專利名稱：聚合物吸附劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的具有選定孔隙度和滲透率特性的大孔聚合物，上述特性使得硬聚合物基質(zhì)適用于中壓和高壓反相液相色譜(RP℃)中。這些聚合物在大規(guī)模的色譜柱中特別適用作固定相，而在較長的使用時間內(nèi)不會增大壓力。
用于RPC，特別是高效制備方式(例如在生物分子分離和提純中所需的)的RPC中的固定相，必需在機械上是剛性的，以承受在色譜柱內(nèi)產(chǎn)生的高操作壓力。過去通常用于這些應用中的二氧化硅基質(zhì)，具有令人滿意的機械剛性；然而，二氧化硅基質(zhì)不能在高pH值條件下操作，這嚴重地限制了它們在生物分子分離等較寬領域的應用。這一因素限制了對于操作色譜工作人員來說是可能的提純選擇，并對二氧化硅介質(zhì)的使用壽命產(chǎn)生不利的影響(由于不能在苛刻的條件下清洗。因此它們分解更快)，導致商業(yè)化生產(chǎn)過程的總的經(jīng)濟性較差。
另一方面，基于有機聚合物的固定相，典型地可在非常寬的pH值條件下操作，更適用于生物分子的分離。色譜工作人員可選擇開發(fā)高pH值方法，這對于某些分子來說可提供例如改進的溶解性、選擇性和分離介質(zhì)的容量特性等益處。此外，聚合物樹脂還可以在苛刻的高pH值條件下進行清洗，由此提高了色譜柱的壽命，隨之改善了方法的經(jīng)濟性然而，在高效生物分子分離所用的中至高壓條件下，現(xiàn)在的聚合物固定相在某種程度上是可壓縮的。這種可壓縮性對于分離操作來說是有害的，因為它限制了可操作的流率范圍，并破壞了柱子中聚合物床體的整體性。例如，下述參考文獻公開了用于高壓分析操作的代表性柱條件(柱的內(nèi)徑小于0.5cm)的聚合物，其中“壁效應”對于減小聚合物的可壓縮性是公知的；然而，這些參考文獻沒有公開大規(guī)模的高壓商業(yè)化色譜柱操作，這時由于不存在壁效應，人們可以設想出其它的由聚合物的可壓縮性所導致的壓力聚集L1oyd，L. L. and Warner，F(xiàn). P.，Preparative High Performance LiquidChromatography on a Unique High-Speed Macroporous Resin，J.Chromatography，Vol. 512，pp 365-376(1990)；和 Lloyd，L. L.，RigidMacroporous Copolymers as Stationary Phases in High Performance LiquidChromatography，Review，J. Chromatography，Vol. 544，pp 201-217(1991)。
通常在非溶劑存在下由含二乙烯基苯(DVB)的單體混合物的懸浮聚合制得的大孔共聚物，使聚合物具有較寬的孔徑分布和表面積。例如，USP 4686269公開了一種用于分析級的液相色譜柱(內(nèi)徑為0.8厘米)的聚合物的制備方法，該聚合物的平均粒徑為0.5～50微米，并含有至少60％的多乙烯基芳族單體，該方法使用基于單體總重量為50～300％的有機助溶劑對單體進行聚合；該文獻并沒有公開具有選定的孔隙度和滲透率特性的聚合物的制備方法，上述特性使得硬聚合物基質(zhì)在通常生產(chǎn)級色譜柱，即內(nèi)徑為2～100厘米，典型地為5～80厘米的高壓使用條件下，不產(chǎn)生壓縮。
聚合物的可壓縮性轉(zhuǎn)移性地通過分離介質(zhì)限制了流動，在色譜體系中產(chǎn)生了額外的背壓，并最終使周期時間變長。需要這樣的一種聚合物固定相，在無明顯壓縮下，它可以承受在典型的RPC方法條件下所產(chǎn)生的中至高操作壓力。此外，對于某些目標類的生物分子來說，固定相還必需具有令人滿意的物質(zhì)遷移和容量特性，以產(chǎn)生所需的色譜效能。
本發(fā)明所提出的問題是，提供一種適用于生物分子分離和提純的大孔聚合物固定相，同時它在RPC過程中提供令人滿意的壓力和流動特性。
本發(fā)明提供一種含(a)50～100重量％的一種或多種多乙烯基芳族單體，和(b)0～50重量％的一種或多種單不飽和乙烯基芳族單體聚合單體單元的大孔聚合物；其中該聚合物(i)其總的孔隙度為0.7～2立方厘米每克；(ii)其操作中間孔隙度為0.7～1.9立方厘米每克；(iii)平均粒徑為2～600微米；(iv)表面積為200～1500平方米每克；(v)在10巴壓力下的流阻值為700至小于1800，在60巴壓力下的流阻值為1500至小于7000；和(vi)總的胰島素容量為75～150克胰島素/升聚合物，動態(tài)胰島素容量為60～150克胰島素/升聚合物。
在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的上述大孔聚合物(a)其表面積為400～1000平方米每克；(b)操作中間孔隙度為0.9～1.4立方厘米每克；(c)平均粒徑為10～75微米；(d)在10巴壓力下的流阻值為700至小于1500，在60巴壓力下的流阻值為1500至小于5000；和(e)總的胰島素容量為90～150克胰島素/升聚合物，動態(tài)胰島素容量為75～150克胰島素/升聚合物。
本發(fā)明還提供一種制備大孔聚合物的方法，該方法包括在100～170％的含疏水性致孔劑(porogen)和親水性致孔劑的致孔劑混合物，以及0.5～10％的自由基聚合引發(fā)劑存在下，在含水懸浮液中聚合0～50％的單乙烯基芳族單體和50～100％的多乙烯基芳族單體；其中所有的百分數(shù)均基于單體的總重量；并且(a)相對于疏水性致孔劑，存在的親水性致孔劑的重量比為大于1.2/1至3/1；(b)親水性致孔劑選自一種或多種(C4～C10)鏈烷醇，疏水性致孔劑選自一種或多種(C7～C10)芳烴和(C6～C12)飽和烴。
本發(fā)明還提供一種提純混合生物分子的水溶液的方法，該方法包括在內(nèi)徑為2～100厘米的液相色譜柱中，使水溶液與上述大孔聚合物相接觸，其中柱的操作壓力為10～100巴。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，可制備適用于通過高壓液相反相色譜進行大規(guī)模生物分子分離和提純的新的大孔聚合物，使其具有選定的孔隙度和滲透率特性。特別地，已發(fā)現(xiàn)在特定的聚合條件下，相對于單體相使用特定比例的特定致孔劑溶劑，可出人意料地制得本發(fā)明的硬聚合物基質(zhì)。新的大孔聚合物可用于高壓RPC中，而不會有明顯的可壓縮性和壓力聚集，同時對于目標生物分子來說可保持良好的產(chǎn)量和容量(動態(tài)的和平衡的)。
除非上下文有明確的說明，在整個說明書中所用的下述術語應具有下述含義。
術語“(甲基)丙烯酸烷基酯”是指相應的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯；類似地，術語“(甲基)丙烯酸”是指丙烯酸或甲基丙烯酸及其相應的衍生物，如酯或酰胺。除非另加說明，所有的百分數(shù)均是基于聚合物或所包含的組合物的總重量，以重量％表示。術語“共聚物”是指含兩個或多個不同單體單元，包括位置異構體的聚合物組成。這里使用下述縮寫g＝克；ppm＝(重量/體積)百萬分之一份，cm＝厘米，mm＝毫米，ml＝毫升，L＝升。除非另加說明，所列范圍應認為是包括的和可結合的，溫度為攝氏度(℃)。
相比于現(xiàn)有的材料，適于作RPC固定相的大孔聚合物具有改進的結構剛性使得這些聚合物可用于商業(yè)規(guī)膜的生產(chǎn)方法。通過使用選定的聚合條件對聚合物基質(zhì)的結構進行改性，可獲得改進的結構剛性。
在制備本發(fā)明的大孔聚合物中，改進聚合物基質(zhì)的孔隙度是很重要的。為有效地分離大的生物分子，固定相優(yōu)選具有可使分子快速擴散進入和擴散出基質(zhì)的開孔多孔結構。此外，較高的孔隙度水平提供了大的表面積，這反過來使得基質(zhì)對于目標分子來說具有較高的容量。最現(xiàn)代地，商業(yè)化的聚合物RPC固定相似乎應圍繞這些標準進行設計，并在低壓力條件下(典型地，從1巴至小于10巴，優(yōu)選1～5巴；1巴壓力＝105帕斯卡或105Pa)使用。然而，在較高壓力條件下(典型地10～100巴)，這些基質(zhì)是可壓縮的。本發(fā)明的大孔聚合物具有改進的聚合物剛性同時對于目標分子來說保持有較高的容量和快速的粒子內(nèi)擴散。
本發(fā)明的大孔聚合物適用于提純?nèi)芙庠谒芤褐械纳锓肿踊旌衔?，它是通過在內(nèi)徑為2～100，優(yōu)選5～80，更優(yōu)選10～50厘米的液相色譜柱中，在柱子的操作壓力為10～100，優(yōu)選20～80巴下，將所述溶液與大孔聚合物接觸。典型地制備級的RPC在20～80巴的壓力下，于10～50厘米的色譜柱中進行。
所選擇的聚合條件是制備本發(fā)明大孔聚合物的重要因素。選定的混合致孔劑相對于單體相的比例，以及親水性致孔劑相對于疏水性致孔劑的比例，據(jù)信是制得本發(fā)明大孔聚合物的關鍵參數(shù)。
盡管不想受理論的限制，但據(jù)信在本發(fā)明的情形下，應改變聚合物基質(zhì)的密度，使得每單位體積的總聚合物中含有更多的固體聚合物，由此增加基質(zhì)的剛性，進而提高對目標分子的容量。據(jù)信致孔劑相對于單體量，以及疏水性致孔劑相對于親水性致孔劑的平衡等的具體選擇，將以有利于結合目標分子(在這里即生物分子)同時提高基質(zhì)剛性的方式影響孔徑分布。
典型地，本發(fā)明的交聯(lián)大孔共聚物為平均粒徑是2～600微米(μm)的球形共聚物珠粒。適用于通過高效反相液相色譜法(例如柱子的直徑為2～100cm)分離并提純生物分子的聚合物，典型地其平均粒徑為2～150，優(yōu)選5～100，更優(yōu)選10～75，最優(yōu)選10～30 μm。適用于通過大規(guī)模的吸附法(例如柱子的直徑上至幾米，或者以發(fā)酵原汁清湯的方式)分離生物分子的聚合物，典型地其平均粒徑為大于150至600，優(yōu)選200～500，更優(yōu)選250～400μm。
典型地，通過懸浮聚合法制得本發(fā)明的大孔聚合物，且該大孔聚合物的表面積為200～1500，優(yōu)選300～1200，更優(yōu)選400～1000平方米每克(m2/g)。優(yōu)選大孔聚合物例如為USP 4382124中所公開的那些類型，其中在致孔劑(也稱作“相增量劑”或“沉淀劑”)，即為單體的溶劑但為聚合物的非溶劑存在下，通過懸浮聚合在共聚物珠粒中引入孔隙。通常的大孔聚合物，如按照USP 4382124所制備的那些聚合物，典型地包括使用大范圍的致孔劑類型、致孔劑相對于單體相的濃度、單體類型、交聯(lián)劑類型、交聯(lián)劑用量、聚合引發(fā)劑以及引發(fā)劑濃度。然而，本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)使用某些選定的致孔劑類型、以特定的相對于單體相的濃度使用、特定的單體和選定量的交聯(lián)劑、以及選定的聚合引發(fā)劑的濃度制得的大孔聚合物，在通過高效反相液相色譜法分離并提純生物分子中，具有意想不到的相應于改進性能的剛性聚合物結構。
可用于適用于本發(fā)明的大孔聚合物制備中的適宜的多乙烯基芳族單體包括，例如選自二乙烯基苯、三乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基萘、二乙烯基蒽和二乙烯基二甲苯的一種或多種單體；應當理解的是，上述每一交聯(lián)劑的任何位置異構體也是適宜的；優(yōu)選的多乙烯基芳族單體是二乙烯基苯、典型地，大孔聚合物含有50～100％，優(yōu)選65～100％，更優(yōu)選75～100％的多乙烯基芳族單體單元。
除多乙烯基芳族交聯(lián)劑外，任選地還可使用脂族交聯(lián)劑，如二丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、三羥甲基丙烷三丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯、二乙二醇二乙烯基醚和三乙烯基環(huán)己烷。當使用脂族交聯(lián)單體時，基于總的形成大孔共聚物的單體重量，作為聚合單元其典型含量為大孔聚合物的0～20％，優(yōu)選0～10％，更優(yōu)選0～5％。
可用于適用于本發(fā)明的大孔共聚物制備中的適宜的單不飽和乙烯基芳族單體包括，例如苯乙烯、α-甲基苯乙烯、(C1～C4)烷基取代的苯乙烯、鹵素取代的苯乙烯(如二溴苯乙烯和三溴苯乙烯)、乙烯基萘和乙烯基蒽；單不飽和乙烯基芳族單體優(yōu)選選自一種或多種苯乙烯和(C1～C4)烷基取代的苯乙烯。適宜的(C1～C4)烷基取代的苯乙烯包括，例如乙基乙烯基苯、乙烯基甲苯、二乙基苯乙烯、乙基甲基苯乙烯和二甲基苯乙烯，應當理解的是，上述每一乙烯基芳族單體的任何位置異構體也是適宜的；優(yōu)選的單不飽和乙烯基芳族單體是乙基乙烯基苯。典型地，大孔聚合物含有0～50％，優(yōu)選0～35％，更優(yōu)選0～25％的單不飽和乙烯基芳族單體單元。
除乙烯基芳族單體外，任選地還可使用非芳族乙烯基單體，如脂族不飽和單體，例如氯乙烯、丙烯腈、(甲基)丙烯酸和(甲基)丙烯酸的烷基酯((甲基)丙烯酸烷基酯)。當使用非芳族的乙烯基單體時，基于總的形成大孔共聚物的單體重量，作為聚合單元其典型含量為大孔聚合物的0～20％，優(yōu)選0～10％，更優(yōu)選0～5％。
優(yōu)選的大孔聚合物選自一種或多種二乙烯基苯共聚物、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，二乙烯基苯-乙基乙烯基苯共聚物，和苯乙烯-乙基乙烯基苯-二乙烯基苯共聚物；更優(yōu)選的是二乙烯基苯-乙基乙烯基苯和苯乙烯-乙基乙烯基苯-二乙烯基苯聚合物。
適用于制備本發(fā)明的大孔聚合物的致孔劑包括疏水性致孔劑，如(C7～C10)芳烴和(C6～C12)飽和烴；以及親水性致孔劑，如(C4～C10)鏈烷醇和多亞烷基二醇。適宜的(C7～C10)芳烴包括例如一種或多種甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯；應當理解的是，上述每一烴的任何位置異構體也是適宜的。優(yōu)選的芳烴為甲苯或二甲苯、或二甲苯的混合物，或甲苯和二甲苯的混合物。適宜的(C6～C12)飽和烴包括例如一種或多種己烷、庚烷和異烷；優(yōu)選的飽和烴為異辛烷。適宜的(C4～C10)鏈烷醇包括例如一種或多種異丁醇、叔戊醇、正戊醇、異戊醇、甲基異丁基甲醇(4-甲基-2-戊醇)、己醇和辛醇；優(yōu)選的鏈烷醇選自一種或多種(C5～C8)鏈烷醇，如甲基異丁基甲醇和辛醇。優(yōu)選地，致孔劑混合物含有選自一種或多種(C5～C8)鏈烷醇的親水性致孔劑和選自一種或多種(C7～C10)芳烴的疏水性致孔劑。
典型地，基于單體的重量，用于制備本發(fā)明聚合物的致孔劑的總量為100～170％，優(yōu)選110～160％，更優(yōu)選115～150％，最優(yōu)選120～140％。當致孔劑的用量大于170％時，填充柱中在高壓條件下，聚合物具有較差的流阻值(高可壓縮性)；當致孔劑的用量低于100％時，聚合物具有較差的色譜性能(如在柱子的流通測試中由胰島素容量測定的)。此外，用于制備本發(fā)明聚合物的致孔劑是基于混合的溶劑體系，該體系含有疏水性溶劑(“疏水性”致孔劑)和疏水性較低的溶劑(“親水性”致孔劑)。應當理解的是，親水性致孔劑具有一定的有限的水溶解度(例如0.5～5％)，它比疏水性致孔劑(典型地水溶解度為10～100ppm或更小)具有更大的水溶性。
典型地，親水性致孔劑與疏水性致孔劑的比例為大于1.2/1至3/1，優(yōu)選1.3/1至2.7/1，更優(yōu)選1.4/1至2.5/1，最優(yōu)選1.6/1至2.4/1。當親水性/疏水性致孔劑的比例為約1.2/1和更低時，聚合物具有可接受的流阻性能，同時其色譜性能(在胰島素容量測試中由受限的質(zhì)量傳遞進入值測定)降低。當親水性/疏水性致孔劑比例大于3/1時，聚合物的總的容量性能(在柱子流動測試過程中由降低的胰島素吸附量測定)將降低。典型地，混合致孔劑含有(C7～C10)芳烴和(C4～C10)鏈烷醇；優(yōu)選地，混合致孔劑含有二甲苯和甲基異丁基甲醇。
適用于制備本發(fā)明聚合物的聚合引發(fā)劑包括單體可溶性引發(fā)劑，如過氧化物、氫過氧化物和相關的引發(fā)劑；例如過氧化苯甲酰，叔丁基過氧化氫。過氧化二異丙苯，過氧化四氫苯，過氧化乙酰，過氧化丙酰，過辛酸叔丁酯(也稱作叔丁基過氧-2-乙基己酸酯)，過辛酸叔戊酯，過苯甲酸叔丁酯，二過對苯二甲酸叔丁酯，過氧化二碳酸二環(huán)己酯，二(4-叔丁基環(huán)己基)過氧化二碳酸酯和過氧化甲乙酮。同樣適用的還有偶氮引發(fā)劑，如偶氮二異丁腈，偶氮二異丁酰胺，2，2’-偶氮二C，4-二甲基戊腈)，偶氮二(α-甲基丁腈)，以及二甲基-、二乙基或二丁基偶氮二(甲基戊酸酯)。優(yōu)選的過氧化物引發(fā)劑為過氧化二?；?，如過氧化苯甲酰，和過氧酯如過辛酸叔丁酯和過苯甲酸叔丁酯；更優(yōu)選的引發(fā)劑為過氧化苯甲酰?；谝蚁┗鶈误w的總重量；過氧化物引發(fā)劑的適宜用量為0.5～10％，優(yōu)選1～9％，更優(yōu)選2～7％，最優(yōu)選3～5％。最優(yōu)選地，基于單體的總重量，自由基引發(fā)劑的存在量為2～7％，且選自一種或多種過氧化二酰基和過氧酯。
適用于制備本發(fā)明大孔聚合物的分散劑和懸浮劑為具有羥烷基纖維素主鏈和含1～24個碳原子的疏水性烷基側(cè)鏈的非離子表面活性劑，其中平均1～8個優(yōu)選1～5個氧化乙烯基團取代了羥烷基纖維素主鏈的每一重復單元，烷基側(cè)鏈的存在量為，每100個羥烷基纖維素主鏈中的重復單元含有0.1～10個烷基基團。羥烷基纖維素中的烷基基團可含有1～24個碳原子，且可以為線性、支化或環(huán)狀的。更優(yōu)選的是每100個葡糖酐單元含有0.1～10個(C16)烷基側(cè)鏈、且大約2.5～4個氧化乙烯基團取代了每一葡糖酐單元的羥乙基纖維素?；诳偟乃嘀亓浚稚┑牡湫陀昧繛榧s0.01～4％。
其它適用于制備本發(fā)明大孔聚合物的分散劑和懸浮劑為含有親水性主鏈的聚合物，它們可在兩相的界面處使其親油部分取向于單體相并使其親水部分取向于水相。這些聚合物分散劑包括纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇和淀粉等。也可以使用分散劑的混合物。這些其它的分散劑是次優(yōu)選的，因為它們傾向于制得某些程度上更大量的聚結的或其它不期望的物質(zhì)。
一種典型的大孔共聚物的制備例如可包括，制備含懸浮助劑(如分散劑、保護膠體和緩沖劑)的連續(xù)水相溶液，然后與單體混合物混合，其中單體混合物含有50～100％的多乙烯基芳族單體、自由基引發(fā)劑和基于每一份單體混合物為1～1.7份的混合致孔劑(疏水性和親水性致孔劑)。然后將單體/混合的致孔劑混合物在升高的溫度下聚合(典型地例如為40～120℃，優(yōu)選60～100℃；聚合1～20小時，優(yōu)選3～15小時)，隨后從所得的聚合物珠粒中通過各自方式將致孔劑除去；例如對于甲苯、二甲苯和(C4～C10)醇，可通過蒸餾或溶劑洗滌除去，對于多亞烷基二醇可通過水洗除去。然后通過通常的方式，如脫水隨后干燥，分離出所得的大孔共聚物。
任選地，大孔聚合物的制備可包括酶處理，以凈化殘留有聚合過程中所用分散劑和懸浮劑的聚合物表面。酶處理典型地包括在聚合過程中、聚合后或聚合物分離后，將大孔聚合物與酶材料(選自一種或多種纖維素分解酶和蛋白水解酶)接觸。在關于聚合物樹脂的制備過程中使用酶的問題，可進一步一般性地和具體地詳細參考日本專利申請61-141704和57-98504。適宜的酶包括，對于基于纖維素的分散劑體系例如為纖維素分解酶，如β-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖基水化酶，β-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，β-1，4-葡聚糖-4-葡萄糖水化酶，和β-1，4-葡聚糖-4-纖維素生物水化酶；對于基于明膠的分散劑體系例如為蛋白水解酶，如尿激酶、彈性蛋白酶和腸激酶。典型地，基于總的聚合物重量，相對于聚合物所用酶的量為2～35％，優(yōu)選5～25％，更優(yōu)選10～20％。
本發(fā)明的大孔聚合物特別適用于填充色譜柱應用，其中聚合物的孔隙度和機械強度使得允許在高產(chǎn)出速率下進行高效生物分子分離和提純，而不會在較長的使用中產(chǎn)生壓力集結。
任選地，還可對大孔聚合物進行涂敷，或者通過公知的方法如通常的磺化、氯甲基化和胺化法等，用各種通常可離子化的官能團(弱酸官能團，如羧酸基團；弱堿官能團，如伯、仲或叔胺官能團；強酸官能團，如磺酸基團；強堿官能團，如氯化或羥基化季銨鹽基團)對大孔聚合物進行后功能化處理。
本發(fā)明大孔聚合物的特征在于改進的滲透性能(低流阻)，這是提高的剛性聚合物結構和選定的在聚合過程中引入到聚合物中的孔隙度的結果。由達西定律(方程1)，滲透率(K)與柱中產(chǎn)生的背壓有關ΔP＝μV/[K(dp)2] 方程1其中μ＝粘度(毫帕斯卡.秒或厘泊)V＝線性粘度(cm/hr)ΔP＝壓力降(巴)dp＝聚合物的平均粒徑(微米)上述各變量的單位以其通常的方式表達；應當理解的是，需要單位轉(zhuǎn)化以使方程1無量綱。聚合物的剛性越大(即可壓縮性較小)，則聚合物的滲透率越大，對于任何給定的溶劑粘度、線性速度和粒徑的結合，則轉(zhuǎn)化成較低的背壓。在對于色譜分離和提純應用來說為典型的層流條件下，柱中的背壓還可通過Carman-Kozeny方程(方程2)來表達ΔP＝150·[(1-ε)2/ε3]·μV/(dp)2方程2其中ε＝粒子間的空隙體積(cm3/cm3)關于達西定律和Carman-Kozeny方程(方程1和2)，可一般性地和具體地參考例如Fundamentals of Preparative and Nonlinear Chromatography，G.Guiochon，S. Goshan Shirazi and A. Katti；Academic Press(1994)and Unit0perations in Chemical Engineering，W.L. McCabe，J.C. Smith and P.Harriott；McGraw Hill(1985)。
結合方程1和2可以看出，色譜柱中的滲透率(或流阻)與聚合物樹脂床的粒子間空隙體積(即聚合物粒子之間的體積)有關；ε表示每單位體積聚合物床的空隙體積。該關系由方程3表示1/K＝150·[(1-ε)2/ε3] 方程3在本發(fā)明中，定義聚合物的“流阻”值為滲透率的倒數(shù)?！傲髯琛敝祵⒈砻骶酆衔镌谥兄粮邏簵l件下的表現(xiàn)低流阻值表示可壓縮性低，高流阻值表示可壓縮性差。
此外，按照達西定律，滲透率或者流阻的表達中均包括粒徑的影響(方程1中的dp)。本發(fā)明的一個目的是通過提高聚合物的剛性來改進流阻，而不考慮粒徑的影響。應當理解的是，由方程1和2所示的，對于給定的聚合物，僅較小粒徑將產(chǎn)生更高的背壓。
典型地，本發(fā)明的大孔聚合物在10巴的操作壓力下(中壓)，其流阻值(即1/K)為700～小于1800，優(yōu)選700至小于1500，更優(yōu)選小于1300。在高壓(以60巴為代表)操作下，大孔聚合物的流阻值為1500至小于7000，優(yōu)選1500至小于5000，更優(yōu)選小于4500。適用于RPC的大孔聚合物，(i)在10巴的壓力下其流阻值小于1800，(ii)在60巴的壓力下其流阻值小于7000。在商業(yè)RPC柱的中壓至高壓下，流阻值超過上述范圍的聚合物，不能提供足夠的抗壓縮性，隨之帶來的問題是在操作過程中產(chǎn)出降低。柱壓集結。
本發(fā)明大孔聚合物的特征在于由用于制備聚合物的致孔劑類型和比例所產(chǎn)生的選定的孔隙度和孔徑分布。用MicronereticsTMASAP-2400氮氣孔隙測試儀測定孔隙度。按照IUPAC命名原則，孔隙度如下定義
微孔＝小于20埃的孔中孔＝20～500埃的孔大孔＝大于500埃的孔在本發(fā)明中，“操作上的”微孔定義為直徑小于50埃的孔，“操作上的”中孔定義為直徑在50～500埃之間的孔。這里所用的“操作上”的孔隙度與按照IUPAC命名原則所定義的孔隙度的微小差別，是由于這樣的事實，即在本發(fā)明的大孔聚合物中，為容納感興趣的生物分子的吸附，50埃是一個更適宜和接近的截止點(相對于20埃)。
典型地，本發(fā)明大孔聚合物的總的孔隙度為0.7～2，優(yōu)選0.9～1.8，更優(yōu)選1.0～1.7cm3/g。典型地，大孔聚合物的操作上的中孔隙度為0.7～1.9，優(yōu)選0.8～1.7，更優(yōu)選0.9～1.4cm3/g。典型地，大孔聚合物的操作上的微孔隙度為0～0.5，優(yōu)選0～0.3，更優(yōu)選0～0.2，最優(yōu)選0至小于0.1cm3/g。典型地，大孔聚合物的大孔隙度為0～0.6，優(yōu)選0～0.5，更優(yōu)選0～0.3cm3/g。以總?cè)萘康男问?，若大孔隙度值大于約0.6cm3/g，則對于目標分子尺寸和形狀的生物分子來說，聚合物的工作容量降低。
對于大規(guī)模分離和提純具有類似尺寸和分子構型的生物分子來說，用胰島素容量作為用作適宜介質(zhì)的聚合物基質(zhì)的容量的指示。本發(fā)明大孔聚合物的動態(tài)胰島素容量為60～150g/L，優(yōu)選70～150g/L，更優(yōu)選75～150g/L。該大孔聚合物的總胰島素容量一般為75～150g/L，優(yōu)選為80～150g/L，更優(yōu)選為90～150g/L。動態(tài)容量是衡量聚合物基質(zhì)可以多么快速地吸收生物分子的一個量度，并定義為當出現(xiàn)1％漏失(相對于吸附在聚合物上的總的胰島素)時的漏出點處的胰島素容量。胰島素容量以g/L定義，即克胰島素/升聚合物樹脂。適用于高效、大規(guī)模生物分子的制備色譜的本發(fā)明的大孔聚合物，典型地，其動態(tài)和總的胰島素容量值分別為60和75g/L；優(yōu)選分別為70和80g/L；更優(yōu)選分別為75和90g/L。
對于一種給定的生物分子(例如胰島素)，聚合物樹脂的總的容量是很明顯的，因為它與提純過程中可負載在柱子上的特定分子的質(zhì)量有關。對于提純方法來說很重要的首要經(jīng)濟因素(柱子的產(chǎn)出、溶劑的用量、工作或時間周期)與負載在柱子上的質(zhì)量直接相關。
聚合物樹脂的動態(tài)容量是很重要的，因為對于特定的分子，它與聚合物的傳質(zhì)效率有關，并且它指示了提純可進行的時間表度。較低的動態(tài)容量說明聚合物基質(zhì)不適于高速提純方法。
在下述實施例中詳細說明了本發(fā)明的一些實施方案。除非另加說明，所有的比例、份數(shù)和百分數(shù)均以重量計，所有所用的試劑均具有良好的商業(yè)質(zhì)量。連同相應的說明，下面列出了實施例和表中所用的縮寫MIBC＝甲基異丁基甲醇(4-甲基-2-戊醇)DVB＝二乙烯基苯(間/對異構體的混合物)EVB＝乙基乙烯基苯(間/對異構體的混合物)BPO＝過氧化苯甲酰rpm＝每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)v/v＝體積/體積w/v＝重量/體積μm＝微米nm＝納米g/L＝克/升cm3/g＝立方厘米/克μl＝微升NA＝未分析通過混合下述組分在一1升的燒杯中制備有機單體相180g二乙烯基苯混合物(80％DVB/20％EVB)，73g鄰二甲苯，147gMIBC，和10.6gBPO(純度75％，25％水)。這些量對應于122％的混合致孔劑(基于總的單體)，親水性致孔劑/疏水性致孔劑比例為2.0，以及4.5％的自由基引發(fā)劑BPO(基于總的單體)。在氮氣氣氛下將該混合物攪拌20分鐘。
向一配有冷凝器、機械攪拌器、熱電偶和氮氣導入口的2升4頸反應燒瓶中，通過混合下述組分制備水溶液783g去離子水，5.0g CulminalTMMHEC-8000(甲基羥乙基纖維素，由Hercules Chemical Company得到，20℃下2％水溶液的粘度為8000毫帕斯卡.秒(mPa·s＝厘泊，cP))，0.158g十二烷基硫酸鈉，2.94g 50％的氫氧化鈉(水溶液)和3.13g硼酸。在將溫度迅速升高至80℃的同時，以250rpm的速度攪拌溶液，保持1小時。然后通過反應器的空氣冷卻在30分鐘內(nèi)將溶液冷卻至室溫。在固體反應物完全溶解后，停止攪拌并將有機相(上述制備的)加入到反應燒瓶中。
將反應混合物(混合的有機相和水相)在室溫下以300rpm的速度攪拌20分鐘，然后經(jīng)47分鐘加熱到80℃。將反應混合物保持在80℃12小時，以使反應物聚合。然后將反應混合物轉(zhuǎn)移到配有攪拌的壓力容器中，并在100℃下加熱5小時，以將剩余的反應物轉(zhuǎn)化并完成聚合。
聚合反應完成后，在攪拌的同時調(diào)節(jié)反應混合物的溫度至50℃。通過加入約3g硼酸，然后緩慢加入10％的硫酸(水溶液)，調(diào)節(jié)水/聚合物混合物的水相pH值直至最終pH值調(diào)節(jié)至5.0。經(jīng)24小時，以4等重量份，通過將酶粉末撒入反應器中，而向水/聚合物混合物中加入總量為25.0g的β-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(CellulaseTM4000，由Valley Research，Inc.得到)。在酶處理的過程中溫度保持在50℃。然后用50％的氫氧化鈉(水溶液)將水/聚合物混合物的水相pH值調(diào)節(jié)至12.0，并將溫度升高至90℃，保持2小時。將水/聚合物混合物冷卻至室溫，從燒瓶中移出，并放入到1升色譜柱中。從聚合物中過濾掉水相，然后用2升去離子水洗滌聚合物的填充床，然后用3.5升丙酮并最后用7升去離子水洗滌。然后在2.5mm(0.1英寸)汞柱真空下，于100℃對水潤濕的聚合物干燥16小時。
按照上述制備聚合物1-4～1-11，所不同的是如表1所列改變了致孔劑百分數(shù)、MIBC/二甲苯比例和％BPO；聚合物樣品1-6相應于上述的描述。表1中所列的所有帶有后綴“C”的聚合物均被認為是與本發(fā)明進行對比的聚合物。聚合物樣品1-5～1-9被認為是本發(fā)明大孔聚合物的代表。聚合物樣品1-12C、1-13C和1-14C為商品可得的色譜級多乙烯基芳族聚合物，它們與按照上述制備的聚合物樣品一起進行評價。
商品聚合物1-12C為30μm粒徑的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)材料，由Amersham-Pharmacia Company，Uppsala，Little Chalfont，UK，以SourceTM30RPC獲得。商品聚合物1-13C為15μm粒徑的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)材料，由Amersham-Pharmacia Company，Uppsala，Little Chalfont，UK，以SourceTM15RPC獲得。商品聚合物1-14C為15μm粒徑的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)材料,由Polymer Labs Ltd.，Shropshire，UK.，以PLRP-S 300獲得該實施例描述了對本發(fā)明的大孔聚合物的胰島素結合量的評價。將約5ml體積的樣品填充到小級別的測試柱(內(nèi)徑1.0cm，長度6.3cm)中，并評價其從水溶液中對牛胰島素的正面吸附；設計該測試的目的是要確定聚合物基質(zhì)是否允許在典型的使用條件下，對目標探針分子(例如胰島素)可進行快速有效的傳質(zhì)并具有高的容量。此外，將約20m1體積的樣品填充到大一些級別的測試柱(內(nèi)徑1.0cm，長度25cm)中，并進行胰島素的分級/分離；用該測試來證實聚合物基質(zhì)在典型的方法條件下具有令人滿意的性能。
將5克干燥的聚合物樹脂(除非另加說明，均按照實施例1制備)與35ml 20％的乙醇/水(v/v)混合，并使其在室溫下放置至少2小時。然后以150cm/hr的線速度，通過以20％v/v乙醇/水溶液進行流動填充，而將聚合物漿液填充到0mnifitTM玻璃柱中(尺寸6.3cm長，10m內(nèi)徑，由Millipore Corp.獲得)。通過向柱中注入50μL于去離子水中的1％氯化鈉溶液脈沖，同時以40cm/hr的線速度使20％v/v乙醇/水洗脫液流動，來證實柱子填充的質(zhì)量。用HewlettPackard ChemstationTM軟件計算柱子的效率(塔板數(shù)/米)和不對稱性?？山邮艿闹畛鋮?shù)的目標值為，效率最小是5000塔板/米，不對稱性為0.8～1.8。
以5克/升水的濃度制備牛胰島素(由Sigma Chemical Co獲得)溶液。以150cm/hr的線速度將總量為200ml的該溶液泵入到柱中，用UV分光光度儀(SpectraflowTM783，由ABI Analytical，Kratos division獲得)，在291nm波長處檢測流出液中牛胰島素。
通過在UV相應曲線中，記錄下在1％胰島素漏失點(相對于吸附在聚合物樹脂上的總的胰島素的量)處吸附在聚合物樹脂上的胰島素的量，得到聚合物樹脂的動態(tài)容量(g/L)。通過用UV分光光度儀測定流入液和流出液的胰島素濃度，然后進行質(zhì)量平衡，來確定樹脂的總的容量(g/L)。結果總結于實施例3的討論中。
在工業(yè)化的高壓液相色譜中，經(jīng)常使用配有活塞的柱子，該活塞直接在樹脂上施加力(壓力)。優(yōu)選使活塞保持主動地壓縮床體，其壓力為等于或大于整個色譜周期中的最大預期流動壓力。為測試本發(fā)明聚合物的滲透率性能，將聚合物樹脂填充到ProChromTMDynamic Axial Compression柱(型號LC.50)中，并用開始設定為10巴，然后設定為60巴壓縮壓力的活塞進行壓縮。該測試的目的是表征每一樣品的滲透率性能(抗壓縮性)。詳述如下將大約100克干燥的聚合物樹脂(相當于大約500ml濕的樹脂)加入到700m120％乙醇/水(v/v)溶液中，并將其在室溫下放置至少2小時。將該聚合物樣品攪拌成漿液形式，并倒入5cm(內(nèi)徑)×54cm(長度)ProchromTMDynamic AxialCompression L.C.50 316L不銹鋼柱子(由Prochrom S.A.，F(xiàn)rance制造)中。使一活動的活塞部件(由轉(zhuǎn)化為水壓的外部氣壓驅(qū)動)在聚合物樹脂床上施加可變的壓力。首先將活塞設定為傳遞約10巴的水壓；當活塞不再移動時，認為樹脂床被壓縮。然后測量床體的高度。使10ml 20％乙醇/水(v/v)溶液流過樹脂床30分鐘，以使床體達到平衡。
通常，為測定聚乙烯基芳族聚合物床體的粒子間空隙體積(或者滲透率)，出于與探針分子的相容性考慮，必須選擇移動相以使其消除或降低探針分子與聚乙烯基芳族聚合物的疏水性表面之間的相互作用?？墒褂猛ǔ５奶结樂肿?，如線性聚苯乙烯、Blue葡聚糖和聚乙二醇，但需要使用非極性移動相(如四氫呋喃和甲苯)。然而在下述方法中使用的探針分子，不需要使用非極性溶劑，并可用于任何水-有機溶劑體系中，例如20％的乙醇。
為測定柱子中總的空隙體積(粒子內(nèi)的和粒子間的)，向體系中注入2ml 1％氯化鈉(w/v，在20％的含水乙醇中)。用電導率檢測器檢測鹽。為僅測定粒子間空隙的體積，將含1％(w/v)0.1～0.9μm的離子化乳液聚合物或研細的離子化聚合物(例如帶有可離子化官能團的交聯(lián)聚苯乙烯，可離子化官能團例如為弱酸官能團(羧酸鹽基團)，強酸官能團(磺酸鹽基團)，或氯化季銨鹽基團)的20％乙醇(含水)溶液，注入到流過床體的20％乙醇(含水)細流中。通過設在280nm處的UV檢測器檢測這些粒子。由于離子化聚合物探針粒子的尺寸，這些粒子不能穿過本發(fā)明聚合物樹脂的孔隙。由于離子化聚合物探針粒子的表面性質(zhì)(這些粒子具有芳族結構，且具有高濃度的分布于整個表面上的離子型基團)，因此可防止對本發(fā)明聚合物樹脂的疏水性吸引/持留。
測定聚合物床體的總的空隙體積(鹽探針洗脫體積)，并將其與聚合物粒子外的空隙體積(離子化的乳液或研細的聚合物洗脫體積)相結合。用這些值及測定的床體積，計算方程2和3中的ε。在10巴下測試后，再進行同樣的60巴下的評價。
表1列出了本發(fā)明大孔聚合物(聚合物1-5至1-9)和各種對比聚合物(帶后綴C的聚合物)的流阻值和胰島素容量。參見實施例1中有關聚合物及其在表中相應確認的詳細描述。表1中的項包括的致孔劑的百分數(shù)(基于總的單體)，親水性致孔劑/疏水性致孔劑的比例(MIBC/二甲苯)，以及用于制備聚合物的自由基引發(fā)劑的百分數(shù)(基于總的單體)；在中壓和高壓下的以g/L表示的胰島素容量，以及流阻值；在每一給定聚合物樣品的胰島素容量和流阻值之后的、作為附帶說明的( )項，給出了按照相同方法(相同的致孔劑百分數(shù)、親水性致孔劑/疏水性改孔劑比例、和％BPO)制備的不同聚合物的數(shù)目，對這些不同的聚合物進行測試并進行平均，得到表1中所示的胰島素容量和流阻值。表2中就選定的樣品還給出了其它的聚合物性能(表面積、孔隙度)。
對比聚合物1-1C說明，致孔劑的用量太高使得高壓下的壓縮性不能令人滿意，而聚合物1-10C和1-11C說明，致孔劑用量太低。雖然可獲得令人滿意的壓縮性(低流阻值)，卻使胰島素容量極低。對比聚合物1-1C、1-2C和1-3C說明，降低致孔劑的用量傾向于改善流阻性能；但高壓操作下的流阻性能仍不能令人滿意。此外，低百分數(shù)的致孔劑和低MIBC/二甲苯比例結合時(對比聚合物1-4C)，動態(tài)胰島素容量不能令人滿意。
聚合物1-5至1-9是出入意料的高胰島素容量和低流阻性能(高壓下)相結合的代表，這是通過將用于制備本發(fā)明聚合物的致孔劑百分數(shù)和親水性致孔劑/疏水性致孔劑比例參數(shù)進行平衡得到的。
商品聚合物樣品1-12C和1-13C其壓縮性能均不能接受，盡管聚合物1-12C具有足夠的胰島素容量性能。盡管商品聚合物1-14C具有在邊緣上可接受的壓縮性能，但其胰島素容量仍低于可接受的值表1流阻和胰島素容量
表2其它的聚合物性能
實施例4該實施例描述了制備本發(fā)明的大孔聚合物時進行和不進行酶處理的影響。聚合物在使用中由于聚合物的表面污染(例如離子或帶電荷的物質(zhì))所導致的珠粒間不期望的吸引力，有時會發(fā)生結塊或聚結，酶處理會減小聚合物樹脂的結塊或聚結。使用酶處理的一個特別優(yōu)點是，所得的球形聚合物粒子不會聚結，即粒子不會相互黏附形成結塊。據(jù)信酶處理會從聚合物珠粒的表面清洗和除去微量的分散劑和懸浮助劑(在聚合過程中使用的)，由此使聚合物珠粒在柱子中流動自由且填充均勻，使床體積最小化，并導致使用中的壓力降較低。
按下述處理以類似于實施例1所述方法制備的5個不同的大孔聚合物樣品用纖維素酶處理(描述如下)4個部分(4A-4D)，一個樣品(4E)不用纖維素酶處理；評價樣品的沉降性能。將每一聚合物樹脂樣品(3.5克干燥的，相當于大約25ml濕分散的體積)稱重加入到25ml量筒中。向每一量筒中加入20ml20％的乙醇(含水)。然后用玻璃棒攪拌量筒得到漿液，并使該混合物沉降約16小時或過夜。然后再用玻璃棒攪拌試樣直至完全混合。樣品混合后，取出玻璃棒并用20％的乙醇(含水)洗滌，調(diào)節(jié)量筒中的總體積至25.0ml(使用大約0.5ml20％的乙醇進行洗滌并調(diào)節(jié)每一樣品)。然后觀察樣品4天，并記錄下作為時間函數(shù)的沉降床的體積(樹脂)。結果列于表3中。聚合物4A的酶處理(在高溫固化之前)將大約250ml漿液狀的樹脂(含150ml樹脂)加入到配有冷凝器、機械攪拌器、熱電偶和氮氣導入口的2升4頸燒瓶中。向該漿液中加入100ml去離子水，用硼酸將其pH值調(diào)節(jié)至5.0，然后向漿液中加入28g CellulaseTM4000(聚合物的19％)。將該混合物加熱至37℃并攪拌3小時。然后將反應混合物轉(zhuǎn)移到配有攪拌的壓力容器中，并在100℃下加熱5小時。將水/聚合物混合物冷卻至室溫，從燒瓶中取出并放入到1升色譜柱中。從聚合物中過濾掉水相，并用7升去離子水，然后用3.5升丙酮，最后用7升去離子水對聚合物的填充床進行洗滌。然后在2.5mm汞柱下，于100℃對水潤濕的聚合物干燥16小時。聚合物4B的酶處理(高溫固化后溶劑洗滌前)將大約250ml漿液狀的樹脂(含150ml樹脂)轉(zhuǎn)移到配有攪拌的壓力容器中，并在100℃下加熱5小時。將水/聚合物混合物冷卻至室溫，并轉(zhuǎn)移至配有冷凝器、機械攪拌器、熱電偶和氮氣導入口的2升4頸燒瓶中。向該漿液中加入100m1去離子水，用硼酸將其pH值調(diào)節(jié)至5.0，然后向漿液中加入28gCellulaseTM4000(聚合物的19％)。將該混合物加熱至37℃并攪拌3小時，從燒瓶中取出并放入到1升色譜柱中。從聚合物中過濾掉水相，并用7升去離子水，然后用3.5升丙酮，最后用7升去離子水對聚合物的填充床進行洗滌。然后在2.5mm汞柱真空下，于100℃對水潤濕的聚合物干燥16小時。聚合物4C的酶處理(高溫固化后，溶劑洗滌后，溶劑再洗滌之前)將大約250ml漿液狀的樹脂(含150ml樹脂)轉(zhuǎn)移到配有攪拌的壓力容器中，并在100℃下加熱5小時。將水/聚合物混合物冷卻至室溫，從燒瓶中取出并放入到1升色譜柱中。從聚合物中過濾掉水相，并用7升去離子水，然后用3.5升丙酮，最后用7升去離子水對聚合物的填充床進行洗滌。將混合物轉(zhuǎn)移至配有冷凝器、機械攪拌器、熱電偶和氮氣導入口的2升4頸燒瓶中。向該漿液中加入100ml去離子水，用硼酸將其pH值調(diào)節(jié)至5.0，然后向漿液中加入28gCellulaseTM4000(聚合物的19％)。將該混合物加熱至37℃并攪拌3小時，從燒瓶中取出并放入到1升色譜柱中。從聚合物中過濾掉水相，并用7升去離子水，然后用3.5升丙酮，最后用7升去離子水對聚合物的填充床進行洗滌。然后在2.5mm汞柱真空下，于100℃對水潤濕的聚合物干燥16小時。聚合物4D的酶處理(高溫固化后，溶劑洗滌后，干燥聚合物后，溶劑再洗滌前)
將大約250ml漿液狀的樹脂(含150ml樹脂)轉(zhuǎn)移到配有攪拌的壓力容器中，并在100℃下加熱5小時。將水/聚合物混合物冷卻至室溫，從燒瓶中取出并放入到1升色譜柱中。從聚合物中過濾掉水相，并用7升去離子水，然后用3.5升丙酮，最后用7升去離子水對聚合物的填充床進行洗滌。然后在2.5mm汞柱真空下，于100℃對水潤濕的聚合物干燥16小時。將干燥的樣品轉(zhuǎn)移至配有冷凝器、機械攪拌器、熱電偶和氮氣導入口的2升4頸燒瓶中.向該漿液中加入100ml去離子水，用硼酸將其pH值調(diào)節(jié)至5.0，然后向漿液中加入28g CellulaseTM4000(聚合物的19％)。將該混合物加熱至37℃并攪拌3小時，從燒瓶中取出并放入到1升色譜柱中。從聚合物中過濾掉水相，并用7升去離子水，然后用3.5升丙酮，最后用7升去離子水對聚合物的填充床進行洗滌。然后在2.5mm汞柱真空下，于100℃對水潤濕的聚合物干燥16小時。聚合物4E的處理(不用酶)將大約250m1漿液狀的樹脂(含150ml樹脂)轉(zhuǎn)移到配有攪拌的壓力容器中，并在100℃下加熱5小時。將水/聚合物混合物冷卻至室溫，從燒瓶中取出并放入到1升色譜柱中。從聚合物中過濾掉水相，并用7升去離子水，然后用3.5升丙酮，最后用7升去離子水對聚合物的填充床進行洗滌。然后在2.5mm汞柱真空下，于100℃對水潤濕的聚合物干燥16小時。
表3的結果說明，可以不同的方式對本發(fā)明的大孔聚合物進行酶處理，以使聚合物粒子的結塊或聚結最小化。這可由下述得到說明，即沉降僅18小時后的處理過的聚合物(4A-4D)的壓緊體積，為每一樣品的初始分散體積的60％，相比之下未處理的聚合物為其初始分散體積的94％。
表3
類似地，制備酶處理的和未經(jīng)酶處理的聚合物樹脂樣品，并評價其用于柱操作時的壓力降性能。將大約1200ml每一樹脂漿液(含大約550ml聚合物樹脂)放入6.2cm AmiconTMVantage柱中。形成一545ml的樹脂床，并使用RaininTMHPLX泵，以50ml/min(178cm/hr)的速度，用3倍床體積的USP(美國藥典)等級的水進行洗滌，然后用65％丙酮/35％USP等級的水的混合物進行洗滌，最后用99.5％的丙酮以50ml/min的速度洗滌。用AshcroftTM壓力測試裝置，以0至6.9×106Pa(1000psi或磅每平方英寸)的范圍測定壓力。相對于未處理的樣品(1.4×106Pa或200psi)，用纖維素酶處理的樣品在柱子中具有較低的壓力降(1.4×105Pa或20psi)。
權利要求
1.一種含下述聚合的單體單元的大孔聚合物(a)50～100重量％的一種或多種多乙烯基芳族單體，和(b)0～50重量％的一種或多種單不飽和乙烯基芳族單體；其中該聚合物(i)其總的孔隙度為0.7～2立方厘米每克；(ii)其操作中間孔隙度為0.7～1.9立方厘米每克；(iii)平均粒徑為2～600微米；(iv)表面積為200～1500平方米每克；(v)在10巴壓力下的流阻值為700至小于1800，在60巴壓力下的流阻值為1500至小于7000；和(vi)總的胰島素容量為75～150克胰島素/升聚合物，動態(tài)胰島素容量為60～150克胰島素/升聚合物。
2.權利要求1的聚合物，其中多乙烯基芳族單體選自一種或多種二乙烯基苯、三乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基苯、二乙烯基蒽和二乙烯基二甲苯。
3.權利要求1的聚合物，其中單不飽和乙烯基芳族單體選自一種或多種苯乙烯和(C1～C4)烷基取代的苯乙烯。
4.權利要求1的聚合物，其中聚合物(a)其表面積為400～1000平方米每克；(b)操作中間孔隙度為0.9～1.4立方厘米每克；(c)平均粒徑為10～75微米；(d)在10巴壓力下的流阻值為700至小于1500，在60巴壓力下的流阻值為1500至小于5000；和(e)總的胰島素容量為90～150克胰島素/升聚合物，動態(tài)胰島素容量為75～150克胰島素/升聚合物。
5.權利要求1的聚合物，該聚合物含有下述聚合的單體單元(a)75～100重量％的一種或多種多乙烯基芳族單體，和(b)0～25重量％的一種或多種單不飽和乙烯基芳族單體。
6.權利要求1的聚合物，其中該聚合物選自一種或多種二乙烯基苯共聚物、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，二乙烯基苯-乙基乙烯基苯共聚物，和苯乙烯-乙基乙烯基苯-二乙烯基苯共聚物。
7.一種制備大孔聚合物的方法，該方法包括在100～170％的含疏水性致孔劑和親水性致孔劑的致孔劑混合物，以及0.5～10％的自由基聚合引發(fā)劑存在下，在含水懸浮液中聚合0～50％的單乙烯基芳族單體和50～100％的多乙烯基芳族單體；其中所有的百分數(shù)均基于單體的總重量；并且其中(a)相對于疏水性致孔劑，存在的親水性致孔劑的重量比為大于1.2/1至3/1；(b)親水性致孔劑選自一種或多種(C4～C10)鏈烷醇，疏水性致孔劑選自一種或多種(C7～C10)芳烴和(C6～C12)飽和烴。
8.權利要求7的方法，其中親水性致孔劑選自一種或多種(C5～C8)鏈烷醇，疏水性致孔劑選自一種或多種(C7～C10)芳烴。
9.權利要求7的方法，進一步包括用選自一種或多種纖維素分解酶和蛋白水解酶的酶處理大孔聚合物，其中在聚合過程中、聚合后、或聚合物分離后將酶與大孔聚合物進行接觸。
10.一種混合的生物分子的水溶液的提純方法，該方法包括在內(nèi)徑為2～100厘米的液相色譜柱中，將所述水溶液與權利要求1的大孔聚合物進行接觸，其中色譜柱的操作壓力為10～100巴。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有選定孔隙度和滲透率特性的大孔聚合物,上述特性使得硬聚合物基質(zhì)適用于中壓和高壓反相液相色譜(RPC)中。本發(fā)明還公開了相對于單體相,以選定比例的選定混合致孔劑制備所述聚合物的方法。這些聚合物在大規(guī)模的色譜柱中特別適用作固定相,而在較長的使用時間內(nèi)不會增大壓力,同時對目標生物分子如胰島素,保持了良好的色譜性能。
文檔編號C08F6/24GK1338480SQ0114110
公開日2002年3月6日 申請日期2001年8月10日 優(yōu)先權日2000年8月11日
發(fā)明者K·C·戴斯勒, M·K·基恩茲, J·J·梅克納, R·E·羅森 申請人:羅姆和哈斯公司