000年起，我國政府頒布規(guī)定，嚴(yán)禁發(fā)菜的采集和貿(mào)易。而液體懸浮培養(yǎng)不但可以有效提高發(fā)狀念珠藻生長速率和胞外多糖產(chǎn)量，而且保護(hù)了野生發(fā)菜的資源和生態(tài)，因而逐漸引起人們的關(guān)注。蘇振宏等人分別從發(fā)狀念珠藻原植體和懸浮培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻懸浮培養(yǎng)體系中分離純化胞外聚合物，并初步檢測胞外聚合物體外抗肝癌活性，結(jié)果表明二者對人肝癌細(xì)胞Hep生長均有抑制作用。于海峰等 人的《發(fā)狀念珠藻胞外多糖的純化與性質(zhì)分析》文獻(xiàn)報道液體懸浮培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻，從中提取的胞外多糖與野生發(fā)狀念珠藻多糖在理化性質(zhì)、單糖組成和熱分解行為等方面具有高度相似性，展現(xiàn)出液體懸浮培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻胞外多糖可以代替野生發(fā)狀念珠藻多糖的可貴前景。

目前液態(tài)深層發(fā)酵法生產(chǎn)發(fā)菜胞外多糖的粗制方法主要采用離心去除藻細(xì)胞，再對脫藻培養(yǎng)液進(jìn)行減壓蒸餾濃縮，再經(jīng)乙醇沉淀后低溫干燥。純化方法包括Sevage法、透析膜法、超濾、離子交換柱層析、凝膠過濾層析一種或多種方法相結(jié)合，以去除蛋白質(zhì)、色素和鹽類等雜質(zhì)。專利CN1220999A公開了一種適用于常見絲狀藍(lán)藻胞外多糖的提取分離方法，采用先離心去除藻細(xì)胞、再對脫藻培養(yǎng)液進(jìn)行減壓蒸餾濃縮的方法獲得，然后依次經(jīng)脫色、除蛋白和醇沉等步驟進(jìn)行純化。但該方法在處理大體積培養(yǎng)液時耗時長、效率低、成本高，不利于胞外多糖的規(guī)?；蛛x制備。專利CN101372668A公開了一種具有抗氧化活性的發(fā)菜細(xì)胞及發(fā)菜提取物的制備方法，將發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)上清液超濾濃縮，采用截留分子量為10000的中空纖維膜超濾裝置，對經(jīng)預(yù)處理的上清液脫水濃縮并去除小分子物質(zhì)。得到的濃縮液用3～5倍體積95％乙醇沉淀，3～5℃靜置20～30h，離心得到沉淀即為發(fā)菜胞外多糖。該方法雖便捷，但制得的發(fā)菜多糖粗品純度低。天津科技大學(xué)陳雪峰等人將培養(yǎng)液濃縮，乙醇沉淀，低溫干燥制得發(fā)菜念珠藻胞外粗多糖，再采用Sevag法去除多糖中的蛋白質(zhì)，利用DEAE-52纖維素柱和SephadexG-100凝膠柱層析法從中分離得到了一種酸性多糖。缺點是提取過程只適于實驗室小型規(guī)模，不易大規(guī)模 操作。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明方法在處理大體積培養(yǎng)液時耗時短、效率高、成本低，有利于胞外多糖的規(guī)?；蛛x制備，并易于工業(yè)化放大，產(chǎn)品含量高，有較大的工業(yè)化應(yīng)用價值。

本發(fā)明的方法包括以下步驟：

1、發(fā)狀念珠藻細(xì)胞經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜過濾除菌。所用陶瓷膜的孔徑為500-1000nm，過濾溫度≤35℃，過濾壓力0.03～0.07MPa。

2、除菌后清液中加入一定量的活性炭和硅藻土處理脫色，所用活性炭為一種粉狀竹炭，用量為0.5～2％(質(zhì)量/體積)；硅藻土目數(shù)為100～200目，用量為0.1～0.5％(質(zhì)量/體積)。處理溫度為40℃，保溫時間為0.5h。

3、板框過濾除去活性炭和硅藻土，所用濾布的孔徑目數(shù)為200～500目，清液經(jīng)大孔吸附樹脂進(jìn)一步脫色除雜；所用大孔吸附樹脂為一種苯乙烯骨架的芳香族大孔吸附樹脂SD 300、LS 840、LS 850、LS 860中的任意一種。

4、收集吸附后清液經(jīng)超濾膜濃縮，在濃縮液中加入無水乙醇沉淀制得粗多糖；所用超濾膜截留分子量為10～50KD，操作壓力0.3～0.6MPa，溫度控制在35℃以下，加入乙醇的終濃度為60～80％。

5、粗多糖經(jīng)水溶解后過陰離子離子交換樹脂純化，所用陰離子交換樹脂為DEAE-陶瓷/瓊脂糖凝膠、Q-陶瓷/瓊脂糖凝膠、DEAE 52中的 任意一種。上柱流速為0.5～1.0BV，經(jīng)0.5～2.0mol/L NaCl溶液解吸后，洗脫流速為0.5～2BV，解吸液進(jìn)行真空低溫濃縮，溫度為40～～50℃，真空度為-0.08～-0.09MPa。

6、濃縮液加入無水乙醇使乙醇的終濃度為70～90％，再次進(jìn)行沉淀，經(jīng)苯酚-硫酸法檢測，制得含量大于85％的發(fā)菜胞外多糖。

綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1、針對發(fā)酵液的除菌操作，使用工業(yè)化更易于放大的陶瓷膜過濾代替離心、抽濾或壓濾操作，提高了除菌效率，也降低了操作成本。

2、在進(jìn)行大孔吸附樹脂處理前，預(yù)先進(jìn)行活性炭和硅藻土的脫色、脫蛋白處理，提高了大孔吸附樹脂的吸附量，增加了樹脂的使用效率，也在一定程度上減少了樹脂的用量，降低了生產(chǎn)成本。

3、對于多糖濃度較低的大孔吸附樹脂吸附液，使用超濾膜濃縮代替高能耗、高損失率的蒸汽濃縮，降低了多糖的損失，縮短了處理時間，進(jìn)一步降低了處理成本。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明提供的方法進(jìn)一步說明，但并不因此而限制本發(fā)明，還應(yīng)包括：在不偏離本發(fā)明范圍條件下，對公開的方案進(jìn)行本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見各種改變。

實施例1

1、發(fā)狀念珠藻細(xì)胞經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜過濾除菌。所用陶瓷膜的孔徑為500nm，過濾溫度≤35℃，過濾壓力0.07MPa。

2、除菌后清液中加入活性炭和硅藻土處理脫色，處理溫度為40℃，保溫時間為0.5h。所用活性炭為一種粉狀竹炭，用量為0.5％(質(zhì)量/體積)；硅藻土目數(shù)為100目，用量為0.1％(質(zhì)量/體積)。

3、板框過濾除去活性炭和硅藻土，所用濾布的孔徑目數(shù)為500目，清液經(jīng)一種苯乙烯骨架的芳香族大孔吸附樹脂SD 300進(jìn)一步脫色除雜，上樣流速為0.5BV，使用3-5％氫氧化鈉溶液，2BV流速再生。

4、收集吸附后清液使用截留分子量為50KD超濾膜濃縮，操作壓力0.3MPa，溫度控制在35℃以下；在濃縮液中加入無水乙醇沉淀制得粗多糖，加入乙醇的終濃度為80％。

5、粗多糖經(jīng)水溶解為濃度1g/L后過DEAE-陶瓷/瓊脂糖凝膠陰離子離子交換樹脂純化。上柱流速為0.5BV，經(jīng)0.5mol/L NaCl溶液解吸后，洗脫流速為1.0BV，解吸液進(jìn)行真空低溫濃縮，溫度為40～50℃，真空度為-0.08～-0.09MPa。

6、在濃縮液中加入無水乙醇使乙醇的終濃度為80％，再次進(jìn)行沉淀，經(jīng)苯酚-硫酸法檢測，制得含量89.5％的發(fā)菜胞外多糖。

實施例2

1、發(fā)狀念珠藻細(xì)胞經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜過濾除菌。所用陶瓷膜的孔徑為500nm，過濾溫度≤35℃，過濾壓力0.06MPa。

2、除菌后清液中加入活性炭和硅藻土處理脫色，處理溫度為40℃，保溫時間為0.5h。所用活性炭為一種粉狀竹炭，用量為1.0％(質(zhì)量/體積)；硅藻土目數(shù)為200目，用量為0.3％(質(zhì)量/體積)。

3、板框過濾除去活性炭和硅藻土，所用濾布的孔徑目數(shù)為500目，清液經(jīng)一種苯乙烯骨架的芳香族大孔吸附樹脂LS 840進(jìn)一步脫色除雜；上樣流速為0.75BV，使用3-5％氫氧化鈉溶液，2BV流速再生。

4、收集吸附后清液使用截留分子量為10KD超濾膜濃縮，在濃縮液中加入無水乙醇沉淀制得粗多糖；超濾操作壓力0.4MPa，溫度控制在35℃以下，加入乙醇的終濃度為80％。

5、粗多糖經(jīng)水溶解為濃度1.5g/L后過Q-陶瓷/瓊脂糖凝膠陰離子離子交換樹脂純化。上柱流速為0.5BV，經(jīng)1.0mol/L NaCl溶液解吸后，洗脫流速為1.0BV，解吸液進(jìn)行真空低溫濃縮，溫度為40～50℃，真空度為-0.08～-0.09MPa。

6、濃縮液加入無水乙醇使乙醇的終濃度為90％，再次進(jìn)行沉淀，經(jīng)苯酚-硫酸法檢測，制得含量90.2％的發(fā)菜胞外多糖。