專利名稱：載有蛋白大分子的多糖－聚合物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術領域的聚合物及其制備方法。特別是一種載有蛋白大分子的多糖-聚合物及其制備方法。
背景技術：
生物兼容性、可降解性聚合物已廣泛地用于疾病治療和其它相關領域。將這類材料與近年來高速發(fā)展的生物技術藥物相結合有著誘人的應用前景，同時也遇到如何保持結構相對脆弱的生物技術藥物在這類材料中穩(wěn)定性低的技術瓶頸。和化學小分子藥物相比，蛋白大分子有著特異性更強、選擇性更好的療效，然而其脆弱易變的結構成為生物醫(yī)學材料制備中有待解決的問題。特別是包括組織工程材料在內的生物醫(yī)學材料常常需要根據治療目的的不同以不同的工藝制備成各種形狀或涂層于不同的治療器械的表面。
關于聚合物包封的蛋白大分子的穩(wěn)定性，較好的辦法是將蛋白分子預先制備成固體微粒，使其構像固定。然而，將蛋白大分子在不改變構像的同時制成固體微粒并不容易，已報道過的方法均有各種不足。比如，將蛋白與小分子糖類或大分子多糖的混合溶液制成凍干粉的方法難以制得粒徑小于10μm的顆粒。將蛋白與糖類的溶液噴霧干燥時會遇到噴嘴的高溫和高剪切力。將蛋白與糖類的溶液噴入液氮然后凍干也會遇到高剪切力，而且所形成的顆粒為密度低于0.5的多孔結構，不利于對蛋白大分子的保護。將蛋白大分子與二價金屬離子作用沉淀為離子鍵微粒則會造成一些蛋白的不可逆聚集。在蛋白溶液中加入無機鹽或PEG，將蛋白鹽析出來成為微粒時，前者難以除去鹽類，而后者的PEG雖然可以除去但蛋白微粒直接接觸聚合物也會引起不可逆沉淀。
在醫(yī)療器械表面涂上載藥的功能材料膜或組織工程材料中添加藥物治療方案已經有產品上市。但是在醫(yī)療器械表面涂上具有生物活性的膜或在組織工程材料里添加具有生物活性的生物治療試劑至今還沒有產品問世，主要是由于生物治療試劑在制備過程容易失活如蛋白質，在制備過程不可避免要接觸到有機試劑、高剪切力、油水界面導致蛋白質的變性失活，在釋放過程又要遇到局部過酸導致變性失活，還有不完全釋放等一系列問題。目前盡管有在心臟支架的表面用化學的方法把抗體固定在支架的表面來捕獲內皮細胞在支架的表面上生長；和在其表面涂上內皮細胞生長因子(VEGF)來刺激內皮細胞在支架的表面上生長防止血管平滑肌細胞增生，但是突釋嚴重和載藥量太低，還遠達不到臨床治療要求。還有在血管內導入基因，促進內皮細胞增生及血栓溶解，抑制平滑肌細胞的增殖等將有可能達到防治再狹窄的目的和Klugherz.B.D.，等人研究報道了控釋DNA-PLGA心臟支架。主要的基因類型有①抗血栓形成的基因，如重組t-PA基因；②血管活性物質的基因，如重組NOS基因；③生長因子和細胞因子的基因，如VEGF基因、PDGF的反意RNA或DNA；④癌基因與抗癌基因，如重組反意Ras癌基因等；⑤細胞周期調節(jié)基因，如Cyclin、CDK以及ICE、Bax等。常用的基因治療方法為轉基因治療(包括；負顯性基因治療、抑制性轉基因治療、藥物前體基因治療)；反義核酸藥物治療(包括反義寡核甘酸、反義mRNA等)?；蛲繉又Ъ艽蠖嗍遣捎猛ㄟ^基因轉錄，如以腺病毒、質粒DNA等為載體攜帶目的基因到病變處，基因表達合成目的蛋白質。但是由于基因的轉染效率及安全問題，現(xiàn)在基因治療還處在實驗研究階段。
經對現(xiàn)有技術文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，[Hennink W.E.and Franssen D.(EN)PROCESS FOR THE PREPARATION OF A CONTROLLED RELEASE SYSTEM(FR)PROCEDEDE PREPARATION D’UN SYSTEME A LIBERATION RETARDEE。Publication No.International Application No.PCT/NL1997/000625].(Hennink W.E.andFranssen D.一種制備控釋放系統(tǒng)的方法，公開號為WO/1998/022093，國際申請?zhí)朠CT/NL1997/000625)Hennink W.E.報道了水相-水相兩相系統(tǒng)制備多糖顆粒。不過它們使用了可以交聯(lián)的多糖，而著些交聯(lián)基團是通過化學修飾得到。這樣不僅會改變多糖的本身的性質，有可能增加多糖的免疫原性，同時這些交聯(lián)基團也可能與蛋白質和多肽發(fā)生交聯(lián)，因為交聯(lián)基團并沒有特殊的選擇性。但是還沒見載有蛋白質的多糖玻璃體-聚合物的報道。
發(fā)明的內容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種載有蛋白大分子的多糖-聚合物及其制備方法。使其當蛋白藥物需要用于介入治療時，如何使得這類大分子在不同的工藝條件下始終保持著自然構像，同時蛋白大分子物理混合于這類親水性多糖微粒的基質中，避免了與用于包封的聚合物的相互作用，不引起蛋白的聚集或其它反應。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明載有蛋白大分子的多糖-聚合物含有多糖、蛋白質、聚合物、保護蛋白質的試劑，在制備具體蛋白質多糖-聚合物時，根據具體需要選擇不同的多糖、蛋白質、聚合物、保護試劑；多糖為0.01％-50％、蛋白質為0.01％-50％、聚合物為20％-80％、保護蛋白質的試劑為0％-10％。
所述的多糖包括葡聚糖、淀粉、纖維素及其衍生物、瓊脂糖和水溶性高分子多糖。
所述的蛋白質，其蛋白大分子分布在多糖相中形成玻璃體微粒，而蛋白-多糖微粒均勻地分布在脂溶性聚合物基質中。內所述的蛋白質為促紅細胞生成素(EPO)、重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、疫苗、干擾素(INF)、生長激素(GH)、胰島素(Insulin)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、轉化生長因子(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、血小板生長因子(PDGF)、內皮生長因子(ECGF)、神經生長因子(NGF)、骨衍生性生長因子(BDGF)、骨形成蛋白(BMP)、組織多肽抗原(TPA)、抗體(antibody)、凝血因子VIII(VIII)及IX遺傳因子和其他用于治療的蛋白質或多肽，反義核苷酸(anti-RNA)、小分子RNA(RNAi)、基因(DNA)、抗體、疫苗、或脂質體。
所述的聚合物為具有功能高分子化合物。
所述的功能高分子聚合物為聚酯、聚酸酐、或骨架非肽鍵的聚氨基酸，其中包括聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸及其組合；還包括硅像膠、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、卡波母、透明質酸、明膠、膠原蛋白、聚乙交酯、聚己內酯、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯、纖維蛋白原、纖維蛋白、凝膠包括聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚羥基乙酸、聚羥基乙酸-聚乙二醇-聚羥基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸溫敏型水凝膠和敏感型材料。
所述的微粒，是指蛋白-多糖微粒，其粒徑在60納米-20微米。
所述的保護蛋白質的試劑為小糖、多羥基化合物、氨基酸化合物、金屬化合物的一種或任意組合。
所述的小糖，包括海藻糖、蔗糖、乳糖。
所述的多羥基化合物，包括甘露醇、甘油。
所述的氨基酸化合物，包括甘氨酸、精氨酸。
所述的金屬化合物，包括鋅、銅、鎂、鐵、鈣。
本發(fā)明可制成為薄膜、纖維、支架、骨架以及器件表面的涂層；還可用于薄膜、纖維、骨架以及器件的表面涂層當載有治療性蛋白藥物的介入治療。
本發(fā)明載有蛋白大分子的多糖-聚合物的制備方法包括以下步驟①將蛋白加入多糖溶液或將蛋白加入多糖和聚乙二醇混合溶溶；②將所制備的蛋白-多糖溶液6％或6％以上濃度溶液與相同濃度的聚乙二醇溶液在低于室溫高于冰點的溫度下混合，或將蛋白-多糖6％或6％以上濃度溶液與并含有0.2-2％的聚電解質的聚乙二醇溶液在冰點以上的溫度混合，或將蛋白-多糖6％以下濃度溶液與相同濃度聚乙二醇溶液在冰點以上的溫度混合；③將所形成的混合溶液或水相-水相乳濁液冷凍干燥；④將所得到的凍干粉加入可溶聚乙二醇的有機溶液洗滌，除去聚乙二醇，得到載有蛋白的多糖玻璃體微粒；⑤將所得到的蛋白-多糖玻璃體微粒加入脂溶性聚合物的溶液混合均勻，并將此懸濁液成型為薄膜、纖維、骨架、涂層或直接噴涂在器械的表面上，使溶劑揮發(fā)后待用。
所述的聚電解質為海藻酸鈉、羧甲酸纖維素鈉帶負電荷的聚電解質。
所述的多糖溶液與相同的聚乙二醇溶液在低于室溫高于冰點的溫度下混合或加聚電解質的，它們的濃度為6％-40％；蛋白質的濃度為0.1％-20％.
所述的聚合物的溶液是一種或幾種功能高分子聚合物組合，蛋白質也是一種或幾種組合，根據具體的蛋白質的性質和治療需要，甚至可以添加化學藥起到聯(lián)合治療目的。
本發(fā)明可以制成薄膜、纖維、骨架以及其它器件的表面涂層以用于介入治療或其它用途。本發(fā)明具有多種功能，可以根據需要，選擇不同的配方達到治療的目的。制備方法制作的各種支架的涂層、膜、骨架、纖維、組織工程材料的支架可以對藥物的活性有保護和緩控釋作用。
具體實施實例實例1薄膜控釋劑的制備和體外釋放行為一、溶液配置1.肌紅蛋白溶液制備稱取肌紅蛋白20.7mg，加入超純水2ml中渦選溶解，得到肌紅蛋白溶液濃度約10mg/ml。
2.葡聚糖溶液制備稱取葡聚糖(Mw＝64,000-70,000)1.0g，加超純水至10.00g，加熱攪拌至溶解。得到葡聚糖溶液重量百分比約10％。
3.PEG溶液制備稱取葡聚糖(Mw＝8,000)1.0g，加超純水至10.00g，加熱攪拌至溶解。得到葡聚糖溶液重量百分比約10％。
二、模型蛋白-葡聚糖微粒制備1.肌紅蛋白葡聚糖微粒制備分別稱取肌紅蛋白溶液、葡聚糖溶液和PEG溶液0.50g、0.16g和1.00g(注兩份)，在0℃的條件下，采用勻漿器E檔(22,000rpm)勻漿3×5s。上述乳液在-20℃放過夜，再冷凍干燥24h。干燥物置于二氯甲烷5ml中，12,000rpm離心5min，傾去上層清夜，重復二氯甲烷洗滌過程三次。將最后得到的肌紅蛋白葡聚糖微粒保存在1ml二氯甲烷中。
2.空白對照葡聚糖微粒制備分別稱取葡聚糖溶液和PEG溶液0.15g和1.00g，按上面制備方法同法制備。
(注將上述兩種微粒在PCS測定其粒徑分布和大小及掃描電鏡觀察形態(tài)和大小如

圖1，2，微粒大多數粒徑在1～2um左右。)三、薄膜控釋制劑的制備1:5薄膜控釋制劑制備稱取PLGA(75/253A)15.1mg、二氯甲烷1ml，渦選溶解。加入700ul搖勻的肌紅蛋白葡聚糖微?；鞈乙?，渦選使分散均勻。采用噴筆將上述溶液噴到載玻片上或金屬片上，將制備的金屬片減壓去除二氯甲烷。干燥后從載玻片上或金屬片上小心的收集膜，我們可以清楚的看到膜中有分散均勻的葡聚糖微粒。
四、釋放液測定
釋放液樣品采用micro-BCA試劑盒測定。以肌紅蛋白標準蛋白制備標準曲線。肌紅蛋白-葡聚糖膜釋放液吸收值減除同法制備的空白膜釋放液吸收值進行校正，帶入上述標準曲線中計算釋放液肌紅蛋白濃度。依次繪制不同葡聚糖/PLGA比例涂層中肌紅蛋白的釋放曲線?？梢钥闯銎溽尫判袨榱己茫瑹o明顯突釋行為。
這些薄膜可以直接用于臨床，起到治療效果。還可以把它固定在其它支架上，起到緩控釋和治療作用。
實例2支架涂層模型控釋劑的制備和體外釋放行為一、模型蛋白-葡聚糖微粒制備按照實例1制備二、模型蛋白(肌紅蛋白)涂層制備15涂層制備稱取PLGA(50/502A)15.1mg、二氯甲烷1ml，渦選溶解。加入700ul搖勻的肌紅蛋白葡聚糖微?；鞈乙?，渦選使分散均勻。采用噴筆將上述溶液噴到316L不銹鋼金屬片，將制備的金屬片減壓去除二氯甲烷。
110涂層制備稱取PLGA(50/502A)29.9mg，按上面方法同法制備涂層。
115涂層制備稱取PLGA(50/502A)45.6mg，按上面方法同法制備涂層。
空白涂層制備同上述三種涂層分別稱取PLGA(50/502A)適量、二氯甲烷1ml，渦選溶解。采用噴筆將上述溶液噴到316L不銹鋼金屬片，將制備的金屬片減壓去除二氯甲烷。
三、涂層釋放試驗按照實例1進行釋放液測定；其釋放曲線如圖6這些醫(yī)療器械的涂層可以直接用于臨床，起到治療效果。
實例3心臟支架涂層控釋劑的制備和體外釋放行為一、模型蛋白-葡聚糖微粒制備按照實例1制備；二、心臟支架涂層按照實例1制備15涂層制備稱取PLGA(75/253A)15.1mg、二氯甲烷1ml，渦選溶解。加入700ul搖勻的肌紅蛋白葡聚糖微粒混懸液，渦選使分散均勻。采用噴筆將上述溶液噴到心臟支架表面上，將制備的心臟支架減壓去除二氯甲烷。心臟支架的表面通過掃描電鏡可以清楚的看到其表面光滑平整，沒有毛刺，支架涂層適合臨床應用。
三、心臟支架涂層釋放試驗按照實例1進行釋放液測定；其體外釋放曲線可以看出其釋放行為良好，無明顯突釋行為。
這些醫(yī)療器械的涂層可以直接用于臨床，起到治療效果，這種支架不僅有支撐作用，還有緩控釋作用和治療效果。
實例4骨架控釋劑的制備和體外釋放行為模型蛋白-葡聚糖微粒制備按照實例1制備；二、骨架控釋劑的制備15骨架控釋劑的制備稱取PLGA(75/253A)300.1mg、二氯甲烷5ml，渦選溶解。加入60mg肌紅蛋白葡聚糖微粒上訴PLGA溶液中，渦懸使其分散均勻。采用噴筆將上述溶液噴到或澆灌到模器中，然后一邊用氮氣吹干，再繼續(xù)溶液噴到或澆灌到模器中，然后再繼續(xù)吹干，直到滿足需要為止。清楚的看到有微粒分散在里面。
三、骨架控釋劑的釋放試驗按照實例1進行釋放液測定；通過優(yōu)化制備處方，可以清楚的看到沒有明顯突釋釋放曲線。
這種骨架不僅有支撐作用，還有緩控釋治療作用。
實例5本發(fā)明方法對β-半糖乳糖苷酶蛋白的保護作用為了驗證本發(fā)明對生物活性物質有較好的保護作用，設計如下實驗有機溶液存在條件下葡聚糖微粒對結構易變的蛋白大分子的保護作用，把β-半糖乳糖苷酶(一個具有四級結構、分子量為500KD的酶)載進葡聚糖微粒進行了測試。先將蛋白質以0.67mg/ml β-半糖乳糖苷酶溶于葡聚糖溶液，按照1∶20的比例，然后將其加入實例1所描述的PEG溶液中乳化。冷凍干燥后，用二氯甲烷反復洗滌幾遍除去PEG。接下來的步驟中，將所回收的載著蛋白質的葡聚糖微粒在緩沖液中重新溶解，加入o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)，測試對底物-ONPG的水解催化活性。如圖13中所示，酶的催化作用在經歷了從實例1到實例2所描述的操作過程(包括乳化、冷凍干燥以及二氯甲烷洗滌)后，只是下降了不到10％。此10％的活性下降還包括了由于在乳化過程中被分配在PEG相的部分蛋白以及冷凍干燥過程中損失的蛋白活性。也就是說，在與微囊包過程所用的有機溶液-二氯甲烷的接觸中，葡聚糖微粒有效地保存了蛋白酶的活性。
權利要求
1.一種載有蛋白大分子的多糖-聚合物，其特征在于，含有多糖、蛋白質、聚合物、保護蛋白質的試劑，在制備具體蛋白質多糖-聚合物時，根據具體需要選擇不同的多糖、蛋白質、聚合物、保護試劑；多糖為0.01％-50％、蛋白質為0.01％-50％、聚合物為20％-80％、保護蛋白質的試劑為0％-10％。
2.根據權利要求1所述的載有蛋白大分子的多糖-聚合物，其特征是，所述的多糖包括葡聚糖、淀粉、纖維素及其衍生物、瓊脂糖和水溶性高分子多糖。
3.根據權利要求1所述的載有蛋白大分子的多糖-聚合物，其特征是，所述的蛋白質，其蛋白大分子分布在多糖相中形成玻璃體微粒，而蛋白-多糖微粒均勻地分布在脂溶性聚合物基質中。
4.根據權利要求1所述的載有蛋白大分子的多糖-聚合物，其特征是，所述的聚合物為功能高分子化合物包括聚酯、聚酸酐、或骨架非肽鍵的聚氨基酸，其中包括聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸及其組合；還包括硅像膠、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、卡波母、透明質酸、明膠、膠原蛋白、聚乙交酯、聚己內酯、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯、纖維蛋白原、纖維蛋白、凝膠包括聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚羥基乙酸、聚羥基乙酸-聚乙二醇-聚羥基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸溫敏型水凝膠和酶感型材料。
5.根據權利要求2所述的載有蛋白大分子的多糖-聚合物及其制備方法，其特征是，是指蛋白-多糖微粒，其粒徑在60納米-20微米。
6.根據權利要求1或者3所述的載有蛋白大分子的多糖-聚合物及其制備方法，其特征是，所述的蛋白質為促紅細胞生成素、重組人粒細胞集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、疫苗、干擾素、生長激素、胰島素、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、轉化生長因子、胰島素樣生長因子、血管內皮細胞生長因子、血小板生長因子、內皮生長因子、神經生長因子、骨衍生性生長因子、骨形成蛋白、組織多肽抗原、抗體、凝血因子VIII及IX遺傳因子和其他用于治療的蛋白質或多肽，反義核苷酸、小分子RNA、基因、抗體、疫苗、或脂質體。
7.根據權利要求2所述的載有蛋白大分子的多糖-聚合物及其制備方法，其特征是，所述的保護蛋白質的試劑為小糖、多羥基化合物、氨基酸化合物、金屬化合物的一種或任意組合。。
8.根據權利要求2所述的載有蛋白大分子的多糖-聚合物及其制備方法，其特征是，所述的小糖，包括海藻糖、甘露醇、蔗糖、乳糖；所述的多羥基化合物，包括甘油；所述的氨基酸化合物，包括甘氨酸、精氨酸；所述的金屬化合物，包括鋅、銅、鎂、鐵、鈣。
9.一種根據權利要求1所述的載有蛋白大分子的多糖-聚合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟①將蛋白加入多糖溶液或將蛋白加入多糖和聚乙二醇混合溶溶；②將所制備的蛋白-多糖溶液6％或6％以上濃度溶液與相同濃度的聚乙二醇溶液在低于室溫高于冰點的溫度下混合，或將蛋白-多糖6％或6％以上濃度溶液與并含有0.2-2％的聚電解質的聚乙二醇溶液在冰點以上的溫度混合，或將蛋白-多糖6％以下濃度溶液與相同濃度聚乙二醇溶液在冰點以上的溫度混合；③將所形成的混合溶液或水相-水相乳濁液冷凍干燥；④將所得到的凍干粉加入可溶聚乙二醇的有機溶液洗滌，除去聚乙二醇，得到載有蛋白的多糖玻璃體微粒；⑤將所得到的蛋白-多糖玻璃體微粒加入脂溶性聚合物的溶液混合均勻，并將此懸濁液成型為薄膜、纖維、骨架或器械涂層，使溶劑揮發(fā)后待用。
10.根據權利要求9所述的載有蛋白大分子的多糖-聚合物及其制備方法，其特征是，所述的聚電解質為海藻酸鈉、羧甲酸纖維素鈉帶負電荷的聚電解質，所述的多糖溶液與相同的聚乙二醇溶液在低于室溫高于冰點的溫度下混合或加聚電解質的，它們的濃度為6％-40％；蛋白質的濃度為0.1％-20％.所述的聚合物的溶液是一種或幾種功能高分子聚合物組合，蛋白質也是一種或幾種組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種生物技術領域的載有蛋白大分子的多糖－聚合物及其制備方法。根據具體需要選擇不同的多糖、蛋白質、聚合物、保護試劑；多糖為0.01％－50％、蛋白質為0.01％－50％、聚合物為20％－80％、保護蛋白質的試劑為0％－10％。制備方法包括①將蛋白加入多糖溶液；②將蛋白－多糖與聚乙二醇溶液混合；③將所形成的混合溶液或水相－水相乳濁液冷凍干燥；④將所得到的凍干粉加入可溶聚乙二醇的有機溶液洗滌，除去聚乙二醇，得到微粒；⑤將所得到的微粒加入脂溶性聚合物的溶液混合均勻，并將此懸濁液成型待用。本發(fā)明用于蛋白藥物介入治療，避免了與用于包封的聚合物的相互作用，不引起蛋白的聚集。
文檔編號C08L83/00GK1903939SQ20061002913
公開日2007年1月31日 申請日期2006年7月20日 優(yōu)先權日2006年7月20日
發(fā)明者金拓, 袁偉恩, 吳飛 申請人:上海交通大學