專(zhuān)利名稱(chēng)：固定化黑芥子酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及--種固定化酶及其制備，具體為一種從植物中分離 并直接固定化的黑芥子酶，及其制備方法。
背景技術(shù)：
黑芥子酶主要存在于十字花科植物中。在一定的條件下，黑芥子酶可以將硫代葡萄糖苷 分解，生成葡萄糖、硫酸鹽、異硫代氰酸鹽、乙腈、硫氰酸鹽等物質(zhì)。其中許多異硫代氰酸 鹽具有生物活性，具有比較好的抗癌效果。
目甜，在國(guó)際上有多種從不同十字花科植物中提取分離黑芥子酶的報(bào)道，但游離的黑芥 子酶存活時(shí)間很短，在酶解催化反應(yīng)中也很難重復(fù)使用，因?yàn)樵撁负?對(duì)二硫鍵，酶在提 純過(guò)程中容易受重金屬離子危害，并對(duì)氧化還原很敏感。而其粗酶往往混有蛋白酶等，也容 易造成其水解失活。因此，該酶難以作為酶制劑應(yīng)用于工業(yè)中。如果將游離的黑芥子酶固定 化，可以提高該酶的利用率，使之能適合于現(xiàn)代工業(yè)應(yīng)用的要求，這對(duì)于黑芥子酶的工業(yè)化 應(yīng)用顯得十分有意義。
將游離酶的催化活動(dòng)完全或基本上限制在一定空間內(nèi)的過(guò)程稱(chēng)為固定化。它解決了酶的 工程化應(yīng)用中存在的問(wèn)題，極大地提高了酶的應(yīng)用價(jià)值，促進(jìn)了酶工程地飛躍發(fā)展。R本在 上世紀(jì)六十年代就實(shí)現(xiàn)了固定化酶的工業(yè)化應(yīng)用，在世界上開(kāi)創(chuàng)了固定化酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn) 的先例。我國(guó)固定化酶的研究起歩較晚，丌始于1970年。目前能夠采用固定化技術(shù)的酶種類(lèi) 還比較少。采用固定化酶技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)的企業(yè)更少。其原因一方面是適合固定化的酶，其 底物和產(chǎn)物分子量應(yīng)該都比較小。另一方面是酶固定化后容易失活。
黑芥子酶的固定化研究目前還未見(jiàn)報(bào)道。黑芥子酶作用對(duì)象硫代葡萄糖苷和酶解產(chǎn)物分 子量都比較小，屬于可以使用固定化技術(shù)的酶。黑芥子酶的分子量和一些蛋白酶的分子量差 異比較小，其分離比較困難。如果將黑芥子酶粗酶進(jìn)行固定化就可以減少蛋白酶對(duì)其的攻擊， 延長(zhǎng)其使用時(shí)間。黑芥子酶又可以重復(fù)使用。但是黑芥子酶含有大量二硫鍵，是一種容易失 活的酶。其固定化難度比較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，獲得了比較好的黑芥子酶固定化方法。本發(fā)明的目的是提供一種 固定化黑芥子酶，并提供適合于黑芥子酶的固定化方法。
本發(fā)明提供的固定化黑芥子酶，是從十字花科蔬菜種子或植株中分離獲取黑芥子酶，制
成2mm 3mm的海藻酸鈣凝膠珠，硬化后用戊二醛交聯(lián)而成。
本發(fā)明的固定化黑芥子酶其制備方法包括以下步驟
(1) 按每克十字花科蔬菜種子粉末加3毫升pH為6.0的磷酸緩沖液計(jì)加入磷酸緩沖液，攪 拌過(guò)濾除雜后，再4"C低溫離心去雜質(zhì)，獲黑芥子酶液；所述磷酸緩沖液中含5%體積份的 甘油，lmMEDTA， 3mM DTT;
(2) 按體積/重量比計(jì)在上述酶液中加80%硫酸銨，4℃低溫靜置2小時(shí)后，在4'C條件下離 心，獲得酶沉淀，4'C下蒸餾水透析2小時(shí)，獲得液體酶；
(3) 在液體酶中加入海藻酸鈉，添加量為每100毫升酶液加入3.5 4.5毫克海藻酸鈉， 35℃ 45℃水浴溶解海藻酸鈉，將混合液呈小滴狀滴加到2%~3 %氯化鈣水溶液中，形成 直徑2mm 3mm的海藻酸鈣凝膠珠；
(4) 將海藻酸鈣凝膠珠在3℃ 5℃靜置硬化2小時(shí)，用蒸餾水洗滌后，取顆粒加入到 0.15%~0.3%的戊二醛溶液交聯(lián)4小時(shí)，再用蒸餾水洗滌，得到固定化黑芥子酶顆粒，在 3'C 5i:密封保存。
歩驟(1)所述十字花科蔬菜種子選用西蘭花種子可以提高固定化黑芥子酶的活性。
上述步驟概括如下
將西蘭花種子或其他十字花科蔬菜種子碎成粉末，加pH為6.0的磷酸緩沖液，其中含 5%甘油，lmM EDTA， 3mM DTT，將其攪拌后紗布過(guò)濾，將濾液在4℃下，12000xg離心20min， 收集上清夜，按體積重量比加80%硫酸銨，在4℃下靜置2h后，4℃下12000xg離心20min， 收集沉淀，4'C下蒸餾水透析2h，截留分子量為14000D，取透析袋內(nèi)酶液，將海藻酸鈉加入 酶液中混合，海藻酸鈉添加量為3.5 4.5%(w/v)， 35℃ 45℃水浴溶解海藻酸鈉后，將混合液 呈小滴狀加入到氯化鈣溶液中，氯化鈣含量為2% 3 %(w/v)，形成2mm 3 mm的海藻酸鈣 凝膠珠，于3℃ 5℃硬化2小時(shí)后蒸餾水洗滌，再加入到戊二酲溶液中，所述戊二醛溶液濃 度為0.15y。 0.3％w/v)，交聯(lián)4小時(shí)后蒸餾水洗滌，獲得的固定化黑芥子酶于3℃ 5℃密封保 存。
本發(fā)明方案中二硫蘇糖醇(DTT)可以保護(hù)游離巰基免被氧化。乙二胺四乙酸(EDTA) 是金屬螯合劑，能避免酶受重金屬離子危害。甘油對(duì)不少酶具有保護(hù)作用，防止蛋白質(zhì)脫水。
當(dāng)海藻酸鈉濃度小于3%，清洗酶珠會(huì)造成酶的較多損失；當(dāng)海藻酸鈉濃度超過(guò)4.5%時(shí)， 酶活力下降。酶解反應(yīng)時(shí)擴(kuò)散阻力大，粘度大制粒難度。選用4%海藻酸鈉對(duì)酶進(jìn)行固定化 最為適宜。
戊二醛作為一種雙功能交聯(lián)劑，可以使海藻酸鈉分子發(fā)生交聯(lián)，同時(shí)也能使酶交聯(lián)在載 體上，能夠增強(qiáng)海藻酸鈉的機(jī)械強(qiáng)度和固定化酶的穩(wěn)定性。戊二醛濃度低于0.15%時(shí)，所固定的酶比較少；當(dāng)戊二醛濃度為0.2%時(shí)，固定化酶相對(duì)酶活最高；繼續(xù)增加戊二醛濃度達(dá)到0.3% 以上，由于酶分子活性基團(tuán)被戊二醛過(guò)多修飾，酶活力明顯下降。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)以十字花科植物西蘭花的種子為實(shí)例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，其具體實(shí)施工藝流 程如下
200g西蘭花種子碎成粉末后加600ml緩沖液，緩沖液為pH為6.0的磷酸緩沖液，其配 制方法為300ml O.lmol/L磷酸二氫鉀+33.6 ml 0.1mol/LNaOH，含5%甘油，lmM EDTA， 3mM DTT。攪拌后紗布過(guò)濾，濾液在4X:下，12000xg離心20min，收集上清夜，加入固體硫酸銨， 使達(dá)到80%飽和度，在4'C下靜置2h后，fC下12000xg離心20min，收集沉淀，用少量的 蒸餾水溶解，4'C下蒸餾水透析2h (截留分子量14000D)，透析袋內(nèi)液體為黑芥子酶液。取 100ml的酶液加水稀釋到500ml，加海藻酸鈉混合。按重量/體積比計(jì)，海藻酸鈉最終濃度為 4%。 37'C水浴溶解海藻酸鈉，將海藻酸鈉和黑芥子酶的混合液呈小滴狀加入到氯化鈣溶液中， 氯化鈣濃度為2.0mol/L，形成直徑為2mm 3mm的海藻酸鈣凝膠珠，于(C硬化2小時(shí)后 過(guò)濾，再用蒸溜水洗滌，將硬化后的海藻酸鈣凝膠珠加入到1L戊二醛溶液交聯(lián)4小時(shí)，戊二 醛溶液濃度為0.2%，用蒸溜水洗滌后獲固定化黑芥子酶，4。C密封保存。
本發(fā)明的固定化方法，使固定化后黑芥子酶的活力達(dá)到游離酶的70.84% (含相同酶量， 通過(guò)HPLC測(cè)定sinigrin酶解后的減少量確定)；催化反應(yīng)的pH值穩(wěn)定范圍從原來(lái)的5~7增 寬到4 9，耐熱能力從原來(lái)的55'C提高到65"C;黑芥子酶使用次數(shù)從原來(lái)的1次，增加到3
次以上。
權(quán)利要求
1.固定化黑芥子酶，其特征在于從十字花科蔬菜種子或植株中分離獲取黑芥子酶，制成2mm～3mm的海藻酸鈣凝膠珠，硬化后用戊二醛交聯(lián)。
2. 如權(quán)利要求1所述固定化黑芥子酶的制備方法，其特征在于以下步驟(1) 按每克十字花科蔬菜種子粉末加3毫升pH為6.0的磷酸緩沖液計(jì)加入磷酸緩沖液，攪 拌過(guò)濾除雜后，再4'C低溫離心去雜質(zhì)，獲黑芥子酶液；所述磷酸緩沖液中含5%體積份的 甘油，lmMEDTA， 3mMDTT;(2) 按體積/重量比計(jì)在上述酶液中加80%硫酸銨，4'C低溫靜置2小時(shí)后，在4。C條件下離 心，獲得酶沉淀，4'C下蒸餾水透析2小時(shí)，獲得液體酶；(3) 在液體酶中加入海藻酸鈉，添加量為每100毫升酶液加入3.5 4.5毫克海藻酸鈉， 35'C 45'C水浴溶解海藻酸鈉，將混合液呈小滴狀滴加到2% 3 %氯化鈣水溶液中，形成 直徑2mm 3tnm的海藻酸鈣凝膠珠；(4) 將海藻酸鈣凝膠珠在3'C 5'C靜置硬化2小時(shí)，用蒸餾水洗滌后，取顆粒加入到 0.15%~0.3%的戊二醛溶液交聯(lián)4小時(shí)，再用蒸餾水洗滌，得到固定化黑芥子酶顆粒，在 3"C 5'C密封保存。
3. 如權(quán)利要求2所述固定化黑芥子酶的制備方法，其特征在于步驟(1)所述十字花科蔬菜種子選用的是西蘭花種子。
全文摘要
本發(fā)明涉及固定化黑芥子酶及其制備方法。采用十字花科蔬菜種子，特別是西蘭花種子，在提取黑芥子酶過(guò)程中添加甘油、EDTA、DTT保護(hù)酶活性；在4℃低溫下操作，完成去雜質(zhì)獲得酶初提液；在固定化步驟中添加海藻酸鈉，在不影響酶活性的溫度下溶解混合，滴入氯化鈣溶液制成海藻酸鈣小顆粒，用戊二醛溶液處理顆粒，將游離的黑芥子酶固定化。本發(fā)明的固定化方法，使固定化后黑芥子酶的活力達(dá)到游離酶的70.84％；催化反應(yīng)的pH值穩(wěn)定范圍從原來(lái)的5～7增寬到4～9，耐熱能力從原來(lái)的55℃提高到65℃；黑芥子酶使用次數(shù)從原來(lái)的1次，增加到3次以上。
文檔編號(hào)C12N11/04GK101173266SQ200710156139
公開(kāi)日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2007年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月19日
發(fā)明者施青紅, 沈蓮清, 王向陽(yáng) 申請(qǐng)人:浙江工商大學(xué)