專利名稱：鯊魚軟骨血管生成抑制因子及其分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種鯊魚軟骨血管生成抑制因子及其分離純化的方法。
成人血管生成通常只限于傷口愈合與女性的生殖周期過程，已經(jīng)證明成人所有其他的血管生成都是病態(tài)的，并能導(dǎo)致廣泛的病變，如腫瘤的生長、糠尿病性視網(wǎng)膜增生、內(nèi)皮細(xì)胞惡變(如血管瘤)、動脈粥樣硬化、以及關(guān)節(jié)炎等。
1971年哈佛大學(xué)教授波斯頓兒童醫(yī)院研究員Judah Folkman提出“腫瘤生長是依賴血管的”，20多年的研究結(jié)果充分證明了這一理論。大部分正常人體內(nèi)均有處于休眠狀態(tài)的腫瘤，只有1mm3大小，不對人體構(gòu)成威脅；只有當(dāng)其生成新生血管，獲得營養(yǎng)供應(yīng)及轉(zhuǎn)移途徑，腫瘤才能生長和轉(zhuǎn)移，威脅人體健康。
腫瘤的生長存在著無血管期和有血管期，在開始的無血管階段，腫瘤組織以慢速線性方式生長，體積不會超過1mm3，在這一時期腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡處于一個動態(tài)平衡狀態(tài)。在向有血管期過渡的開始階段，腫瘤組織會釋放出一種可溶性的血管生成刺激因子，誘導(dǎo)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移，以及血管內(nèi)皮芽的形成與新生血管生成，致使腫瘤組織以指數(shù)方式生長。抑制血管生成可切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)及血道轉(zhuǎn)移途徑，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。
國外，特別是Folkman實驗室對抑制新生血管進(jìn)行多年研究，發(fā)現(xiàn)了一些細(xì)胞因子具有抑制新生血管生成的效應(yīng)，同時合成了一些能抑制血管生成的有機化合物，但大部分由于毒性較大而受到限制。后來，科學(xué)工作者將研究重點轉(zhuǎn)到了天然存在的生物大分子，發(fā)現(xiàn)天然動植物和微生物中都可能存在有血管生成抑制因子(angiogen-esis inhibitory factor,AIF)。1994年Folkman實驗室發(fā)現(xiàn)38KD的纖溶酶原片段-angiostatin能夠特異抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及新生血管生成，并能顯著抑制Lewis肺癌轉(zhuǎn)移灶的生長(O’Reilly M S,Holmgren L,Shing Y,et al.Angiostatin:A novelangiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lungcarcinoma.Cell,1994；79:315-328)。1997年他們又報道膠原XⅧ的20KD的C-末端片段-endostatin具有同樣的活性(O’Reilly M S,Boehm T,Shing Y,et al.En-dostatin:An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth.Cell,1997；38:277-285)。
軟骨是動物機體的主要無血管組織，含有較豐富的血管生成抑制因子，早在80年代中期，人們就發(fā)現(xiàn)軟骨能夠抵抗腫瘤細(xì)胞的侵入，很少長腫瘤。1990年Moses報道從小牛氣管軟骨純化均一的小牛軟骨血管生成抑制因子，分子量為27650(Moses AM,Sudhalter J,Langer R.Identification of an inhibitor of neovascularization fromcartilage.Science,1990248:1408-1410)。后來他們也從培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中獲得分子量為35550的同功蛋白。由于牛軟骨含量較少，加工困難，一直未見其產(chǎn)品進(jìn)入臨床或市場的報道。
鯊魚屬于軟骨魚類，1983年Lee報道鯊魚軟骨含有豐富的AIF。Lane博士將鯊魚軟骨粗提物及鯊魚軟骨粉大量應(yīng)用于腫瘤病人的治療，取得了較好的療效。九十年代初以來，美國、新西蘭、加拿大、澳大利亞、日本等國批準(zhǔn)鯊魚軟骨粉或粗提物以保健食品進(jìn)入市場用于腫瘤病人的治療，興起了國際上的鯊魚軟骨抗癌熱潮。美國FDA于1994年批準(zhǔn)鯊魚軟骨粉進(jìn)入Ⅱ期臨床實驗，加拿大1997年批準(zhǔn)鯊魚軟骨粗提物進(jìn)入Ⅲ期臨床實驗。我們于80年代末開始對鯊魚及小牛軟骨的抗腫瘤作用進(jìn)行研究，在國內(nèi)率先獲得了鯊魚軟骨粗提物的食品、保健食品和內(nèi)部制劑批準(zhǔn)文號，并率先進(jìn)行臨床應(yīng)用研究。幾年來的研究結(jié)果表明鯊魚軟骨粗提物對實體瘤患者具有一定的療效。但鯊魚軟骨粉及鯊魚軟骨粗提物仍有其缺點。軟骨含有豐富的血管生成抑制因子，同時其中也含有血管生成刺激因子，軟骨粉或粗提物未經(jīng)純化，未能去除其中的血管生成刺激因子，會影響其抑制血管生成作用。此外，軟骨中含有豐富的鈣，服用鯊魚軟骨粉或粗提物會引起腫瘤病人的高鈣血癥。因此，近年來許多實驗室嘗試從鯊魚軟骨中分離純化鯊魚軟骨血管生成抑制因子(shark cartilage angiogenesis inhibitory fac-tor,SCAIF)，但到目前為止，仍未見獲得成功的報道。
本發(fā)明的目的在于提供一種從鯊魚軟骨獲得的血管生成抑制因子及其分離純化的方法。
本發(fā)明從鯊魚軟骨制備獲得了一種新的蛋白質(zhì)-鯊魚軟骨血管生成抑制因子-Ⅰ(簡記為SCAIF-Ⅰ)，能顯著抑制血管生成以及小鼠腫瘤的生長，經(jīng)純度鑒定及其分子量測定，其SDS-PAGE電泳結(jié)果銀染顯示一條帶，如圖1所示。說明SCAIF-Ⅰ達(dá)到電泳純。測得其分子量為18000。
本發(fā)明中SCAIF-Ⅰ由下述分離純化方法獲得，將鯊魚軟骨經(jīng)鹽酸胍(Gu.HCl)溶液抽提，用有機溶劑分級沉淀，再用Resource Q進(jìn)行離子交換層析，得到3個洗脫峰(如圖3)，收集第3峰，濃縮后進(jìn)行Sephacryl S-300分子篩層析，同樣得到3個明顯的洗脫峰(如圖4)，再收集第3峰，濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE制備電泳，得到4個洗脫峰(如圖5)，再收集第3峰，濃縮凍干，即得白色粉末狀物質(zhì)SCAIF-Ⅰ。
對由上述方法分離純化得到的SCAIF-Ⅰ，本發(fā)明進(jìn)行了一系列實驗研究。
1．SCAIF-Ⅰ對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)研究。
參考Mosmann的MTT方法進(jìn)行(Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cel-lular growth and survival:application to prolifereation and cytotoxicity assays.J Im-muno Met,1983；65:55-63)，以小牛主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象，以皮膚成纖維細(xì)胞為正常對照。結(jié)果如表1所示。其中，μg/ml表示SCAIF-Ⅰ的濃度，BaEc為小牛主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，F(xiàn)C為成纖維細(xì)胞，P為顯著性。
結(jié)果表示SCAIF-Ⅰ對小牛主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長具有明顯的抑制效應(yīng)，并有明顯的劑量依賴關(guān)系；當(dāng)劑量為0.1μg/ml時，抑制率仍達(dá)47.71％；而對正常的皮膚成纖維細(xì)胞無抑制作用，在高濃度時反有促進(jìn)作用，提示SCAIF-Ⅰ能較特異抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長。
表1 SCAIF-Ⅰ對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)
2．SCAIF-Ⅰ對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的抑制效應(yīng)研究。
參考付生法等的方法加以改進(jìn)(付生法，陸應(yīng)麟，張朝山等。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1993；17(4):294-296)。將孵化第9天加樣改為第4天加樣，以生理鹽水為試劑對照，ANG為陽性對照，SCAIF-Ⅰ處理濃度為0.5mg/L，加樣量為10μl，照相記錄結(jié)果(見圖6所示)。
結(jié)果表明，生理鹽水組血管生長旺盛，管徑粗且分支多；而SCAIF-Ⅰ處理組則相反。說明SCAIF-Ⅰ能顯著抑制新生血管生成。
3．SCAIF-Ⅰ對小鼠腫瘤生長的抑制效應(yīng)研究。
參考王衡文等方法(王衡文，程立主編。實驗?zāi)[瘤學(xué)基礎(chǔ)。北京人民衛(wèi)生出版社，1992。296-297)。C57BL/6小鼠接種Lewis肺癌，接種第2天開始給藥，給藥劑量為1mg/kg.d，每天1次，皮下或腹腔注射，連續(xù)18天后稱瘤重，計算抑瘤率。結(jié)果如表2和圖7所示。SCAIF-Ⅰ顯著抑制C57BL/6小鼠Lewis肺癌的生長，實驗組腫瘤明顯比對照組小。皮下注射組抑瘤率達(dá)96.25％，腹腔注射抑瘤率達(dá)92.76％，均幾乎完全抑制了腫瘤的生長，顯示了良好的研究開發(fā)價值。
表2 SCAIF-Ⅰ對C57BL/6小鼠Lewis肺癌的抑制效應(yīng)
本發(fā)明的研究結(jié)果說明，SCAIF-Ⅰ為純度較高、活性強、特異性好的血管生成抑制因子，能通過抑制新生血管生成非常顯著抑制腫瘤的生長，是很有研究開發(fā)前景的一種蛋白質(zhì)。
SCAIF具有一般抗血管增生藥物的優(yōu)點，同時也具有自己突出的優(yōu)點1．SCAIF-Ⅰ作為抗血管增生藥物，其作用靶為遺傳物質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定的血管內(nèi)皮細(xì)胞，在人體內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞的壽命僅次于壽命最長的神經(jīng)細(xì)胞，不易產(chǎn)生藥物耐受性，而現(xiàn)有的細(xì)胞毒類化療藥物大都作用于腫瘤細(xì)胞，其遺傳物質(zhì)極不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生多藥抗藥性。
2．與其他抗血管增生藥物一樣，SCAIF-Ⅰ只作用于正在生長繁殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞，而不作用于已有的“靜止的”血管內(nèi)皮細(xì)胞，不對人體正常血管產(chǎn)生作用。人體在正常的生理條件下，除了女性的生理周期、傷口愈合及胎兒與兒童的生長發(fā)育過程，沒有新生血管生成。已有的血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝緩慢，處于相對靜止?fàn)顟B(tài)。因此，抗血管增生藥物沒有明顯的毒副作用。
3．SCAIF-Ⅰ直接從動物組織純化獲得，無一般化療藥物的毒性。
4．SCAIF-Ⅰ可能在有機體中存在較高的保守性，在動物實驗中未發(fā)現(xiàn)明顯的過敏反應(yīng)。
5．鯊魚在各大海洋中均大量存在，其繁殖能力很強，作為軟骨的豐富來源，保證了SCAIF-Ⅰ的原料供應(yīng)。


圖1為SDS-PAGE SCAIF-Ⅰ的銀染結(jié)果，其中圖1-1和圖1-2為SCAIF-Ⅰ，圖1-3為Marker。
圖2為SCAIF-Ⅰ的質(zhì)譜分析圖3Resource Q離子交換層析(1.6×20cm)圖4Sephacryl S-300分子篩層析(1.6×30cm)圖5SDS-PAGE制備電脈洗脫圖譜圖6SCAIF-Ⅰ對雞胚絨毛尿囊膜血管生成抑制效應(yīng)其中圖6-1為生理鹽水對照組，圖6-2為SCAIF-Ⅰ處理組，圖6-3為ANG陽性對照組圖7SCAIF-Ⅰ處理組及對照組小鼠腫瘤大小比較實施例采用我國東海鯨鯊軟骨300g，經(jīng)過1mol/l Gu HCl溶液抽提45-50小時，8000rpm離心25-35分鐘，用45％-65％的丙酮分級沉淀，用Resource Q離子交換層析，得到3個洗脫峰P11、P12、P13(如圖3所示)，其中buffer A:20mM Tris-Cl,pH8.5 Buffer B:1M NaCl,20mM Tris-Cl,pH7.6，收集第3峰；濃縮后進(jìn)行SephacrylS-300分子篩層析，同樣得到3個明顯的洗脫峰P21、P22、P23，如圖2所示；再將第3峰收集濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE制備電泳洗脫，得到4個峰P31、P32、P33、P34，如圖5所示；再收集第3峰，濃縮凍干后得到0.5mg白色粉末狀物質(zhì)即SCAIF-Ⅰ。對其進(jìn)行純度鑒定，參考Sambrook等的方法進(jìn)行(Sambrook J,Friescn E F,Maniatis T.Moleoular Cloning-a laboratory manual.2nd ed,cold Spring Harbor laboratotryPress,1989.)，用5％的濃縮膠，12％的分離膠，采用垂直平板電泳，SDS-PAGE電泳銀染顯示一條帶，如圖1所示，說明SCAIF-Ⅰ達(dá)到電泳純，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率，測得其分子量為18128。另外，采用質(zhì)譜法進(jìn)一步測得SCAIF-Ⅰ的分子量為18415，如圖2所示。
權(quán)利要求
1．一種鯊魚軟骨血管生成抑制因子，其特征在于該因子的SDP-PAGE電泳銀染顯示一條帶，其分子量為18000。
2．一種鯊魚軟骨血管生成抑制因子的分離純化方法，其特征在于將鯊魚軟骨經(jīng)鹽酸胍溶液抽提，用有機溶劑分級沉淀后，用Resource Q離子交換層析，得到3個洗脫峰，收集第3峰，濃縮后進(jìn)行Sephacryl S-300分子篩層析，得到3個洗脫峰，收集第3峰，濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE制備電泳，洗脫得到4個峰，再收集第3峰，濃縮干凍，即得白色粉末狀物質(zhì)SCAIF-Ⅰ。
全文摘要
一種鯊魚軟骨血管生成抑制因子及其分離純化的方法。該鯊魚軟骨血管生成抑制因子SCAIF－I其SDS－PAGE電泳結(jié)果銀染顯示一條帶,分子量為18000。它以鯊魚軟骨為原料,經(jīng)鹽酸胍溶液抽提,有機溶劑分級沉淀,Resource Q離子交換層析,Sephacryl S－300分子篩層析,制備電泳獲得。經(jīng)對其關(guān)于血管內(nèi)皮細(xì)胞生長、新生血管生成、小鼠腫瘤生長的抑制效應(yīng)研究,表明其純度高、活性強、特異性好,是一種很有研究開發(fā)前景的蛋白質(zhì)。
文檔編號C07K1/36GK1217341SQ9811107
公開日1999年5月26日 申請日期1998年9月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月10日
發(fā)明者沈先榮, 吉冬梅, 賈福星, 任大明, 孫加紅, 黃建生, 雷呈祥, 楊曉燕, 王玲, 劉為平 申請人:復(fù)旦大學(xué), 中國人民解放軍海軍醫(yī)學(xué)研究所