一種雞油菌菌絲多糖的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種雞油菌菌絲多糖的提取方法，該方法包括以下步驟：⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基；⑵制備種子培養(yǎng)基；⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基；⑷雞油菌菌絲接種至馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基，經(jīng)恒溫培養(yǎng)得斜面菌種；⑸1cm2斜面菌種接種至種子培養(yǎng)基，經(jīng)振蕩培養(yǎng)得菌種種子液；⑹菌種種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)振蕩培養(yǎng)得發(fā)酵液；發(fā)酵液離心、洗滌、烘干、磨粉后，得到菌絲體干粉末；⑺菌絲體干粉末先超聲提取再浸提得到多糖浸提液；⑻多糖浸提液離心、過濾、濃縮后得到多糖濃縮液；⑼多糖濃縮液中加Sevag試劑，離心后得多糖提取液；⑽多糖提取液加乙醇靜置，得到沉淀物；⑾沉淀物離心、洗滌、干燥，即得多糖干品。本發(fā)明操作簡單，成本低，多糖得率高。
【專利說明】一種雞油菌菌絲多糖的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及真菌多糖【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種雞油菌菌絲多糖的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]真菌多糖是ー類具有廣泛的藥理活性和保健作用的高分子聚合物，具有抗腫瘤、抗感染、抗凝血、抗病毒、降血糖、降血脂、修復(fù)損傷組織細(xì)胞等多種生理功能。常見的真菌多糖有香菇多糖、黑木耳多糖、猴頭菌多糖、銀耳多糖、靈芝多糖、冬蟲夏草多糖、云芝多糖、茯苓多糖、灰樹花多糖等。目前，已有多種真菌多糖應(yīng)用于臨床，使得多糖生物資源的研究和開發(fā)日益活躍，成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點。
[0003]隴南康縣位于甘肅省東南部，陜、甘、川三省交界地帯，是珍貴的天然植物寶庫。境內(nèi)氣候?qū)俚湫蛠啛釒蚺瘻貛н^渡氣候，溫和濕潤，雨量充沛，自然資源十分豐富。雞油菌是隴南康縣地區(qū)生長的ー種具有生理活性的野生食用菌，別名黃絲菌、杏菌，屬真菌界、擔(dān)子菌門、同擔(dān)子菌綱、雞油菌目、雞油菌科和雞油菌屬。在我國主要分布于云南、貴州、四川、湖南、甘肅、安徽、陜西、江蘇等省。研究表明，雞油菌富含胡蘿卜素、VA、V。、多糖物質(zhì)、鈣、鉄、磷等礦質(zhì)元素和人體必需的8種氨基酸，其性平、味甘具有清肝、明目、利肺、減肥和抗衰老等多種功效。雞油菌多糖具有多種生理活性，能夠促進(jìn)人體免疫功能，具有抗腫瘤、抗病毒、抗突變、抗輻射、降血壓等功能。目前，雞油菌的開發(fā)基本依靠野生資源，存在菌種污染率高、生長周期長、エ藝復(fù)雜等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供ー種操作簡單、成本低、多糖得率高的雞油菌菌絲多糖的提取方法。
[0005]為解決上述問題，本發(fā)明所述的ー種雞油菌菌絲多糖的提取方法，包括以下步驟:
⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液A，該濾液A補(bǔ)足至1.0L依次加入5~IOg葡萄糖和5~IOg瓊脂，使其pH值為6.(T8.0，在9(Tl00°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121 °C的條件下滅菌20min即得；
⑵制備種子培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液B，該濾液B補(bǔ)足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值為6.(T8.0，在90~100で溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得；
⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液C，該濾液C補(bǔ)足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值為6.(T8.0，在90~100で溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得；⑷真菌的發(fā)酵培養(yǎng):接一環(huán)雞油菌菌絲至所述馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)4~10天后，置于4°C冰箱中，得到斜面菌種；
(5)將Icm2所述斜面菌種接種至裝有IOmL所述種子培養(yǎng)基的試管中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以100~200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)4~10天，制得pH值為5.0^7.0的菌種種子液；
(6)將所述菌種種子液按5~20%的接種量接種至含有所述發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以10(T200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)4~10天，即得發(fā)酵液；所述發(fā)酵液在高速冷凍離心機(jī)中于5000r/min離心l(T30min,得到菌絲體；所述菌絲體用蒸餾水洗滌后在真空干燥箱于5(T80°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌絲體干粉末；所述發(fā)酵培養(yǎng)基在所述搖瓶中的裝瓶量為10~30% ；
(7)在所述菌絲體干粉末中按Ig:10 mL~30mL的料液比加入去離子水，在功率為10(T300W的條件下超聲提取20~40 min后，在溫度為70~90で的條件下浸提次數(shù)2~4次，每次0.5^2h,合并提取液，得到多糖浸提液；
⑶將所述多糖浸提液在高速冷凍離心機(jī)中于4000r/min離心l(T20min過濾后，得到上清液A，該上清液A在溫度為50°C、真空度為0.06、.08MPa的條件下濃縮至原上清液A體積的1/5~1/3，得到多糖濃縮液；
⑶在所述多糖濃縮液中按其體積的1/5加入Sevag試劑,充分混合攪拌l(T30min,再用高速冷凍離心機(jī)以5000 r/min離心20 min除掉變性蛋白質(zhì),棄去水與有機(jī)相間的蛋白變性層，收集上清液B，反復(fù)多次直到所述上清液B與有機(jī)相中間有清晰的分界面為止，視為蛋白質(zhì)除盡，即得多糖提取液；`
(抑所述多糖提取液中按其體積的2~4倍加入質(zhì)量濃度為95%的こ醇，在4°C下靜置24h，得到沉淀物A;
(11)將所述沉淀物A經(jīng)高速冷凍離心機(jī)以4000 r / min離心20 min后,得到沉淀物B,
該沉淀物B經(jīng)無水こ醇多次洗滌后置于真空干燥箱內(nèi)，經(jīng)50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
[0006]所述步驟⑷中雞油菌菌絲是指采集于隴南康縣的雞油菌6?/?從areBys sp.KX560JY按常規(guī)方法經(jīng)組織分離獲得的雞油菌菌絲；所述雞油菌6?/?tharellus sp.KX560JY在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC NO:M 2012114 (保藏單位地址:中國.武漢.武漢大學(xué)；保藏日期:2012年4月13日)，其分子生物學(xué)鑒定后的核酸序列提交至GenBank的登錄號為JQ086387。
[0007]所述步驟(9)中Sevag試劑是指氯仿與正丁醇按4mL: ImL混合而成的混合液。
[0008]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點:
1、本發(fā)明采用超聲波輔助熱水浸提法取代以往的単獨水提，利用其獨特的熱作用、機(jī)械作用及空化等物理化學(xué)效應(yīng)，可以有效縮短提取時間，顯著提高多糖得率，具有提取效率高、時間短、溫度低、不易破壞多糖的立體結(jié)構(gòu)等優(yōu)點。
[0009]2、本發(fā)明整個過程中無需試劑和化學(xué)反應(yīng)，不但設(shè)備簡単，可操作性強(qiáng)，而且成本低。
[0010]3、本發(fā)明發(fā)酵菌絲體培養(yǎng)周期短、菌種純、エ藝簡單，利于實現(xiàn)規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，從其發(fā)酵液或固體培養(yǎng)物中得到菌絲體提取多糖，為雞油菌資源的合理開發(fā)利用提供參考。
【具體實施方式】
[0011]實施例1 一種雞油菌菌絲多糖的提取方法，包括以下步驟:
⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4倍加水煮沸25min后用紗布過濾，得到濾液A，該濾液A補(bǔ)足至1.0L依次加入5g葡萄糖和5g瓊脂，使其pH值為6.0~8.0，在90°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0012]⑵制備種子培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4倍加水煮沸25min后用紗布過濾，得到濾液B，該濾液B補(bǔ)足至1.0L加入5g葡萄糖，使其pH值為6.(T8.0，在90°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0013]⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4倍加水煮沸25min后用紗布過濾，得到濾液C，該濾液C補(bǔ)足至1.0L加入5g葡萄糖，使其pH值為6.(T8.0，在90°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0014]⑷真菌的發(fā)酵培養(yǎng):接一環(huán)雞油菌菌絲至馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)4天后，置于4°C冰箱中，得到斜面菌種。
[0015]其中:雞油菌菌絲是指采集于隴南康縣的雞油菌6?/?從印.KX560JY按常規(guī)方法經(jīng)組織分離獲得的雞油`菌菌絲；雞油菌6?/?(AardAz1S sp.KX560JY在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC NO:M 2012114 (保藏單位地址:中國.武漢?武漢大學(xué)；保藏日期:2012年4月13日)，其分子生物學(xué)鑒定后的核酸序列提交至GenBank的登錄號為 JQ086387。
[0016](5)將Icm2斜面菌種接種至裝有IOmL種子培養(yǎng)基的試管中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以100 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)4天，制得pH值為5.(T7.0的菌種種子液。
[0017](6)將菌種種子液按5%的接種量接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以100 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)4天，即得發(fā)酵液；發(fā)酵液在高速冷凍離心機(jī)中于5000r/min離心IOmin,得到菌絲體；菌絲體用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于50°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌絲體干粉末。
[0018]其中:發(fā)酵培養(yǎng)基在搖瓶中的裝瓶量為10%。
[0019](7)在菌絲體干粉末中按I g:10 mL的料液比加入去離子水，在功率為100W的條件下超聲提取40 min后，在溫度為70°C的條件下浸提次數(shù)2次，毎次0.5h，合并提取液，得到
多糖浸提液。
[0020]⑶將多糖浸提液在高速冷凍離心機(jī)中于4000r/min離心IOmin過濾后，得到上清液A，該上清液A在溫度為50°C、真空度為0.06MPa的條件下濃縮至原上清液A體積的1/5，得到多糖濃縮液。
[0021]⑶在多糖濃縮液中按其體積的1/5加入Sevag試劑,充分混合攪拌IOmin,再用高速冷凍離心機(jī)以5000 r/min離心20 min除掉變性蛋白質(zhì),棄去水與有機(jī)相間的蛋白變性層，收集上清液B，反復(fù)多次直到上清液B與有機(jī)相中間有清晰的分界面為止，視為蛋白質(zhì)除盡，即得多糖提取液。
[0022]其中:Sevag試劑是指氯仿與正丁醇按4mL =ImL混合而成的混合液。
[0023](W)多糖提取液中按其體積的2倍加入質(zhì)量濃度為95%的こ醇，在4°C下靜置24h，得到沉淀物A。
[0024](11)將沉淀物A經(jīng)高速冷凍離心機(jī)以4000 r / min離心20 min后,得到沉淀物B,
該沉淀物B經(jīng)無水こ醇多次洗滌后置于真空干燥箱內(nèi)，經(jīng)50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
[0025]采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，并按下式計算:
粗多糖含量(mg/g菌絲干重)=粗多糖總質(zhì)量(mg)/菌絲體干粉末質(zhì)量(g)。
[0026]實施例2 —種雞油菌菌絲多糖的提取方法，包括以下步驟:
⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的6倍加水煮沸35min后用紗布過濾，得到濾液A，該濾液A補(bǔ)足至1.0L依次加入IOg葡萄糖和IOg瓊脂，使其PH值為6.(T8.0，在100°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0027]⑵制備種子培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的6倍加水煮沸35min后用紗布過濾，得到濾液B，該濾液B補(bǔ)足至1.0L加入IOg葡萄糖，使其pH值為6.(T8.0，在100°C溫度下充分加熱溶解后分裝 ，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0028]⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的6倍加水煮沸35min后用紗布過濾，得到濾液C，該濾液C補(bǔ)足至1.0L加入IOg葡萄糖，使其pH值為6.(T8.0，在100°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0029]⑷真菌的發(fā)酵培養(yǎng):接一環(huán)雞油菌菌絲至馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)10天后，置于4°C冰箱中，得到斜面菌種。
[0030]其中:雞油菌菌絲同實施例1。
[0031](5)將Icm2斜面菌種接種至裝有IOmL種子培養(yǎng)基的試管中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)10天，制得pH值為5.(T7.0的菌種種子液。
[0032](6)將菌種種子液按20%的接種量接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)10天，即得發(fā)酵液；發(fā)酵液在高速冷凍離心機(jī)中于5000r/min離心30min,得到菌絲體；菌絲體用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于80°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌絲體干粉末。
[0033]其中:發(fā)酵培養(yǎng)基在搖瓶中的裝瓶量為30%。
[0034](7)在菌絲體干粉末中按I g:30mL的料液比加入去離子水，在功率為300W的條件下超聲提取20 min后，在溫度為90°C的條件下浸提次數(shù)4次，毎次2h，合并提取液，得到多糖浸提液。
[0035]⑶將多糖浸提液在高速冷凍離心機(jī)中于4000r/min離心20min過濾后，得到上清液A，該上清液A在溫度為50°C、真空度為0.08MPa的條件下濃縮至原上清液A體積的1/3，得到多糖濃縮液。
[0036]⑶在多糖濃縮液中按其體積的1/5加入Sevag試劑,充分混合攪拌30min,再用高速冷凍離心機(jī)以5000 r/min離心20 min除掉變性蛋白質(zhì),棄去水與有機(jī)相間的蛋白變性層，收集上清液B，反復(fù)多次直到上清液B與有機(jī)相中間有清晰的分界面為止，視為蛋白質(zhì)除盡，即得多糖提取液。
[0037]其中:Sevag試劑同實施例1。
[0038](W)多糖提取液中按其體積的4倍加入質(zhì)量濃度為95%的こ醇，在4°C下靜置24h，得到沉淀物A。
[0039](11)將沉淀物A經(jīng)高速冷凍離心機(jī)以4000 r / min離心20 min后,得到沉淀物B,
該沉淀物B經(jīng)無水こ醇多次洗滌后置于真空干燥箱內(nèi)，經(jīng)50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
[0040]采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，并按實施例1中的公式計算。
[0041]實施例3 —種雞油菌菌絲多糖的提取方法，包括以下步驟:
⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的5倍加水煮沸30min后用紗布過濾，得到濾液A，該濾液A補(bǔ)足至1.0L依次加入8g葡萄糖和8g瓊脂，使其pH值為6.(T8.0，在95°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0042]⑵制備種子培養(yǎng)基 :將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的5倍加水煮沸30min后用紗布過濾，得到濾液B，該濾液B補(bǔ)足至1.0L加入8g葡萄糖，使其pH值為6.(T8.0，在95°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0043]⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的5倍加水煮沸30min后用紗布過濾，得到濾液C，該濾液C補(bǔ)足至1.0L加入8g葡萄糖，使其pH值為6.(T8.0，在95°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0044]⑷真菌的發(fā)酵培養(yǎng):接一環(huán)雞油菌菌絲至馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)7天后，置于4°C冰箱中，得到斜面菌種。
[0045]其中:雞油菌菌絲同實施例1。
[0046](5)將Icm2斜面菌種接種至裝有IOmL種子培養(yǎng)基的試管中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以150 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)7天，制得pH值為5.(T7.0的菌種種子液。
[0047](6)將菌種種子液按12%的接種量接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以150 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)7天，即得發(fā)酵液；發(fā)酵液在高速冷凍離心機(jī)中于5000r/min離心20min,得到菌絲體；菌絲體用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于65°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌絲體干粉末。
[0048]其中:發(fā)酵培養(yǎng)基在搖瓶中的裝瓶量為20%。
[0049](7)在菌絲體干粉末中按I g:20mL的料液比加入去離子水，在功率為200W的條件下超聲提取30 min后，在溫度為80°C的條件下浸提次數(shù)3次，毎次lh，合并提取液，得到多糖浸提液。[0050]⑶將多糖浸提液在高速冷凍離心機(jī)中于4000r/min離心15min過濾后,得到上清液A，該上清液A在溫度為50°C、真空度為0.07MPa的條件下濃縮至原上清液A體積的1/4，得到多糖濃縮液。
[0051]⑶在多糖濃縮液中按其體積的1/5加入Sevag試劑,充分混合攪拌20min,再用高速冷凍離心機(jī)以5000 r/min離心20 min除掉變性蛋白質(zhì),棄去水與有機(jī)相間的蛋白變性層，收集上清液B，反復(fù)多次直到上清液B與有機(jī)相中間有清晰的分界面為止，視為蛋白質(zhì)除盡，即得多糖提取液。
[0052]其中:Sevag試劑同實施例1。
[0053](1Φ多糖提取液中按其體積的3倍加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，在4°C下靜置24h，得到沉淀物A。
[0054](11)將沉淀物A經(jīng)高速冷凍離心機(jī)以4000 r / min離心20 min后,得到沉淀物B,
該沉淀物B經(jīng)無水乙醇多次洗滌后置于真空干燥箱內(nèi)，經(jīng)50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
[0055]采用苯酚-硫酸法測`定多糖含量，并按實施例1中的公式計算。
【權(quán)利要求】
1.一種雞油菌菌絲多糖的提取方法，包括以下步驟: ⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液A，該濾液A補(bǔ)足至1.0L依次加入5~IOg葡萄糖和5~IOg瓊脂，使其pH值為6.(T8.0，在9(Tl00°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121 °C的條件下滅菌20min即得； ⑵制備種子培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液B，該濾液B補(bǔ)足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值為6.(T8.0，在90~100で溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得； ⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液C，該濾液C補(bǔ)足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值為6.(T8.0，在90~100で溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得； ⑷真菌的發(fā)酵培養(yǎng):接一環(huán)雞油菌菌絲至所述馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)4~10天后，置于4°C冰箱中，得到斜面菌種； (5)將Icm2所述斜面菌種接種至裝有IOmL所述種子培養(yǎng)基的試管中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以100~200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)4~10天，制得pH值為5.0^7.0的菌種種子液； (6)將所述菌種種子液按5~20%的接種量接種至含有所述發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以10(T200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)4~10天，即得發(fā)酵液；所述發(fā)酵液在高速冷凍離心機(jī)中于5000r/min離心l(T30min,得到菌絲體；所述菌絲體用蒸餾水洗滌后在真空干燥箱于`5(T80°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌絲體干粉末；所述發(fā)酵培養(yǎng)基在所述搖瓶中的裝瓶量為10~30% ； (7)在所述菌絲體干粉末中按Ig:10 mL~30mL的料液比加入去離子水，在功率為10(T300W的條件下超聲提取20~40 min后，在溫度為70~90で的條件下浸提次數(shù)2~4次，每次0.5~2h，合并提取液，得到多糖浸提液； ⑶將所述多糖浸提液在高速冷凍離心機(jī)中于4000r/min離心l(T20min過濾后，得到上清液A，該上清液A在溫度為50°C、真空度為0.06、.08MPa的條件下濃縮至原上清液A體積的1/5~1/3，得到多糖濃縮液； ⑶在所述多糖濃縮液中按其體積的1/5加入Sevag試劑,充分混合攪拌l(T30min,再用高速冷凍離心機(jī)以5000 r/min離心20 min除掉變性蛋白質(zhì),棄去水與有機(jī)相間的蛋白變性層，收集上清液B，反復(fù)多次直到所述上清液B與有機(jī)相中間有清晰的分界面為止，視為蛋白質(zhì)除盡，即得多糖提取液； (抑所述多糖提取液中按其體積的2~4倍加入質(zhì)量濃度為95%的こ醇，在4°C下靜置24h，得到沉淀物A; (11)將所述沉淀物A經(jīng)高速冷凍離心機(jī)以4000 r / min離心20 min后,得到沉淀物B,該沉淀物B經(jīng)無水こ醇多次洗滌后置于真空干燥箱內(nèi)，經(jīng)50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
2.如權(quán)利要求1所述的ー種雞油菌菌絲多糖的提取方法，其特征在于:所述步驟⑷中雞油菌菌絲是指采集于隴南康縣的雞油菌Cantharellus sp.KX560JY按常規(guī)方法經(jīng)組織分離獲得的雞油菌菌絲；所述雞油菌sp.KX560JY在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC NO:M 2012114，其分子生物學(xué)鑒定后的核酸序列提交至GenBank 的登錄號為 JQ086387。
3.如權(quán)利要求1所述的ー種雞油菌菌絲多糖的提取方法，其特征在于:所述步驟⑶中Sevag試 劑是指氯仿與正丁醇按4mL:lmL混合而成的混合液。
【文檔編號】C08B37/00GK103554285SQ201310480649
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】陳朋, 嚴(yán)曉娟, 梁寧, 胡先望 申請人:甘肅省商業(yè)科技研究所