產纖維素酶放線菌及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及產纖維素酶，具體的說是產纖維素酶放線菌及應用。
【背景技術】
[0002] 纖維素是自然界中分布最為廣泛、產量最為豐富的可再生資源，廣泛存在于植物 的根莖葉中。我國是農業(yè)大國，每年秸桿產量約為7億噸左右，秸桿中的主要成分為纖維素。 纖維素降解后可轉化為生物燃料、優(yōu)質飼料等物質。然而在自然界中，纖維素降解困難，主 要源于其特殊的結構。纖維素是由葡萄糖通過β_(1，4)糖苷鍵連接而成的線狀大分子聚合 物。纖維素酶是能夠將纖維素降解為葡萄糖的一類酶的總稱，根據其催化功能分為三大類： 1)葡聚糖內切酶(1，4-0-D-glucan glucanohydrolase):該酶能夠隨機切割纖維素多糖鏈 內的無定型區(qū)，產生不同長度的寡糖和新鏈末端；2)葡聚糖外切酶（l，4-i3-D-glucan cellobilhydrolase):作用于纖維素還原性和非還原性的纖維素多糖鏈的末端，產生葡萄 糖或纖維二糖;3)β_葡聚糖苷酶(β-l，4-glucosidase):該酶功能為水解纖維二糖產生葡萄 糖。由于纖維素酶的三個組分經過協同作用，將大分子的纖維素降解為低分子量的寡糖、雙 糖或多糖，而被廣泛應用于食品加工、釀造、造紙、飼料添加劑、紡織、醫(yī)藥等工農業(yè)領域。使 得纖維素酶成為酶制劑工業(yè)中的一個新的增長點。纖維素酶主要由微生物產生，受制于纖 維素酶制劑工業(yè)化生產的因素主要有菌種和酶活及產量，因而高酶活微生物的篩選和產酶 條件的優(yōu)化尤為重要。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種高效產纖維素酶放線菌及其應用。
[0004] 為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：
[0005] 一種高效產纖維素酶放線菌，放線菌（Streptomyces sp. )nC24,已于2015年12月 9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號院3號），其保藏編號為CGMCC No.11848。
[0006]所述產纖維素酶放線菌分離自粉碎的蘋果樹枝條自然發(fā)酵腐熟的木肩中，通過纖 維素酶活的測定及菌種鑒定表明，該菌是一株產酶能力強、纖維素酶活高的放線菌菌 (Streptomyces sp.)。對該菌進行16S rRNA基因序列分析，并通過在GenBank中比對發(fā)現， 本發(fā)明的放線菌擴增的 16S rRNA序列與Streptomyces diastaticus subsp.ardesiacus NRRL Β-1773τ(登錄號:KJ706443)相似性最高，為99%。從而將分離出來的放線菌菌命名為 Streptomyces sp.YIC24〇
[0007] 所述放線菌(Streptomyces sp. )YIC24在生產纖維素酶中的應用。
[0008] 進一步的說，將所述放線菌（Streptomyces sp. )YIC24于羧甲基纖維素鈉產酶培 養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得纖維素酶。
[0009] 更進一步的說，將所述放線菌（3奸6口加1117〇6 8 8。.）￥1024在。!1 = 7、羧甲基纖維素 鈉濃度為12.5g/L、NaN03濃度為5g/L的羧甲基纖維素鈉產酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得纖維素酶。 產酶培養(yǎng)基中酶活最強，濾紙酶活達21.68 ±0.67IU/mL，內切酶酶活達19.37 ± 1.26IU/mL， 外切酶酶活達29.21 ±0.98IU/mL。
[0010]本發(fā)明所具有優(yōu)點：
[0011] 1.本發(fā)明的放線菌YIC24具有產纖維素酶活高的特性，該菌在纖維素篩選平板上 降解圈/菌落直徑達到7.0，在發(fā)酵培養(yǎng)基中酶活較高，濾紙酶活為16.90±0.30IU/mL，內切 酶酶活為17.65 ± 1.35IU/mL，外切酶酶活為 21.62 ± 1.26IU/mL。
[0012] 2 ·經本發(fā)明優(yōu)化后，該菌產酶能力明顯提高，濾紙酶活為21 · 68±0 · 67IU/mL，內切 酶酶活為19.37 ± 1.26IU/mL，外切酶酶活為 29.21 ±0.98IU/mL。
[0013] 3.本發(fā)明菌株分離自秸桿腐熟發(fā)酵的秸桿中，屬于Streptomyces菌株，因而無毒 無害，未經遺傳改造，可放心應用到秸桿堆肥腐熟、秸桿還田、飼料加工、纖維素酶工程領域 中。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明實施例提供的菌株YIC24的菌落照片。
[0015] 圖2為本發(fā)明實施例提供的菌株YIC24產纖維素酶的剛果紅染色前照片。
[0016] 圖3為本發(fā)明實施例提供的菌株YIC24產纖維素酶的剛果紅染色照片。
[0017]圖4為本發(fā)明實施例提供的菌株YIC24培養(yǎng)條件優(yōu)化前后纖維素酶酶活
【具體實施方式】
[0018] 下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而 非以任何形式對本發(fā)明進行限制。
[0019] 實施例1:菌株YIC24的獲得
[0020]從粉碎的蘋果樹枝條堆肥腐熟物中采集約lg腐熟物，進行梯度稀釋，從ΠΓ1~10 _8,分別吸取l〇〇yL懸濁液進行涂布至羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基，28°C倒置培養(yǎng)3-5天，分 別挑取單菌落至PDA培養(yǎng)基平板，反復劃線直至純化后轉接至PDA培養(yǎng)基斜面(參見圖1)。將 純化后的菌株分別轉接至羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)3天，測定菌落直徑后，用lmg/ ml的剛果紅溶液染色lh，棄去染料，加入lmol/L的NaCl溶液脫色lh，然后用去離子水沖洗3-5遍后測定透明圈直徑。一般說來，比值的大小與菌株降解纖維素能力大小有關。水解圈和 菌株直徑的比值越大，菌株降解纖維素的能力越強，因此比值大小的定性試驗，直接反映了 菌降解纖維素的的能力。因此，本研究選取了水解圈和菌株直徑的比值最大的菌株YIC24作 為研究對象。
[0021] 羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉5g、KH2P〇4 lg、NaN〇3 3g、KCl 0.5g、 MgS〇4 0 · 5g、蒸餾水 1000ml、FeS〇4.7H200 · Olg，瓊脂粉15g。（調pH在5 · 5-6 · 0，于121°C， 0· llMpa下滅菌30min備用）。
[0022] PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g、葡萄糖20g、蒸餾水1000ml、1.5%瓊脂。（自然pH值， 于121°C，0. llMpa下滅菌30min備用）。1)菌株鑒定
[0023] 將上述純化獲得的產纖維素酶活高的菌株進行菌落觀察，在roA固體培養(yǎng)基上，菌 落產生白色氣生菌絲，為典型放線菌的表型特征。
[0024] 分子鑒定:為了確定本實施放線菌菌株YIC24的系統(tǒng)進化地位，對其16S rRNA基因 序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析。
[0025] 首先提取該菌株的基因組DNA，并擴增其16S rRNA的基因序列，PCR引物為27F: (AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG)，1492R:(AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG)，將PCR產物進行 測序并進行序列分析，表明，與Streptomyces diastaticus subsp.ardesiacus NRRL B-1773τ(登錄號:KJ706443)相似性最高為99%。
[0026] Streptomyces sp.YIC24的 16S rRNA基因序列：
[0027] ACCTTCGGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGG AAACGGGGTCTAATACCGGATACTGACCTGCCAAGGCATCTTGGCGGGTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCC CGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGC CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTG ATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGG TACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATT ATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCG ATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGG