專利名稱：新型腫瘤抗原蛋白sart－3及其腫瘤抗原肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新型腫瘤抗原蛋白及其腫瘤抗原肽。更具體地說，本發(fā)明涉及新型腫瘤抗原蛋白及其基因、衍生自該腫瘤抗原蛋白的腫瘤抗原肽和這些物質的衍生物、以及體內或體外利用這種腫瘤抗原蛋白、基因、腫瘤抗原肽或它們的衍生物治療、預防或診斷腫瘤。
雖然長期以來人們不了解攻擊自身腫瘤細胞的CTL的靶分子，但是免疫學和分子生物學的最新進展已經逐漸揭示了這類靶分子。準確地說，已經發(fā)現(xiàn)CTL利用T細胞受體(TCR)識別稱為腫瘤抗原肽的肽和主要組織相容性復合體Ⅰ類抗原(Ⅰ類MHC抗原，在人類稱為HLA抗原)之間的復合物，由此攻擊自身腫瘤細胞。
腫瘤抗原肽產生自腫瘤抗原蛋白(即腫瘤特異性蛋白)在具有蛋白酶體的細胞中的降解，所述腫瘤抗原蛋白在細胞內合成。由此產生的腫瘤抗原肽結合至在內質網(wǎng)中的MHCⅠ類抗原(HLA抗原)上，形成復合物，而且該復合物被轉運到細胞表面作為抗原提呈。腫瘤特異性CTL識別作為抗原提呈的該復合物，并通過其細胞毒性作用或產生淋巴因子呈現(xiàn)其抗腫瘤效應。因為這一系列作用的闡明，通過使用腫瘤抗原蛋白或腫瘤抗原肽作為所謂的癌癥疫苗增強腫瘤患者體內的腫瘤特異性CTL來治療腫瘤已成為可能。
作為腫瘤抗原蛋白，T.Boon等于1991年首次由人黑素瘤細胞鑒定了命名為MAGE的蛋白(Science,254:1643,1991)。此后主要從黑素瘤細胞鑒定了數(shù)種其它腫瘤抗原蛋白。已鑒定的黑素瘤抗原的實例是黑色素體蛋白，例如黑素細胞組織特異性蛋白、gp 100(J.Exp.Med.,179:1005,1994)、MART-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3515,1994)和酪氨酸酶(J.Exp.Med.,178:489,1993)；不僅在黑素瘤細胞而且在各種癌癥細胞和正常睪丸細胞上表達的MEGE-相關蛋白(J.Exp.Med,179:921,1994)；具有腫瘤特異性氨基酸突變的β-連環(huán)蛋白(J.Exp.Med.,183:1185,1996)和CDK4(Sience,269:1281,1995)。還鑒定了不是得自黑素瘤的腫瘤抗原蛋白，包括癌基因產物，例如HER2-neu(J.Exp.Med.,181:2109,1995)和p53(變異體)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:14704,1996)、腫瘤標記物例如CEA(J.Natl.CancerInst.,87:982,1995)和PSA(J.Natl.CancerInst.,89:293,1997)，以及病毒蛋白例如HPV(J.Immunol.,154:5934,1995)和EBV(Int.Immunol.,7:653,1995)。關于這些物質的詳細描述可見公開出版的綜述(例如Immunol.Today,18:267,1997；J.Exp.Med.,183:725,1996；和Curr.Opin.Immunol.,8:628,1996)。
應用腫瘤抗原蛋白或腫瘤抗原肽治療或診斷腫瘤時，重要的是鑒定可廣泛用于比黑素瘤發(fā)病率高得多的鱗狀細胞癌例如食管癌和肺癌的腫瘤抗原。與此相關的是，本發(fā)明人對編碼得自食管癌鱗狀癌細胞的新腫瘤抗原蛋白的基因進行了克隆，以及首次從非黑素瘤腫瘤細胞鑒定了幾種結合并提呈在HLA型為HLA-A24或HLA-A26的HLA抗原上的腫瘤抗原肽(J.Exp.Med,187:277,1998；國際專利公開WO97/46676)。
當將這些腫瘤抗原肽在臨床實際應用時，最好使用兩種或多種不同腫瘤抗原肽而不是僅使用單一肽。也就是說，鑒于這樣的事實所有癌癥細胞并不是表達共有的相同腫瘤抗原以及在單一癌細胞上存在兩種或多種不同腫瘤抗原肽，所以認為采用兩種或多種不同腫瘤抗原肽治療更有效。實際上，對于黑素瘤已經嘗試研制包含兩種或多種肽的混合制劑，因為衍生自腫瘤抗原的單一肽不能產生足夠的作用(Int.J.Cancer,66:162,1996；和Int.J.Cancer,67:54,1996)。在這樣的情況下，需要鑒定能夠廣泛用于發(fā)病率較高的鱗狀細胞癌的新的腫瘤抗原蛋白和腫瘤抗原肽。
為了獲得新型腫瘤抗原蛋白和腫瘤抗原肽，本發(fā)明人進行了以下努力。
首先，本發(fā)明人從食管癌細胞系KE-4(FERM BP-5955)制備了cDNA文庫，并用該文庫的重組質粒和含HLA-A2402(一種HLA-A24)cDNA的重組質粒雙重轉染成纖維細胞系VA-13(RIKEN CELLBANK,The Institute of Physical and Chemical Research)。用針對KE-4的KE-4CTL(FERM BP-5954)處理獲得的轉染子，測量產生的IFN-γ量以確定是否激活KE-4CTL。重復進行這種廣泛的篩選，盡管本發(fā)明人不能保證這種篩選就能夠獲得新的有用的腫瘤抗原蛋白，但是我們最終成功克隆了一個編碼腫瘤抗原蛋白的基因。本發(fā)明人將該基因編碼的腫瘤抗原蛋白稱為“SART-3”。比較SART-3與已知序列的堿基序列表明，SART-3的所述堿基序列是一種新的堿基序列，有一個堿基不同于在GenBank數(shù)據(jù)庫以登錄號D63879登記的KIAA0156基因，其作用仍不清楚。
此外，本發(fā)明人在SART-3的氨基酸序列中鑒定了結合并提呈在HLA-A24和HLA-A2上的腫瘤抗原肽部分，并證實這類肽具有腫瘤抗原肽活性。
本發(fā)明人根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及(1)編碼以下蛋白的DNA:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列組成的蛋白或在SEQ ID NO:1中替代、缺失和/或添加一個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列組成的蛋白變異體，前提是所述蛋白和蛋白變異體可產生能夠結合HLA抗原而且被細胞毒性T淋巴細胞識別的腫瘤抗原肽；(2)SEQ ID NO:2所示堿基序列組成的DNA或在嚴格條件下與所述DNA雜交的DNA變異體，前提是所述DNA或DNA變異體產生和表達的蛋白可產生能夠結合HLA抗原而且被細胞毒性T淋巴細胞識別的腫瘤抗原肽；(3)含有上述(1)或(2)的DNA的表達質粒；(4)用上述(3)的表達質粒轉化的轉化體；(5)產生重組蛋白的方法，它包括培養(yǎng)上述(4)的轉化體，回收表達的重組蛋白；(6)上述(1)或(2)的DNA編碼的腫瘤抗原蛋白，或者通過上述(5)的方法產生的腫瘤抗原蛋白；
(7)包含作為活性成分的上述(1)或(2)的DNA或上述(6)的蛋白的藥用組合物；(8)用于治療或預防腫瘤的藥用組合物，它包含作為活性成分的上述(1)或(2)的DNA或上述(6)的蛋白；(9)為衍生自上述(6)的蛋白的部分肽、而且能夠結合HLA抗原并被細胞毒性T淋巴細胞識別的腫瘤抗原肽，或其具有相同功能特性的衍生物；(10)上述(9)的腫瘤抗原肽，其中所述HLA抗原是HLA-A24或HLA-A2或其具有相同功能特性的衍生物；(11)上述(10)的腫瘤抗原肽或其具有相同功能特性的衍生物，所述腫瘤抗原肽包含選自SEQ ID NO:3-52中任一個所示全部或部分氨基酸序列的序列；(12)上述(11)的腫瘤抗原肽或其具有相同功能特性的衍生物，所述腫瘤抗原肽包含選自SEQ ID NO:3-9和25-29中任一個所示全部或部分氨基酸序列的序列；(13)上述(11)的腫瘤抗原肽衍生物，它包含選自在SEQ ID NO:3-52中任何一個所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基取代的全部或部分氨基酸序列的序列；(14)上述(13)的腫瘤抗原肽衍生物，它包含選自在SEQ ID NO:3-9或25-29中任一個所示的氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基取代的全部或部分氨基酸序列的序列；(15)上述(13)的腫瘤抗原肽衍生物，它包含選自在SEQ ID NO:3-24中的任何一個所示的氨基酸序列的位置2的氨基酸殘基被酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸取代，和/或C末端的氨基酸殘基被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸取代的全部或部分氨基酸序列的序列；(16)上述(13)的腫瘤抗原肽衍生物，它包含選自在SEQ ID NO:25-52中的任何一個所示的氨基酸序列的位置2的氨基酸殘基被亮氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或谷氨酰胺取代，和/或C末端的氨基酸殘基被纈氨酸或亮氨酸取代的全部或部分氨基酸序列的序列；(17)上述(14)的腫瘤抗原肽衍生物，它包含選自SEQ ID NO:53-64中的任何一個所示的全部或部分氨基酸序列的序列；(18)用于治療或預防腫瘤的藥用組合物，它包含作為活性成分的至少一種選自按照上述(9)-(17)中的任一項的腫瘤抗原肽及其衍生物的物質；(19)包含至少一種編碼按照上述(9)-(17)中任一項的腫瘤抗原肽或其衍生物的DNA的重組DNA；(20)可通過表達上述(19)的重組DNA獲得的重組多肽；(21)用于治療或預防腫瘤的藥用組合物，它含有作為活性成分的上述(19)的重組DNA或上述(20)的重組多肽；(22)特異性結合上述(6)中的任何一種腫瘤抗原蛋白以及按照上述(9)-(17)中任一項的腫瘤抗原肽或其衍生物的抗體；(23)其中HLA抗原和按照上述(9)-(17)中任一項的腫瘤抗原肽或其衍生物之間的復合物提呈在從腫瘤患者分離的具有抗原提呈能力的細胞表面的抗原提呈細胞；(24)HLA抗原和腫瘤抗原肽或其衍生物之間的復合物提呈于其上的抗原提呈細胞，所述抗原提呈細胞可如下制得使從腫瘤患者分離的具有抗原提呈能力的細胞與上述(1)或(2)的DNA、上述(6)的腫瘤抗原蛋白、上述(19)的重組DNA或上述(20)的重組多肽結合；(25)用于治療腫瘤的藥用組合物，它包含作為活性成分的上述(23)或(24)的抗原提呈細胞；(26)特異性識別HLA抗原和按照上述(9)-(17)中任一項的腫瘤抗原肽或其衍生物之間的復合物的細胞毒性T淋巴細胞；(27)特異性識別HLA抗原和腫瘤抗原肽或其衍生物之間的復合物的細胞毒性T淋巴細胞，所述復合物提呈在上述(23)或(24)的抗原提呈細胞上；
(28)用于治療腫瘤的藥用組合物，它含有作為活性成分的上述(26)或(27)的細胞毒性T淋巴細胞；(29)腫瘤診斷試劑，它包括按照上述(9)-(17)中任一項的腫瘤抗原肽或其衍生物、上述(6)的蛋白或上述(20)的重組多肽；(30)其保藏號為FERM BP-6818的細胞毒性T淋巴細胞OK-CTL；(31)鑒定腫瘤抗原蛋白或腫瘤抗原肽的方法，它包括采用上述(30)的OK-CTL。
本發(fā)明的DNA編碼新型腫瘤抗原蛋白，而具體DNA實例包括編碼SEQ ID NO:1所示氨基酸序列組成的SART-3蛋白的DNA、或編碼在SART-3的氨基酸序列中替代、缺失和/或添加一個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列組成的蛋白變異體的DNA，前提是所述蛋白和蛋白變異體可產生能夠結合HLA抗原而且被細胞毒性T淋巴細胞識別的的腫瘤抗原肽；SEQ ID NO:2所示堿基序列組成的SART-3的DNA或在嚴格條件下與SART-3 DNA雜交的DNA變異體，前提是所述DNA和DNA變異體表達和產生的蛋白可產生能夠結合HLA抗原而且被細胞毒性T淋巴細胞識別的腫瘤抗原肽。按照以上順序在下文詳細描述本發(fā)明的DNA。1)編碼SART-3的DNA上述DNA中的“編碼SEQ ID NO:1所示氨基酸序列組成的蛋白的DNA”和“SEQ ID NO:2所示堿基序列組成的DNA”是指編碼本發(fā)明的腫瘤抗原蛋白SART-3的DNA?？砂凑找韵聦嵤├龅姆椒寺≡揇NA。此外，通過例如用GenBank登記號D63879公開的合適部分的堿基序列或本發(fā)明SEQ ID NO:2所示的合適部分的堿基序列作為雜交探針或PCR引物，篩選從細胞系如食管癌細胞系KE-4(FERM BP-5955)獲得的cDNA文庫，也可以進行所述DNA的克隆。本領域技術人員隨對可以例如按照Molecular Cloning，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)完成這樣的克隆。2)編碼SART-3修飾蛋白或其等位基因變異體的DNA在上述DNA中“編碼SART-3氨基酸序列取代、缺失和/或添加一個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列組成的蛋白變異體的DNA”是指編碼人工制備的所謂修飾蛋白或編碼諸如在活體存在的等位基因變異體的蛋白的DNA。可用各種方法例如在Molecular Cloning:ALaboratory Manual第二版，第1-3卷，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)中描述的定點誘變和PCR技術制備編碼這種蛋白變異體的DNA。取代、缺失和/或添加的氨基酸殘基數(shù)范圍是按照周知的方法例如上述的定點誘變可取代、缺失和/或添加的氨基酸殘基數(shù)范圍。3)在嚴格條件下與SART-3 DNA雜交的DNA在上述DNA中“在嚴格條件下與SART-3 DNA雜交的DNA變異體”是指在嚴格條件下與SEQ ID NO:2所示堿基序列組成的人SART-3 cDNA雜交的DNA，包括得自所有脊椎動物如大鼠和小鼠的SART-3 DNA和編碼SART-3部分蛋白的DNA。
術語“嚴格條件”是指這樣的條件在含有6×SSC(20×SSC表示333mM檸檬酸鈉、333mM NaCl)、0.5％SDS和50％甲酰胺的溶液中于42℃進行雜交，然后用0.1×SSC、0.5％SDS的溶液于68℃洗滌雜交產物；或者是指在Nakayama等，Bio-Jikken-Illustrated.第二卷，“Idenshi-Kaiseki-NO-Kiso(基因分析的基礎)”，第148-151頁，Shujunsha,1995中描述的條件。
用各種方法例如與SEQ ID NO:2所示DNA雜交克隆所述DNA變異體。所述方法中的具體步驟是本領域周知的，例如產生cDNA文庫、雜交、選擇陽性集落以及測定堿基序列，并可以參考上述Molecular Cloning進行?？捎糜陔s交的探針包括含有SEQ ID NO:2所示堿基序列的DNA。
在上述1)-3)的DNA中，具有產生能夠結合HLA抗原而且被CTL識別的腫瘤抗原肽的能力、而且所述腫瘤抗原肽通過細胞內降解所述DNA表達產生的蛋白而產生的DNA就是編碼本發(fā)明的腫瘤抗原蛋白的DNA，即本發(fā)明的DNA。具體來說，本發(fā)明的DNA是可產生所述DNA表達產生的蛋白的一部分氨基酸序列組成的部分肽的肽片段的DNA，所述肽能夠結合HLA抗原而且誘導CTL產生細胞毒性作用和細胞因子，所述CTL對所述肽和所述HLA抗原之間的復合物是特異性的并且與提呈在所述細胞表面的所述復合物結合。
例如用以下方法可確定候選DNA是否是編碼腫瘤抗原蛋白的DNA。
將一種含有候選DNA的表達質粒和一種含有編碼HLA抗原的DNA的表達質粒雙重轉染入成纖維細胞VA-13(RIKEN CELL BANK,The Institute of Physical and Chemical Research)或得自非洲綠猴腎臟的COS-7(ATCC CRL1651)。例如通過采用脂質轉染胺試劑(GIBCO BRL)的脂質轉染法可以實現(xiàn)所述轉染。接著加入限于所用的特定HLA抗原的腫瘤效應性CTL作用于轉染子，然后例如可用ELISA檢測所述CTL在應答所述轉染子時產生的各種細胞因子(例如IFN-γ)量，以確定所述候選DNA是否是本發(fā)明的DNA。在這種情況下，因為SART-3含有HLA-A24-或HLA-A2-限制性腫瘤抗原肽部分，所以HLA-A24cDNA(Cancer Res.,55:4248-4252(1995)；Genbank登記號M64740)和HLA-A2 cDNA(Genbank登記號M84379)可用作編碼所述HLA抗原的上述DNA，而從人外周血淋巴細胞制得的CTL以及HLA-A24-限制性CTL如KE-4CTL (FERM BP-5954)或HLA-A2-限制性CTL如OK-CTL(FERM BP-6818)可用作上述CTL。
上述的本發(fā)明DNA可用作藥物或藥用組合物中的活性成分。按照含有作為活性成分的本發(fā)明DNA的“藥用組合物”，給予腫瘤患者本發(fā)明的DNA可治療或預防腫瘤。
按照下述方法給予腫瘤患者摻入表達載體的本發(fā)明DNA，所述腫瘤抗原蛋白在抗原提呈細胞中的表達量高。然后在細胞內降解產生的腫瘤抗原肽結合HLA抗原形成復合物，而該復合物密集存在于所述抗原提呈細胞表面上。因此，腫瘤特異性CTL在機體內有效增殖并破壞腫瘤細胞。這樣達到治療或預防腫瘤。
可用病毒載體或按照任何一種其它方法(Nikkei-Science,1994年4月，第20-45頁；Gekkan-Yakuji,36(1),23-48(1994)；Jikken-Igaku-Zokan,12(15),1994以及其中引用的參考文獻)將本發(fā)明的DNA給予并導入細胞中。
采用病毒載體的方法實例包括這樣的方法其中將本發(fā)明DNA導入DNA或RNA病毒如逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰質炎病毒或Sindbis病毒中，并將其引入細胞中。在這些方法中，特別優(yōu)選采用逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒或痘苗病毒的方法。
其它方法包括其中表達質粒直接肌內注射(DNA疫苗接種)的方法、脂質體法、脂質轉染法、微量注射法、磷酸鈣方法和電穿孔，特別優(yōu)選DNA疫苗接種和脂質體法。
為了使本發(fā)明的DNA真正用作藥物，人們可以采用以下方法其中DNA直接引入機體的體內法，和其中從人體取出一定的細胞，在體外將DNA導入所述細胞中后，再將所述細胞導入所述機體的體外法(Nikkei-Sciecnce,1994年4月，第20-45頁；Gekkan-yakuji,36(1),23-48(1994)；Jikkenn-Igaku-Zokan,12(15),1994；以及其中引用的參考文獻)。更優(yōu)選體內法。
體內法時，根據(jù)需要治療的疾病和癥狀以及其它因素可以采用任何合適的途徑給予所述DNA。例如可以通過靜脈內、動脈內、皮下、皮內或肌內途徑等給予。體內法時，所述組合物可以以各種劑型如溶液劑給予，而且通常配制為例如含有作為活性成分的本發(fā)明DNA的注射劑形式，必要時也可加入常規(guī)載體。如果本發(fā)明DNA包含于脂質體或膜融合的脂質體(例如仙臺病毒(HVJ)脂質體)中，則所述組合物可以為脂質體制劑形式，例如懸浮劑、冷凍藥物、離心濃縮的冷凍藥物等。
雖然在這類制劑中的本發(fā)明DNA量可以根據(jù)需要治療的疾病、患者的年齡和體重等而不同，但是通常每隔數(shù)天或數(shù)月給予本發(fā)明的DNA0.0001-100mg、優(yōu)選0.001-10mg。
在本發(fā)明中術語“蛋白”是指上述的本發(fā)明各種DNA編碼的蛋白，它作為腫瘤抗原蛋白能夠通過細胞內降解產生能夠結合HLA抗原而且被CTL識別的腫瘤抗原肽。所述蛋白的具體實例包括含SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的SART-3。本發(fā)明的蛋白可用上述本發(fā)明的DNA大量生產。
按照許多公開出版物和文獻例如上述的“Molecular Cloning”可通過表達本發(fā)明的DNA產生腫瘤抗原蛋白。具體來說，通過將本發(fā)明的DNA導入合適的表達載體(例如pSV-SPORT1,pCR3)構建可在宿主細胞中復制和起作用的表達質粒。然后將表達質粒導入合適宿主細胞獲得轉化體。宿主細胞實例包括原核生物宿主細胞例如大腸桿菌、單細胞真核生物如酵母和從多細胞真核生物如昆蟲或動物獲得的細胞。用常規(guī)方法如磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖法、電脈沖法、脂質轉染法等可以將基因轉入宿主細胞中。在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)的轉化體產生目的蛋白?？砂凑諛藴噬椒ǚ蛛x和純化如此獲得的腫瘤抗原蛋白。
如上所述，通過在細胞內表達本發(fā)明的DNA可產生本發(fā)明的蛋白，并確定通過細胞內降解所述蛋白產生的所述肽片段是否具有腫瘤抗原肽活性，從而可證實本發(fā)明的腫瘤抗原蛋白是否具有一定活性。如果采用腫瘤抗原蛋白本身，可如下測定所述活性使所述蛋白導入吞噬細胞如巨噬細胞以在細胞內產生肽片段，然后使CTL接觸所述肽片段和HLA抗原之間的復合物，再后測定所述CTL在應答所述復合物時產生的各種細胞因子(例如IFN-γ)的量。
上述的本發(fā)明蛋白也可用作藥物或藥用組合物中的活性成分。按照含有作為活性成分的本發(fā)明蛋白的“藥用組合物”，例如給予本發(fā)明的蛋白可治療或預防腫瘤。當給予腫瘤患者時，本發(fā)明的蛋白導入抗原提呈細胞中。然后在細胞內降解產生的腫瘤抗原肽結合HLA抗原形成復合物，而該復合物提呈在所述抗原提呈細胞表面上。所述復合物特異性CTL在機體內有效增殖并破壞腫瘤細胞。這樣達到治療或預防腫瘤。
包含本發(fā)明腫瘤抗原蛋白的藥用組合物可以和佐劑一起給予，以便有效建立所述細胞免疫，或者可以以顆粒劑型給予。為此，可應用描述于文獻(Clin.Microbiol.Rev.,7:277-289,1994)中的佐劑。另外，也可以應用脂質體制劑、其中所述成分結合到直徑數(shù)μm的微珠上的顆粒劑或其中所述成分結合到脂質的制劑。例如可以皮內、皮下或靜脈內注射給藥。雖然所述制劑中的本發(fā)明腫瘤抗原蛋白量可因為需要治療的疾病、患者的年齡和體重等而不同，但是通常每隔數(shù)天或數(shù)月給予本發(fā)明腫瘤抗原蛋白0.0001mg-1000mg，優(yōu)選0.001mg-1000mg，更優(yōu)選0.01mg-10mg。
在本發(fā)明中，術語“腫瘤抗原肽”是指本發(fā)明的腫瘤抗原蛋白的一部分組成的而且能夠結合至HLA抗原并被CTL識別的部分肽。因此，任何肽均屬于本發(fā)明的腫瘤抗原肽范圍，無論其長度或其在本發(fā)明蛋白氨基酸序列的部位，只要所述肽由本發(fā)明蛋白的一部分氨基酸序列構成而且所述肽和HLA抗原之間的復合物能夠被CTL識別。鑒定本發(fā)明的這種腫瘤抗原肽可通過合成包含本發(fā)明腫瘤抗原蛋白的一部分的候選肽，并進行分析以確定所述候選肽和HLA抗原之間的復合物是否被CTL識別，換句話說，所述候選肽是否具有腫瘤抗原肽活性。
關于此，可按照在肽化學中通常使用的方法合成肽。這類已知方法的實例描述于文獻中，包括“肽合成”，Interscience，紐約，1966；“蛋白質”，第二卷，Academic Press Inc.,紐約，1976；“Pepuchido-Gosei”,Maruzen Co.Ltd.,1975；“Pepuchido-Gosei-no-Kiso-to-Jikkenn”,Maruzen Co.Ltd.,1985；和“Iyakuhin-no-Kaihatu,Zoku,第14卷，Peputido-Gosei”,Hirokawa Shoten,1991。
鑒定本發(fā)明腫瘤抗原肽的方法在下文詳細描述。
已知結合至并提呈在以下HLA型上的抗原肽的相應的序列規(guī)律(基元)HLA-A1、-A0201、-A0204、-A0205、-A0206、-A0207、-A11、-A24、-A31、-A6801、-B7、-B8、-B2705、-B37、-Cw0401和-Cw0602(參見例如，Immunogenetics,41:178,1995)。例如關于HLA-A24的基元，已知在8-11個氨基酸組成的肽序列中，位置2的氨基酸是酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸，和C末端的氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸(J.Immunol.,152:3913,1994；Immunogenettcs,41:178,1995；J.Immunol.,155:4307,1994)。同樣，已知HLA-A2的下表1中所示的基元(Immunogenetics,41:178,1995；J.Immunol.,155:4749,1995)。表1

(所述肽長度為8-11個氨基酸)此外，可用NIH BIMAS軟件在互聯(lián)網(wǎng)上檢索預期能夠結合HLA抗原的任何肽序列(http:∥bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)。
通過分析與各種HLA分子結合的抗原肽，已經證實所述肽長度通常為8-14個氨基酸長，但是也在HLA-DR、-DP和-DQ觀察到14個或更多氨基酸長度的抗原肽(Immunogenetics,41:178,1995)。
容易從本發(fā)明蛋白的氨基酸序列選擇包含在這類基元中的肽部分。包含在上述基元結構中的所述肽部分可容易地通過檢查腫瘤抗原蛋白SART-3(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列來選擇。此外，如上所述通過在互聯(lián)網(wǎng)上檢索容易選擇預期能夠結合HLA抗原的任何序列?？赏ㄟ^合成按照上述方法如此選擇的候選肽，并進行分析以確定所述候選肽和HLA抗原之間的復合物是否被CTL識別，換句話說，所述候選肽是否具有腫瘤抗原肽活性，從而鑒定本發(fā)明腫瘤抗原肽。
鑒定本發(fā)明腫瘤抗原肽方法的具體實例為描述于，Immunol.,154:2257,1995中的方法。具體地說，從預期提呈所述候選肽的HLA抗原型陽性的人分離外周血淋巴細胞，并加入所述候選肽體外刺激所述淋巴細胞。如果所述候選肽誘導特異性識別用所述候選肽施以脈沖的HLA抗原提呈細胞的CTL，則說明所述具體候選肽可以用作腫瘤抗原肽。關于此，可檢測CTL誘導存在與否，例如采用ELISA檢測法檢測CTL在應答抗原肽提呈細胞時產生的各種細胞因子(例如IFN-γ)的量。或者，也可以將檢測CTL對51Cr標記的抗原肽提呈細胞的細胞毒性的方法(51Cr釋放測定，Int.,Cancer,58:317,1994)用于這種檢測。
此外，也可以如下完成上述檢測。通過將表達預期提呈所述候選肽的HLA抗原型cDNA的表達質粒引入例如COS-7細胞(ATCC第CRL1651號)或VA-13細胞(RIKEN CELL BANK,The Institute ofPhysical and Chemical Research)中，用所述候選肽對所獲得的細胞施以脈沖處理。然后將所述細胞與預期提呈上述候選肽的HLA抗原型限制性CTL反應，并檢測所述CTL產生的各種細胞因子(例如IFN-γ)的量(J.Exp.Med,187:277,1998)。
SART-3含有HLA-A24-或HLA-A2-限制性腫瘤抗原肽部分。為了鑒定HLA-A24-限制性腫瘤抗原肽，可以使用HLA-A24 cDNA(Cancer Res.,55:4248-4252,1995,GenBank登記號M64740)作為編碼所述HLA抗原的cDNA，而CTL例如KE-4CTL(FERM BP-5954)以及用肽刺激的人外周血淋巴細胞制備的CTL可用作上述CTL。同樣對于HLA-A2-限制性腫瘤抗原肽，用HLA-A2 cDNA (GenBank登記號M84379)和用這些CTL如OK-CTL(FERM BP-6818)以及用肽刺激的人外周血淋巴細胞制備的CTL作為上述CTL，可鑒定這類腫瘤抗原肽。
上述各種測定的具體實例在下文的實施例4、6和8中進行說明。
在其中相關肽基元像HLA-A26一樣沒有被闡明的情況下，可以例如按照WO97/46676中所述方法鑒定本發(fā)明腫瘤抗原肽，該方法不同于其中所述序列規(guī)律(基元)已闡明的上述情況，前提是可獲得識別HLA-A26和腫瘤抗原肽之間的復合物的CTL細胞系。
如上所述鑒定腫瘤抗原肽的方法在下文中統(tǒng)稱為“腫瘤抗原肽分析方法”。
如上所述，已知結合并提呈在HLA-A24上的腫瘤抗原肽序列遵循一定規(guī)律(基元)，具體來說，所述基元是在8-11個氨基酸組成的肽序列中，在位置2的氨基酸為酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而C末端氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸(J.Immunol.,152:3913,1994；Immunogenetics,41:178,1995；J.Immunol.,155:4307,1994)。同樣，相似的規(guī)律(基元)可見于結合并提呈在HLA-A2上的腫瘤抗原肽序列，具體來說已知上述表1所示的基元(Immunogenetics,41,178,1995；J.Immunol.,155:4749,1995)。如上所述，可用NIH BIMAS軟件在互聯(lián)網(wǎng)上進一步檢索預期能夠結合HLA抗原的肽序列(http:∥bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)。
因此，在本發(fā)明腫瘤抗原肽中，HLA-A24-和HLA-A2-限制性腫瘤抗原肽的典型實例為包含在所述基元結構中或包含在SEQ ID NO:1所示的SART-3氨基酸序列中預期能夠結合所述HLA的結構中的部分肽而且能夠結合至相應的HLA抗原并被CTL識別的這類腫瘤抗原肽。
上述HLA-A24-限制性腫瘤抗原肽的具體實例包括包含SEQ IDNO:3-24中任一個所示的全部或部分氨基酸序列而且能夠結合HEA-A24抗原并被CTL識別的那些腫瘤抗原肽。同樣，HLA-A2-限制性腫瘤抗原肽的具體實例包括包含SEQ ID NO:25-52中任一個所示的全部或部分氨基酸序列而且能夠結合HLA-A2抗原并被CTL識別的那些腫瘤抗原肽。
具體地說，本發(fā)明腫瘤抗原肽的實例包括1)SEQ ID NO:3-52中任一個所示氨基酸序列組成的肽；和2)包含SEQ ID NO:3-52中任一個所示全長氨基酸序列或連續(xù)的部分氨基酸序列而且與所述氨基酸序列相比在N末端和/或C末端方向延長的肽，或由SEQ ID NO:3-52中任一種所示的連續(xù)部分氨基酸序列組成的肽；所述肽能夠結合至相應的HLA抗原并被CTL識別。鑒于上述2)中的所述肽與相應的HLA抗原結合并提呈的事實，所述肽可能約8-11個氨基酸長度。
本發(fā)明HLA-A24-限制性腫瘤抗原肽的合適實例包括包含SEQID NO:3-9中任何一個所示全部或部分氨基酸序列而且能夠結合HLA-A24抗原并被CTL識別的那些腫瘤抗原肽。具體地說，實例有1)SEQ ID NO:3-9中任何一個所示氨基酸序列組成的肽；和2)包含SEQ ID NO:3-9中任何一個所示的全長氨基酸序列或連續(xù)的部分氨基酸序列而且與所述氨基酸序列相比在N末端和/或C末端方向延長的肽，或SEQ ID NO:3-9中任何一個所示的連續(xù)的部分氨基酸序列組成的肽；所述肽能夠結合至HLA-A24抗原并被CTL識別。鑒于上述2)中的肽結合并提呈在HLA-A24抗原上的事實，所述肽可能為約8-11個氨基酸長度。
本發(fā)明HLA-A2-限制性腫瘤抗原肽的合適實例包括包含SEQ IDNO:25-29中任何一個所示全部或部分氨基酸序列而且能夠結合HLA-A2抗原并被CTL識別的那些腫瘤抗原肽。具體地說，實例有1)SEQ ID NO:25-29中任何一個所示氨基酸序列組成的肽；和2)包含SEQ ID NO:25-29中任何一個所示的全長氨基酸序列或連續(xù)的部分氨基酸序列而且與所述氨基酸序列相比在N末端和/或C末端方向延長的肽，或SEQ ID NO:25-29中任何一個所示的連續(xù)的部分氨基酸序列組成的肽；所述肽能夠結合至HLA-A2抗原并被CTL識別。鑒于上述2)中的肽結合并提呈在HLA-A2抗原上的事實，所述肽可能為約8-11個氨基酸長度。
在本發(fā)明中，術語“具有與腫瘤抗原肽相同功能特性的衍生物”(下文可簡稱為腫瘤抗原肽衍生物)是指其氨基酸序列是在本發(fā)明腫瘤抗原肽氨基酸序列中包含一個或多個、優(yōu)選1個至數(shù)個改變的氨基酸殘基而且具有腫瘤抗原肽特性(能夠結合至HLA抗原并被CTL識別)的改變的肽。因此，所有改變的肽均屬于本發(fā)明腫瘤抗原肽范圍，只要它們在本發(fā)明腫瘤抗原肽氨基酸序列中含有一個或多個改變氨基酸殘基而且具有腫瘤抗原肽特性(即能夠結合至HLA抗原并被CTL識別)。
在這種情況下，氨基酸殘基“改變”是指取代、缺失和/或添加(包括在所述肽的N末端和/或C末端添加氨基酸)氨基酸殘基，優(yōu)選取代氨基酸殘基。對于包含氨基酸殘基取代的改變，盡管只要保持腫瘤抗原肽活性可任意確定被取代的氨基酸殘基的數(shù)目和位置，但是優(yōu)選一個至數(shù)個殘基被取代，因為如上所述腫瘤抗原肽通常為約8-14個氨基酸長度。
在上述腫瘤抗原肽的情況下，盡管HLA-DR、-DP和-DQ的衍生物也可能具有14或更長氨基酸長度，但是本發(fā)明腫瘤抗原肽衍生物的優(yōu)選長度為約8-14個氨基酸。
可根據(jù)上述肽制備方法合成包含本發(fā)明腫瘤抗原肽的改變部分的改變的肽，并對腫瘤抗原肽進行上述分析，從而鑒定本發(fā)明的這類腫瘤抗原肽衍生物。
如上所述，已經闡明結合至并提呈在HLA型例如HLA-A1、-A0201、-A0204、-A0205、-A0206、-A0207、-A11、-A24、-A31、-A6801、-B7、-B8、-B2705、-B37、-Cw0401和-Cw0602上的肽的序列規(guī)律(基元)。如上所述，可在互聯(lián)網(wǎng)上進一步檢索預期能夠結合HLA抗原的肽序列(http:∥bimas.dcrt.nih.gov/mo1bio/hla bind/)。所以，可以根據(jù)這類基元制備在本發(fā)明腫瘤抗原肽中含有改變的氨基酸的腫瘤抗原肽衍生物。
例如關于結合至并提呈在HLA-A24上的抗原肽基元，如上所述，已知在8-11個氨基酸組成的肽的序列中，位置2的氨基酸為酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而C末端的氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸(J.Immunol.,152:3913,1994；Immunogenetics,41:178,1995；J.Immunol.,155:4307,1994)。同樣，已知HLA-A2的上表1所示的基元。此外，在互聯(lián)網(wǎng)(http:∥bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)上公開了預期能夠結合HLA抗原的肽序列，具有類似于符合所述基元的氨基酸的性質的氨基酸殘基也是可以的。所以，本發(fā)明腫瘤抗原肽衍生物的實例包括包含其中根據(jù)所述基元在允許取代的任何位置(對于HLA-24和HLA-A2而言為位置2和C末端)的一個或多個氨基酸殘基被其它氨基酸(優(yōu)選根據(jù)上述互聯(lián)網(wǎng)預期能夠結合所述抗原的氨基酸殘基)取代的本發(fā)明腫瘤抗原肽的全部或部分氨基酸序列的那些肽衍生物，而且這類肽衍生物具有結合至HLA抗原并被CTL識別的活性。優(yōu)選實例為包含其中將取代的氨基酸殘基選自按照上述基元的所述位置的氨基酸殘基的全部或部分氨基酸序列的這些腫瘤抗原肽衍生物，而且這類衍生物具有上述活性?！巴暾虿糠帧卑被嵝蛄械膬?yōu)選長度為約8-14個氨基酸，盡管HLA-DR、-DP和-DQ可以為14或更多氨基酸長度。
HLA-A24-或HLA-A2-限制性腫瘤抗原肽衍生物實例包括包含下述完整或部分氨基酸序列的肽衍生物在所述氨基酸序列中，在衍生自具有HLA-A24或HLA-A2的結合基元的SART-3氨基酸序列的肽中，根據(jù)上述基元在允許取代的位置、具體地說是位置2和/或C末端的一個或多個氨基酸殘基被其它氨基酸殘基(優(yōu)選為預期能夠結合按照上述互聯(lián)網(wǎng)的抗原的氨基酸)取代，并且這類衍生物具有上述活性。優(yōu)選實例為這樣的腫瘤抗原肽衍生物它們包含其中在位置2和/或C末端的氨基酸殘基被按照上述基元涉及的氨基酸殘基取代的全部或部分氨基酸序列，而且這類衍生物具有上述活性。在這些HLA-A24-或HLA-A2-限制性腫瘤抗原肽衍生物中，“完整或部分”的所述氨基酸序列的優(yōu)選長度為約8-11個氨基酸。
具體來說，實例為這些腫瘤抗原肽衍生物它們包含其中在SEQID NO:3-52中任一個所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸殘基被其它氨基酸殘基(如上所述優(yōu)選預期能夠結合互聯(lián)網(wǎng)上的所述抗原的氨基酸)取代的全部或部分氨基酸序列，而且這類衍生物具有上述活性。優(yōu)選實例為這些腫瘤抗原肽衍生物它們包含其中在SEQID NO:3-52中任一個所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸殘基被按照上述基元涉及的氨基酸殘基取代的全部或部分氨基酸序列，而且這類衍生物具有上述活性。準確地說，HLA-A24-限制性腫瘤抗原衍生物的實例為這些腫瘤抗原肽衍生物它們包含其中在SEQID NO:3-24中任一個所示氨基酸序列的位置2的氨基酸殘基被酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸取代，和/或C末端的氨基酸殘基被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸取代的全部或部分氨基酸序列，而且這類衍生物具有上述活性。同樣，HLA-A2-限制性腫瘤抗原衍生物的實例為這些腫瘤抗原肽衍生物它們包含其中在SEQ ID NO:25-52中任一個所示氨基酸序列的位置2的氨基酸殘基被亮氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或谷氨酰胺取代，和/或C末端的氨基酸殘基被纈氨酸或亮氨酸取代的全部或部分氨基酸序列，而且這類衍生物具有上述活性。
本發(fā)明HLA-A24-限制性腫瘤抗原肽衍生物的合適實例為這些腫瘤抗原肽衍生物它們包含其中在SEQ ID NO:3-9中任何一個所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的全部或部分氨基酸序列，而且這類衍生物具有上述活性。更優(yōu)選的實例為這些腫瘤抗原肽衍生物它們包含其中在SEQ ID NO:3-9中任何一個所示氨基酸序列的位置2的氨基酸殘基被酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸取代，和/或C末端的氨基酸殘基被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸取代的全部或部分氨基酸序列，而且這類衍生物具有上述活性。這類腫瘤抗原肽衍生物的合適實例見SEQ ID NO:53-59。
本發(fā)明HLA-A2-限制性腫瘤抗原肽衍生物的合適實例為這些腫瘤抗原肽衍生物它們包含其中在SEQ ID NO:25-29中任何一個所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的全部或部分氨基酸序列，而且這類衍生物具有上述活性。更優(yōu)選的實例為這些腫瘤抗原肽衍生物它們包含其中在SEQ ID NO:25-29中任何一個所示氨基酸序列的位置2的氨基酸殘基被亮氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或谷氨酰胺取代，和/或C末端的氨基酸殘基被纈氨酸或亮氨酸取代的全部或部分氨基酸序列，而且這類衍生物具有上述活性。這類腫瘤抗原肽衍生物的合適實例見SEQ ID NO:60-64。
本發(fā)明腫瘤抗原肽或其衍生物可以單獨或與另一種或多種本發(fā)明腫瘤抗原肽或其衍生物作為藥用組合物用于治療或預防腫瘤。即本發(fā)明提供用于治療或預防腫瘤的藥用組合物，它包含作為活性成分的所述腫瘤抗原肽或其衍生物。當將用于治療或預防腫瘤的包含作為活性成分的本發(fā)明腫瘤抗原肽或其衍生物的組合物給予SART-3陽性患者時，所述腫瘤抗原肽或其衍生物與抗原提呈細胞的HLA抗原一起被提呈，所以，提呈的HLA抗原復合物特異性的CTL增殖并破壞所述腫瘤細胞。因此，可以治療所述患者的腫瘤，或者可以防止所述腫瘤的增殖或轉移。SART-3廣泛存在于鱗狀細胞癌如食管癌上，因而按照本發(fā)明用于治療或預防腫瘤的組合物在廣泛適用性方面具有優(yōu)勢。鱗狀細胞癌通常對化療和放療具有耐藥性，所以本發(fā)明用于治療腫瘤的組合物也可通過其聯(lián)合應用增強治療效果。
包含作為活性成分的本發(fā)明腫瘤抗原肽或其衍生物的用于治療或預防腫瘤的藥用組合物可以和佐劑一起給予，以便有效建立所述細胞免疫，或者可以以顆粒劑型給予。為此，可應用文獻(Clin.Microbiol.Rev.,7:277-289,1994)中描述的佐劑。另外，也可以應用脂質體制劑、其中所述成分結合到直徑數(shù)μm的微珠上的顆粒劑或其中所述成分結合到脂質的制劑。例如可以皮內、皮下或靜脈內注射給藥。雖然在要給予的制劑中的本發(fā)明腫瘤抗原肽或其衍生物的量可以根據(jù)例如需要治療的疾病、患者的年齡和體重調適，但是通常每隔數(shù)天或數(shù)月給予0.0001mg-1000mg，優(yōu)選0.001mg-100mg，更優(yōu)選0.01mg-10mg。
此外，按照本發(fā)明用于治療或預防腫瘤的組合物也可以含有作為活性成分的重組DNA或重組多肽，該重組DNA含有至少一種編碼本發(fā)明腫瘤抗原肽或其衍生物的DNA，所述重組多肽可通過表達所述重組DNA獲得，詳見下文。
關于此，術語“重組DNA”是指編碼一部分本發(fā)明腫瘤抗原蛋白組成的部分多肽、部分肽、其衍生物、其中組合這類肽的多位(polytope)等的任何DNA。所有的DNA，只要它們含有至少一種編碼本發(fā)明腫瘤抗原肽或其衍生物的DNA，就均屬于本發(fā)明重組DNA范疇。這種重組DNA可摻入合適表達載體中以產生用于治療或預防腫瘤的藥用組合物含有的活性成分。
術語“多位”是指多種CTL表位的組合肽，而且最近已經應用編碼這種多位的DNA進行DNA疫苗接種。參見例如J.of Immunology,160，第1717頁，1998。可通過將編碼本發(fā)明腫瘤抗原肽或其衍生物的一種或多種DNA相互連接制備編碼本發(fā)明多位的DNA，需要的話，還可連接入編碼其它腫瘤抗原肽的DNA。
按照常規(guī)DNA合成和基因工程技術，例如按照標準講義如“Molecular Cloning”，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)所述，可容易地制備本發(fā)明的重組DNA。也可以按照標準講義等將所述重組DNA摻入表達載體。
按照例如測定本發(fā)明DNA活性的上述方法可測定以上制備的本發(fā)明重組DNA是否可以產生能夠結合HLA抗原并被CTL識別的腫瘤抗原肽。同樣，本發(fā)明的重組DNA用作治療藥物或預防藥物的方法與本發(fā)明DNA的方法相同。
如上所述，通過表達本發(fā)明重組DNA可獲得的“重組多肽”也可用于治療或預防腫瘤的藥用組合物。
可用與上述本發(fā)明蛋白相似的方法制備本發(fā)明的重組多肽。同樣，可按照與本發(fā)明蛋白相似的方法測定以上制備的本發(fā)明重組多肽是否具有一定活性。此外，本發(fā)明重組多肽用作治療藥物或預防藥物的方法與本發(fā)明蛋白或肽的方法相同。
本發(fā)明還提供特異性結合本發(fā)明腫瘤抗原蛋白、本發(fā)明腫瘤抗原肽或其衍生物的抗體。例如按照“Antibodies:A Laboratory Manual”,Lane,H.D.等編輯，C1od Spring Harbor Laboratory Press，紐約，1989中描述的方法容易制得這類抗體。準確地說，采用所述腫瘤抗原肽或其衍生物以常規(guī)方法適當免疫動物，可容易地制得識別本發(fā)明腫瘤抗原肽或其衍生物的抗體和進一步中和其活性的抗體。這類抗體可以用于親和層析、免疫診斷等。免疫診斷可根據(jù)需要選擇免疫印跡、放射性免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、熒光或發(fā)光測定等。
本發(fā)明的腫瘤抗原肽、其衍生物、腫瘤抗原蛋白、其基因、或本發(fā)明的重組DNA或重組多肽也可以如下體外用于治療腫瘤患者。
應用腫瘤抗原肽、其衍生物、腫瘤抗原蛋白或它們的基因治療腫瘤時，重要的是建立能夠在患者體內有效誘導特異性CTL的給藥方法。因此一種方法是，本發(fā)明提供其中HLA抗原和本發(fā)明腫瘤抗原肽或其衍生物之間的復合物提呈在從腫瘤患者分離的具有抗原提呈能力的細胞表面上的抗原提呈細胞，而且本發(fā)明還提供包含作為活性成分的所述抗原提呈細胞的治療腫瘤的藥用組合物。
在這方面，“具有抗原提呈能力的細胞”不限于具體細胞，前提是它是在其細胞表面上表達能夠提呈本發(fā)明腫瘤抗原肽或其衍生物的HLA抗原的細胞，優(yōu)選樹突細胞，據(jù)報道其提呈抗原的能力特別高。
需要加入以由上述具有抗原提呈能力的細胞制備本發(fā)明的抗原提呈細胞的物質可以是本發(fā)明腫瘤抗原肽或其衍生物以及本發(fā)明的DNA、蛋白質、重組DNA或重組多肽。當使用蛋白或DNA形式時，必須將其導入細胞中。
為了制備本發(fā)明的抗原提呈細胞，從腫瘤患者分離具有抗原提呈能力的細胞，并用本發(fā)明腫瘤抗原肽、其衍生物、腫瘤抗原蛋白或重組多肽體外進行脈沖處理，以提呈HLA抗原和所述腫瘤抗原肽或其衍生物之間的復合物(Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998；J.Immunol.158:1796,1997；Cancer Res.,59:1184,1999)。當使用樹突細胞時，例如可用以下步驟制備本發(fā)明抗原提呈細胞采用Ficoll法從腫瘤患者外周血分離淋巴細胞，去除非粘附細胞，在GM-CSF和IL-4存在下培養(yǎng)粘附細胞，以誘導樹突細胞，用本發(fā)明腫瘤抗原肽或腫瘤抗原蛋白等培養(yǎng)并脈沖處理所述樹突細胞。
當通過將本發(fā)明的DNA或重組DNA導入上述具有抗原提呈能力的細胞中制備本發(fā)明抗原提呈細胞時，所述基因可以是DNA或RNA形式。具體而言，可參閱例如Cancer Res,56:5672,1996或J.Immunol.,161:5607,1998使用DNA，而可通過參閱例如J.Exp.Med.,184:465,1996使用RNA。
用于治療腫瘤包含作為活性成分的上述抗原提呈細胞的藥用組合物最好含有生理鹽水、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、培養(yǎng)基等，以便穩(wěn)定維持所述抗原提呈細胞。例如可以靜脈內、皮下或皮內給予藥用組合物。通過將這樣的包含作為活性成分的抗原提呈細胞的治療腫瘤的組合物再導入所述患者體內，在所述SART-3陽性患者體內有效誘導特異性CTL，以實現(xiàn)腫瘤治療。確定無疑的是，所述患者和所用的肽之間的HLA類型需要匹配，因此HLA-A24限制性腫瘤抗原肽或其衍生物必須用于HLA-A24陽性腫瘤患者。
此外，在以下過繼免疫療法中體外應用按照本發(fā)明的腫瘤抗原肽、其衍生物、腫瘤抗原蛋白、其DNA、重組DNA或重組多肽為其另一應用實例。
在黑素瘤已經觀測到過繼免疫療法獲得的治療效應，其中體外大量培養(yǎng)從所述患者自身取出的腫瘤侵潤T細胞，然后再回輸給所述患者(J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159,1994)。同樣，在小鼠黑素瘤通過用腫瘤抗原肽TRP-2體外刺激脾細胞，因此增殖所述腫瘤抗原肽特異性CTL，然后將所述CTL給予移植黑素瘤的小鼠，觀測到對所述小鼠黑素瘤轉移的抑制(J.Exp.Med.,185:453,1997)。獲得這樣的結果是因為特異性識別抗原提呈細胞的HLA抗原和所述腫瘤抗原肽之間的復合物的CTL體外增殖所致。所以，認為治療腫瘤的方法是有效的，所述方法包括利用按照本發(fā)明的腫瘤抗原肽、其衍生物、腫瘤抗原蛋白或它們的DNA體外刺激患者的外周血淋巴細胞，以增殖腫瘤特異性CTL，然后將所述CTL返回所述患者體內。
因此，本發(fā)明提供特異性識別所述HLA抗原和所述腫瘤抗原肽或其衍生物之間的復合物的CTL，而且還提供包含作為活性成分的所述CTL的用于治療腫瘤的藥用組合物。這種組合物優(yōu)選含有生理鹽水、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、培養(yǎng)基等以穩(wěn)定保持CTL。例如可以靜脈內、皮下或皮內給予所述藥用組合物。通過將包含作為活性成分的CTL的用于治療腫瘤的組合物再導入所述患者體內，CTL針對所述腫瘤細胞的毒性作用在SART-3陽性患者中得到加強，而因此破壞所述腫瘤細胞，達到治療所述腫瘤。
按照本發(fā)明的腫瘤抗原肽、其衍生物、腫瘤抗原蛋白或其重組多肽也可以用作診斷腫瘤的診斷試劑活性成分。準確地說，通過將按照本發(fā)明的腫瘤抗原肽或其衍生物本身用作檢測得自懷疑患有腫瘤的患者的標本(例如血液或腫瘤組織)中存在的抗體的診斷試劑，可以早期檢測到腫瘤并可診斷腫瘤的復發(fā)和轉移。相同的方法也可用于選擇適用包含作為活性成分的例如本發(fā)明的腫瘤抗原肽的藥物的腫瘤患者。具體來說，可應用免疫印跡、RIA、ELISA或熒光或發(fā)光測定進行這樣的診斷。
此外，近年來，已經建立了利用所述抗原肽和HLA抗原之間的復合物檢測抗原特異性CTL的新型檢測方法(Science,274:94,1996)。通過將按照本發(fā)明的腫瘤抗原肽或其衍生物和HLA抗原之間的復合物用于上述檢測法，因此檢測腫瘤抗原特異性CTL，從而可以早期檢測腫瘤并診斷腫瘤的復發(fā)或轉移。相同的方法也可用于選擇適用包含作為活性成分的例如本發(fā)明的腫瘤抗原肽的藥物的腫瘤患者；或者用于確定所述藥物的治療作用。因此，本發(fā)明還提供包含按照本發(fā)明的腫瘤抗原肽或其衍生物的腫瘤診斷試劑。
具體來說，可以如下進行這樣的診斷制備按照文獻(Science,274:94,1996)所述方法熒光標記的HLA抗原和腫瘤抗原肽之間的復合物的四聚體，用其利用流式細胞儀定量檢測懷疑患有腫瘤的患者的外周血淋巴細胞中的所述抗原肽特異性CTL。
本發(fā)明還提供由得自結腸癌的腫瘤侵潤淋巴細胞建立的CTL的OK-CTL(保藏號FERM BP-6818)。已證實OK-CTL是HLA-A2-限制性的。所以，利用OK-CTL可發(fā)現(xiàn)新的腫瘤抗原蛋白和HLA-A2限制性腫瘤抗原肽。詳見下文的實施例8。
采用如下的脂質轉染法，用KE-4 cDNA的重組質粒和HLA-A2402 cDNA的重組質粒雙重轉染成纖維細胞系VA-13細胞(RIKENCELL BANK,The Institute of Physical and Chemical Research；Ann.Med.Exp.Biol.Fenn.,44:242-254,1966)。將7000個VA-13細胞加入96孔平底微量培養(yǎng)板的各孔中，在含有10％FCS的100μl RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。采用脂質轉染試劑(GIBCO BRL)，從70μl混合物中取30μl加入到VA-13細胞中，并使它們被雙重轉染，所述混合物組成為25μl相當于約100個轉化體的KE-4 cDNA重組質粒、10μl(200ng)參考2所述HLA-A2402 cDNA的重組質粒和35μl約稀釋35倍的脂質轉染試劑。復份制備轉染子。5小時后，將200μl含有10％FCS的培養(yǎng)基加入到所述轉染子中，再于37℃培養(yǎng)72小時。去除所述培養(yǎng)基后，每孔加入10,000個KE-4CTL細胞，在100μl含有10％FCS和25U/mlIL-2的培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)24小時?；厥账雠囵B(yǎng)基，如下所述用ELISA檢測所述培養(yǎng)物中的IFN-γ量。
具體地說，使抗人IFN-γ小鼠單克隆抗體吸附于96孔微量培養(yǎng)板的各孔上，用作固相抗體，用牛血清白蛋白封閉非特異性結合后，使所述抗體與上述樣品中的IFN-γ結合。然后使用作檢測抗體的抗人IFN-γ兔多克隆抗體與其結合，在與堿性磷酸酶標記的抗兔免疫球蛋白山羊抗體結合后，使用作顯色底物的磷酸對硝基苯酯反應。加入等體積1N NaOH猝滅該反應后，于405nm檢測吸光度。比較該吸光度與用標準IFN-γ獲得的吸光度，以確定所述樣品中的IFN-γ量。
關于其中觀察到高產量IFN-γ的各個組，將約100個含有KE-4cDNA重組質粒的轉化體的相應冷凍保藏合并物用于以下篩選。將所述轉化體合并物平板接種于含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上以獲得菌落。如上所述，培養(yǎng)每組的200個菌落使得每孔含有單一種類的轉化體，由此制備KE-4 cDNA的重組質粒DNA。然后，用KE-4 cDNA的重組質粒和HLA-A2402 cDNA的重組質粒雙重轉染VA-13細胞，然后與KE-4CTL共培養(yǎng)，如上所述定量檢測因KE-4CTL反應產生的IFN-γ，以便選擇陽性質粒。這樣，選擇了一個KE-4cDNA重組質?？寺〔⒚麨榭寺?3。另外的分析提示克隆13摻入約1.2kb cDNA。此外，用克隆13重復相似的步驟以按照上述相同方法檢測KE-4CTL產生的IFN-γ量。結果示于以下表2。表2靶細胞 KE-4CTL產生的IFN-γ量(pg/ml)VA-13細胞+HLA-A2402326VA-13細胞+HLA-A2402+克隆13 775與只用HLA-A2402轉染的VA-13細胞相比，KG-4CTL與用HLA-A2402和克隆13雙重轉染的VA13細胞反應更強烈并產生更多的IFN-γ。該結果表明克隆13編碼的蛋白是腫瘤抗原蛋白。
首先，采用RNAzol B(TEL-TEST,Inc.)從食管癌細胞系KE-4制備RNA。使5μg RNA在甲酰胺和甲醛存在下變性，在瓊脂糖上電泳，然后轉移并固定在Hybond-N+尼龍膜上(Amersham)。采用Multiprime DNA標記系統(tǒng)(Amersham)，用32P標記克隆13的插入序列區(qū)以制備DNA探針。按照已知方法(Nakayama等，Bio-Jikken-Illustrated，第二卷，“Idenshi-Kaiseki-No-Kiso(基因分析的基礎)”，第148-151頁，Shuiunsha,1995)，使該探針雜交到所述膜上的RNA，并進行放射性自顯影以檢測摻入克隆13的cDNA的mRNA，提示所述mRNA全長約3.8kb。然后克隆以上制備的克隆13中含有的所述全長cDNA克隆。將上述參考3所述的KE-4衍生的cDNA文庫平板接種于含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上獲得菌落。然后按照生產商的方案將菌落轉移并固定于Hybond-N+尼龍膜(Amersham)上。在上述相同條件下，應用其中用32p標記克隆13的插入序列的DNA探針進行雜交和放射性自顯影，以便選擇為陽性轉化體的菌落。然后從選定的許多菌落回收重組質粒，用限制酶NotⅠ和SAlⅠ處理，再后在瓊脂糖上電泳以確定摻入cDNA的長度。選擇摻入約3.8kb cDNA的重組質粒并命名為克隆K。用上述摻入所述腫瘤抗原蛋白基因cDNA的重組質?？寺和另一種含有HLA-A-2402cDNA的重組質粒雙重轉染VA-13細胞，將所述細胞用作靶細胞。按照上述方法測定KE-4CTL反應產生的IFN-γ量。結果見表3。表3靶細胞 KE-4CTL產生的IFN-γ量(pg/ml)VA-13細胞+HLA-A2403 342VA-13細胞+HLA-A2402+克隆K627與只用HLA-A2402轉染的VA-13細胞相比，KE-4CTL與用HLA-A2402和克隆K雙重轉染的VA13細胞反應更強烈并產生更多的IFN-γ。該結果表明克隆K編碼的蛋白是腫瘤抗原蛋白?？寺編碼的腫瘤抗原蛋白稱為SART-3(T細胞識別的鱗狀細胞癌抗原-3)。
然后按照文獻(J.Exp.Med.,187:277,1998)，用HLA-A2402 cDNA的重組質粒通過脂質轉染法轉染1.8×104VA-13細胞，以表達HLA-A2402。在2小時內以10μM向這些細胞中分別加入先前合成的具有HLA-A24結合基元的各種肽，以對所述細胞施以脈沖。然后將所述細胞與2×104KE-4CTL培養(yǎng)18小時，用ELISA法測定在培養(yǎng)物上清液中KE-4CTL產生的IFN-γ量。對腫瘤抗原蛋白SART-3的氨基酸序列中的7種肽進行的測定的結果見表4，所述7種肽是包括位置109-位置118的序列的肽“109-118”(SEQ ID NO:3)、包括位置172-位置181的序列的肽“172-181”(SEQ ID NO:4)、包括位置284-位置292的序列的肽“284-292”(SEQ ID NO:5)、包括位置315-位置323的序列的肽“315-323”(SEQ ID NO:6)、包括位置416-位置425的序列的肽“416-425”(SEQ ID NO:7)、包括位置426-位置434的序列的肽“426-434”(SEQ ID NO:8)和包括位置448-位置456的序列的肽“448-456”(SEQ ID NO:9)表4肽上清液IFN-γ(pg/ml)“109-118”928“172-181”830“284-292”794“315-323”880“416-425”731“426-434”833“448-456”754無 677與沒有用肽脈沖處理的細胞相比，KE-4CTL與用所述肽脈沖處理的細胞反應更強烈并產生更多的IFN-γ。該結果表明所述7種肽起腫瘤抗原肽的作用。
在該樹脂中加入2ml試劑K(5％苯酚，5％苯硫基甲烷，5％H2O和2.5％乙二硫酚的TFA溶液)，使該混合物在室溫下反應2.5小時。用冰冷卻的同時，向該反應物中加入10ml乙醚，攪拌該混合物10分鐘，過濾，用10ml乙醚洗滌。向該濾餅中加入10ml醋酸水溶液，攪拌該混合物30分鐘。然后過濾該樹脂，用4mL醋酸水溶液洗滌。凍干濾液和洗滌液后，將獲得粗品肽溶解于醋酸水溶液中，并注射入用0.1％TFA水溶液預平衡的反相填料YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗滌該柱，然后在180分鐘內將乙腈濃度升高至25％的同時，以7ml/min的流速進行洗脫。以A220nm監(jiān)測洗出液。將含有所需產物的流分合并在一起并凍干獲得31.0mgVal-Tyr-Asp-Tyr-Asn-Cys-His-Val-Asp-Leu。
用含0.1％TFA的16-46％乙腈線性濃度梯度洗脫的反相填料YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)分析，所獲得的肽Val-Tyr-Asp-Tyr-Asn-Cys-His-Val-Asp-Leu的保留時間為19.3分鐘，所述產物的氨基酸分析(未檢測Cys)和質譜結果與理論值一致。
氨基酸分析水解1％苯酚/6N鹽酸水溶液，110℃,8小時；分析方法茚三酮法；*參比氨基酸；理論值標示于括號內。
Asx:2.77(3)Val:1.70(2)*Leu:1.00(1)Tyr:1.98(2)His:0.91(1)質譜(FAB)[M+H]+:1241表5流程1步驟處理時間(分鐘)×處理次數(shù)1．(洗滌)DMF 1.2ml 1×22．(去保護)50％哌啶/DMF 12×13．(洗滌)DMF 1.2ml 1×74．(偶聯(lián))氨基保護的各氨基酸(5當 30×1量)/NMP溶液0.9ml,DIC(5當量)/NMP溶液0.3ml5．(洗滌)DMF 1.2ml 1×26．(偶聯(lián))氨基保護的各氨基酸(5當 30×1量)/NMP溶液0.9ml,DIC(5當量)/NMP溶液0.3ml7．(洗滌)DMF 1.2ml 1×4(2)合成SART-3“172-181”Leu-Phe-Glu-Lys-Ala-Val-Lys-Asp-Tyr-Ile(SEQ ID NO:4)按照類似于上述(1)的方法，用100mg Fmoc-Ile-Alko樹脂(0.41mmol/g,100-200目)，依次偶聯(lián)Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH和Fmoc-Leu-OH，然后將產物去保護。將獲得的粗品肽溶解于醋酸水溶液中，并注射入用0.1％TFA水溶液預平衡的反相填料YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗滌該柱，然后在300分鐘內將乙腈濃度升高至30％的同時，以7ml/min流速進行洗脫。以A 220nm監(jiān)測洗出液。將含有所需產物的流分合并在一起并凍干獲得66.3mg Leu-Phe-Glu-Lys-Ala-Val-Lys-Asp-Tyr-Ile。
在用含有0.1％TFA的12-42％線性濃度梯度乙腈洗脫的反相填料YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)的分析中，所獲得的肽Leu-Phe-Glu-Lys-Ala-Val-Lys-Asp-Tyr-Ile的保留時間為23.8分鐘，所述產物的氨基酸分析以及質譜結果與理論值一致。
氨基酸分析水解1％苯酚/6N鹽酸水溶液，110℃,12小時；分析方法茚三酮法；*參比氨基酸；理論值標示于括號內。
Asx: 0.94(1)Glx:1.03(1)Ala:1.00(1)Val:0.88(1)Ile:0.92(1)*Leu:1.00(1)Tyr:0.96(1)Phe:0.97(1)Lys:1.45(2)質譜(FAB):[M+H]+:1225(3)合成SART-3“284-292”Asn-Tyr-Asn-Lys-Ala-Leu-Gln-Gln-Leu(SEQ ID NO:5)按照類似于上述(1)的方法，用100mg Fmoc-Leu-Alko樹脂，依次偶聯(lián)Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Asn-OH，然后將產物去保護。將獲得的粗品肽溶解于醋酸水溶液中，并注射入用0.1％TFA水溶液預平衡的反相填料YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗滌該柱，然后在300分鐘內將乙腈濃度升高至30％的同時，以7ml/min流速進行洗脫。以A220nm監(jiān)測洗出液。將含有所需產物的流分合并在一起并凍干獲得25.0mg Asn-Tyr-Asn-Lys-Ala-Leu-Gln-GLn-Leu。
在用含有0.1％TFA的12-42％線性濃度梯度乙腈洗脫的反相填料YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)的分析中，所獲得的肽Asn-Tyr-Asn-Lys-Ala-Leu-Gln-GLn-Leu的保留時間為19.0分鐘，所述產物的氨基酸分析以及質譜結果與理論值一致。
氨基酸分析水解1％苯酚/6N鹽酸水溶液，110℃,12小時；分析方法茚三酮法；*參比氨基酸；理論值標示于括號內。
Asx:1.87(2)Glx:2.03(2)Ala:0.98(1)*Leu:2.00(2)Tyr:0.99(1)Lys:0.97(1)質譜(FAB):[M+H]+:1091(4)合成SART-3“315-323”Ala-Tyr-Ile-Asp-Phe-Glu-Met-Lys-Ile(SEQ ID NO:6)按照類似于上述(1)的方法，用100mg Fmoc-Ile-Alko樹脂(0.62mmol/g,100-200目)，依次偶聯(lián)Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Ala-OH，然后將產物去保護。將獲得的粗品肽溶解于醋酸水溶液中，并注射入用0.1％TFA水溶液預平衡的反相填料YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗滌該柱，然后在180分鐘內將乙腈濃度升高至40％的同時，以7ml/min流速進行洗脫。以A220nm監(jiān)測洗出液。將含有所需產物的流分合并在一起并凍干獲得15.4mg Ala-Tyr-Ile-Asp-Phe-Glu-Met-Lys-Ile。
在用含有0.1％TFA的21-51％線性濃度梯度乙腈洗脫的反相填料YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)的分析中，所獲得的肽Ala-Tyr-Ile-Asp-Phe-Glu-Met-Lys-Ile的保留時間為19.6分鐘，所述產物的氨基酸分析(未檢測Met)以及質譜結果與理論值一致。
氨基酸分析水解1％苯酚/6N鹽酸水溶液，110℃,12小時；分析方法茚三酮法；*參比氨基酸；理論值標示于括號內Asx:0.91(1)Glx:1.06(1)Ala:1.06(1)Ile:1.69(2)Tyr:0.81(1)*Phe:1.00(1)Lys:0.87(1)質譜(FAB):[M+H]+:1130(5)合成SART-3“416-425”Asp-Tyr-Val-Glu-Ile-Trp-Gln-Ala-Tyr-Leu(SEQ ID NO:7)按照類似于上述(1)的方法，用100mg Fmoc-Leu-Alko樹脂，依次偶聯(lián)Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Asp(OtBu)-OH，然后將產物去保護。將獲得的粗品肽溶解于醋酸水溶液中，并注射入用0.1％TFA水溶液預平衡的反相填料YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗滌該柱，然后在180分鐘內將乙腈濃度升高至35％的同時，以7ml/min流速進行洗脫。以A220nm監(jiān)測洗出液。將含有所需產物的流分合并在一起并凍干獲得18.9mg Asp-Tyr-Val-Glu-Ile-Trp-Gln-Ala-Tyr-Leu。
在用含有0.1％TFA的25-55％線性濃度梯度乙腈洗脫的反相填料YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)的分析中，所獲得的肽Asp-Tyr-Val-Glu-Ile-Trp-Gln-Ala-Tyr-Leu的保留時間為20.5分鐘，所述產物的氨基酸分析(未檢測Trp)以及質譜結果與理論值一致。
氨基酸分析水解1％苯酚/6N鹽酸水溶液，110℃,10小時；分析方法茚三酮法；*參比氨基酸；理論值標示于括號內Asx:1.00(1)Glx:2.09(2)Ala:1.04(1)Val:0.89(1)Ile:0.86(1)*Leu:1.00(1)Tyr:1.95(2)質譜(FAB):[M+H]+:1300(6)合成SART-3“426-434”Asp-Tyr-Leu-Arg-Arg-Arg-Val-Asp-Phe(SEQ ID NO:8)按照類似于上述(1)的方法，用100mg Fmoc-Phe-Alko樹脂(0.72mmol/g,100-200目)，依次偶聯(lián)Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Asp(OtBu)-OH，然后將產物去保護。將獲得的粗品肽溶解于醋酸水溶液中，并注射入用0.1％TFA水溶液預平衡的反相填料YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗滌該柱，然后以7ml/min流速進行洗脫，同時在240分鐘內將乙腈濃度升高至25％。以A220nm監(jiān)測洗出液。將含有所需產物的流分合并在一起并凍干獲得34.0mg Asp-Tyr-Leu-Arg-Arg-Arg-Val-Asp-Phe。
在用含有0.1％TFA的12-42％線性濃度梯度乙腈洗脫的反相填料YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)的分析中，所獲得的肽Ala-Tyr-Leu-Arg-Arg-Arg-Val-Asp-Phe的保留時間為20.1分鐘，所述產物的氨基酸分析以及質譜結果與理論值一致。
氨基酸分析水解1％苯酚/6N鹽酸水溶液，110℃,12小時；分析方法茚三酮法；*參比氨基酸；理論值標示于括號內:
Asx:1.90(2)Val:0.95(1)*Leu:1.00(1)Tyr:1.00(1)Phe:0.99(1)Arg:2.93(3)質譜(FAB):[M+H]+:1239(7)合成SART-3“448-456”Ala-Phe-Thr-Arg-Ala-Leu-Glu-Tyr-Leu(SEQ ID NO:9)按照類似于上述(1)的方法，用100mg Fmoc-Leu-Alko樹脂，依次偶聯(lián)Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH和Fmoc-Ala-OH，然后將產物去保護。將獲得的粗品肽溶解于醋酸水溶液中，并注射入用0.1％TFA水溶液預平衡的反相填料YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)。用0.1％TFA水溶液洗滌該柱，然后以7ml/min流速進行洗脫，同時在240分鐘內將乙腈濃度升高至30％。以A220nm監(jiān)測洗出液。將含有所需產物的流分合并在一起并凍干獲得22.8mg Ala-Phe-Thr-Arg-Ala-Leu-Glu-Tyr-Leu。
在用含有0.1％TFA的20-50％線性濃度梯度乙腈洗脫的反相填料YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)的分析中，所獲得的肽Ala-Phe-Thr-Arg-Ala-Leu-Glu-Tyr-Leu的保留時間為18.1分鐘，所述產物的氨基酸分析以及質譜結果與理論值一致。
氨基酸分析水解1％苯酚/6N鹽酸水溶液，110℃,12小時；分析方法茚三酮法；*參比氨基酸；理論值標示于括號內Thr:0.91(1)Glx:1.03(1)Ala:1.91(2)*Leu:2.00(2)Tyr:1.00(1)Phe:0.97(1)Arg:0.97(1)質譜(FAB):[M+H]+:1083實施例6用腫瘤抗原肽及其衍生物從外周血淋巴細胞誘導CTL研究了用實施例5合成的肽“109-118”(SEQ ID NO:3)和“315-323”(SEQ ID NO:6)從外周血淋巴細胞誘導抗原特異性CTL的能力。
采用Ficoll法從HLA-A基因座的A24雜合子(分別稱為HD1和HD2)的健康提供者的外周血分離淋巴細胞。將淋巴細胞以2×106細胞/孔加入24孔培養(yǎng)板的各孔中，并用淋巴細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。以10μM將上述腫瘤抗原肽加入所述培養(yǎng)基中刺激外周血淋巴細胞。1周后，加入上述腫瘤抗原肽達到10μM，同時加入約2×105X-輻射(50 Gy)的外周血淋巴細胞，以進行第二次刺激。再過1周后，以相同的方法進行第三次刺激。第三次刺激后1周收獲培養(yǎng)的淋巴細胞。用以下兩種細胞作靶細胞(1×104細胞)表達SART-3的HLA-A2402-陽性的白血病T細胞系MT-2和表達SART-3的HLA-A2402-陰性的白血病T細胞系RPMI8402，按照類似于實施例1的ELISA檢測法檢測上述淋巴細胞(8×104細胞)應答所述靶細胞時在培養(yǎng)基中產生的IFN-γ量。結果見表6。表6上清液中的IFN-γ(pg/ml)HD1 HD2抗原肽 MT-2RPMI8402 MT-2RPMI8402“109-118” 1771159 207828“315-323” 204126 974 40無 552 154 413 69用“109-118”和“315-323”肽刺激的外周血淋巴細胞與HLA-A24-陽性MT-2反應，而不能與HLA-A24-陰性細胞RPMI8402反應，說明誘導HLA-A24-限制性類型的腫瘤抗原肽特異性CTL。
同樣，用HLA-A24 cDNA的表達質粒導入其中而且用上述肽脈沖處理的COS-7細胞(ATCC號CRL1651)或VA-13細胞(RIKEN CELLBANK,The Institute of Physical and Chemical Research)代替在上述試驗中使用的MT-2，可進行相似的試驗(J.Exp.Med.,187:277,1998)。
按照Naka等Cancer Res,55:4248-4252(1995)的描述，由SW620細胞(ATCC號CCL-227)制備其中HLA-A0201(GenBank收錄號M84379)的cDNA已導入表達載體pCR3(INVITROGEN)的重組質粒。用以下轉化體作靶細胞通過采用類似于實施例1的脂質轉染法，用摻入SART-3基因cDNA的重組質粒克隆K和摻入HLA-A0201cDNA的重組質粒雙重轉染非洲綠猴腎臟細胞系COS-7(ATCC號CRL1615)(1×104細胞)制備的轉化體，用ELISA測定5×104OK-CTL在應答所述靶細胞時產生的IFN-γ量。對照組為未用質粒轉染的非處理組以及其中用重組質?？寺和摻入HLA-A2402 cDNA的重組質粒雙重轉染的組。結果見表7。表7靶細胞OK-CTL產生的IFN-γ量(pg/ml)COS-7 653COS-7+HLA-A0201+K 2401COS-7+HLA-A2402+K 600與其它靶細胞組相比，OK-4CTL與用摻入SART-3基因cDNA的重組質?？寺和摻入HLA-A0201 cDNA的重組質粒雙重轉染的靶細胞反應更強烈并產生更多的IFN-γ。該結果表明腫瘤抗原蛋白SART-3的抗原肽提呈在HLA-A0201上，而且OK-CTL識別它，提示SART-3含有HLA-A2限制性腫瘤抗原肽。
然后在2小時內以10μM用預先合成的預期能夠結合HLA-A0201的各種肽，對1×104T2細胞施以脈沖，其中T2細胞是HLA-A0201陽性而且缺乏提呈內源肽能力的T-B雜交瘤細胞系。然后將所述細胞與6×104OK-CTL培養(yǎng)18小時，用ELISA法測定在培養(yǎng)物上清液中OK-CTL產生的IFN-γ量。對腫瘤抗原蛋白SART-3的氨基酸序列中的5種肽進行的測定的結果見表8，所述5種肽是包括位置152-位置160的序列的肽“152-160”(SEQ ID NO:25)、包括位置249-位置257的序列的肽“249-257”(SEQ ID NO:26)、包括位置302-位置310的序列的肽“302-310”(SEQ ID NO:27)、包括位置309-位置317的序列的肽“309-317”(SEQ ID NO:28)和包括位置386-位置394的序列的肽“386-394”(SEQ ID NO:29)。表8肽 上清液IFN-γ(pg/ml)*“152-160” 162“249-257” 209“302-310” 190“309-317” 213“386-394” 122*其中數(shù)值為減去未用肽脈沖處理的T2細胞產生的IFN-γ量的數(shù)值。
與沒有用肽脈沖處理的細胞相比，KE4-CTL與用所述肽脈沖處理的細胞反應更強烈并產生更多的IFN-γ。該結果表明這5種肽起HLA-A2限制性腫瘤抗原肽的作用。
同樣，用HLA-A2402 cDNA的表達質粒導入其中的COS-7細胞(ATCC號CRL1651)或VA-13細胞(RIKEN CELL BANK,The Instituteof Physical and Chemical Research)代替在本試驗中使用的T2細胞，可進行相似的試驗(J.Exp.Med.,187:277,1998)。序列表獨立文本在SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列中，第二個氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第十個氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
在SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列中，第二個氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第十個氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
在SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列中，第二個氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第九個氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
在SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列中，第二個氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第九個氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
在SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列中，第二個氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第十個氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
在SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列中，第二個氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第九個氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
在SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列中，第二個氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第九個氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
在SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列中，第二個氨基酸為亮氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或谷氨酰胺，而第九個氨基酸為纈氨酸或亮氨酸。
在SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列中，第二個氨基酸為亮氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或谷氨酰胺，而第九個氨基酸為纈氨酸或亮氨酸。
在SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列中，第二個氨基酸為亮氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或谷氨酰胺，而第九個氨基酸為纈氨酸或亮氨酸。
在SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列中，第二個氨基酸為亮氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或谷氨酰胺，而第九個氨基酸為纈氨酸或亮氨酸。
在SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列中，第二個氨基酸為亮氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或谷氨酰胺，而第九個氨基酸為纈氨酸或亮氨酸。
工業(yè)適用性按照本發(fā)明能夠提供新型腫瘤抗原蛋白及其基因、源自所述抗原蛋白的腫瘤抗原肽及其衍生物、以及體內或體外利用所述腫瘤抗原蛋白、基因、腫瘤抗原肽或其衍生物治療、預防或診斷腫瘤。
序列表<110>ITOH,Kyogo；Sumitomo Pharmaceuticals Company,Limited<120>新型腫瘤抗原SART-3及其腫瘤抗原肽<130>661463<150>日本98-242660<151>28.08.98<160>64<210>1<211>963<212>PRT<213> 人<400> 1Met Ala Thr Ala Ala Glu Thr Ser Ala Ser Glu Pro Glu Ala Glu Ser5 10 15Lys Ala Gly Pro Lys Ala Asp Gly Glu Glu Asp Glu Val Lys Ala Ala20 25 30Arg Thr Arg Arg Lys Val Leu Ser Arg Ala Val Ala Ala Ala Thr Tyr35 40 45Lys Thr Met Gly Pro Ala Trp Asp Gln Gln Glu Glu Gly Val Ser Glu50 55 60Ser Asp Gly Asp Glu Tyr Ala Met Ala Ser Ser Ala Glu Ser Ser Pro65 70 75 80Gly Glu Tyr Glu Trp Glu TyrAsp Glu Glu Glu Glu Lys Asn Gln Leu85 90 95Glu Ile Glu Arg Leu Glu Glu Gln Leu Ser Ile Asn Val Tyr Asp Tyr100 105 110Asn Cys His Val Asp Leu Ile Arg Leu Leu Arg Leu Glu Gly Glu Leu115 120 125Thr Lys Val Arg Met Ala Arg Gln Lys Met Ser Glu Ile Phe Pro Leu130 135 140Thr Glu Glu Leu Trp Leu Glu Trp Leu His Asp Glu Ile Ser Met Ala145 150 155 160Gln Asp Gly Leu Asp Arg Glu His Val Tyr Asp Leu Phe Glu Lys Ala165 170 175Val Lys Asp Tyr Ile Cys Pro Asn Ile Trp Leu Glu Tyr Gly Gln Tyr180 185 190Ser Val Gly Gly Ile Gly Gln Lys Gly Gly Leu Glu Lys Val Arg Ser195 200 205Val Phe Glu Arg Ala Leu Ser Ser Val Gly Leu His Met Thr Lys Gly210 215 220Leu Ala Leu Trp Glu Ala Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Ala Ile Val Glu225 230 235 240Ala Ala Arg Leu Glu Lys Val His Ser Leu Phe Arg Arg Gln Leu Ala245 250 255Ile Pro Leu Tyr Asp Met Glu Ala Thr Phe Ala Glu Tyr Glu Glu Trp260 265 270Ser Glu Asp Pro Ile Pro Glu Ser Val Ile Gln Asn Tyr Asn Lys Ala275 280 285Leu Gln Gln Leu Glu Lys Tyr Lys Pro Tyr Glu Glu Ala Leu Leu Gln290 295 300Ala Glu Ala Pro Arg Leu Ala Glu Tyr Gln Ala Tyr Ile Asp Phe Glu305 310 315 320Met Lys Ile Gly Asp Pro Ala Arg Ile Gln Leu Ile Phe Glu Arg Ala325 330 335Leu Val Glu Asn Cys Leu Val Pro Asp Leu Trp Ile Arg Tyr Ser Gln340 345 350Tyr Leu Asp Arg Gln Leu Lys Val Lys Asp Leu Val Leu Ser Val His
355 360 365Asn Arg Ala lle Arg Asn Cys Pro Trp Thr Val Ala Leu Trp Ser Arg370 375 380Tyr Leu Leu Ala Met Glu Arg His Gly Val Asp His Gln Val Ile Ser385 390 395 400Val Thr Phe Glu Lys Ala Leu Asn Ala Gly Phe Ile Gln Ala Thr Asp405 410 415Tyr Val Glu Ile Trp Gln Ala Tyr Leu Asp Tyr Leu Arg Arg Arg Val420 425 430Asp Phe Lys Gln Asp Ser Ser Lys Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Ala435 440 445Phe Thr Arg Ala Leu Glu Tyr Leu Lys Gln Glu Val Glu Glu Arg Phe450 455 460Asn Glu Ser Gly Asp Pro Ser Cys Val Ile Met Gln Asn Trp Ala Arg465 470 475 480Ile Glu Ala Arg Leu Cys Asn Asn Met Gln Lys Ala Arg Glu Leu Trp485 490 495Asp Ser Ile Met Thr Arg Gly Asn Ala Lys Tyr Ala Asn Met Trp Leu500 505 510Glu Tyr Tyr Asn Leu Glu Arg Ala His Gly Asp Thr Gln His Cys Arg515 520 525Lys Ala Leu His Arg Ala Val Gln Cys Thr Ser Asp TyrPro Glu His530 535 540Val Cys Glu Val Leu Leu Thr Met Glu Arg Thr Glu Gly Ser Leu Glu545 550 555 560Asp Trp Asp Ile Ala Val Gln Lys Thr Glu Thr Arg Leu Ala Arg Val565 570 575Asn Glu Gln Arg Met Lys Ala Ala Glu Lys Glu Ala Ala Leu Val Gln580 585 590Gln Glu Glu Glu Lys Ala Glu Gln Arg Lys Arg Ala Arg Ala Glu Lys595 600 605Lys Ala Leu Lys Lys Lys Lys Lys Ile Arg Gly Pro Glu Lys Arg Gly610 615 620Ala Asp Glu Asp Asp Glu Lys Glu Trp Gly Asp Asp Glu Glu Glu Gln625 630 635 640Pro Ser Lys Arg Arg Arg Val Glu Asn Ser Ile Pro Ala Ala Gly Glu645 650 655Thr Gln Asn Val Glu Val Ala Ala Gly Pro Ala Gly Lys Cys Ala Ala660 665 670Val Asp Val Glu Pro Pro Ser Lys Gln Lys Glu Lys Ala Ala Ser Leu675 680 685Lys Arg Asp Met Pro Lys Val Leu His Asp Ser Ser Lys Asp Ser Ile690 695 700Thr Val Phe Val Ser Asn Leu Pro Tyr Ser Met Gln Glu Pro Asp Thr705 710 715 720Lys Leu Arg Pro Leu Phe Glu Ala Cys Gly Glu Val Val Gln Ile Arg725 730 735Pro Ile Phe Ser Asn Arg Gly Asp Phe Arg Gly Tyr Cys Tyr Val Glu740 745 750Phe Lys Glu Glu Lys Ser Ala Leu Gln Ala Leu Glu Met Asp Arg Lys755 760 765Ser Val Glu Gly Arg Pro Met Phe Val Ser Pro Cys Val Asp Lys Ser770 775 780Lys Asn Pro Asp Phe Lys Val Phe Arg Tyr Ser Thr Ser Leu Glu Lys785 790 795 800His Lys Leu Phe Ile Ser Gly Leu Pro Phe Ser Cys Thr Lys Glu Glu805 810 815Leu Glu Glu Ile Cys Lys Ala His Gly Thr Val Lys Asp Leu Arg Leu
820 825 830Val Thr Asn Arg Ala Gly Lys Pro Lys Gly Leu Ala Tyr Val Glu Tyr835 840 845Glu Asn Glu Ser Gln Ala Ser Gln Ala Val Met Lys Met Asp Gly Met850 855 860Thr Ile Lys Glu Asn Ile Ile Lys Val Ala Ile Ser Asn Pro Pro Gln865 870 875 880Arg Lys Val Pro Glu Lys Pro Glu Thr Arg Lys Ala Pro Gly Gly Pro885 890 895Met Leu Leu Pro Gln Thr Tyr Gly Ala Arg Gly Lys Gly Arg Thr Gln900 905 910Leu Ser Leu Leu Pro Arg Ala Leu Gln Arg Pro Ser Ala Ala Ala Pro915 920 925Gln Ala Glu Asn Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala Pro Ala930 935 940Ala Thr Glu Ala Pro Lys Met Ser Asn Ala Asp Phe Ala Lys Leu Phe945 950 955 960Leu Arg Lys963<210> 2<211> 3798<212> DNA<213> 人<400> 2ccacgcgtcc g atg gcg act gcg gcc gaa acc tcg gct tca gaa ccc gag 50Met Ala Thr Ala Ala Glu Thr Ser Ala Ser Glu Pro Glu5 10gct gag tcc aag gct ggg ccc aag gct gac gga gag gag gat gag gtt 98Ala Glu Ser Lys Ala Gly Pro Lys Ala Asp Gly Glu Glu Asp Glu Val15 20 25aag gcg gct agg aca agg aga aag gtg tta tcg cgg gct gtg gcc gct 146Lys Ala Ala Arg Thr Arg Arg Lys Val Leu Ser Arg Ala Val Ala Ala30 35 40 45gcg aca tac aag acc atg ggg cca gcg tgg gat cag cag gag gaa ggc 194Ala Thr Tyr Lys Thr Met Gly Pro Ala Trp Asp Gln Gln Glu Glu Gly50 55 60gtg agc gag agc gat ggg gat gag tac gcc atg gct tcc tcc gcg gag 242Val Ser Glu Ser Asp Gly Asp Glu Tyr Ala Met Ala Ser Ser Ala Glu65 70 75agc tcc ccc ggg gag tac gag tgg gaa tat gac gaa gag gag gag aaa 290Ser Ser Pro Gly Glu Tyr Glu Trp Glu Tyr Asp Glu Glu Glu Glu Lys80 85 90aac cag ctg gag att gag aga ctg gag gag cag ttg tct atc aac gtc 338Asn Gln Leu Glu Ile Glu Arg Leu Glu Glu Gln Leu Ser Ile Asn Val95 100 105tat gac tac aac tgc cat gtg gac ttg atc aga ctg ctc agg ctg gaa 386Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu Ile Arg Leu Leu Arg Leu Glu110 115 120 125ggg gag ctt acc aag gtg agg atg gcc cgc cag aag atg agt gaa atc 434Gly Glu Leu Thr Lys Val Arg Met Ala Arg Gln Lys Met Ser Glu Ile130 135 140ttt ccc ttg act gaa gag ctc tgg ctg gag tgg ctg cat gac gag atc 482Phe Pro Leu Thr Glu Glu Leu Trp Leu Glu Trp Leu His Asp Glu Ile145 150 155agc atg gcc cag gat ggc ctg gac aga gag cac gtg tat gac ctc ttt 530Ser Met Ala Gln Asp Gly Leu Asp Arg Glu His Val Tyr Asp Leu Phe160 165 170gag aaa gcc gtg aag gat tac att tgt cct aac att tgg cta gag tat 578Glu Lys Ala Val Lys Asp Tyr Ile Cys Pro Asn Ile Trp Leu Glu Tyr175 180 185ggc cag tac tca gtt ggt ggg att ggt cag aaa ggt ggc ctt gag aaa 626Gly Gln Tyr Ser Val Gly Gly Ile Gly Gln Lys Gly Gly Leu Glu Lys190 195 200 205gtt cgc tcc gtg ttt gaa agg gct ctc tcg tct gtt ggt tta cat atg 674Val Arg Ser Val Phe Glu Arg Ala Leu Ser Ser Val Gly Leu His Met210 215 220acc aaa gga ctc gcc ctc tgg gag gct tac cga gag ttt gaa agt gcg 722Thr Lys Gly Leu Ala Leu Trp Glu Ala Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Ala225 230 235att gtg gaa gct gct cgg ctt gag aaa gtc cac agt ctt ttc cgg cga 770Ile Val Glu Ala Ala Arg Leu Glu Lys Val His Ser Leu Phe Arg Arg240 245 250cag ttg gcg atc cca ctc tat gat atg gag gcc aca ttt gca gag tat 818Gln Leu Ala Ile Pro Leu Tyr Asp Met Glu Ala Thr Phe Ala Glu Tyr255 260 265gaa gaa tgg tca gaa gac cca ata cca gag tca gta att cag aac tat 866Glu Glu Trp Ser Glu Asp Pro Ile Pro Glu Ser Val Ile Gln Asn Tyr270 275 280 285aac aaa gca cta cag cag ctg gag aaa tat aaa ccc tat gaa gaa gca 914Asn Lys Ala Leu Gln Gln Leu Glu Lys Tyr Lys Pro Tyr Glu Glu Ala290 295 300ctg ttg cag gca gag gca cca agg ctg gca gaa tat caa gca tat atc 962Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu Ala Glu Tyr Gln Ala Tyr Ile305 310 315gat ttt gag atg aaa att ggc gat cct gct cgc att cag ttg atc ttt 1010Asp Phe Glu Met Lys Ile Gly Asp Pro Ala Arg Ile Gln Leu Ile Phe
320 325 330gag cgc gcc ctg gtc gag aac tgc ctt gtc cca gac tta tgg atc cgt 1058Glu Arg Ala Leu Val Glu Asn Cys Leu Val Pro Asp Leu Trp Ile Arg335 340 345tac agt cag tac cta gat cga caa ctg aaa gta aag gat ttg gtt tta 1106Tyr Ser Gln Tyr Leu Asp Arg Gln Leu Lys Val Lys Asp Leu Val Leu350 355 360 365tct gta cat aac cgc gct att aga aac tgc ccc tgg aca gtt gcc tta 1154Ser Val His Asn Arg Ala Ile Arg Asn Cys Pro Trp Thr Val Ala Leu370 375 380tgg agt cgg tac ctc ttg gcc atg gag aga cat gga gtt gat cat caa 1202Trp Ser Arg Tyr Leu Leu Ala Met Glu Arg His Gly Val Asp His Gln385 390 395gta att tct gta acc ttc gag aaa gct ttg aat gcc ggc ttc atc cag 1250Val Ile Ser Val Thr Phe Glu Lys Ala Leu Asn Ala Gly Phe Ile Gln400 405 410gcc act gat tat gtg gag att tgg cag gca tac ctt gat tac ctg agg 1298Ala Thr Asp Tyr Val Glu Ile Trp Gln Ala Tyr Leu Asp Tyr Leu Arg415 420 425aga agg gtt gat ttc aaa caa gac tcc agt aaa gag ctg gag gag ttg 1346Arg Arg Val Asp Phe Lys Gln Asp Ser Ser Lys Glu Leu Glu Glu Leu430 435 440 445agg gcc gcc ttt act cgt gcc ttg gag tat ctg aag cag gag gtg gaa 1394Arg Ala Ala Phe Thr Arg Ala Leu Glu Tyr Leu Lys Gln Glu Val Glu450 455 460gag cgt ttc aat gag agt ggt gat cca agc tgc gtg att atg cag aac 1442Glu Arg Phe Asn Glu Ser Gly Asp Pro Ser Cys Val Ile Met Gln Asn465 470 475tgg gct agg att gag gct cga ctg tgc aat aac atg cag aaa gct cgg 1490Trp Ala Arg Ile Glu Ala Arg Leu Cys Asn Asn Met Gln Lys Ala Arg480 485 490gaa ctc tgg gat agc atc atg acc aga gga aat gcc aag tac gcc aac 1538Glu Leu Trp Asp Ser Ile Met Thr Arg Gly Asn Ala Lys Tyr Ala Asn495 500 505atg tgg cta gag tat tac aac ctg gaa aga gct cat ggt gac acc cag 1586Met Trp Leu Glu Tyr Tyr Asn Leu Glu Arg Ala His Gly Asp Thr Gln510 515 520 525cac tgc cgg aag gct ctg cac cgg gcc gtc cag tgc acc agt gac tac 1634His Cys Arg Lys Ala Leu His Arg Ala Val Gln Cys Thr Ser Asp Tyr530 535 540cca gag cac gtc tgc gaa gtg tta ctc acc atg gag agg aca gaa ggt 1682Pro Glu His Val Cys Glu Val Leu Leu Thr Met Glu Arg Thr Glu Gly545 550 555tct tta gaa gat tgg gat ata gct gtt cag aaa act gaa acc cga tta 1730Ser Leu Glu Asp Trp Asp Ile Ala Val Gln Lys Thr Glu Thr Arg Leu560 565 570gct cgt gtc aat gag cag aga atg aag gct gca gag aag gaa gca gcc 1778Ala Arg Val Asn Glu Gln Arg Met Lys Ala Ala Glu Lys Glu Ala Ala575 580 585ctt gtg cag caa gaa gaa gaa aag gct gaa caa cgg aaa aga gct cgg 1826Leu Val Gln Gln Glu Glu Glu Lys Ala Glu Gln Arg Lys Arg Ala Arg590 595 600 605gct gag aag aaa gcg tta aaa aag aag aaa aag atc aga ggc cca gag 1874Ala Glu Lys Lys Ala Leu Lys Lys Lys Lys Lys Ile Arg Gly Pro Glu610 615 620aag cgc gga gca gat gag gac gat gag aaa gag tgg ggc gat gat gaa 1922Lys Arg Gly Ala Asp Glu Asp Asp Glu Lys Glu Trp Gly Asp Asp Glu625 630 635gaa gag cag cct tcc aaa cgc aga agg gtc gag aac agc atc cct gca 1970Glu Glu Gln Pro Ser Lys Arg Arg Arg Val Glu Asn Ser Ile Pro Ala640 645 650gct gga gaa aca caa aat gta gaa gta gca gca ggg ccc gct ggg aaa 2018Ala Gly Glu Thr Gln Asn Val Glu Val Ala Ala Gly Pro Ala Gly Lys655 660 665tgt get gcc gta gat gtg gag ccc cct tcg aag cag aag gag aag gca 2066Cys Ala Ala Val Asp Val Glu Pro Pro Ser Lys Gln Lys Glu Lys Ala670 675 680 685gcc tcc ctg aag agg gac atg ccc aag gtg ctg cac gac agc agc aag 2114Ala Ser Leu Lys Arg Asp Met Pro Lys Val Leu His Asp Ser Ser Lys690 695 700gac agc atc acc gtc ttt gtc agc aac ctg ccc tac agc atg cag gag 2162Asp Ser Ile Thr Val Phe Val Ser Asn Leu Pro Tyr Ser Met Gln Glu705 710 715ccg gac acg aag ctc agg cca ctc ttc gag gcc tgt ggg gag gtg gtc 2210Pro Asp Thr Lys Leu Arg Pro Leu Phe Glu Ala Cys Gly Glu Val Val720 725 730cag atc cga ccc atc ttc agc aac cgt ggg gat ttc cga ggt tac tgc 2258Gln Ile Arg Pro Ile Phe Ser Asn Arg Gly Asp Phe Arg Gly Tyr Cys735 740 745tac gtg gag ttt aaa gaa gag aaa tca gcc ctt cag gca ctg gag atg 2306Tyr Val Glu Phe Lys Glu Glu Lys Ser Ala Leu Gln Ala Leu Glu Met750 755 760 765gac cgg aaa agt gta gaa ggg agg cca atg ttt gtt tcc ccc tgt gtg 2354Asp Arg Lys Ser Val Glu Gly Arg Pro Met Phe Val Ser Pro Cys Val770 775 780gat aag agc aaa aac ccc gat ttt aag gtg ttc agg tac agc act tcc 2402Asp Lys Ser Lys Asn Pro Asp Phe Lys Val Phe Arg Tyr Ser Thr Ser
785 790 795cta gag aaa cac aag ctg ttc atc tca ggc ctg cct ttc tcc tgt act 2450Leu Glu Lys His Lys Leu Phe Ile Ser Gly Leu Pro Phe Ser Cys Thr800 805 810aaa gag gaa cra gaa gaa arc tgt aag gct cat ggc acc gtg aag gac 2498Lys Glu Glu Leu Glu Glu Ile Cys Lys Ala His Gly Thr Val Lys Asp815 820 825ctc agg ctg gtc acc aac cgg gct ggc aaa cca aag ggc ctg gcc tac 2546Leu Arg Leu Val Thr Asn Arg Ala Gly Lys Pro Lys Gly Leu Ala Tyr830 835 840 845gtg gag tat gaa aat gaa tcc cag gcg tcg cag gct gtg atg aag atg 2594Val Glu Tyr Glu Asn Glu Ser Gln Ala Ser Gln Ala Val Met Lys Met850 855 860gac ggc atg act atc aaa gag aac atc atc aaa gtg gca atc agc aac 2642Asp Gly Met Thr Ile Lys Glu Ash Ile Ile Lys Val Ala Ile Ser Asn865 870 875cct cct cag agg aaa gtt cca gag aag cca gag acc agg aag gca cca 2690Pro Pro Gln Arg Lys Val Pro Glu Lys Pro Glu Thr Arg Lys Ala Pro880 885 890ggt ggc ccc atg ctt ttg ccg cag aca tac gga gcg agg ggg aag gga 2738Gly Gly Pro Met Leu Leu Pro Gln Thr Tyr Gly Ala Arg Gly Lys Gly895 900 905agg acg cag ctg tct cta ctg cct cgt gcc ctg cag cgc cca agt gct 2786Arg Thr Gln Leu Ser Leu Leu Pro Arg Ala Leu Gln Arg Pro Ser Ala910 915 920 925gca gct cct cag gct gag aac ggc cct gcc gcg gct cct gca gtt gcc 2834Ala Ala Pro Gln Ala Glu Asn Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala930 935 940gcc cca gca gcc acc gag gca ccc aag atg tcc aat gcc gat ttt gcc 2882Ala Pro Ala Ala Thr Glu Ala Pro Lys Met Ser Asn Ala Asp Phe Ala945 950 955aag ctg ttt ctg aga aag tgaacgggac gctgggagac aggaaatgcc2930Lys Leu Phe Leu Arg Lys960ttacttcact ctggcccggc ggacctccca ccacccagca gtgcactggg gatggacagg 2990cctggtgtgc tgcgtgctcg caaccacaga tggctcctcg gctttagaca gaaaggggaa 3050ggggttctaa gtcaagagcc tttcagtgct ccctcatatt gagggcagtg gcagaaaagt 3110gaccactctg caggctgggc ccaggatgtg gtgtcctgag atagttttgt atcttaaaga 3170ctgaggcaca gaagcgaaac gagaacacac tgtttttgag acacagttgt ccaaatgttt 3230ctggccagct ccggcccctt tttgtatgac acttctcttc caccctgcac agcacatgtg 3290cccgtcattc ttttaatttt aaaagatgaa atggcagatg ctagtaattc acagaatggc 3350ctcttgtggg ggtgggtctg agggaagtca gctataaaac atttgctgga gttttgttca 3410atggggctgt gcatttttat attatgtgtt tgtaaatgac atgtcagccc ttgtttcatg 3470tttcctaaaa gcagaatatt tgcaacattt gttttgtata ggaattattt gtgccacctg 3530ctgtggactg ttttctttgc ctagtgacta gtgacctgtg ttgtctaaac atgagtttca 3590gccctttggt tttgtttaat accatgtcaa atgcaaactt caattctccc catttagctt 3650tattaaactg acgttctctt caaaacttct tgctgaatgg tactcagatg tgcattcaca 3710tacagatgtg ttttgaagtg ggtgtacctt gctttaccta atagatgtgt aaatagaact 3770tttgtaagtc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 3798<210>3<211>10<212>PRT<213>人<400>3Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu5 10<210>4<211>10<212>PRT<213>人<400>4Leu Phe Glu Lys Ala Val Lys Asp Tyr Ile5 10<210>5<211>9<212>PRT<213>人<400>5Asn Tyr Asn Lys Ala Leu Gln Gln Leu5<210>6<211>9<212>PRT<213>人<400>6Ala Tyr Ile Asp Phe Glu Met Lys Ile5<210>7<211>10<212>PRT<213>人<400>7Asp Tyr Val Glu Ile Trp Gln Ala Tyr Leu5 10<210>8<211>9<212>PRT<213> 人<400>8Asp Tyr Leu Arg Arg Arg Val Asp Phe5<210>9<211>9<212>PRT<213>人<400>9Ala Phe Thr Arg Ala Leu Glu Tyr Leu5<210>10<211>9<212>PRT<213>人<400>10Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu Ile5<210>11<211>10<212>PRT<213>人<400>11Ile Phe Pro Leu Thr Glu Glu Leu Trp Leu5 10<210>12<211>9<212>PRT<213>人<400>12Asp Tyr Ile Cys Pro Asn Ile Trp Leu5<210>13<211>10<212>PRT<213>人<400>13Glu Tyr Gly Gln Tyr Ser Val Gly Gly Ile5 10<210>14<211>9<212>PRT<213>人<400>14Ala Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Ala Ile5<210>15<211>10<212>PRT<213>人<400>15Leu Phe Arg Arg Gln Leu Ala Ile Pro Leu5 10<210>16<21l>10<212>PRT<213>人<400>16Glu Tyr Glu Glu Trp Ser Glu Asp Pro Ile5 10<210>17<211>9<212>PRT<213>人<400>17Lys Tyr Lys Pro Tyr Glu Glu Ala Leu5<210>18<211>10<212>PRT<213>人<400>18Arg Tyr Ser Gln Tyr Leu Asp Arg Gln Leu5 10<210>19<211>10<212>PRT<213>人<400>19Thr Phe Glu Lys Ala Leu Asn Ala Gly Phe5 10<210>20<211>10<212>PRT<213>人<400>20Asp Phe Lys Gln Asp Ser Ser Lys Glu Leu5 10<210>21<211>10<212>PRT<213>人<400>21Asp Tyr Pro Glu His Val Cys Glu Val Leu5 10<210>22<211>10<212>PRT<213>人<400>22Asp Phe Arg Gly Tyr Cys Tyr Val Glu Phe5 10<210>23<211>9<212>PRT<213>人<400>23Glu Phe Lys Glu Glu Lys Ser Ala Leu5<210>24<211>9<212>PRT<213>人<400>24Pro Phe Ser Cys Thr Lys Glu Glu Leu5<210>25<211>9<212>PRT<213>人<400>25Trp Leu His Asp Glu Ile Ser Met Ala
5<210>26<211>9<212>PRT<213>人<400>26Ser Leu Phe Arg Arg Gln Leu Ala Ile5<210>27<211>9<212>PRT<213>人<400>27Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu5<210>28<211>9<212>PRT<213>人<400>28Arg Leu Ala Glu Tyr Gln Ala Tyr Ile5<210>29<211>9<212>PRT<213>人<400>29Leu Leu Ala Met Glu Arg His Gly Val5<210>30<211>9<212>PRT<213>人<400>30Asn Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val5<210>31<211>9<212>PRT<213>人<400>31Lys Met Ser Glu Ile Phe Pro Leu Thr5<210>32<211>9<212>PRT<213>人<400>32Trp Leu Glu Tyr Gly Gln Tyr Ser Val5<210>33<211>10<212>PRT<213>人<400>33Ser Val Phe Glu Arg Ala Leu Ser Ser Val5 10<210>34<211>10<212>PRT<213>人<400>34Ala Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu5 10<210>35<211>10<212>PRT<213>人<400>35Lys Ile Gly Asp Pro Ala Arg Ile Gln Leu5 10<210>36<211>10<212>PRT<213>人<400>36Ile Gln Leu Ile Phe Glu Arg Ala Leu Val5 10<210>37<211>9<212>PRT<213>人<400>37Gln Leu Ile Phe Glu Arg Ala Leu Val5<210>38<211>10<212>PRT<213>人<400>38Asp Leu Trp Ile Arg Tyr Ser Gln Tyr Leu5 10<210>39<211>9<212>PRT<213>人<400>39Ala Leu Trp Ser Arg Tyr Leu Leu Ala5<210>40<211>10<212>PRT<213>人<400>40Ala Leu Trp Ser Arg Tyr Leu Leu Ala Met5 10<210>41<211>10<212>PRT<213>人<400>41Tyr Leu Leu Ala Met Glu Arg His Gly Val5 10<210>42<211>10<212>PRT<213>人<400>42Ala Leu Asn Ala Gly Phe Ile Gln Ala Thr5 10<210>43<211>9<212>PRT<213>人<400>43Tyr Leu Asp Tyr Leu Arg Arg Arg Val5<210>44<211>10<212>PRT<213>人<400>44Ile Met Thr Arg Gly Asn Ala Lys Tyr Ala5 10<210>45<211>9<212>PRT<213>人<400>45Asn Met Trp Leu Glu Tyr Tyr Asn Leu5<210>46<211>10<212>PRT<213>人<400>46Val Leu His Asp Ser Ser Lys Asp Ser Ile5 10<210>47<211>9<212>PRT<213>人<400>47Ser Ile Thr Val Phe Val Ser Asn Leu
5<210>48<211>9<212>PRT<213>人<400>48Ser Met Gln Glu Pro Asp Thr Lys Leu5<210>49<211>10<212>PRT<213>人<400>49Lys Ser Val Glu Gly Arg Pro Met Phe Val5 10<210>50<211>9<212>PRT<213>人<400>50Lys Val Phe Arg Tyr Ser Thr Ser Leu5<210>51<211>9<212>PRT<213>人<400>51Met Leu Leu Pro Gln Thr Tyr Gly Ala5<210>52<211>10<212>PRT<213>人<400>52Lys Met Ser Asn Ala Asp Phe Ala Lys Leu5 10<210>53<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><221>變異體<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。<220><221>變異體<222>10<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>53Val Xaa Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Xaa5 10<210>54<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><221>變異體<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。<220><221>變異體<222>10<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>54Leu Xaa Glu Lys Ala Val Lys Asp Tyr Xaa5 10<210>55<211> 9<212> PRT<213>人工序列<220><221>變異體<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp<220><221>變異體<222>9<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>55Asn Xaa Asn Lys Ala Leu Gln Gln Xaa5<210>56<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>變異體<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。<220><221>變異體<222>9<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>56Ala Xaa Ile Asp Phe Glu Met Lys Xaa5<210>57<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><221>變異體<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。<220><221>變異體<222>10<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>57Asp Xaa Val Glu Ile Trp Gln Ala Tyr Xaa5 10<210>58<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>變異體<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。<220><221>變異體<222>9<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>58Asp Xaa Leu Arg Arg Arg Val Asp Xaa5<210>59<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>變異體<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。<220><221>變異體<222>9<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>59Ala Xaa Thr Arg Ala Leu Glu Tyr Xaa5<210>60<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>變異體<222>2<223>Xaa是Leu、Met、Val、Ile或Gln。<220><221>變異體<222>9<223>Xaa是Val或Leu。<400>60Trp Xaa His Asp Glu Ile Ser Met Xaa5<210>61<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>變異體<222>2<223>Xaa是Leu、Met、Val、Ile或Gln。<220><221>變異體<222>9<223>Xaa是Val或Leu。<400>61Ser Xaa Phe Arg Arg Gln Leu Ala Xaa5<210>62<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>變異體<222>2<223>Xaa是Leu、Met、Val、Ile或Gln。<220><221>變異體<222>9<223>Xaa是Val或Leu。<400>62Leu Xaa Gln Ala Glu Ala Pro Arg Xaa5<210>63<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>變異體<222>2<223>Xaa是Leu、Met、Val、Ile或Gln。<220><221>變異體<222>9<223>Xaa是Val或Leu。<400>63Arg Xaa Ala Glu Tyr Gln Ala Tyr Xaa5<210>64<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>變異體<222>2<223>Xaa是Leu、Met、Val、Ile或Gln。<220><221>變異體<222>9<223>Xaa是Val或Leu。<400>64Leu Xaa Ala Met Glu Arg His Gly Xaa權利要求
1．一種DNA，它編碼SEQ ID NO:1所示氨基酸序列組成的蛋白或取代、缺失和/或添加一個或多個氨基酸殘基的SEQ ID NO:1氨基酸序列組成的蛋白變異體，前提是所述蛋白和蛋白變異體產生能夠與HLA抗原結合而且被細胞毒性T淋巴細胞識別的腫瘤抗原肽。
2．SEQ ID NO:2所示堿基序列組成的DNA或在嚴格條件下與所述DNA雜交的DNA變異體，前提是所述DNA或DNA變異體產生和表達的蛋白質可產生能夠與HLA抗原結合而且被細胞毒性T淋巴細胞識別的腫瘤抗原肽。
3．一種表達質粒，它含有權利要求1或2的DNA。
4．一種轉化體，它是用權利要求3的表達質粒轉化的轉化體。
5．產生重組蛋白的方法，它包括培養(yǎng)權利要求4的轉化體，回收所表達的重組蛋白。
6．一種腫瘤抗原蛋白，它由權利要求1或2的DNA編碼，或者用權利要求5的方法制得。
7．一種藥用組合物，它含有作為活性成分的權利要求1或2的DNA，或權利要求6的蛋白質。
8．用于治療或預防腫瘤的藥用組合物，它包含作為活性成分的權利要求1或2的DNA，或權利要求6的蛋白質。
9．一種腫瘤抗原肽或其具有相同功能性質的衍生物，所述腫瘤抗原肽是衍生自權利要求6的蛋白的部分肽而且能夠與HLA抗原結合并被細胞毒性T淋巴細胞識別。
10．其中所述HLA抗原是HLA-A24或HLA-A2的權利要求9的腫瘤抗原肽，或其具有相同功能性質的衍生物。
11．權利要求10的腫瘤抗原肽或其具有相同功能性質的衍生物，所述腫瘤抗原肽包括選自SEQ ID NO:3-52中任何一個所示氨基酸序列的全部或部分的序列。
12．權利要求11的腫瘤抗原肽或其具有相同功能性質的衍生物，所述腫瘤抗原肽包括選自SEQ ID NO:3-9和25-29中任何一個所示氨基酸序列的全部或部分的序列。
13．權利要求11的腫瘤抗原肽衍生物，它包括選自其中SEQ IDNO:3-52中任何一個所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基取代的氨基酸序列的全部或部分的序列。
14．權利要求13的腫瘤抗原肽衍生物，它包括選自其中SEQ IDNO:3-9和25-29中任何一個所示氨基酸序列的位置2和/或C末端的氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基取代的氨基酸序列的全部或部分的序列。
15．權利要求13的腫瘤抗原肽衍生物，它包括選自其中SEQ IDNO:3-24中任何一個所示氨基酸序列的位置2的氨基酸殘基被酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸取代，和/或C末端的氨基酸殘基被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸取代的氨基酸序列的全部或部分的序列。
16．權利要求13的腫瘤抗原肽衍生物，它包括選自其中SEQ IDNO:25-52中任何一個所示氨基酸序列的位置2的氨基酸殘基被亮氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和谷氨酰胺取代，和/或C末端的氨基酸殘基被纈氨酸或亮氨酸取代的氨基酸序列的全部或部分的序列。
17．權利要求14的腫瘤抗原肽衍生物，它包括選自SEQ ID NO:53-64中任何一個所示氨基酸序列的全部或部分的序列。
18．用于治療或預防腫瘤的藥用組合物，它包含作為活性成分的至少一種選自權利要求9-17中任何一項的腫瘤抗原肽及其衍生物的物質。
19．一種重組DNA，它包含至少一種編碼權利要求9-17中任何一項的腫瘤抗原肽或其衍生物的DNA。
20．一種重組多肽，它可通過表達權利要求9的重組DNA獲得。
21．用于治療或預防腫瘤的藥用組合物，它包含作為活性成分的權利要求19的重組DNA或權利要求20的重組多肽。
22．一種抗體，它特異性結合權利要求6的任何一種腫瘤抗原蛋白和權利要求9-17中任一項的腫瘤抗原肽或其衍生物。
23．一種抗原提呈細胞，其中HLA抗原和權利要求9-17中任一項的腫瘤抗原肽或其衍生物之間的復合物提呈在具有抗原提呈能力的細胞表面上，所述具有抗原提呈能力的細胞從腫瘤患者分離獲得。
24．一種抗原提呈細胞，其中HLA抗原和腫瘤抗原肽或其衍生物之間的復合物提呈在其上，所述抗原提呈細胞可通過使權利要求1或2的DNA、權利要求6的腫瘤抗原蛋白、權利要求19的重組DNA或權利要求20的重組多肽加入從腫瘤患者分離的具有抗原提呈能力的細胞獲得。
25．用于治療腫瘤的藥用組合物，它包含作為活性成分的權利要求23或24的抗原提呈細胞。
26．一種細胞毒性T淋巴細胞，它特異性識別HLA抗原和權利要求9-17中任一項的腫瘤抗原肽或其衍生物之間的復合物。
27．一種細胞毒性T淋巴細胞，它特異性識別HLA抗原和腫瘤抗原肽或其衍生物之間的復合物，所述復合物提呈在權利要求23或24的抗原提呈細胞上。
28．用于治療腫瘤的藥用組合物，它包含作為活性成分的權利要求26或27的細胞毒性T淋巴細胞。
29．一種腫瘤診斷試劑，它包含權利要求9-17中任一項的腫瘤抗原肽或其衍生物、權利要求6的蛋白或權利要求20的重組多肽。
30．細胞毒性T淋巴細胞OK-CTL，其保藏號是FERM BP-6818
31．鑒定腫瘤抗原蛋白或腫瘤抗原肽的方法，它包括應用權利要求30的OK-CTL。
全文摘要
新型腫瘤抗原蛋白;其基因;衍生自該腫瘤抗原蛋白的腫瘤抗原肽;這些物質的衍生物;以及在體內或體外利用這些物質治療、預防、診斷腫瘤等。
文檔編號C07K14/435GK1324404SQ99812596
公開日2001年11月28日 申請日期1999年8月27日 優(yōu)先權日1998年8月28日
發(fā)明者伊東恭悟, 中尾真修 申請人:伊東恭悟, 住友制藥株式會社