本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種從北葶藶子中提取硫苷化合物的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

葶藶子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為草部下品，為常用中藥材。2015版《中國藥典》收錄的“葶藶子”有南北之分，其中十字花科植物獨行菜Lepidium apetalum Willd.的干燥成熟種子習(xí)稱“北葶藶子”，而播娘蒿Descurainia sophia(L.)Webbex Prantl.的干燥成熟種子習(xí)稱“南葶藶子”。該藥味辛、苦，性大寒，歸肺與膀胱經(jīng)，具有宣泄平喘、行水消腫的功效。南葶藶子研究較多，其化學(xué)成分主要有黃酮類、硫苷類、異硫氰酸類等，而北葶藶子研究較少。據(jù)記載，北葶藶子具有強心作用，其化學(xué)成分主要是黃酮類。而從葶藶子的水提物中分離硫苷化合物以及研究其應(yīng)用至今還未見有這方面的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述情況，為解決現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種從北葶藶子中提取硫苷化合物的方法，可有效挖掘北葶藶子的新作用。

本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，從北葶藶子中提取硫苷化合物的方法：取炮制后的北葶藶子，加北葶藶子10倍重量的水提取三次，每次1.5h，提取液減壓濃縮至浸膏狀，濃縮的浸膏用北葶藶子2-3倍重量的體積濃度為80％的乙醇醇沉，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味，上Dianion HP-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹脂)，先用水洗脫，再用20％乙醇洗脫，得到20％乙醇洗脫部位A，20％乙醇洗脫部位A用水離散溶解，離心過濾，濃縮后通過Toyopearl HW-40柱色譜，依次用水和10％含水甲醇洗脫，得到水洗脫組分B1和10％甲醇洗脫組分B2，組分B2經(jīng)ODS-18反相柱色譜，分別用水和10％含水甲醇洗脫洗脫，得到組分C1和C2，組分C2用甲醇溶解，靜置24h，析出無色結(jié)晶，將上層溶液吸出，干燥，再次用甲醇溶解，靜置24h，析出無色結(jié)晶，如此反復(fù)操作4次，合并得到的無色結(jié)晶，將無色結(jié)晶用甲醇溶解，用半制備HPLC分離，色譜柱為YMC-Pack ODS-A色譜柱(規(guī)格型號：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm)，流動相為甲醇：水(v/v)＝32:68，得到硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin。

硫苷化合物(cis-desulfoglucotropaeolin)，分子式為C₁₄H₁₉NO₆S[M+H]+m/z 330.1013，其結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明從北葶藶子水提物中分離得到硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin，含量較高，且硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin對雙氧水(H₂O₂)損傷大鼠心肌細(xì)胞H9c2具有一定的保護(hù)作用，能極顯著提高細(xì)胞活力，為制備心肌保護(hù)類藥物提供了新的途徑。

附圖說明

圖1為本發(fā)明cis-desulfoglucotropaeolin的¹H-NMR譜(DMSO-d₆)。

圖2為本發(fā)明cis-desulfoglucotropaeolin的¹³C-NMR譜(DMSO-d₆)。

圖3為本發(fā)明cis-desulfoglucotropaeolin的¹H-¹H COSY譜。

圖4為本發(fā)明cis-desulfoglucotropaeolin的HSQC譜。

圖5為cis-desulfoglucotropaeolin的HMBC譜。

圖6為本發(fā)明cis-desulfoglucotropaeolin的NOESY譜。

圖7為本發(fā)明cis-desulfoglucotropaeolin的MS譜。

圖8為本發(fā)明cis-desulfoglucotropaeolin的UV譜。

圖9為本發(fā)明cis-desulfoglucotropaeolin的IR譜。

圖10為本發(fā)明硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin對H₂O₂誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細(xì)胞存活率的影響(n＝6)。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實施例1

取炮制后的北葶藶子8kg，加北葶藶子10倍重量的水提取三次，每次1.5h，提取液減壓濃縮至2000ml浸膏狀，濃縮的浸膏用北葶藶子4倍體積的體積濃度為80％的乙醇醇沉，醇沉5次，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味(約1500ml)，上Dianion HP-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹脂)，先用水洗脫，除去大部分多糖，再用20％乙醇洗脫，得到20％乙醇洗脫部位A(71.2g)，20％乙醇洗脫部位A用水離散溶解，離心過濾，濃縮后(約30ml)通過Toyopearl HW-40柱色譜，依次用水和10％含水甲醇洗脫，得到水洗脫組分B1(40.2g)和10％甲醇洗脫組分B2(12.8g)，組分B2經(jīng)ODS-18反相柱色譜，分別用水和10％含水甲醇洗脫洗脫，得到組分C1(5.0g)和C2(5.2g)，組分C2用甲醇溶解，靜置24h，析出無色結(jié)晶，將上層溶液吸出，干燥，再次用甲醇溶解，靜置24h，析出無色結(jié)晶，如此反復(fù)操作4次，合并得到的無色結(jié)晶，將無色結(jié)晶用甲醇溶解，用半制備HPLC分離，YMC-Pack ODS-A色譜柱(規(guī)格型號：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm)，流動相為甲醇：水(v/v)＝32:68，得到硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin(質(zhì)量m＝2.0g,保留時間t_R＝26.2min)。

實施例2

取炮制后的北葶藶子5kg，加北葶藶子10倍重量的水提取三次，每次1.5h，提取液減壓濃縮至1500ml浸膏狀，濃縮的浸膏用北葶藶子4倍體積的體積濃度為80％的乙醇醇沉，醇沉5次，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味(約1200ml)，上Dianion HP-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹脂)，先用水洗脫，再用20％乙醇洗脫，得到20％乙醇洗脫部位A(45.3g)，20％乙醇洗脫部位A用水離散溶解，離心過濾，濃縮后(約25ml)通過Toyopearl HW-40柱色譜，依次用水和10％含水甲醇洗脫，得到水洗脫組分B1(25.6g)和10％甲醇洗脫組分B2(9.1g)，組分B2經(jīng)ODS-18反相柱色譜，分別用水和10％含水甲醇洗脫洗脫，得到組分C1(3.3g)和C2(3.4g)，組分C2用甲醇溶解，靜置24h，析出無色結(jié)晶，將上層溶液吸出，干燥，再次用甲醇溶解，靜置24h，析出無色結(jié)晶，如此反復(fù)操作4次，合并得到的無色結(jié)晶，將無色結(jié)晶用甲醇溶解，用半制備HPLC分離，色譜柱為YMC-Pack ODS-A色譜柱(規(guī)格型號：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm)，流動相為甲醇：水(v/v)＝32:68，得到硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin(1.3g)。

實施例3

取炮制后的北葶藶子10kg，加北葶藶子10倍重量的水提取三次，每次1.5h，提取液減壓濃縮至2500ml浸膏狀，濃縮的浸膏用北葶藶子4倍體積的體積濃度為80％的乙醇醇沉，醇沉5次，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味(約2000ml)，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味，上Dianion HP-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹脂)，先用水洗脫，再用20％乙醇洗脫，得到20％乙醇洗脫部位A(88.9g)，20％乙醇洗脫部位A用水離散溶解，離心過濾，濃縮(40ml)后通過Toyopearl HW-40柱色譜，依次用水和10％含水甲醇洗脫，得到水洗脫組分B1(51.0g)和10％甲醇洗脫組分B2(16.3g)，組分B2經(jīng)ODS-18反相柱色譜，分別用水和10％含水甲醇洗脫洗脫，得到組分C1(6.3g)和C2(6.5g)，組分C2用甲醇溶解，靜置24h，析出無色結(jié)晶，將上層溶液吸出，干燥，再次用甲醇溶解，靜置24h，析出無色結(jié)晶，如此反復(fù)操作4次，合并得到的無色結(jié)晶，將無色結(jié)晶用甲醇溶解，用半制備HPLC分離，色譜柱為YMC-Pack ODS-A色譜柱(規(guī)格型號：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm)，流動相為甲醇：水(v/v)＝32:68，得到硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin(2.5g)。

為了明確北葶藶子的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本發(fā)明采用水煎煮法對其進(jìn)行提取，而由于其遇水發(fā)黏，使得水煎液提取率低不說，提取出來的成分絕大部分是粘液質(zhì)，因此本發(fā)明首先采用清炒法，于240℃，炒制5.5min對其進(jìn)行簡單炮制，以使北葶藶子中的成分更易溶出，從北葶藶子的水提物中從中分離并鑒定了兩個新的酚苷化合物，即：北葶新苷A和北葶新苷B，實驗結(jié)果顯示這兩個新酚苷化合物均能顯著提高雙氧水(H₂O₂)誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2損傷的細(xì)胞存活率，具有心肌細(xì)胞保護(hù)作用。并經(jīng)試驗進(jìn)行了充分證明，相關(guān)試驗資料如下：

1儀器與試藥

核磁共振用BrukerAVANCEⅢ500核磁共振儀(TMS內(nèi)標(biāo))(Bruker)，紅外光譜用Nicolet is 10Microscope Spectrometer(Thermo Scientific,USA)，高分辨質(zhì)譜用Bruker maxis HD mass spectrometer，紫外光譜用Shimadzu UV-2401PC apparatus，高效液相色譜用Waters Alliance系列2695高效液相系統(tǒng)，配備2998型二極管陣列檢測器，Empower3色譜數(shù)據(jù)工作站，LC50型高壓制備液相色譜儀，UV200型紫外檢測器[賽譜銳思(北京)科技有限公司]，YMC-Pack ODS-A色譜柱(250×10mm.D.S-5mm,12mm)(YMC有限公司)，其余有N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，A-1000S型水流抽氣機(上海愛朗儀器有限公司)，N-1111型冷凍水循環(huán)裝置(上海愛朗儀器有限公司)，F(xiàn)DU-2110型冷凍干燥機(上海愛朗儀器有限公司)，DFZ-60508型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，AB204-N萬分之一精密分析天平(METTLER TOLEDO)，iMARK型酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD)，二氧化碳培養(yǎng)箱(上海STIK)，超凈工作臺(蘇凈集團(tuán))，Arium 611VF超級組合型超純水器(SARTORIUS)，倒置顯微鏡(Nikon)，PB-10酸度計(德國賽多利斯集團(tuán))。

柱層析填料Diaion HP-20、MCI Gel CHP-20(日本三菱化學(xué)公司)，Toyopearl HW-40(日本TOSOH公司)，Sephadex LH-20(Parmacia Biotech公司)，柱層析所用硅膠H(160-200目)為青島海洋化工廠生產(chǎn)，培養(yǎng)皿、96孔培養(yǎng)板、細(xì)胞凍存管(Corning公司)，所用色譜純試劑位天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn)，所用分析純試劑為北京化工廠和天津第三化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

DMEM高糖培養(yǎng)液(Gibco)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰蛋白酶(Gibco)，DMSO(Solarbio)；MTT(Biosharp)，H₂O₂溶液(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)，水為超純水，PBS緩沖液等為自配。

北葶藶子于2014年采自河南南陽，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授及董誠明教授鑒定為十字花科植物獨行菜Lepidium apetalum Willd.的干燥成熟種子。

2結(jié)構(gòu)鑒定

cis-desulfoglucotropaeolin，無色結(jié)晶性粉末(MeOH)，分子式為C₁₄H₁₉NO₆S[M+H]⁺m/z330.1013(計算式.330.1013)，UV(MeOH)λ_max:209nm和230nm。其結(jié)構(gòu)式、主要HMBC相關(guān)及核磁數(shù)據(jù)如下：

主要HMBC相關(guān)

HMBC相關(guān)

NOE相關(guān)

表1 cis-desulfoglucotropaeolin的¹H NMR(500MHz)和¹³C NMR(125MHz)數(shù)據(jù)(in DMSO-d₆)

3 cis-desulfoglucotropaeolin對雙氧水(H₂O₂)損傷大鼠心肌細(xì)胞H9c2的保護(hù)作用

3.1細(xì)胞

H9c2細(xì)胞株購自深圳市百恩維生物科技有限公司。

3.2細(xì)胞培養(yǎng)

將H9c2培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(含青霉素和鏈霉素100kU·L^-1)，置于37℃、5％CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，均取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

3.3 H₂O₂誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細(xì)胞損傷模型的建立

傳代培養(yǎng)時，將對數(shù)生長期的細(xì)胞以5×10⁴的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，換用含藥的高糖DMEM培養(yǎng)液。H₂O₂給予含200μM H₂O₂的含血清高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)6h。

3.4實驗分組

每組設(shè)6個平行孔，設(shè)正常組(NC)、H₂O₂組(M)、cis-desulfoglucotropaeolin給藥組。H₂O₂組：給予含200μM H₂O₂的含血清高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)6h；cis-desulfoglucotropaeolin給藥組：分別給予含200μM H₂O₂和1、2、4、8、16、32、64μMcis-desulfoglucotropaeolin的含血清高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)6h。

3.5 MTT法檢測cis-desulfoglucotropaeolin對H9c2損傷細(xì)胞存活率的影響

細(xì)胞接種于96孔板，貼壁后加藥干預(yù)培養(yǎng)后，吸除上清液，各孔分別加入含1％MTT(5g/L)的高糖DMEM培養(yǎng)液200μl，37℃孵育4h，吸除上清液，加入150μL的DMSO，震蕩10min使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀檢測490nm波長處OD值，用公式計算細(xì)胞存活率＝(OD實驗組/OD對照組)×100％。實驗重復(fù)3次，取平均值。

3.6統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，各組間比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，P<0.05表示有顯著性意義，P<0.01表示有極顯著性意義。

3.7結(jié)果

北葶藶子中化合物cis-desulfoglucotropaeolin對H₂O₂誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細(xì)胞存活率的影響(n＝6)

注：與正常組比較:*P<0.05；**P<0.01與H₂O₂組比較:^#P<0.05；^##P<0.01

研究結(jié)果表明：與空白組相比，模型組細(xì)胞活力顯著降低；與模型組相比，北葶藶子單體化合物cis-desulfoglucotropaeolin給藥劑量在32、64μM時，極顯著提高細(xì)胞活力(P<0.01)，在2、4μM時，顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.05)，在8、16μM時，對細(xì)胞活力無明顯改變，表明北葶藶子單體化合物cis-desulfoglucotropaeolin對心肌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

綜上，本發(fā)明從北葶藶子的水提物中分離并鑒定的硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin，含量較高，硫苷化合物cis-desulfoglucotropaeolin對雙氧水(H₂O₂)損傷大鼠心肌細(xì)胞H9c2具有一定的保護(hù)作用，能極顯著提高細(xì)胞活力，可有效用于制備心肌保護(hù)類藥物，開發(fā)了北葶藶子的新用途，具有實際的臨床意義和良好的應(yīng)用推廣價值。