本發(fā)明涉及植物中活性成分的制備方法，具體涉及一種提取黑芥子苷的方法。

背景技術(shù)：
已有的研究表明，富含十字花科蔬菜的飲食，如西蘭花、花椰菜、甘藍(lán)、芥菜等能減小許多癌癥的發(fā)病率。目前一致認(rèn)為，十字花科植物的重要抗癌活性成分前體是硫代葡萄糖苷(Glucosinolates)。在天然植物中已發(fā)現(xiàn)120多種不同的硫代葡萄糖苷，它們存在于11個(gè)不同種屬的雙子葉被子植物中，最重要的是十字花科，所有的十字花科植物都能夠合成硫代葡萄糖苷。硫代葡萄糖苷存在于這些植物的根、莖、葉和種子中，但主要存在于種子中。黑芥子苷也稱黑芥子甙(Sinigrin)是其中脂肪族硫代葡萄糖苷中研究得較多的一種，黑芥子苷的R基團(tuán)是烯丙基，因此黑芥子苷也叫烯丙基硫代葡萄糖苷。本申請(qǐng)人之前申請(qǐng)的公開號(hào)為CN102048791A的發(fā)明專利公開了一種黑芥子甙提取物的制備方法，它包括以下步驟：1)以十字花科蕓苔屬植物芥菜、甘藍(lán)或西蘭花為原料用乙酸提取，提取液離心，得上清液；2)向上清液中加入乙醇，調(diào)節(jié)其中乙醇濃度為80～85％，放置1～1.5小時(shí)，離心，收集二次離心液；3)二次離心液濃縮至無(wú)醇味，所得濃縮離心液過(guò)0.5μm的陶瓷膜，透過(guò)液濃縮至原料重量的2～3倍，得濃縮透過(guò)液；4)濃縮透過(guò)液進(jìn)大孔樹脂柱，收集流出液，用2～3倍樹脂重量的水洗脫，收集洗脫液，合并流出液和洗脫液，濃縮，冷凍干燥，即得黑芥子甙提取物。由該方法制得的產(chǎn)品中黑芥子甙含量為20～40％，黑芥子甙的含量較低，而且低含量的產(chǎn)品放置時(shí)間較長(zhǎng)容易自身發(fā)生變化使含量降低，而高含量的產(chǎn)品相對(duì)來(lái)說(shuō)比較穩(wěn)定，放置較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)含量基本沒有變化?，F(xiàn)有技術(shù)中，由于黑芥子苷本身的性質(zhì)以及在提取純化過(guò)程中黑芥子苷容易被破壞(黑芥子苷是硫苷，在酸堿中不穩(wěn)定，很容易分解或破壞，同時(shí)在有其他金屬離子(如鐵，鋅，銅等)存在情況，也容易破壞，溫度對(duì)其的分解也有很大程度的影響)導(dǎo)致很難分離純化得到高含量的黑芥子苷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種提取黑芥子苷的方法。采用該方法可以獲得黑芥子苷含量≥70％的黑芥子苷提取物。本發(fā)明所述的提取黑芥子苷的方法，包括以下步驟：1)以十字花科蕓苔屬植物芥菜、甘藍(lán)或西蘭花為原料，用乙醇提取，獲得提取液，提取液回收乙醇后離心，收集上清液；2)上清液用混合溶劑進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相，然后減壓回收溶劑，得到濃縮液；所述的混合溶劑為選自乙酸乙酯、乙醚和石油醚中的一種與甲醇或丙酮的組合，其中乙酸乙酯、乙醚或石油醚中與甲醇或丙酮的體積比為5～6：1；3)取濃縮液上陰離子交換樹脂柱層析，先水洗樹脂柱至流出液澄清，然后用堿液洗脫，收集堿液洗脫液，濃縮，干燥，得到黑芥子苷含量≥70％的黑芥子苷提取物；其中，所述的陰離子交換樹脂的型號(hào)為700A或700B，所述的堿液為0.5～3w/w％的氫氧化鈉水溶液或0.5～3w/w％的氫氧化鈣水溶液。為了進(jìn)一步提高所得產(chǎn)品的純度，本發(fā)明方法還可包括一純化步驟，所述的純化步驟是取黑芥子苷提取物與選自甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯中的一種或兩種以上的組合混合均勻，調(diào)節(jié)體系的pH＝4～5，于低溫條件下進(jìn)行放置結(jié)晶，分離晶體，干燥，得到黑芥子苷含量≥95％的黑芥子苷產(chǎn)品。上述純化步驟中，優(yōu)選是將體系置于0～4℃條件下進(jìn)行放置結(jié)晶。該純化步驟中，用于與黑芥子苷提取物混合的溶劑的用量通常為黑芥子苷重量的3～6倍。通常用鹽酸、硫酸或冰醋酸來(lái)調(diào)節(jié)體系的pH值。上述技術(shù)方案的步驟1)中，提取用乙醇的濃度為50～80v/v％，優(yōu)選為50～60v/v％；提取的方式與現(xiàn)有常用的提取方法相同，優(yōu)選采用回流提取，提取的次數(shù)通常為1～3次，每次提取時(shí)的料液比通常為1g：5～10g(當(dāng)原料為干燥原料時(shí))，每次提取的時(shí)間通常為1～3h；優(yōu)選選用芥菜種子、甘藍(lán)種子或西蘭花花蕾或嫩芽。上述技術(shù)方案的步驟2)中，每次萃取時(shí)，萃取用的混合溶劑的用量與現(xiàn)有常規(guī)萃取方式時(shí)相同，優(yōu)選的，混合溶劑與上清液體積比為6～8：1。上述技術(shù)方案的步驟3)中，堿液洗脫時(shí)，采用薄層層析跟蹤檢測(cè)。申請(qǐng)人在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，可以按下述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行洗脫液的收集：當(dāng)流出液有苦味時(shí)收集，流出液無(wú)苦味時(shí)停止收集。該步驟中，洗脫用的堿液的濃度優(yōu)選為1～2w/w％。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用上述特殊配比的的混合溶劑對(duì)回收乙醇并離心處理的上清液進(jìn)行萃取，可以有效去除上清液中殘余的雜質(zhì)(如多糖、蛋白質(zhì)、其它容易與有效成分發(fā)生變化的組分)，再結(jié)合特定的700A或700B陰離子交換樹脂對(duì)除雜后的濃縮液層析，可以獲得黑芥子苷含量≥70％(HPLC法)的黑芥子苷提取物；進(jìn)一步地，在純化操作后可以獲得純度≥95％(HPLC法)的黑芥子苷產(chǎn)品，填補(bǔ)了目前市場(chǎng)上尚未有工業(yè)化生產(chǎn)得到如此高純度產(chǎn)品的空白；而且整個(gè)方法操作簡(jiǎn)單易控，生產(chǎn)成本低。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制得產(chǎn)品的高效液相圖譜；圖2為本發(fā)明實(shí)施例5制得產(chǎn)品的高效液相圖譜。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述,以更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容,但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。實(shí)施例11)取干燥的芥菜種子100kg(黑芥子苷含量為3.3％，HPLC法，下同)，粉碎，用相當(dāng)于原料重量8倍、50v/v％的乙醇回流提取2h，過(guò)濾，殘?jiān)儆孟喈?dāng)于原料重量10倍、50v/v％的乙醇回流提取1.5h，過(guò)濾，合并提取液，所得提取液減壓回收乙醇后離心，收集上清液；2)上清液用混合溶劑(乙酸乙酯的甲醇的體積比為5:1)萃取2次，合并收集有機(jī)相(上層溶液)，然后減壓回收溶劑，得到濃縮液(6波美)；3)取濃縮液上700B型陰離子交換樹脂柱層析，先水洗樹脂柱至流出液澄清且無(wú)色，然后用1.5w/w％的氫氧化鈉水溶液洗脫，薄層層析跟蹤檢測(cè)，收集含目標(biāo)成分的堿液洗脫液，減壓濃縮，干燥，得到黑芥子苷提取物4.00kg。取本實(shí)施例所得的黑芥子苷提取物進(jìn)行檢測(cè)，純度為74.50％(HPLC法，下同，圖譜如圖1所示)，原料黑芥子苷回收率為90.30％。對(duì)比例1重復(fù)實(shí)施例1，不同的是，在步驟3)中，用717#陰離子交換樹脂代替700B型陰離子交換樹脂。由本對(duì)比例制得黑芥子苷提取物4.10kg，對(duì)所得的黑芥子苷提取物進(jìn)行檢測(cè)，純度為41.50％，原料黑芥子苷回收率為51.56％。對(duì)比例2重復(fù)實(shí)施例1，不同的是，在步驟3)中，用731型陰離子交換樹脂代替700B型陰離子交換樹脂。由本對(duì)比例制得黑芥子苷提取物3.95kg，對(duì)所得的黑芥子苷提取物進(jìn)行檢測(cè)，純度為40.5％，原料黑芥子苷回收率為48.48％。對(duì)比例3重復(fù)實(shí)施例1，不同的是，在步驟3)中，用D941型陰離子交換樹脂代替700B型陰離子交換樹脂。由本對(duì)比例制得黑芥子苷提取物3.98kg，對(duì)所得的黑芥子苷提取物進(jìn)行檢測(cè)，純度為39.5％，原料黑芥子苷回收率為47.64％。對(duì)比例4重復(fù)實(shí)施例1，不同的是，在步驟2)中，用單獨(dú)的乙酸乙酯替代原來(lái)的混合溶劑(乙酸乙酯的甲醇的體積比為5:1)。由本對(duì)比例制得黑芥子苷提取物4.20kg，對(duì)所得的黑芥子苷提取物進(jìn)行檢測(cè)，純度為58.55％，原料黑芥子苷回收率為74.52％。對(duì)比例5重復(fù)實(shí)施例1，不同的是，在步驟2)中，用單獨(dú)的丙酮替代原來(lái)的混合溶劑(乙酸乙酯的甲醇的體積比為5:1)。由本對(duì)比例制得黑芥子苷提取物4.15kg，對(duì)所得的黑芥子苷提取物進(jìn)行檢測(cè)，純度為55.85％，原料黑芥子苷回收率為70.24％。對(duì)比例6重復(fù)實(shí)施例1，不同的是，在步驟2)中，用單獨(dú)的乙醚替代原來(lái)的混合溶劑(乙酸乙酯的甲醇的體積比為5:1)。由本對(duì)比例制得黑芥子苷提取物4.35kg，對(duì)所得的黑芥子苷提取物進(jìn)行檢測(cè)，純度為56.60％，原料黑芥子苷回收率為74.61％。實(shí)施例2重復(fù)實(shí)施例1，不同的是，在步驟2)中，用體積比為1：3的石油醚與丙酮的組合替代原來(lái)的混合溶劑(乙酸乙酯的甲醇的體積比為5:1)。由本實(shí)施例制得黑芥子苷提取物4.10kg，對(duì)所得的黑芥子苷提取物進(jìn)行檢測(cè)，純度為72.50％，原料黑芥子苷回收率為90.08％。實(shí)施例3重復(fù)實(shí)施例1，不同的是，在步驟3)中，用700A型陰離子交換樹脂代替700B型陰離子交換樹脂。由本實(shí)施例制得黑芥子苷提取物4.05kg，對(duì)所得的黑芥子苷提取物進(jìn)行檢測(cè)，純度為73.80％，原料黑芥子苷回收率為90.57％。實(shí)施例4重復(fù)實(shí)施例1，不同的是，在步驟3)中，用3w/w％的氫氧化鈣水溶液代替1.5w/w％的氫氧化鈉水溶液。由本實(shí)施例制得黑芥子苷提取物3.94kg，對(duì)所得的黑芥子苷提取物進(jìn)行檢測(cè)，純度為74.20％，原料黑芥子苷回收率為88.59％。實(shí)施例51)取干燥的芥菜種子150kg(黑芥子苷含量為3.5％)，粉碎，用相當(dāng)于原料重量8倍、55v/v％的乙醇回流提取2h，過(guò)濾，殘?jiān)儆孟喈?dāng)于原料重量7倍、50v/v％的乙醇回流提取1h，過(guò)濾，殘?jiān)^續(xù)用相當(dāng)于原料重量5倍、80v/v％的乙醇回流提取1h，過(guò)濾，合并提取液，所得提取液減壓回收乙醇后離心，收集上清液；2)上清液用混合溶劑(乙酸乙酯的丙酮的體積比為5:1)萃取2次，合并收集有機(jī)相(上層溶液)，然后減壓回收溶劑，得到濃縮液(8波美)；3)取濃縮液上700A型陰離子交換樹脂柱層析，先水洗樹脂柱至流出液澄清且無(wú)色，然后用1.5w/w％的氫氧化鈣水溶液洗脫，薄層層析跟蹤檢測(cè)，收集含目標(biāo)成分的堿液洗脫液，減壓濃縮至浸膏(20波美)；4)取浸膏與相當(dāng)于其4倍重量的丙酮混合均勻(也可以干燥后再與相當(dāng)于干燥物4倍重量的丙酮混合均勻)，用鹽酸調(diào)節(jié)體系的pH＝4.5，于4℃條件下放置12h結(jié)晶，分離晶體，干燥，得到黑芥子苷產(chǎn)品4.3kg。取本實(shí)施例所得的黑芥子苷提取物進(jìn)行檢測(cè)，純度為96.3％(圖譜如圖2所示)，原料黑芥子苷回收率為78.8％。實(shí)施例61)取干燥的芥菜種子200kg(黑芥子苷含量為3.1％)，粉碎，用相當(dāng)于原料重量10倍、60v/v％的乙醇回流提取3h，過(guò)濾，所得提取液減壓回收乙醇后離心，收集上清液；2)上清液用混合溶劑(石油醚與丙酮的體積比為5:1)萃取2次，合并收集有機(jī)相(上層溶液)，然后減壓回收溶劑，得到濃縮液(6波美)；3)取濃縮液上700B型陰離子交換樹脂柱層析，先水洗樹脂柱至流出液澄清且無(wú)色，然后用0.5w/w％的氫氧化鈉水溶液洗脫，薄層層析跟蹤檢測(cè)，收集含目標(biāo)成分的堿液洗脫液，減壓濃縮至浸膏(20波美)；4)取浸膏與相當(dāng)于其4倍重量的乙酸乙酯混合均勻(也可以干燥后再與相當(dāng)于干燥物4倍重量的乙酸乙酯混合均勻)，用冰醋酸調(diào)節(jié)體系的pH＝4，于4℃條件下放置12h結(jié)晶，分離晶體，干燥，得到黑芥子苷產(chǎn)品4.97kg。取本實(shí)施例所得的黑芥子苷提取物進(jìn)行檢測(cè)，純度為95.9％，原料黑芥子苷回收率為76.9％。