專(zhuān)利名稱(chēng)：Cd148血管生成抑制結(jié)構(gòu)域的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗CD148抗體并且涉及用于制備所述抗體的CD148 結(jié)合表位。本發(fā)明還涉及使用所述抗體抑制血管生成的方法。背景血管生成是指從現(xiàn)有血管形成新血管，這對(duì)于許多生理及病理 過(guò)程來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的。通常，血管生成受到促血管生成因子和抗 血管生成因子的嚴(yán)格調(diào)控，但是在癌癥、新血管性眼病、關(guān)節(jié)炎和 銀屑病等疾病的情形下，這一過(guò)程就會(huì)出差錯(cuò)。Folkman, J.，Nat.Med., 1:27-31 (1995)。人們認(rèn)為，血管生成在維持類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎性組織擴(kuò)張(血 管翳)中起到重要作用(Walsh等，Arthritis Res., 3:147-153 (2001)。事實(shí) 上，已知許多疾病都與未受控或不想要的血管生成相關(guān)。參見(jiàn) Carmeliet等，Nature 407:249-257 (2000)。這些疾病包括但不限于眼新 血管形成例如視網(wǎng)膜病(包括糖尿病性視網(wǎng)膜病)、年齡相關(guān)性黃斑變 性、4艮屑病、成血管細(xì)胞瘤、血管瘤、動(dòng)脈硬化、炎性疾病例如類(lèi) 風(fēng)濕性或風(fēng)濕性炎性疾病(尤其是關(guān)節(jié)炎，包括類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)或其 它慢性炎性疾病例如慢性哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化或移植后動(dòng)脈粥樣硬 化、子宮內(nèi)膜異位癥和腫瘤性疾病例如所謂的實(shí)體瘤和液體(或血液)
瘤(例如白血病和淋巴瘤)。與不想要的血管生成相關(guān)的其它疾病對(duì)于 本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。盡管許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)都涉及血管生成的調(diào)控，但是最近才表征的一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)涉及CD148受體酪氨酸激酶(也稱(chēng)為DEP-1 (密 度增強(qiáng)磷酸酶)、ECRTP (內(nèi)皮細(xì)胞受體酪氨酸磷酸酶)、HPTPti或 BYP，這取決于不同物種和cDNA來(lái)源)。CD148是一種哺乳動(dòng)物跨膜蛋白質(zhì)，屬于一類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞表面受 體，稱(chēng)為III型密度增強(qiáng)受體蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)。蛋白酪氨酸磷 酸化在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中是必要因素，所述途徑能控制基本細(xì)胞過(guò)程， 包括生長(zhǎng)和分化、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞骨架功能。配體與受體蛋白 酪氨酸激酶(PTK)的結(jié)合，在酶的靶底物中催化酪氨酸殘基的自身磷 酸化，而配體與受體PTP的結(jié)合則催化脫磷酸化。耙底物的胞內(nèi)酪 氨酸磷酸化水平可通過(guò)PTK和PTP間的平衡而確定。PTK在促進(jìn)細(xì) 胞生長(zhǎng)中起到重要作用，而PTP則通過(guò)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)而下調(diào)PTK的 活性。已經(jīng)知道，CD148能促進(jìn)紅細(xì)胞樣祖細(xì)胞分化，當(dāng)與其它信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白交聯(lián)時(shí)則能調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的功能，還能抑制過(guò)量表達(dá)蛋 白質(zhì)的乳癌細(xì)胞系的克隆表達(dá)。因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí)CD148作為細(xì)胞生長(zhǎng) 抑制劑的作用，所以目前也已知道CD148介導(dǎo)阻斷血管生成的抑制 信號(hào)，這對(duì)細(xì)胞遷移和增殖來(lái)說(shuō)是必要的生物活性，使得CD148成 為治療癌癥的一個(gè)重要靶標(biāo)，即通過(guò)激活CD148所介導(dǎo)的對(duì)腫瘤生 長(zhǎng)相關(guān)血管生成的抑制作用，來(lái)進(jìn)行治療。與其它受體蛋白酪氨酸磷酸酶一樣，CD148也具有胞內(nèi)羧基部分，具有催化域、單個(gè)跨膜域和胞外氨基端結(jié)構(gòu)域(包含5個(gè)串聯(lián)的 纖連蛋白m型(FNin)重復(fù)序列，該序列具有與Ig樣結(jié)構(gòu)域類(lèi)似的折 疊模式)。FNIII域?qū)α姿崂野彼釟埢哂薪^對(duì)特異性，對(duì)底物蛋白具 有高親和性并且比PTK的比活大幾個(gè)數(shù)量級(jí)。認(rèn)為FNIII域參與蛋 白質(zhì)/蛋白質(zhì)間的相互作用，以激活CD148觸發(fā)的CD148自身磷酸 化，由此轉(zhuǎn)導(dǎo)的生物信號(hào)導(dǎo)致對(duì)血管生成的抑制。
美國(guó)專(zhuān)利第6,552,169號(hào)公開(kāi)了人DEP-1 (CD148)相關(guān)的多核苷 酸序列，同時(shí)公開(kāi)了針對(duì)由這類(lèi)多核香酸所編碼的多肽產(chǎn)生的多克 隆抗體。美國(guó)專(zhuān)利第6，248,327號(hào)公開(kāi)了 CD148在血管生成中的作用， 并且提供了調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物血管生成的方法，即通過(guò)給予能夠與CD148 胞外域特異性結(jié)合的組合物，而且還公開(kāi)了單克隆抗體的用途，所 述單克隆抗體能夠與CD148胞外域的非特異區(qū)特異性結(jié)合，以激活 CD148抗血管生成活性。一種有效的CD148活化療法可使大量癌癥患者受益，因?yàn)榇蠖?數(shù)實(shí)體瘤都需要新血管形成，以長(zhǎng)到直徑超過(guò)1-2毫米。該療法在4見(jiàn) 網(wǎng)膜病、關(guān)節(jié)炎和銀屑病等其它血管生成相關(guān)疾病中也具有廣泛應(yīng) 用。對(duì)于鑒定那些能特異性識(shí)別并結(jié)合CD148的新藥物，具有尚未 開(kāi)發(fā)的需求。這樣的藥物將會(huì)用于診斷性篩選和治療性干預(yù)與CD148 活性相關(guān)的疾病狀態(tài)。因此，本發(fā)明的目的是提供CD148的特異性結(jié)合劑，這樣的結(jié) 合劑能夠激活CD148的活性。本發(fā)明的這類(lèi)藥物呈抗體及其片段的 形式，所述抗體及其片段能夠與CD148表位特異性結(jié)合。本文所引用的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和其它文件的公開(kāi)內(nèi)容都通 過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供與CD148表位結(jié)合的抗CD148抗體或其抗原結(jié)合 區(qū)，所述CD148表位參與對(duì)炎癥和/或血管生成的抑制作用，所述抗 體可用于治療炎癥和血管生成相關(guān)疾病。在具體的實(shí)施方案中，抗 體或其抗原結(jié)合區(qū)來(lái)自人抗體或其抗原結(jié)合區(qū)。在其它實(shí)施方案中， 抗體或其抗原結(jié)合片段選自scFv、 Fab、 F(ab')2、 Fv和單鏈抗體，尤 其是scFv片段，更尤其是scFv-Fc融合物。在另一個(gè)具體的實(shí)施方
案中，抗體或其抗原結(jié)合區(qū)是IgG同種型，例如IgG2同種型。
本發(fā)明一方面提供與CD148表位結(jié)合的分離的抗體或其抗原結(jié) 合區(qū)，所述CD148表位定義為CD148的FNIII域2、 3、 4或5。在 一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括與人CD148表位特異性 結(jié)合的分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，所述人CD148表位定義為一個(gè) 或多個(gè)選自SEQ ID NO: 33的^J^酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本 發(fā)明的抗體包括竟?fàn)幮砸种粕鲜鰡慰寺】贵w與人CD148表位結(jié)合的 分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，所述人CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè) 選自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，本發(fā) 明的抗體包括與人CD148表位特異性結(jié)合的分離的抗體或其抗原結(jié) 合區(qū)，所述人CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQ ID NO: 33的 氨基酸324-338和321-335的多肽序列，但是所述抗體或其抗原結(jié)合 區(qū)不與SEQ ID NO: 33的氨基酸殘基324-331的多狀序列結(jié)合。這類(lèi) 抗體的實(shí)例包括抗體Ab-l、 Ab-2、 Ab-3、 Ab-4、 Ab-5、 Ab-6、 Ab-7 和Ab國(guó)8。
本發(fā)明的另一方面提供可產(chǎn)生本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合區(qū)的雜 交瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞，以及由這些雜交瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞所產(chǎn) 生的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)。雜交瘤可包含與無(wú)限增殖化細(xì)胞融合的B 細(xì)胞，所述B細(xì)胞得自轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物 的基因組包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)染瘤可包含編碼人 重鏈和人輕鏈的核酸。
本發(fā)明的另 一方面提供表達(dá)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)的轉(zhuǎn) 基因非人類(lèi)動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物的基因組包含人重鏈 轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因。
本發(fā)明的另一方面提供制備與人CD148表位特異性結(jié)合的抗體 或其抗原結(jié)合區(qū)的方法，所述人CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自 SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸序列；所述方法包括用人CD148表位 或表達(dá)所述人CD148表位的細(xì)胞來(lái)免疫轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物，所述動(dòng) 物的基因組包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因，所述人CD148表位 定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQ ED NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸序列；使所述動(dòng)物 的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體；分離所述動(dòng)物的B細(xì)胞；將所述B細(xì)胞與骨髓 瘤細(xì)胞融合，形成分泌所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū)的無(wú)限增殖化雜交 瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的另 一 方面提供包含所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū)和藥學(xué)上 可接受的人用載體的藥物組合物。 一個(gè)具體的實(shí)施方案中提供治療 有效量的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，例如濃度為至少約10昭/ml。
本發(fā)明的另一方面提供抑制血管生成的方法，所述方法包括給 予有需要的患者治療有效量的本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合區(qū)。
本發(fā)明的另一方面提供CD148表位，與所述表位結(jié)合能激活 CD148介導(dǎo)的生物活性。本發(fā)明的CD148表位包括與本發(fā)明抗體或 其抗原結(jié)合區(qū)結(jié)合的分離的多肽或其任何片段，所述多肽包含一個(gè) 或多個(gè)選自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸序列，其中所述多肽不包括那 些來(lái)自CD148 4旦不是選自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明提供與本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合區(qū)結(jié)合的分離的多肽 或其任何片段，所述多肽由一個(gè)或多個(gè)選自SEQIDNO:33的氨基酸 315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸 序列組成。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與本發(fā)明抗體或其抗 原結(jié)合區(qū)結(jié)合的分離的多肽或其任何片段，所述多肽主要由一個(gè)或 多個(gè)選自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸序列組成。本發(fā)明的另一方面提供免疫測(cè)定方法，所述方法包括下述步驟 (a)使試驗(yàn)樣品與單克隆抗體或其抗原結(jié)合區(qū)接觸，所述單克隆抗體 或其抗原結(jié)合區(qū)在其與人CD148結(jié)合時(shí)能夠被與本發(fā)明抗體或其抗 原結(jié)合區(qū)結(jié)合的人CD148表位或其任何片段特異性結(jié)合的單克隆抗 體或其抗原結(jié)合區(qū)竟?fàn)幮砸种?，所述人CD148表位定義為一個(gè)或多 個(gè)選自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列；和(b)測(cè)定所述試驗(yàn)樣品中人CD148 的存在。本發(fā)明的另一方面包括與人CD148表位特異性結(jié)合的化合物的 鑒定方法，所述人CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQ ID NO: 33 的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725 的多肽序列；所述方法包括使試驗(yàn)化合物與人CD148表位接觸足 夠時(shí)間以形成復(fù)合物，所述人CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQ IDNO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725 和200-725的多肽序列；然后通過(guò)檢測(cè)復(fù)合物中的CD148表位或所 述化合物，來(lái)檢測(cè)所述復(fù)合物的形成，因此，如果檢出復(fù)合物的話， 就鑒定出與所述CD148表位結(jié)合的化合物。
本發(fā)明的又一方面是與人CD148表位特異性結(jié)合的化合物的鑒 定方法，所述人CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQ ID NO: 33 的^J^酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725 的多肽序列；所述方法包括提供限定CD148表位三維結(jié)構(gòu)的原子 坐標(biāo)(atomic coordinate),所述CD148表位定義為 一個(gè)或多個(gè)選自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725 和200-725的多肽序列；然后根據(jù)所述原子坐標(biāo)來(lái)設(shè)計(jì)或選擇能夠結(jié) 合CD148表位的化合物。附圖描述

圖1A和圖1B顯示本發(fā)明的抗體即1號(hào)抗體(Ab-l)重鏈可變區(qū) (VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列重疊 (overlap)。圖上的陰影區(qū)表示CDR1、 CDR2和CDR3 (分別從氨基端 到羧基端)。查詢(xún)序列(Query)和讀框1 (Framel)分別表示核普酸序列 和氨基酸序列。圖2A和2B顯示2號(hào)抗體(Ab-2)重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū) (VL)的核普酸序列及其所編碼的氨基酸序列重疊。圖上的陰影區(qū)表 示CDR1 、 CDR2和CDR3 (分別從氨基端到羧基端)。圖3A和3B顯示3號(hào)抗體(Ab-3)重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū) (VL)的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列重疊。圖上的陰影區(qū)表 示CDR1、 CDR2和CDR3 (分別從氨基端到羧基端)。圖4A和4B顯示4號(hào)抗體(Ab-4)重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū) (VL)的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列重疊。圖上的陰影區(qū)表 示CDR1 、 CDR2和CDR3 (分別從氨基端到羧基端)。圖5A和5B顯示5號(hào)抗體(Ab-5)重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū) (VL)的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列重疊。圖上的陰影區(qū)表
示CDR1、 CDR2和CDR3(分別從氨基端到羧基端)。
圖6A和6B顯示6號(hào)抗體(Ab-6)重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)
(VL)的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列重疊。圖上的陰影區(qū)表
示CDR1、 CDR2和CDR3(分別從氨基端到羧基端)。
圖7A和7B顯示7號(hào)抗體(Ab-7)重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)
(VL)的核普酸序列及其所編碼的氨基酸序列重疊。圖上的陰影區(qū)表
示CDR1、 CDR2和CDR3 (分別從氨基端到羧基端)。
圖8A和8B顯示8號(hào)抗體(Ab-8)重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)
(VL)的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列重疊。圖上的陰影區(qū)表
示CDR1 、 CDR2和CDR3 (分別從氨基端到羧基端)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式
為了便于理解本發(fā)明，首先定義一些術(shù)語(yǔ)。其它定義在發(fā)明詳 述中給出。
定義
單位、前綴和符號(hào)均采用SI可接受形式。除非另有說(shuō)明，否則 核酸從左到右是以5，至3'的方向來(lái)書(shū)寫(xiě)；氨基酸序列從左到右是以 氨基至羧基方向來(lái)書(shū)寫(xiě)。本文記載的數(shù)值范圍包括定義該范圍的數(shù) 字并包括所定義范圍之內(nèi)的任何整數(shù)。本文所提及的氨基酸按其公 知的三字母符號(hào)或IUPAC-IUBMB命名委員會(huì)所推薦的單字母符號(hào) 來(lái)表示。同樣，核苷酸也按其公知的單字母編碼來(lái)表示。除非另有 說(shuō)明，否則本文所用術(shù)語(yǔ)包括其復(fù)數(shù)形式。本文所用的各部分標(biāo)題 僅用于組織的目的，不得視為對(duì)所述主題的限制。本說(shuō)明書(shū)所引用 的所有文件或文件部分，包括但不限于專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、文章、書(shū) 籍和論文，都通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中，用于任何目的。當(dāng)在本 申請(qǐng)內(nèi)有任何氨基酸或核酸序列不相符的情況下，以附圖為準(zhǔn)。
標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于重組DNA、寡核苷酸合成和組織培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)化(例
如電穿孔、脂轉(zhuǎn)染)。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)或者按照本領(lǐng)域常規(guī)方法 或本文所述方法，實(shí)施酶促反應(yīng)和純化技術(shù)。通常按照本領(lǐng)域眾所 周知的常規(guī)方法以及本說(shuō)明書(shū)全文所引用和討論的各種一般性和具體參考文獻(xiàn)，來(lái)實(shí)施上述技術(shù)和方法。參見(jiàn)例如Sambrook等， Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)),所述文獻(xiàn)通過(guò)引用 結(jié)合到本文中。本文所述的分析化學(xué)、有機(jī)合成化學(xué)以及藥物化學(xué) 和制藥化學(xué)的實(shí)驗(yàn)室方法和技術(shù)相關(guān)的命名法是眾所周知的，也是 本領(lǐng)域常用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、制 劑和給藥以及對(duì)患者進(jìn)行治療。當(dāng)用于本說(shuō)明書(shū)時(shí)，除非另有說(shuō)明，否則以下術(shù)語(yǔ)將理解為具 有以下含義術(shù)語(yǔ)"人CD148"是經(jīng)鑒定為人ECRTP/DEP的蛋白質(zhì)，包括 其等位變異體，參見(jiàn)Ostman等，尸rac Ato/ Jcac/ 91:9680-9684(1994),所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。"人CD148胞外域"是 指人CD148部分，該部分位于NCBI (National Center for Biotechnology Information)檢索號(hào)AAB36687 version AAB36687.1 GI: 1685075 (1996 年11月26日提交)的約殘基36-973之間(殘基1-35是前導(dǎo)序列，在 成熟形式中不存在)，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中，并且在萬(wàn)維 網(wǎng)ncbi.nlm.nih.gov上可查才戈到。術(shù)語(yǔ)"抗體，，包括任何同種型或亞類(lèi)或其組合的糖基化及非糖 基化免疫球蛋白，包括人抗體(包括CDR移植抗體)、人源化抗體、 嵌合抗體、多特異性抗體、單克隆抗體、多克隆抗體及其寡聚物， 無(wú)論所述抗體是通過(guò)免疫方法、重組技術(shù)、體外合成還是通過(guò)其它 方法產(chǎn)生的，無(wú)論是完整抗體還是部分抗體。因此，術(shù)語(yǔ)"抗體" 包括通過(guò)重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，例如(a)從動(dòng)物(例 如小鼠)或該動(dòng)物所制備的雜交瘤中分離的抗體，所述動(dòng)物是具有人 免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，(b)從宿主細(xì)胞(例如轉(zhuǎn)染瘤)中分離的
抗體，所述宿主細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染并能表達(dá)所述抗體，(C)從重組、組合抗
體文庫(kù)中分離的抗體,和(d)通過(guò)任何其它方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或 分離的抗體，所述方法包括免疫球蛋白基因序列與其它DNA序列的 剪接。所述抗體具有來(lái)自?xún)煞N不同動(dòng)物的種系(germline)免疫球蛋白 序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。然而，在某些實(shí)施方案中，所述抗體可經(jīng) 歷體外誘變(或者體內(nèi)體細(xì)胞誘變，當(dāng)使用具有人免疫球蛋白序列的 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí))，因此抗體VH區(qū)和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序 列盡管它們來(lái)自特定物種(例如人)的種系VH序列和VL序列或與 其相關(guān)的序列，但是它們?cè)谠撐锓N體內(nèi)的抗體種系庫(kù)(repertoire)中并 不是天然存在的。
完整抗體是含有以二硫鍵相連的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L) 或其抗原結(jié)合區(qū)的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文縮寫(xiě)為VH) 和重鏈恒定區(qū)組成，重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域(本文縮寫(xiě)為CH1、 CH2 和CH3)組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文縮寫(xiě)為VL)和輕鏈恒定區(qū) 組成，輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域(本文縮寫(xiě)為CL)組成。VH區(qū)和VL 區(qū)還可進(jìn)一步細(xì)分為超變區(qū)，稱(chēng)為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中散布有更 保守的區(qū)域，稱(chēng)為構(gòu)架區(qū)(FR)。每個(gè)VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè) FR組成，從氨基端到羧基端按以下順序排布FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4。重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)含有與抗原相 互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。抗體恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或 因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系 統(tǒng)的第一組分(Clq)。當(dāng)與參考序列進(jìn)行比較時(shí)，與重鏈或輕鏈CDR 基本相同的氨基酸序列，表現(xiàn)出相當(dāng)大數(shù)量或程度的序列同一性， 并且有利地影響具有參考序列的抗體特異性結(jié)合抗原的特異性結(jié) 合。明確知道或者可以辨別出這樣的同 一性代表了特定人單克隆抗 體氨基酸序列。基本相同的重鏈CDR和輕鏈CDR的氨基酸序列可 具有例如少量氨基酸修飾或保守取代，只要能保持結(jié)合特定抗原的 能力。術(shù)語(yǔ)"人單克隆抗體，，包括基本具有人CDR氨基酸序列的單
克隆抗體，所述抗體是通過(guò)重組等方法，由淋巴細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞 產(chǎn)生的。術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合區(qū)"是指抗體的一個(gè)或多個(gè)片段，所述片段保留了與抗原(例如CD148)特異性結(jié)合的能力，而所述抗原也可 與參考抗體特異性結(jié)合，如本文所公開(kāi)的一樣?？贵w的"抗原結(jié)合 區(qū)"可包括例如這樣的多肽所述多肽包含各重鏈或輕鏈及其片段， 例如VL區(qū)、VH區(qū)和Fd區(qū)；單價(jià)片段，例如Fv區(qū)、Fab區(qū)和Fab' 區(qū)；二價(jià)片段，例如F(ab')2;單鏈抗體，例如單鏈Fv (scFv)區(qū)；Fc 片段；雙抗體(diabody); Fd (由VH區(qū)和CH1區(qū)組成)、大抗體 (maxibodies)(與IgGl的Fc氨基端(CH2-CH3區(qū))融合的二價(jià)scFV)和 互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)域。這些術(shù)語(yǔ)的描迷參見(jiàn)例如Harlow和Lane， Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R. A.(編著)，New York: VCH Publisher, Inc.); Huston 等，Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun和Skerra, Meth. Enzymol.， 178:497-515 (1989)和Day, E. D.， Advanced Immunochemistry, 第2版，Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. (1990),所述文獻(xiàn)通過(guò)引用 結(jié)合到本文中。術(shù)語(yǔ)"抗原結(jié)合區(qū)"也包括例如通過(guò)人單克隆抗體 經(jīng)蛋白酶消化或還原而產(chǎn)生的片段，以及經(jīng)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的 重組DNA方法而產(chǎn)生的片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，人單克隆抗體 片段的準(zhǔn)確邊界是不確定的，只要該片段保持功能活性即可。本領(lǐng) 域技術(shù)人員采用眾所周知的重組方法，可以改造核酸，以表達(dá)具有 最終想要的功能片段，用于特定用途。此外，盡管Fv片段的VL和 VH兩個(gè)區(qū)是由獨(dú)立的基因所編碼的，但是可以采用重組方法，通過(guò) 能夠?qū)⑺鼈冞B接成一條蛋白鏈的合成接頭，將它們連接在一起，其 中VL區(qū)和VH區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(稱(chēng)為單鏈Fv (scFv);參見(jiàn)例如 Bird等(1988) Science 242:423-426; Huston等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。這樣的單鏈抗體也包括在術(shù)語(yǔ)抗體的"抗
原結(jié)合區(qū)"的范圍之內(nèi)?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)， 獲得這些抗體片段，并且采用與完整抗體相同的方法，對(duì)這些片段 進(jìn)行篩選。這些片段包括得自氨基端和/或羧基端缺失的片段，但是
其中保留的氨基酸序列與例如從全長(zhǎng)cDNA序列推導(dǎo)出的天然存在 序列的相應(yīng)位置基本相同?？乖Y(jié)合區(qū)也包括抗體片段，所述片段 保留特定互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(即重鏈和/或輕鏈的CDR1、 CDR2和/或 CDR3中的至少一個(gè)或更多個(gè))的至少一個(gè)(例如1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)……) 重鏈序列和/或至少一個(gè)(例如1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)……)輕鏈序列。含有 CDR的序列與Fc區(qū)(或含有其重鏈恒定區(qū)2 (CH2)或重鏈恒定區(qū)3 (CH3)的區(qū))的融合物包括在該定義范圍之內(nèi)，包括例如本文包括直接 或間接與Fc融合的scFV?？乖Y(jié)合區(qū)包括但不限于來(lái)自抗體或其片 段(例如通過(guò)酶促消化或二硫鍵還原)的抗原結(jié)合區(qū)、用重組方法(例 如轉(zhuǎn)染瘤)合成產(chǎn)生的抗原結(jié)合區(qū)、通過(guò)體外合成方法(例如Merrifield 樹(shù)脂)產(chǎn)生的抗原結(jié)合區(qū)、通過(guò)這些方法的組合或通過(guò)其它方法產(chǎn)生 的抗原結(jié)合區(qū)。抗原結(jié)合區(qū)也可包括通過(guò)合成方法、化學(xué)方法或其 它方法連接在一起的、呈寡聚體形式的多個(gè)片段，例如CDR片段。 因此，本發(fā)明的抗原結(jié)合區(qū)包括通過(guò)多種方法產(chǎn)生的多肽，所述多 肽包括至少一個(gè)來(lái)自本發(fā)明VH鏈或VL鏈的CDR (例如Ab-l至 Ab-8)。
術(shù)語(yǔ)"VL片段"是指人單克隆抗體輕鏈片段，包括所有或部分 輕鏈可變區(qū)，包括CDR。 VL片段還可包括輕鏈恒定區(qū)序列。
術(shù)語(yǔ)"Fd片段"是指人單克隆抗體重鏈片段，包括所有或部分 YH重鏈可變區(qū)，包括CDR。 Fd片段還可包括CHl重鏈恒定區(qū)序歹L
術(shù)語(yǔ)"Fv片段，，是指人單克隆抗體的單價(jià)抗原結(jié)合片段，包括 所有或部分重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，并且缺乏重鏈恒定區(qū)和輕鏈 恒定區(qū)。重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)包括例如CDR。例如，F(xiàn)v片段包 括重鏈和輕鏈的約IIO個(gè)氨基酸的所有或部分氨基端可變區(qū)。
術(shù)語(yǔ)"Fab片段"是指由VL區(qū)、VH區(qū)、CL區(qū)和CH1區(qū)組成
的抗體的單價(jià)抗原結(jié)合片段，該片段比Fv片段稍大。例如，F(xiàn)ab片 段包括重鏈和輕鏈的可變區(qū)以及所有或部分第一恒定區(qū)。因此，F(xiàn)ab 片段還包括例如重鏈和輕鏈的約110至約220個(gè)氨基酸殘基。術(shù)語(yǔ)"Fab'片段"是指人單克隆抗體的單價(jià)抗原結(jié)合片段，該片 段比Fab片段稍大。例如，F(xiàn)ab'片段包括所有輕鏈，所有重鏈可變區(qū) 以及重鏈的所有或部分第一和笫二恒定區(qū)。例如，F(xiàn)ab'片段還可包括 重鏈的部分或所有的220-330個(gè)氨基酸殘基。術(shù)語(yǔ)"F(ab')2片段"是指人單克隆抗體的二價(jià)抗原結(jié)合片段，所 述片段包含在鉸鏈區(qū)通過(guò)二硫橋連接的兩個(gè)Fab片段。F(ab')2片段包 括例如兩條重鏈和兩條輕鏈的所有或部分可變區(qū)，并且還可包括兩 條重鏈和兩條輕鏈的所有或部分笫一恒定區(qū)。術(shù)語(yǔ)"dAb片段"是指由VH區(qū)組成的片段，參見(jiàn)Ward等，(1989) Nature 341:544-546。術(shù)語(yǔ)"CDR"是指在重鏈和輕鏈多肽可變區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的非毗連抗 原結(jié)合位點(diǎn)。以下文獻(xiàn)已經(jīng)描述了該特定區(qū)Kabat等，U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)和Chothia等，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)和 MacCallum等，J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié) 合到本文中，其中所述定義包括氨基酸殘基重疊或亞類(lèi)，當(dāng)彼此間 進(jìn)行比較時(shí)。然而，用于表示抗體或其功能片段的CDR的定義包括 在該術(shù)語(yǔ)范圍之內(nèi)，如同本文所定義和使用的一樣。包含特定CDR 的準(zhǔn)確氨基酸殘基數(shù)目視CDR結(jié)構(gòu)而異。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī) 確定具體CDR中哪些殘基屬于抗體的可變區(qū)氨基酸序列。本領(lǐng)域技 術(shù)人員可比較兩個(gè)以上抗體序列，即通過(guò)用相同CDR定義來(lái)限定相 應(yīng)序列的各區(qū)或個(gè)別氨基酸位置。術(shù)語(yǔ)"CDR移植"是指這樣的抗體或抗原結(jié)合區(qū)其中將來(lái)自 一個(gè)物種的CDR插入到不同物種的構(gòu)架中，例如移植到人構(gòu)架上的 鼠CDR ("人，，抗體)。
術(shù)語(yǔ)"類(lèi)似物"是指由至少25個(gè)氨基酸的區(qū)段組成的多肽，所 述多肽與推導(dǎo)出的氨基酸序列部分基本上相同，并且所述多肽具有 至少一個(gè)以下特性(1)與CD148在合適的結(jié)合條件下特異性結(jié)合，(2) 阻斷CD148配體與CD148結(jié)合的能力，或(3)抑制CD148介導(dǎo)的血 管生成的能力。通常，多肽類(lèi)似物包含相對(duì)于天然存在的序列來(lái)說(shuō) 的保守氨基酸取代(或添加或缺失)。類(lèi)似物的長(zhǎng)度通常為至少20個(gè) 氨基酸，優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸或更長(zhǎng)，通?？梢耘c全長(zhǎng)天然存在的 多肽一樣長(zhǎng)。
術(shù)語(yǔ)"分離的"是指從一種或多種化合物中分離，所述化合物 是與天然抗體或多肽一起存在的化合物，或者在用于制備抗體的合 成反應(yīng)中所包括的那些化合物(例如分子、前體或其它反應(yīng)產(chǎn)物)，優(yōu) 選基本上不含任何其它污染的哺乳動(dòng)物多肽，這樣的多肽可能會(huì)干 擾其治療或診斷應(yīng)用。分離的分子也包括基本純的分子。該術(shù)語(yǔ)可 包括天然存在的分子，例如生物合成反應(yīng)產(chǎn)物或合成分子。當(dāng)抗體 中基本上不含具有不同抗原特異性的其它抗體時(shí)，該抗體就被認(rèn)為 是"分離的"。而且，如果一種物質(zhì)與多肽或其它物質(zhì)結(jié)合(而在自 然界并不與之結(jié)合)或綴合時(shí)，這種物質(zhì)也是"分離的"。
術(shù)語(yǔ)"基本純的"是指存在的主要物質(zhì)種類(lèi)(即在組合物中，以 摩爾濃度計(jì)，它比任何其它各種類(lèi)的含量更豐富)，并且占所有存在 的大分子的至少約50% (以摩爾濃度計(jì))。 一般而言，基本純的組合 物占組合物中存在的所有大分子的約80%以上，或者約85%以上、90% 以上、95%以上和99%以上。物質(zhì)經(jīng)純化成為基本同質(zhì)的(通過(guò)常規(guī) 檢測(cè)方法，在組合物中不能檢測(cè)出污染物質(zhì))，其中組合物主要由一 種大分子組成。同樣，如果在制備或配制過(guò)程中， 一種物質(zhì)如上所 述是"分離的"或是"基本純的"，然后再與其它成分混合成已知 成分的組合物，則它是"分離的"，盡管在已知成分的組合物中的 該物質(zhì)并非主要存在的種類(lèi)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合"是指化合物優(yōu)先或選擇性識(shí)別
并結(jié)合成熟的全長(zhǎng)或部分CD148表位或其直向同源物，使得它的親 和力(通過(guò)例如本文所述的親和ELISA或BIAcore測(cè)定法而測(cè)得)或它 的中和能力(通過(guò)例如本文所述的中和ELISA測(cè)定法或類(lèi)似測(cè)定法而 測(cè)得)比任何其它多肽的親和力或中和能力高至少10倍，任選高50 倍、100倍、250倍或500倍，或者甚至至少高1000倍，其中肽抗 體(peptibody)中的肽部分先與人Fc部分融合，以便在所述測(cè)定法中 進(jìn)行評(píng)價(jià)。通常，抗體結(jié)合親和力至少大約為lx107 M",并且，與 預(yù)定抗原結(jié)合的親和力是與除預(yù)定抗原或密切相關(guān)抗原以外的非特 異性抗原(例如BSA、酪蛋白)結(jié)合的親和力的至少兩倍。認(rèn)為本文所 用的"識(shí)別"抗原的抗體或者對(duì)抗原具有"特異性"的抗體相當(dāng)于"特 異性結(jié)合"抗原的抗體。然而，與人CD148特定表位、同種型或變來(lái)自其它物種的相關(guān)抗原(例如CD148類(lèi)同源物)，并且所述抗體仍 然被認(rèn)為是"特異性結(jié)合"特定CD148表位。術(shù)語(yǔ)"表位"是指能夠被特異性結(jié)合劑(例如抗體)在一個(gè)或多個(gè) 結(jié)合劑的抗原結(jié)合區(qū)上識(shí)別并與之結(jié)合的任何分子部分。表位通常 由分子的化學(xué)活性表面集合(surface grouping)組成，例如氨基酸或糖 側(cè)鏈，并且通常具有特殊的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特殊的電荷特征。 構(gòu)象表位和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于，在變性溶劑存在下，是與前者 的結(jié)合而不是與后者的結(jié)合喪失。當(dāng)解離常數(shù)約SlpM、優(yōu)選約^100nM 和最優(yōu)選40nM時(shí)，就認(rèn)為抗體能特異性結(jié)合抗原。本發(fā)明的抗體 及其抗原結(jié)合區(qū)包括用本文定義的表位決定子產(chǎn)生的抗體及其抗原 結(jié)合區(qū)，或者用與本文定義的表位決定子基本相同的表位決定子而 產(chǎn)生的抗體及其抗原結(jié)合區(qū)。在上下文中，"基本相同"是指序列 共享足夠的同一性，使得與修飾表位決定子結(jié)合的抗體能夠竟?fàn)幮?抑制所述抗體與如本文所述的表位決定子的結(jié)合。短語(yǔ)"竟?fàn)幮砸种平Y(jié)合"是指一種抗體同另一種抗體或其抗原 結(jié)合區(qū)，都能識(shí)別、結(jié)合相同或基本相同的表位或其片段，或者對(duì)
相同或基本相同的表位或其片段具有免疫特異性。在本發(fā)明內(nèi)容中，竟?fàn)幮砸种茊慰寺】贵w與人CD148表位特異性結(jié)合的分離的抗體或 其抗原結(jié)合區(qū)，能夠測(cè)定對(duì)CD148結(jié)合的竟?fàn)幜Γ鋈薈D148表 位定義為選自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200_536、 533_725和200-725的氨基酸序列。通常，可以在被測(cè)抗體 或其抗原結(jié)合區(qū)存在時(shí)，通過(guò)測(cè)定與革巴蛋白(例如人CD148)結(jié)合的參 考抗體或抗原結(jié)合區(qū)的數(shù)量，來(lái)測(cè)定竟?fàn)幮砸种?。通常，被測(cè)抗體 或被測(cè)抗原結(jié)合區(qū)是過(guò)量存在的，例如過(guò)量5倍、10倍、25倍或50 倍。當(dāng)過(guò)量存在時(shí)，竟?fàn)幮越Y(jié)合的抗體或抗原結(jié)合區(qū)在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 上能顯著抑制參考抗體或抗原結(jié)合區(qū)與人CD148胞外域的特異性結(jié) 合，通常至少10%、 25%、 50%、 75%、 90%或更高。竟?fàn)幮砸种茰y(cè) 定法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見(jiàn)例如Harlow和Lane (1998), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York。本 文所用的結(jié)合抑制包括部分和完全抑制/阻斷。當(dāng)與本發(fā)明的抗CD148 抗體接觸時(shí)，抑制和阻斷也包括特定抗CD148抗體與CD148的結(jié)合 親和力上的任何可檢測(cè)的下降，例如結(jié)合被阻斷至少約10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 99%或100%。如果確定了由以下氨基酸所定義的人CD148表位的話，竟?fàn)幮?抑制單克隆抗體與人CD148表位特異性結(jié)合的一種或多種抗體的鑒 定，就是一項(xiàng)簡(jiǎn)單技術(shù)，所述人CD148表位定義為選自SEQ ID NO: 33 的氨基酸447-725、 533-725、 715-973、 324-335、 200-536、 533-725 和200-725的氨基酸序列。 一旦產(chǎn)生了與人CD148表位特異性結(jié)合 的抗體時(shí)，就能簡(jiǎn)單地通過(guò)與參考抗體進(jìn)行比較，容易地對(duì)竟?fàn)幮?抑制那些與CD148結(jié)合的抗體進(jìn)行鑒定，所述人CD148表位定義為 選自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸序列。 可以使用任一種能評(píng)價(jià)抗體竟?fàn)幮缘拿庖吆Y選測(cè)定方法，容易 地對(duì)交叉反應(yīng)性抗體進(jìn)行鑒定。這些測(cè)定方法都是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，下文將會(huì)有進(jìn)一步詳細(xì)描述。1997年8月26日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利 第5,660,827號(hào)(通過(guò)引用結(jié)合到本文中)，用于進(jìn)一步補(bǔ)充說(shuō)明如何 制備這樣的抗體所述抗體如同給定抗體一樣，能結(jié)合相同或基本 相同的表位。例如，當(dāng)待測(cè)試驗(yàn)抗體得自不同來(lái)源的動(dòng)物或者是不同的同種 型時(shí)，可以采用一種簡(jiǎn)單的竟?fàn)帨y(cè)定，其中將對(duì)照和試驗(yàn)抗體混合 在一起(或預(yù)先吸附)并用于CD148抗原組合物，該組合物中含有本 文所述的CD148表位。因此，基于ELISA的方案和蛋白質(zhì)印跡適用 于這樣簡(jiǎn)單的竟?fàn)幯芯?。在某些?shí)施方案中，可以將對(duì)照抗體與不同數(shù)量的試驗(yàn)抗體(例 如1:10或1:100)預(yù)混合一段時(shí)間，然后再用于抗原組合物。在其它 實(shí)施方案中，可以將對(duì)照和不同數(shù)量的試驗(yàn)抗體在暴露給抗原組合 物的同時(shí)進(jìn)行簡(jiǎn)單地混合。在任何情況下，通過(guò)使用同種或同種型 第二抗體，能夠僅測(cè)定結(jié)合的對(duì)照抗體，其結(jié)合作用因基本上識(shí)別 同 一表位的試驗(yàn)抗體的存在而降低。的抗體竟?fàn)幯芯恐?，可以先用可檢測(cè)標(biāo)記(例如生物素或酶標(biāo)或者放 射性標(biāo)記)來(lái)標(biāo)記對(duì)照，以便進(jìn)行隨后的筌定。在這些情況下，可以 將標(biāo)記的對(duì)照抗體與待測(cè)試驗(yàn)抗體按不同比例(例如1:10或1:100)預(yù) 混合或孵育，然后(任選過(guò)一段合適的時(shí)間后)測(cè)定標(biāo)記的對(duì)照抗體的 反應(yīng)性，并將其與對(duì)照值進(jìn)行比較，在所述對(duì)照的孵育中沒(méi)有潛在 竟?fàn)幮栽囼?yàn)抗體。測(cè)定也可以是大量基于抗體雜交的免疫測(cè)定法中的任一種，可 以通過(guò)檢測(cè)它們的標(biāo)記來(lái)檢測(cè)對(duì)照抗體，例如在生物素化抗體的情 況下使用鏈霉抗生物素，或者通過(guò)使用與酶標(biāo)有關(guān)的生色底物(例如 3,3'5,5'-四曱基聯(lián)苯胺(TMB)底物以及過(guò)氧化物酶)或者通過(guò)簡(jiǎn)單地測(cè) 定放射性標(biāo)記。與對(duì)照抗體結(jié)合同一表位的抗體能夠有效竟?fàn)幗Y(jié)合， 因此能顯著降低對(duì)照抗體的結(jié)合，其證據(jù)是結(jié)合標(biāo)記的減少。在缺乏完全無(wú)關(guān)抗體的情況下，(標(biāo)記的)對(duì)照抗體的反應(yīng)性將是對(duì)照高值(control high value)。將標(biāo)記抗體與完全相同類(lèi)型的標(biāo)記抗體 一起孵育，可得到對(duì)照低值(control low value),當(dāng)竟?fàn)幇l(fā)生并降低標(biāo) 記的抗體的結(jié)合時(shí)。在試驗(yàn)測(cè)定中，在試驗(yàn)抗體存在下，標(biāo)記抗體 反應(yīng)性的顯著下降，表明試驗(yàn)抗體與標(biāo)記抗體識(shí)別同一表位，即試 驗(yàn)抗體與標(biāo)記抗體具有"交叉反應(yīng)"。短語(yǔ)"抑制血管生成"是指相對(duì)于未處理對(duì)照來(lái)說(shuō)，血管生成 水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的減少。相對(duì)于陰性對(duì)照血管生成來(lái)說(shuō)，示例 性的減少至少5-99%,減少至少10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%或90%。普遍接受的血管生成功能測(cè)定法例如角膜微袋測(cè) 定法(corneal micropocket assay)和人腎孩Lfc管內(nèi)皮細(xì)胞(HRMEC)平面 遷移測(cè)定法(planar migration assay),都是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如美 國(guó)專(zhuān)利第5/712,291和5，871,723號(hào)。簡(jiǎn)而言之，HRMEC平面遷移測(cè) 定是傷口閉合(woimd closure),該測(cè)定可用于在體外定量測(cè)定本發(fā)明 抗體或其抗原結(jié)合區(qū)對(duì)血管生成的抑制作用。在該測(cè)定中，用在培 養(yǎng)的細(xì)胞單層中的環(huán)形傷口閉合速率來(lái)測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞遷移。傷口閉 合速率是線性的，在體內(nèi)剌激和抑制血管生成的藥物能動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)傷 口閉合速率。小鼠角膜袋測(cè)定也可用于定量測(cè)定本發(fā)明抗體或其抗 原結(jié)合區(qū)對(duì)血管生成的體內(nèi)抑制作用。在該測(cè)定中，將有待檢測(cè)血 管生成活性或抗血管生成活性的藥物以緩釋形式固定在吸水性丙烯 酸聚合物小片(hydron pellet)上，將其植入到麻醉小鼠角膜上皮產(chǎn)生 的微袋中。測(cè)定血管化角膜緣向正常無(wú)血管角膜生長(zhǎng)的血管生成的 現(xiàn)象、密度和血管生長(zhǎng)范圍。可以理解，可以修飾本發(fā)明抗體，使它們與抗體多肽序列或其 片段基本相同，同時(shí)仍能結(jié)合本發(fā)明的CD148表位。當(dāng)用GAP或 BESTFIT等程序進(jìn)行優(yōu)化比對(duì)時(shí)，使用缺省空位權(quán)重(weight)時(shí)，如
果多肽序列共享至少80%序列同 一性、至少90%序列同 一性、至少95% 序列同一性或至少99%序列同一性，則這些多肽序列是"基本相同 的"。優(yōu)選不同殘基位的不同之處在于保守氨基酸取代。保守氨基 酸取代是指具有相似側(cè)鏈的殘基的可互換性。例如， 一組具有脂族 側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；一 組具有脂族-羥基側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸； 一組具有含酰胺 側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺； 一組具有芳族側(cè)鏈的氨基酸 是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸； 一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴(lài)氨 酸、精氨酸和組氨酸； 一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸和曱 硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組合是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、 苯丙氨酸-酪氨酸、賴(lài)氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨 酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。正如本文所討論的，所提出的抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸 序列上的小的變化包括在本發(fā)明之內(nèi)，只要氨基酸序列中的變化保 持至少75%，更優(yōu)選至少80%、 90%、 95%，最優(yōu)選99%。具體地講， 提出了保守氨基酸取代。保守取代是發(fā)生在一組側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸 之內(nèi)的取代。遺傳編碼的氨基酸通常分為以下類(lèi)型(l)酸性氨基酸(天 冬氨酸、谷氨酸)；(2)堿性氨基酸(賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸)；(3)非 極性氨基酸(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨 酸、曱硫氨酸、色氨酸)；和(4)不帶電荷的極性氨基酸(甘氨酸、天冬 酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)。更優(yōu)選的 種類(lèi)是絲氨酸和蘇氨酸為脂族-羥基類(lèi)；天冬酰胺和谷氨酰胺是含 酰胺類(lèi)；丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸是脂族類(lèi)；苯丙氨酸、 色氨酸和酪氨酸是芳族類(lèi)。例如，有理由相信，以下獨(dú)立的取代將 不會(huì)對(duì)所得分子的結(jié)合或特性產(chǎn)生重要影響亮氨酸被異亮氨酸或 纈氨酸取代、天冬氨酸被谷氨酸取代、蘇氨酸被絲氨酸取代、或氨 基酸被結(jié)構(gòu)相關(guān)氨基酸的類(lèi)似取代，尤其是如果取代不涉及構(gòu)架位 置內(nèi)的氨基酸的話。通過(guò)測(cè)定多肽衍生物的比活，可以容易地確定
氨基酸變化是否產(chǎn)生功能肽。本文詳細(xì)描述了測(cè)定方法。本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員可以容易地制備抗體或免疫球蛋白分子的片段或類(lèi)似 物。優(yōu)選的氨基端和羧基端片段或類(lèi)似物發(fā)生在功能區(qū)邊界。將核 苷酸和/或氨基酸序列數(shù)據(jù)與公共或?qū)＠蛄袛?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，可以 鑒定出結(jié)構(gòu)域和功能域。優(yōu)選采用計(jì)算機(jī)比較方法，來(lái)鑒定序列基 序或預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象區(qū)，所述構(gòu)象區(qū)發(fā)生在其它已知結(jié)構(gòu)和/或功能 的蛋白質(zhì)內(nèi)。折疊成已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列的鑒定方法是已知的。Bowie等，Science 253:164 (歷)。因此，上述實(shí)例證明，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可識(shí)別序列基序和結(jié)構(gòu)構(gòu)象，這可用于定義本發(fā)明的結(jié)構(gòu) 域和功能域。優(yōu)選的氨基酸取代是這樣的取代(l)降低蛋白酶解敏感性，(2) 降低氧化敏感性，(3)改變形成蛋白復(fù)合物的結(jié)合親和力，(4)改變結(jié) 合親和力，和(4)賦予或修飾所述類(lèi)似物的其它理化或結(jié)構(gòu)特征。類(lèi) 似物可包括各種序列突變蛋白，但不是天然存在的肽序列。例如， 在天然存在的序列(優(yōu)選在形成分子間接點(diǎn)的區(qū)域外的多肽部分)中， 可以進(jìn)行單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代(優(yōu)選保守氨基酸取代)。保守氨基酸 取代不應(yīng)基本改變母序列的結(jié)構(gòu)特征(例如取代氨基酸不應(yīng)傾向于石皮 壞母序列中存在的螺旋，或者破壞母序列特征性的其它類(lèi)型的二級(jí) 結(jié)構(gòu))。本領(lǐng)域公知的多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)例參見(jiàn)Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton編著，W. H. Freeman和 Company, New York (1984》；Introduction to Protein Structure (C. Branden和J. Tooze編著，Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); Thornton等，Nature 354:105 (l"l)，所述文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文 中。也可使用本文公開(kāi)的表位決定子的肽類(lèi)似物，來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的 抗體，所述類(lèi)似物可由具有類(lèi)似于模板肽特性的非肽化合物組成。 這些類(lèi)型的非肽化合物稱(chēng)為"肽模擬物，，。Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber和Freidinger TINS第392頁(yè)(1985); Evans等，J.Med. Chem. 30:1229 (l987)。通常借助于計(jì)算機(jī)分子建模，來(lái)開(kāi)發(fā)這 類(lèi)化合物。可以使用結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于治療用肽的肽模擬物，來(lái)產(chǎn)生相 同的治療或預(yù)防效果。 一般而言，通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法，肽 模擬物的結(jié)構(gòu)類(lèi)似于范例多肽(paradigm polyp印tide,即具有生化特 性或藥理活性的多肽)，例如人抗體，但具有一個(gè)或多個(gè)任選被選自 以下鍵取代的肽鍵—CH2NH--、 —CH2S—、 —CH2—CH2--、 —CH=CH--(順式和反式)、—COCH2—、 —CH(OH)CH2—和CH2SO--。可以采用 共有序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被同類(lèi)型D-氨基酸的系統(tǒng)取代(例如D-賴(lài)氨酸替代L-賴(lài)氨酸)，產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。另外，通過(guò)本領(lǐng)域已知方 法(Rizo和Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)，通過(guò)引用結(jié)合 到本文中)，可以產(chǎn)生包含共有序列或基本相同的共有序列變異體的 限制肽；例如，通過(guò)添加能夠形成分子內(nèi)二硫橋并使肽環(huán)化的內(nèi)部 半胱氨酸殘基。術(shù)語(yǔ)"雙特異性分子，，包括具有至少兩種不同結(jié)合特異性的任 何分子，例如蛋白質(zhì)、肽或者蛋白質(zhì)復(fù)合物或肽復(fù)合物。例如，所 述分子可以與(a)細(xì)胞表面抗原和(b)效應(yīng)細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合或相 互作用。術(shù)語(yǔ)"多特異性分子(multispecific molecule)"或"不均一特 異性分子(heterospecific molecule)"包括具有兩種以上不同結(jié)合特異 性的任何分子，例如蛋白質(zhì)、肽或者蛋白質(zhì)復(fù)合物或肽復(fù)合物。例 如，所述分子可以與(a)細(xì)胞表面抗原、(b)效應(yīng)細(xì)胞表面的Fc受體和 (c)至少一個(gè)其它組分結(jié)合或相互作用。因此，本發(fā)明包括但不限于 針對(duì)CD148表位和其它靶(例如效應(yīng)細(xì)胞上的Fc受體)的雙特異性分 子、三特異性分子、四特異性分子和其它多特異性分子。術(shù)語(yǔ)"雙 特異性抗體"也包括雙抗體(diabody)。雙抗體是二價(jià)雙特異性抗體， 其中VH區(qū)和VL區(qū)在一條多肽鏈上表達(dá)，但是使用接頭來(lái)表達(dá)，所 述接頭太短而不允許同 一條鏈的兩個(gè)區(qū)之間配對(duì)，從而迫使這些區(qū) 與另 一條鏈的互補(bǔ)區(qū)配對(duì)，產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見(jiàn)例如Holliger, P.等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J.，等(1994) Structure 2:1121-1123)。雙特異性抗體包括兩個(gè)以上的抗體、 抗體結(jié)合片段(例如Fab)、它們的衍生物或連接在一起的抗原結(jié)合區(qū) (它們中間的至少兩種具有不同特異性)。這些不同特異性包括針對(duì)效 應(yīng)細(xì)胞上的Fc受體的結(jié)合特異性，以及針對(duì)把細(xì)胞(例如胂瘤細(xì)胞) 上的抗原或表位的結(jié)合特異性。術(shù)語(yǔ)"人抗體"是指恒定區(qū)和構(gòu)架都完全由人序列組成或主要 由人序列組成的抗體，使得當(dāng)將人抗體給予人宿主時(shí)，基本上不會(huì) 引起針對(duì)自身的免疫原性反應(yīng)、優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)的免疫原性反應(yīng)。 應(yīng)當(dāng)知道，"人抗體"不一定完全由人序列組成，而是可含有部分 非人類(lèi)序列，只要當(dāng)將該抗體給予人宿主時(shí)，不引起免疫原性反應(yīng)。 例如，"人抗體，，包括將非人類(lèi)(例如小鼠)CDR區(qū)移植到人構(gòu)架上 的抗體。在某些實(shí)施方案中，在非人類(lèi)哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生人抗體，所 述非人類(lèi)哺乳動(dòng)物包括但不限于小鼠、大鼠和兔子。在其它實(shí)施方 案中，在雜交瘤細(xì)胞中產(chǎn)生人抗體，所述雜交瘤細(xì)胞來(lái)自具有人免 疫球蛋白庫(kù)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在其它實(shí)施方案中，完全人抗體是經(jīng)重 組產(chǎn)生的，例如在轉(zhuǎn)染瘤中。術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"是指所有恒定區(qū)基本上都來(lái)源于人，而一 個(gè)或多個(gè)可變區(qū)全部或部分來(lái)源于其它物種例如小鼠的抗體。本文所用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指 單一分子組成的抗體分子制劑。單克隆抗體組合物對(duì)特定表位表現(xiàn) 出單一結(jié)合特異性和親和性。因此，術(shù)語(yǔ)"人單克隆抗體，，是指表 現(xiàn)出單一結(jié)合特異性，同時(shí)又具有來(lái)自人種系免疫球蛋白序列的可 變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤 產(chǎn)生，所述雜交瘤包含與無(wú)限增殖化細(xì)胞融合的B細(xì)胞，所迷B細(xì) 胞得自轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)，所述轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物 的基因組包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因。本文所用的術(shù)語(yǔ)"重組"用于修飾抗體時(shí)，包括通過(guò)重組方法 制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，例如(a)從動(dòng)物(例如小鼠)或該動(dòng)物所制備的雜交瘤(下面的第I小節(jié)中有進(jìn)一步描迷)中分離的抗體，所述動(dòng)物是帶有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，(b)從宿主細(xì) 胞(例如轉(zhuǎn)染瘤)中分離的抗體，所述宿主細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染并能表達(dá)所述抗 體，(c)從重組、組合人抗體文庫(kù)中分離的抗體，和(d)通過(guò)任何其它 方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，所述方法包括人免疫球蛋白 基因序列與其它DNA序列的剪接。所迷重組人抗體具有來(lái)自人種系 免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。然而，在某些實(shí)施方案中，所 述重組人抗體可經(jīng)歷體外誘變(或者體內(nèi)體細(xì)胞誘變，當(dāng)使用具有人Ig 序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí))，因此重組抗體VH區(qū)和VL區(qū)的氨基酸序列 是這樣的序列盡管它們來(lái)自人種系VH序列和VL序列或與其相關(guān) 的序列，但是它們?cè)隗w內(nèi)的人抗體種系庫(kù)中并不是天然存在的。本文所用的"異源抗體"定義為轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)生物體產(chǎn)生的一 類(lèi)抗體。該術(shù)語(yǔ)是指具有對(duì)應(yīng)于生物體中存在的氨基酸序列或編碼 的核酸序列的抗體，所述生物體不是轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物，而是通常 來(lái)自不是轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物的其它物種。本文所用的"異源雜種抗體(heterohybrid antibody)"是指具有來(lái) 源于不同生物體的輕鏈和重鏈的抗體。例如，具有人重鏈以及鼠輕 鏈的抗體，就是異源雜種抗體。異源雜種抗體的實(shí)例包括嵌合抗體 和人源化抗體，在上文中有論述。本文所用的"同種型轉(zhuǎn)換(isotype switching)"是指抗體類(lèi)別或同 種型從一類(lèi)Ig變成另 一類(lèi)Ig的現(xiàn)象。本文所用的"非轉(zhuǎn)換同種型"是指在沒(méi)有發(fā)生同種型轉(zhuǎn)換時(shí)產(chǎn) 生的重鏈的同種型類(lèi)別；編碼非轉(zhuǎn)換同種型的CH基因通常是緊接著 功能性重排VDJ基因下游的第一個(gè)CH基因。同種型轉(zhuǎn)換分為經(jīng)典 或非經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換。經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換是通過(guò)涉及轉(zhuǎn)基因中至少一 個(gè)轉(zhuǎn)換序列區(qū)的重組事件而發(fā)生的。非經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換是通過(guò)例如 人e-pi (theta-mu)和人e卞(theta-mu) (5-相關(guān)缺失)之間同源重組而發(fā)生 的?；蛘撸墙?jīng)典轉(zhuǎn)換機(jī)制例如轉(zhuǎn)基因間和/或染色體間重組，可以
發(fā)生并實(shí)現(xiàn)同種型轉(zhuǎn)換。
本文所用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)換序列"是指負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)換重組的DNA序列。 "轉(zhuǎn)換供體"序列通常是p轉(zhuǎn)換區(qū)，位于在轉(zhuǎn)換重組過(guò)程中將被缺失 的構(gòu)建體區(qū)的5'(即上游)。"轉(zhuǎn)換受體"區(qū)位于構(gòu)建區(qū)待缺失區(qū)和取 代恒定區(qū)(例如Y、 e等)之間。因?yàn)闆](méi)有總是發(fā)生重組的特定位點(diǎn)，故 此最終的基因序列通常不能根椐構(gòu)建體來(lái)預(yù)測(cè)。
本文所用的"糖基化模式"定義為與蛋白質(zhì)共價(jià)連接、.更具體 地說(shuō)與免疫球蛋白共價(jià)連接的糖單位的模式。當(dāng)本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn) 為，與轉(zhuǎn)基因的CH基因來(lái)源的物種相比，異源抗體的糖基化模式與 轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物物種中的糖基化模式更為相似時(shí)，異源抗體的糖 基化模式可以被描述為與在轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物的物種所產(chǎn)生的抗體 上正常發(fā)生的糖基化模式基本相似。
本文所用的術(shù)語(yǔ)"天然存在的"當(dāng)用于物體時(shí)，是指物體可以 在自然界中被發(fā)現(xiàn)的事實(shí)。例如，生物體(包括病毒)中存在的、可以 從自然界的來(lái)源分離的、未在實(shí)驗(yàn)室中被人為有意修飾的多肽或多 核苷酸序列就是天然存在的。
本文所用的術(shù)語(yǔ)"重排"是指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的 構(gòu)型，其中在分別編碼基本上完整的VH區(qū)或VL區(qū)的構(gòu)象中，V區(qū) 段緊鄰D-J或J區(qū)段定位?？梢酝ㄟ^(guò)與種系DNA比較，來(lái)鑒定重排 的免疫球蛋白基因座；重排的基因座具有至少一個(gè)重組七聚體/九聚 體同源元件。
本文所用的術(shù)語(yǔ)"未重排"或"種系構(gòu)型"在涉及V區(qū)段時(shí)， 是指V區(qū)段未經(jīng)過(guò)重組而緊鄰D或J區(qū)段的構(gòu)型。
本文所用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)染瘤，'包括表達(dá)抗體的重組真核宿主細(xì)胞， 例如CHO細(xì)胞或NS/0細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物"是指具有這樣的基因組的非人類(lèi)動(dòng) 物所述基因組包含一個(gè)或多個(gè)人重鏈和/或輕鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體 (整合或不整合到動(dòng)物的天然基因組DNA上)并且能夠表達(dá)完全人抗
體。例如，轉(zhuǎn)基因小鼠可具有人輕鏈轉(zhuǎn)基因和人重鏈轉(zhuǎn)基因或人重
鏈轉(zhuǎn)染色體，使得當(dāng)用CD148和/或表達(dá)CD148的細(xì)胞免疫時(shí)，該 小鼠能夠產(chǎn)生人抗CD148抗體。人重鏈轉(zhuǎn)基因可以整合到小鼠染色 體DNA上(例如在轉(zhuǎn)基因的情況下)，例如HuMAb小鼠，或者人重 鏈轉(zhuǎn)基因可以保持在染色體外(例如在轉(zhuǎn)染色體(例如KM)小鼠的情況 下)，參見(jiàn)WO 02/43478。這樣的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠能夠通過(guò)經(jīng) 歷V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生多種抗CD148的人單克隆抗體同 種型(例如IgG、 IgA和/或IgE)。
下面各小節(jié)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的各個(gè)方面。
抗CD148抗體的制備
本發(fā)明用結(jié)合特定CD148表位的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)為例來(lái)說(shuō) 明，已經(jīng)知道所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū)在激活CD148介導(dǎo)的炎性和/ 或血管生成活性方面起作用。這樣的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)包括抗 CD148抗體及其抗原結(jié)合區(qū)，這些抗體及其抗原結(jié)合區(qū)與CD148的 結(jié)合，受到本文公開(kāi)的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)的竟?fàn)幮砸种?。同時(shí)待 審的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0/564,885和60/585,686中，/^開(kāi)了編碼 本發(fā)明抗體及其抗原結(jié)合區(qū)的多核苷酸序列、以及這些多核苷酸序 列表達(dá)的多肽序列，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
本發(fā)明提供抗CD148抗體，所述抗體結(jié)合與人CD148表位基本 相同的表位，所述人CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQIDNO: 33的氨基酸447-725、 533-725、 715-973、 324-335、 200-536、 533-725 和200-725的多肽序列。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與人CD148 表位或基本相同的表位結(jié)合的抗CD148抗體及其抗原結(jié)合區(qū)，所述 表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，本發(fā)明提供與人CD148表位或基本相同的表位特異性結(jié)合
的分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，所述表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQ IDNO:33的#^酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725 和200-725的多肽序列。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與人CD148 表位或基本相同的表位特異性結(jié)合的單克隆抗體或其抗原結(jié)合區(qū)， 所述表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列?？梢?通過(guò)以下公開(kāi)的多種方法中的任一種，制備這類(lèi)抗體或其抗原結(jié)合 區(qū)，例如，通過(guò)用至少第一 CD148抗原性組合物免疫動(dòng)物，然后從 免疫動(dòng)物中選擇與本發(fā)明單克隆抗體基本上有交叉反應(yīng)的抗體。
可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)受體竟?fàn)?、ELISA、共沉淀和/或功能測(cè)定 和本文所述的交叉反應(yīng)測(cè)定法或這些方法的組合，容易地鑒定具有 所述特性組合的抗體。
本發(fā)明所包括的抗體，包括IgG、 IgA、 IgGl-4、 IgE、 IgM和IgD 抗體，例如IgGlK或IgGU同種型，或IgG4K或IgG4X同種型。在 一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是IgG2同種型。在一個(gè)實(shí)施 方案中，人抗體是在轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)中產(chǎn)生的， 所述動(dòng)物通過(guò)經(jīng)歷V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換，能夠產(chǎn)生多種抗CD148 的人抗體同種型(例如IgG、 IgA和/或IgE)。因此，本發(fā)明的方面不 僅包括抗體、抗體片段及其藥物組合物，而且還包括產(chǎn)生多克隆抗 體的轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物、B細(xì)胞、宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤和雜交瘤。在體外 或體內(nèi)使用本發(fā)明抗體來(lái)檢測(cè)表達(dá)CD148的細(xì)胞或相關(guān)的交叉反應(yīng) 生長(zhǎng)因子受體，或者抑制表達(dá)CD148的細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和/或運(yùn)動(dòng) 的方法，也都包括在本發(fā)明之內(nèi)。本發(fā)明還包括含本發(fā)明抗體的藥 物制劑以及通過(guò)給予本發(fā)明抗體來(lái)治療生理障礙的方法。
可以通過(guò)各種不同的方法構(gòu)建本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合區(qū)，所 述方法包括通過(guò)免疫動(dòng)物(例如用刺激產(chǎn)生抗體的抗原，所述抗體能
夠特異性結(jié)合并竟?fàn)幮砸种艫b-l至Ab-8抗體中的至少一個(gè)的結(jié)合)； 通過(guò)雜交瘤(例如使用來(lái)自轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的B細(xì)胞)；通過(guò)重 組方法(例如CHO轉(zhuǎn)染瘤；參見(jiàn)Morrison, S. (1985) Science 229:1202))，或者通過(guò)體外合成方法(例如固相多肽合成)。
在某些實(shí)施方案中，抗體和抗原結(jié)合區(qū)是人或人源化的。非人 抗體的人源化方法是本領(lǐng)域眾所周知的。基本上可以按照以下文獻(xiàn) 的方法實(shí)施人源化Winter及合作者(Jones等，Nature, 321 :，522 (1986); Riechmann等，Nature, 332: 323 (1988); Verhoeyen等，Science, 239: 1534 (1988))。簡(jiǎn)而言之，將人恒定區(qū)基因與合適人或非人類(lèi)可 變區(qū)基因連接。例如，在DNA水平上，將代表母鼠單克隆抗體的抗 原結(jié)合位點(diǎn)(CDR或互補(bǔ)決定區(qū))的氨基酸序列移植到人可變區(qū)構(gòu)架 序列上。人恒定區(qū)基因序列可參見(jiàn)Kabat等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242。 容易從已知 克隆中得到人C區(qū)基因。所需效應(yīng)子功能(例如補(bǔ)體結(jié)合，或抗體依 賴(lài)性細(xì)胞毒性的活性)將會(huì)指導(dǎo)對(duì)抗體同種型的選擇。在某些實(shí)施方 案中，同種型是IgG2。
也可通過(guò)包括但不限于噬菌體展示、逆轉(zhuǎn)錄病毒展示、核糖體 展示以及其它技術(shù)在內(nèi)的各類(lèi)展示技術(shù)，產(chǎn)生人抗體或人源化抗體 或抗原結(jié)合區(qū)，使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，所得分子可經(jīng)歷其它 的成熟過(guò)程，例如親和力成熟，這些技術(shù)都是本領(lǐng)域眾所周知的。 Hanes和Plucthau， PNAS USA 94:4937-4942 (1997)(核糖體展示), Parmley和Smith, Gene 73:305-318 (1988) (p籃菌體展示)，Scott TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla等，PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel 等，Nucl, Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom等，Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell和McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992)和美國(guó)專(zhuān)利第5,733,743號(hào)。
通過(guò)計(jì)算機(jī)建模，可以幫助鑒定合適的人抗體序列。建模是本 領(lǐng)域眾所周知的，用于例如避免非人類(lèi)CDR區(qū)與人可變構(gòu)架區(qū)的非
天然并列(juxtaposition),這樣的并列會(huì)產(chǎn)生非天然的構(gòu)象限制并伴隨 結(jié)合親和力的喪失。用于產(chǎn)生免疫球蛋白分子三維圖像的計(jì)算機(jī)硬 件和軟件是很容易獲得的。 一般而言，分子模型的產(chǎn)生，是從免疫 球蛋白鏈或其區(qū)的分解結(jié)構(gòu)(solved structure)開(kāi)始的。將有待建模的 鏈與分解的三維結(jié)構(gòu)鏈或區(qū)進(jìn)行比較，比較氨基酸序列相似性，然 后選擇表現(xiàn)出最大的序列相似性的鏈或區(qū)，作為構(gòu)建分子模型的出 發(fā)點(diǎn)?？紤]到在建的免疫球蛋白鏈或區(qū)的實(shí)際氨基酸與開(kāi)始結(jié)構(gòu)之 間的差異，修改開(kāi)始的分解結(jié)構(gòu)。然后將修改結(jié)構(gòu)裝配成復(fù)雜的免 疫球蛋白。最后，通過(guò)能量最小化來(lái)改進(jìn)模型，證實(shí)所有原子彼此 間都在合適的距離內(nèi)，鍵長(zhǎng)和鍵角都在化學(xué)上可接受的限制之內(nèi)?？梢援a(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)，在沒(méi)有產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白的 情況下，所述動(dòng)物在免疫后能夠產(chǎn)生完全人抗體庫(kù)。例如，在嵌合 小鼠和種系突變小鼠中，抗體重鏈連接區(qū)(Jh)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi) 源抗體產(chǎn)生被完全抑制。在所述種系突變小鼠中， 一旦抗原攻擊， 人種系免疫球蛋白基因陣列的轉(zhuǎn)移就會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生人抗體。參見(jiàn)例如 Jakobovits等，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits 等，Nature, 362: 255 (1993); Brugge腿nn等，Year in Immunol., 207: 33 (1993)。已經(jīng)描述了市售轉(zhuǎn)基因小鼠品系，例如XenoMouse;參見(jiàn)Green 等，Nature Genetics 7:13-21 (1994)。產(chǎn)生本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合區(qū)的重組方法中，首先是免疫球 蛋白重鏈和輕鏈所需區(qū)域的分離的核酸，例如Ab-1至Ab-8中任一 種中存在的分離的核酸。這些區(qū)可包括例如重鏈和輕鏈的所有或部 分可變區(qū)。這些區(qū)尤其包括重鏈和/或輕鏈的至少一個(gè)CDR，通常是 來(lái)自Ab-1至Ab-8的至少一個(gè)CDR對(duì)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的體外 寡核苷酸合成法，直接合成編碼本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合區(qū)的核酸。 或者，采用本領(lǐng)域已知的重組方法合成小片段，再連接成大片段。 可以通過(guò)切割完整蛋白質(zhì)，例如用蛋白酶或化學(xué)切割，制備抗體結(jié) 合區(qū)，例如Fab或F(ab')2。或者可以設(shè)計(jì)截短的基因。 為了表達(dá)抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如PCR擴(kuò)增、位點(diǎn)定向誘變)，得到編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈和重鏈 的DNA，然后可以插入到表達(dá)載體內(nèi)，使得所述基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯 調(diào)節(jié)序列有效連接?？梢詫⒕幋a本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合區(qū)的核酸 克隆到合適的表達(dá)載體中并在合適宿主中表達(dá)。合適的載體和宿主 細(xì)胞系統(tǒng)允許例如Ab-l至Ab-8中至少 一個(gè)的重鏈可變區(qū)和輕鏈可 變區(qū)的共表達(dá)和裝配，或其含有CDR的多肽的共表達(dá)和裝配。本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以決定合適的表達(dá)系統(tǒng)。包含本發(fā)明多核苷酸的核酸可用于轉(zhuǎn)染合適哺乳動(dòng)物或非哺乳 動(dòng)物宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，為了表達(dá)輕鏈和重鏈，通過(guò)標(biāo) 準(zhǔn)技術(shù)，將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn) 染"的不同形式包括各種技術(shù)，所述技術(shù)常用于將外源DNA導(dǎo)入原 核或真核宿主細(xì)胞中，所述技術(shù)例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等。盡管從理論上說(shuō)，無(wú)論原核宿主細(xì)胞還是真核宿主 細(xì)胞都可以表達(dá)本發(fā)明的抗體，但是最典型的還是在真核細(xì)胞、最 優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體，因?yàn)檫@些真核細(xì)胞、尤其是哺 乳動(dòng)物細(xì)胞與原核細(xì)胞不同，能夠裝配和分泌適當(dāng)折疊且具有免疫 活性的抗體或抗原結(jié)合區(qū)。表達(dá)載體包括質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、粘粒、YAC、源自EBV的附 加體等。常用栽體是編碼功能完整的人CH (重鏈恒定區(qū))或CL (輕鏈恒定區(qū))免疫球蛋白序列的載體，帶有經(jīng)改造的合適限制位點(diǎn)，使得 任何VH序列或VL序列可以容易地插入并表達(dá)。在這些載體中，剪 接通常發(fā)生在插入J區(qū)的剪接供體位點(diǎn)和在人C區(qū)前的剪接受體位 點(diǎn)之間，也可在人CH外顯子內(nèi)的剪接區(qū)上。聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止發(fā)生在編碼區(qū)下游的天然染色體位點(diǎn)。選擇與所用表達(dá)宿主細(xì)胞相容的表達(dá)載體和表達(dá)控制序列。本發(fā)明的抗體重鏈可變區(qū)核酸和抗體輕鏈可變區(qū)核酸可以插入到不同 的載體中，或者通常將這兩個(gè)基因都插入到同一表達(dá)載體中。可以 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，將核酸插入到表達(dá)載體中(例如將互補(bǔ)的限制位點(diǎn)連 接在抗體核酸片段和載體，或平端連接，如果沒(méi)有限制位點(diǎn)的話)。本文所迷的Ab-l至Ab-8的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可用于產(chǎn)生任 何抗體同種型的全長(zhǎng)抗體基因，即通過(guò)將它們插入到已經(jīng)編碼所需 同種型(和亞類(lèi))的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，使得在載 體內(nèi)VH區(qū)段與CH區(qū)段有效連接，而且在載體內(nèi)VL區(qū)段與CL區(qū) 段有效連接?；蛘?，表達(dá)載體可編碼信號(hào)肽，所述肽能促進(jìn)抗體或 抗原結(jié)合區(qū)鏈從宿主細(xì)胞中分泌出來(lái)。抗體或抗原結(jié)合區(qū)鏈基因可 以克隆到載體中，使得信號(hào)肽與抗體/抗原結(jié)合區(qū)鏈基因的氨基端符 合讀框地連接。信號(hào)肽可以是免疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽(即來(lái) 自非免疫球蛋白的信號(hào)肽)。本發(fā)明的表達(dá)載體除了攜帶包含CDR的序列之外，還攜帶有控 制序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)序列"包括啟動(dòng) 子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如聚腺苷酸化信號(hào))，這些元件控 制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。這些調(diào)節(jié)序列參見(jiàn)例如Goeddel; Gene Expression Technology。 Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego， Calif. (1990)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)(包 括調(diào)節(jié)序列的選擇)可取決于以下因素有待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、 所需的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等。優(yōu)選的用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的調(diào) 節(jié)序列包括在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中指導(dǎo)高水平蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒元件， 例如來(lái)自巨細(xì)胞病毒(CMV)、猿猴病毒40 (SV40)、腺病毒(例如腺病 毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子?；?者，可以使用非病毒調(diào)節(jié)序列，例如泛蛋白啟動(dòng)子或(3珠蛋白啟動(dòng)子。本發(fā)明的表達(dá)載體除了攜帶抗體或抗原結(jié)合區(qū)核酸和調(diào)節(jié)序列 之外，還可攜帶其它序列，例如在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)載體復(fù)制的序列(例 如復(fù)制起點(diǎn))和選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因便于選擇其中已導(dǎo) 入載體的宿主細(xì)胞(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第4，399,216號(hào)、第4,634,665 號(hào)和笫5,179,017號(hào)，全都屬于Axel等)。例如，選擇性標(biāo)記基因通
常使已導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞具有抗藥性，例如抗G418、潮霉素或曱 氨蝶呤。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因包括二氬葉酸還原酶(DHFR)基因(用 于用甲氨蝶呤選擇/擴(kuò)增dhfr-宿主細(xì)胞)和neo基因(用于G418選擇)。優(yōu)選的用于表達(dá)本發(fā)明重組抗體或抗原結(jié)合區(qū)的哺乳動(dòng)物宿主 細(xì)胞包括中國(guó)倉(cāng)鼠卯巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)(包括dhfr-CHO細(xì)胞，參見(jiàn) Urlaub和Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220，使 用DHFR選擇性標(biāo)記，例如參見(jiàn)R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621)、 NS/0骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2.0細(xì)胞。 尤其是對(duì)于使用NS/0骨髓瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō)，另一個(gè)優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是GS 基因表達(dá)系統(tǒng)，參見(jiàn)WO 87/04462、 WO 89/01036和EP 338 841。當(dāng) 將本發(fā)明的表達(dá)栽體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，產(chǎn)生抗體或抗原 結(jié)合區(qū)，即通過(guò)將宿主細(xì)胞培養(yǎng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以在宿主細(xì)胞中表 達(dá)抗體或抗原結(jié)合區(qū)，或者更優(yōu)選使所述抗體或抗原結(jié)合區(qū)分泌到 宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。一旦表達(dá)，可以按照HPLC純化、分步柱層析法、凝膠電泳等 本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法(參見(jiàn)例如Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982)，純化本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合區(qū)。在某些實(shí)施方案中， 用層析和/或電泳技術(shù)純化多肽。示例性的純化方法包括但不限于硫 酸銨沉淀；PEG沉淀；免疫沉淀；離心后進(jìn)行熱變性；層析，包括 但不限于親和層析(例如A蛋白-瓊脂糖凝膠)、離子交換層析、排阻 層析和反相層析；凝膠過(guò)濾；羥基磷灰石層析；等電聚焦；聚丙烯 酰胺凝膠電泳；以及這些技術(shù)和其它技術(shù)的組合。在某些實(shí)施方案 中，用快速蛋白質(zhì)液相層析或高壓液相層析(HPLC)來(lái)純化多肽。產(chǎn)生抗CD148人單克隆抗體的雜交瘤的制備本發(fā)明的另 一方面包括產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)的雜 交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞可包含與無(wú)限增殖化細(xì)胞融合的B細(xì)胞，所 述B細(xì)胞得自轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物的基因組包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因，其中雜交瘤產(chǎn)生可檢測(cè)量的本發(fā) 明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合區(qū)?？梢园凑諛?biāo)準(zhǔn)方案，分離小鼠脾細(xì)胞，用PEG使小鼠脾細(xì)胞與 小鼠骨髓瘤細(xì)胞系融合。然后根據(jù)抗原-特異性抗體的產(chǎn)生，對(duì)所得 雜交瘤進(jìn)行篩選。例如，使用50% PEG,將得自免疫小鼠脾淋巴細(xì) 胞的單細(xì)胞懸液與1/6數(shù)量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤細(xì) 胞(ATCC， CRL 1580)融合。將細(xì)胞接種在平底微量滴定板中，濃度 約為2xl05,然后在含有20。/。胎兒克隆血清(fetal Clone Serum)、 18% "653"條件培養(yǎng)基、5% origen (IGEN)、 4mM L-谷氨酰胺、lmM L-谷氨酰胺、lmM丙酮酸鈉、5mMHEPES、 0.055mM 2-巰基乙醇、50 單位/ml青霉素、50mg/ml鏈霉素、50mg/ml慶大霉素和lxHAT (Sigma;融合后24小時(shí)加入HAT)的選擇培養(yǎng)基中，孵育2周。2周 后，將細(xì)胞在用HT替代HAT的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。然后各孔用ELISA 法篩選人抗CD148單克隆IgM和IgG抗體。 一旦發(fā)生大量雜交瘤生 長(zhǎng)時(shí)，通常在10-14天后觀察培養(yǎng)基。將分泌的抗體雜交瘤再次接種， 再次篩選，如果對(duì)人IgG仍然呈陽(yáng)性，則可以通過(guò)有限稀釋?zhuān)瑢⒖?CD148單克隆抗體亞克隆至少兩次。然后，體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆， 以便在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體，供表征用。產(chǎn)生抗CD148人單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤的制備也可采用例如本領(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法 的組合(Momson, S. (1985) Science 229:1202),用宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤產(chǎn) 生本發(fā)明的人抗體。轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞可包括編碼人重鏈和人輕鏈的核酸， 其中轉(zhuǎn)染瘤產(chǎn)生可檢測(cè)量的本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合區(qū)。例如，為了表達(dá)抗體或其抗體片段，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué) 技術(shù)(例如PCR擴(kuò)增、位點(diǎn)定向誘變)，得到編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈和 重鏈的DNA,然后可以將其插入到表達(dá)栽體內(nèi)，使得所述基因與轉(zhuǎn) 錄和翻譯控制序列有效連接。在上下文中，術(shù)語(yǔ)"有效連接"是指
抗體基因與載體相連接，使得載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列起到它 們預(yù)定的功能，即調(diào)節(jié)抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。選擇與所用表達(dá)宿 主細(xì)胞相容的表達(dá)載體和表達(dá)控制序列?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈 基因可以插入到不同的載體中，或者更通常的是將兩個(gè)基因都插入 到同一表達(dá)載體中?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，將抗體基因插入到表達(dá)栽 體中(例如將互補(bǔ)的限制位點(diǎn)連接在抗體基因片段和載體，或平端連 接，如果沒(méi)有限制位點(diǎn)的話)。本文所述的抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈 可變區(qū)可用于產(chǎn)生任何抗體同種型的全長(zhǎng)抗體基因，即通過(guò)將它們 插入到已經(jīng)編碼所需同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，使得在栽體內(nèi)VH區(qū)段與CH區(qū)段有效連接，而且在栽體內(nèi)VL 區(qū)段與CL區(qū)段有效連接?；蛘?，重組表達(dá)載體可編碼信號(hào)肽，所述 肽能促進(jìn)抗體鏈從宿主細(xì)胞中分泌出來(lái)。抗體鏈基因可以克隆到載 體中，使得信號(hào)肽與抗體鏈基因的氨基端符合讀框地連接。信號(hào)肽 可以是免疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽(即來(lái)自非免疫球蛋白的信號(hào) 肽)。本發(fā)明的重組表達(dá)載體除了攜帶抗體鏈基因外> 還攜帶控制抗 體鏈基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)序列，，包括啟 動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的表達(dá)控制元件(例 如聚腺普酸化信號(hào))。這些調(diào)節(jié)序列參見(jiàn)例如Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)(包括調(diào)節(jié)序列的選擇)可取決于以下因素有待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需的蛋 白質(zhì)表達(dá)水平等。優(yōu)選的用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的調(diào)節(jié)序列包 括在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中指導(dǎo)高水平蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒元件，例如來(lái)自 巨細(xì)胞病毒(CMV)、猿猴病毒40 (SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚 期啟動(dòng)子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子?；蛘?，可以使 用非病毒調(diào)節(jié)序列，例如泛蛋白啟動(dòng)子或P珠蛋白啟動(dòng)子。本發(fā)明的重組表達(dá)載體除了攜帶抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列之外，
還可攜帶其它序列，例如在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)栽體復(fù)制的序列(例如復(fù) 制起點(diǎn))和選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因便于選擇其中已導(dǎo)入栽體的宿主細(xì)胞(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第4,399,216、 4,634,665和5,179,017 號(hào)，全都屬于Axel等)。例如，選擇性標(biāo)記基因通常使已導(dǎo)入載體的 宿主細(xì)胞具有抗藥性，例如抗G418、潮霉素或曱氨蝶呤。優(yōu)選的選 擇性標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于用甲氨蝶呤選擇/ 擴(kuò)增dhfr-宿主細(xì)胞)和neo基因(用于G418選擇)。在一個(gè)本發(fā)明的優(yōu) 選的實(shí)施方案中，抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列在"splitdhfr載體"PDC323 和PDC324中表達(dá)，參見(jiàn)Bianchi, A.A.和McGrew， J.T. (2003) "High-level expression of full antibodies using tran-complementing expression vectors," Bioengineering and Biotechnology, 84 (4): 439-444; McGrew,J.T.和Bianchi， A.A. (2002) "Selection of cells expressing heteromeric proteins,"美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0030082735,所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)引用 結(jié)合到本文中。為了表達(dá)輕鏈和重鏈，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將編碼重鏈和輕鏈的表 達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)染"的不同形式包括各種技術(shù)， 所述技術(shù)常用于將外源DNA導(dǎo)入原核或真核宿主細(xì)胞中，所述技術(shù) 例如電穿孔、磷酸鉤沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等。盡管從理論上說(shuō)， 無(wú)論原核宿主細(xì)胞還是真核宿主細(xì)胞都可以表達(dá)本發(fā)明的抗體，^f旦 是最典型的還是在真核細(xì)胞、最優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體， 因?yàn)檫@些真核細(xì)胞、尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞與原核細(xì)胞不同，能夠裝 配和分泌適當(dāng)折疊且具有免疫活性的抗體。優(yōu)選的用于表達(dá)本發(fā)明重組抗體的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，包括中 國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)(包括dhfr-CHO細(xì)胞，參見(jiàn)Urlaub和 Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220,使用DHFR 選擇性標(biāo)記，例如參見(jiàn)R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621)、 NS/0骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2.0細(xì)胞。尤其是對(duì) 于使用NS/0骨髓瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō)，另一個(gè)優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是GS基因表 達(dá)系統(tǒng)，參見(jiàn)WO 87/04462、 WO 89/01036和EP 338 841。當(dāng)將編碼 抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，產(chǎn)生抗體， 即通過(guò)將宿主細(xì)胞培養(yǎng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體， 或者更優(yōu)選使所述抗體分泌到宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。采用標(biāo)準(zhǔn) 蛋白質(zhì)純化方法，可以從培養(yǎng)基中回收抗體。使用部分抗體序列來(lái)表達(dá)完整抗體抗體與靶抗原的相互作用，主要是通過(guò)位于6個(gè)重鏈和輕鏈互 補(bǔ)決定區(qū)(CDR)上的氨基酸殘基。為此，比起CDR外的序列來(lái)說(shuō)，CDR 內(nèi)氨基酸序列的各抗體間更多樣化。因?yàn)镃DR序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體-抗原的相互作用，所以可以表達(dá)模擬天然存在的特異性抗體特性的 重組抗體，即通過(guò)構(gòu)建表達(dá)栽體，所述載體包括移植到來(lái)自不同抗序歹寸(參見(jiàn)例如Riechmann, L.等，1998, Nature 332:323-327; Jones， P. 等，1986, Nature 321:522-525; Queen, C.等，1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033)。這樣的構(gòu)架序列可得自包括種系抗體基因序 列的公共DNA數(shù)據(jù)庫(kù)。這些種系序列不同于成熟抗體基因序列，因 為它們不包含完全裝配的可變區(qū)基因，這樣的基因是在B細(xì)胞成熟 期間由V(D)J連接而成。種系基因序列在單個(gè)平均跨越可變區(qū)上也不同于高親和性第二庫(kù)抗體的序列。例如，體細(xì)胞突變很少發(fā)生在 構(gòu)架區(qū)的氨基端部分內(nèi)。例如，體細(xì)胞突變很少發(fā)生在構(gòu)架區(qū)1的 氨基端部分內(nèi)和構(gòu)架區(qū)4的羧基端部分內(nèi)。此外，許多體細(xì)胞突變 都不會(huì)顯著改變抗體的結(jié)合特性。因此，沒(méi)有必要為了再次產(chǎn)生具 有類(lèi)似于原抗體的結(jié)合特性的完整重組抗體，而獲得特定抗體的完 整DNA序列(參見(jiàn)PCT/US99/05535, 1999年3月12曰申請(qǐng)，所述 文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中，用于所有目的)。通常，跨越CDR區(qū)的 部分重鏈和輕鏈序列就足以達(dá)到此目的。部分序列用于測(cè)定哪些種 系可變區(qū)和連接區(qū)基因區(qū)段賦予重組抗體可變區(qū)基因。然后，種系
序列用于補(bǔ)平可變區(qū)中缺少的部分。在蛋白質(zhì)成熟過(guò)程中，切割重 鏈和輕鏈前導(dǎo)序列，并不對(duì)最終抗體的這些特性造成影響。為此， 必須使用相應(yīng)種系前導(dǎo)序列，用于表達(dá)構(gòu)建體。為了添加缺少的序列，通過(guò)連接或PCR擴(kuò)增，將克隆的cDNA序列與合成寡核苷酸連 接在一起。或者，可以將完整可變區(qū)合成為一組短的重疊寡核苷酸， 再通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)組合，以產(chǎn)生完整的合成可變區(qū)克隆。該方法具 有一些優(yōu)勢(shì)，例如消除或包含特定限制位點(diǎn)，或優(yōu)化特定密碼子。
來(lái)自雜交瘤的重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核苷酸序列用于設(shè)計(jì)重疊 的合成寡核苷酸組，以產(chǎn)生合成V序列，所述V序列帶有與天然序 列相同的氛基酸編碼能力。合成重鏈和K鏈序列以3種方式與天然序 列不同重復(fù)核苷酸堿基間隔排列，以利于寡核苦酸合成和PCR擴(kuò) 增；按照Kozak法則(Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870)摻 入最佳翻譯起始位點(diǎn)；而且HindIII位點(diǎn)是改造的翻譯起始位點(diǎn)的上 游。
對(duì)于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，將優(yōu)化的編碼鏈和相應(yīng)非編碼 鏈序列大約在相應(yīng)非編碼寡核苷酸的中點(diǎn)斷裂成30-50個(gè)核普酸。因 此，對(duì)于每條鏈來(lái)說(shuō)，寡核苷酸可以裝配成跨越150-400個(gè)核苷酸區(qū) 段的重疊的雙鏈組中。再將所得混合物用作模板，產(chǎn)生150-400個(gè)核 苷酸的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。通常，單個(gè)可變區(qū)寡核苷酸組可斷裂成兩種 混合物，將其分別擴(kuò)增，產(chǎn)生兩種重疊的PCR產(chǎn)物。再通過(guò)PCR擴(kuò) 增，將這些重疊產(chǎn)物組合在一起，形成完整可變區(qū)。在PCR擴(kuò)增中， 也希望包括重鏈或輕鏈恒定區(qū)(包括K輕鏈的Bbsl位點(diǎn)，或Agel位點(diǎn)， 如果是Y重鏈的話)的重疊片段，以產(chǎn)生易于克隆到表達(dá)載體構(gòu)建體中 的片段。
再將重建的重鏈和輕鏈可變區(qū)與克隆的啟動(dòng)子、翻譯起始序列、 恒定區(qū)、3'非翻譯序列、聚腺苷酸化序列和轉(zhuǎn)錄終止序列連接在一起， 形成表達(dá)載體構(gòu)建體。可以將重鏈和輕鏈表達(dá)構(gòu)建體組合成一個(gè)載 體，共轉(zhuǎn)染、連續(xù)轉(zhuǎn)染或分別轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，在其中融合而形 成同時(shí)表達(dá)兩條鏈的宿主細(xì)胞。下面描述用于構(gòu)建人IgGK表達(dá)載體的質(zhì)粒。構(gòu)建所述質(zhì)粒，使得PCR擴(kuò)增的V重鏈和VK輕鏈cDNA序列可用于再次構(gòu)建完整重 鏈和輕鏈小基因(minigene)。這樣的質(zhì)?？捎糜诒磉_(dá)完全人抗體或嵌 合IgGlK或IgG4K抗體?？梢詷?gòu)建類(lèi)似質(zhì)粒，用于表達(dá)其它重鏈同 種型，或者用于表達(dá)含有人輕鏈的抗體。因此，在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的人抗CD148抗體的結(jié)構(gòu) 特征可用于產(chǎn)生結(jié)構(gòu)相關(guān)的人抗CD148抗體，所述結(jié)構(gòu)相關(guān)的人抗 CD148抗體保留了本發(fā)明抗體的至少一個(gè)功能特征，例如與CD148 結(jié)合。更具體地講，可以通過(guò)重組方法，將抗CD148抗體的一個(gè)或 多個(gè)CDR區(qū)與已知的人構(gòu)架區(qū)和CDR結(jié)合，產(chǎn)生另外的重組改造 的本發(fā)明人抗CD148抗體。因此，本發(fā)明的抗CD148抗體可用于制備抗CD148抗體，即通 過(guò)制備包含以下部分的抗CD148抗體(l)人重鏈構(gòu)架區(qū)和人重鏈 CDR;和(2)人輕鏈構(gòu)架區(qū)和人輕鏈CDR,其中所述抗體仍保留結(jié)合 CD148的能力。采用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定法(例如ELISA),可以測(cè)定抗體結(jié)合CD148 的能力。因?yàn)楸绢I(lǐng)域眾所周知，抗體重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在抗體針 對(duì)抗原的結(jié)合特異性/親和性中起到非常重要的作用，所以如上所述 制備的本發(fā)明重組抗體優(yōu)選包含抗CD148抗體的重鏈CDR3和輕鏈 CDR3。這些抗體還可包含抗CD148抗體的CDR2。這些抗體還可包 含抗CD148抗體的CDR1。因此，本發(fā)明還提供包含以下部分的抗 CD148抗體(l)人重鏈構(gòu)架區(qū)、人重鏈CDR1區(qū)、人重鏈CDR2區(qū) 和人重鏈CDR3區(qū)。其中人重鏈CDR3區(qū)是抗CD148抗體的CDR3; 和(2)人輕鏈構(gòu)架區(qū)、人輕鏈CDR1區(qū)、人輕鏈CDR2區(qū)和人輕鏈CDR3 區(qū)，其中人輕鏈CDR3區(qū)是抗CD148抗體的CDR3，其中所述抗體 結(jié)合CD148。該抗體還可包含抗CD148 '抗體的重鏈CDR2和/或輕鏈 CDR2。該抗體還可包含抗CD148抗體的重鏈CDR1和/或輕鏈CDR1 。
優(yōu)選上迷工程抗體的CDR1、 CDR2和/或CDR3包含與本文公 開(kāi)的抗CD148抗體一樣的準(zhǔn)確的氨基酸序列。然而，普通技術(shù)人員 能理解，準(zhǔn)確CDR序列中可能有一些變動(dòng)，同時(shí)仍能保留抗體有效 結(jié)合CD148的能力(例如保守取代)。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中， 工程抗體可由與抗CD148抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR具有例如90%、 95%、 98%或99.5。/o同一性的一個(gè)或多個(gè)CDR組成。人抗CD148單克隆抗體結(jié)合的表征為了表征本發(fā)明抗人CD148人單克隆抗體的結(jié)合特性，通過(guò)例 如ELISA,測(cè)定來(lái)自免疫小鼠的血清。簡(jiǎn)而言之，用濃度為0.25jLig/ml 的純化CD148的PBS溶液包被;敞量滴定板，再用5%牛血清白蛋白 的PBS溶液進(jìn)行封閉。向各孔中加入經(jīng)CD148免疫小鼠的血漿稀釋 液，在"。C孵育1-2小時(shí)。該板用PBS/吐溫洗滌，再與山羊-抗人IgG Fc-特異性多克隆試劑(與堿性磷酸酶綴合)在37。C醉育1小時(shí)。洗滌 后，該板用pNPP底物(lmg/ml)顯色，在OD 405-650進(jìn)行分析。優(yōu) 選使用具有最高效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。如上所述的ELISA測(cè)定也可用于篩選對(duì)CD148抗原表現(xiàn)出陽(yáng)性 反應(yīng)的雜交瘤。可以將與CD148以高親和力結(jié)合的雜交瘤亞克隆， 再進(jìn)一步表征?？梢詮拿總€(gè)雜交瘤中選出一個(gè)保留親代細(xì)胞反應(yīng)性 的克隆(通過(guò)ELISA),制成5-10個(gè)小瓶的細(xì)胞庫(kù)，貯存于-14。C,用 于抗體純化。為了純化人抗CD148抗體，可以讓選定的雜交瘤在兩升;^走動(dòng)培 養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)，用于單克隆抗體純化。過(guò)濾上清液，濃縮，然后用A 蛋白-瓊脂糖凝膠(Pharmacia, Piscataway, N丄)進(jìn)行親和層析。用凝膠 電泳和高效液相層析檢查洗脫的IgG,保證純度。緩沖液可更換成 PBS，通過(guò)OD，，用消光系數(shù)1.43，確定濃度。將單克隆抗體等分 并貯存于-80。C:為了檢查所選人抗CD148單克隆抗體是否結(jié)合獨(dú)特表位，用市
售試劑(Pierce, Rockford， 111.),使每種抗體都生物素化?？刹捎梦礃?biāo) 記的單克隆抗體和生物素化單克隆抗體，使用如上所述的CD148包 被的ELISA板，進(jìn)行竟?fàn)幮匝芯?。可以用鏈霉抗生物素蛋?堿性磷 酸酶探針，來(lái)檢測(cè)生物素化MAb的結(jié)合。為了確定純化抗體的同種型，可以進(jìn)行同種型ELISA。微量滴 定板的各孔可以在4'C、用10g/ml抗人Ig包被過(guò)夜。用5% BSA封 閉后，將該板與10g/ml單克隆抗體或純化的同種型對(duì)照在環(huán)境溫度 下反應(yīng)2小時(shí)。再讓各孔分別與人IgGl或人IgM-特異性堿性磷酸酶 -綴合探針?lè)磻?yīng)。如上所述，使板顯色并對(duì)其進(jìn)行分析。為了證明單克隆抗體與表達(dá)CD148的活細(xì)胞結(jié)合，可使用流式 細(xì)胞術(shù)。簡(jiǎn)而言之，將表達(dá)CD148的細(xì)胞系(在標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)) 與不同濃度的單克隆抗體的PBS溶液(含0.1% Tween 80和20%小鼠 血清)混合，于37。C孵育1小時(shí)。洗滌后，讓細(xì)胞與萸光素標(biāo)記的抗 人IgG抗體反應(yīng)，反應(yīng)條件與第一抗體染色條件相同。通過(guò)^f吏用 FACScan儀器，利用光散射和側(cè)向散射性能對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行門(mén)控(gate) 來(lái)分析樣品?？梢允褂靡粋€(gè)替代測(cè)定，用焚光顯微鏡(加上或替代)流 式細(xì)胞術(shù)測(cè)定。如上所述，細(xì)胞可以進(jìn)行精確染色，然后用焚光顯 微鏡檢查。該方法可以看到各個(gè)細(xì)胞，但是基于抗原密度，可能會(huì) 降低靈敏度。還可通過(guò)蛋白質(zhì)印跡，測(cè)定抗CD148人IgG對(duì)CD148抗原的 反應(yīng)性。簡(jiǎn)而言之，從表達(dá)CD148的細(xì)胞制備細(xì)胞提取物，進(jìn)行十 二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將各抗原轉(zhuǎn)移到 硝酸纖維素膜上，用20%小鼠血清封閉，再用待測(cè)單克隆抗體進(jìn)行 探測(cè)。人IgG的結(jié)合可以用抗人IgG石咸性磷酸酶來(lái)檢測(cè)，并且用 BCIP細(xì)T底物片(Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.)來(lái)顯色。產(chǎn)生人單克隆抗CD148抗體的轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物用攜帶部分人免疫系統(tǒng)、而非小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠，可以產(chǎn) 生抗CD148多肽的人單克隆抗體。這些轉(zhuǎn)基因小鼠在本文中稱(chēng)為 "HuMAb"小鼠，含有編碼未重排的人重鏈(jLi和力和k輕鏈免疫球 蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(minilocus)以及致使內(nèi)源p鏈 和k鏈基因座失活的把突變(Lonberg,等(1994) Nature 368(6474): 856-859)。因此，所述小鼠表現(xiàn)出小鼠IgM或k表達(dá)減少，并且對(duì)免疫 有應(yīng)答，所引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類(lèi)別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變， 產(chǎn)生高親和力的人IgGK單克隆抗體(Lonberg， N.等(1994)，出處同上； 有關(guān)綜述參見(jiàn)Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N.和Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol.笫13巻65-93，以及Harding, F.和Lonberg， N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546)。 HuMAb小鼠的制備在下文有詳細(xì)描述， 還可參見(jiàn)Taylor， L.等(1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J.等(1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720-3724; Choi等(1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen， J.等(1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon等(1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg等,(1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L.等(1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N.和Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F.和Lonberg， N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D.等(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851,所有這些文獻(xiàn) 的內(nèi)容都通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。另參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,545,806、 5,569,825、 5，625,126、 5,633,425、 5,789,650、 5,877,397、 5,661,016、 5,814,318、 5,874,299、和5，770，429 (所有這些專(zhuān)利都授予Lonberg和 Kay,以及GenPharai International);美國(guó)專(zhuān)利第5，545，807號(hào)(Surani 等)；1998年6月11日公布的國(guó)際公布號(hào)WO 98/24884; 1994年11 月10日公布的WO 94/25585; 1993年12月23日公布的WO 93/1227; 1992年12月23日公布的WO 92/22645; 1992年3月19日/>布的 WO 92/03918,所有這些文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容都通過(guò)引用全部結(jié)合到本文 中。另一方面，可以用轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)產(chǎn)生人抗CD148抗體。為了產(chǎn)生完全人抗CD148單克隆抗體，可以用CD148抗原純化 或富集制備物和/或表達(dá)CD148的細(xì)胞，來(lái)免疫HuMAb小鼠，參見(jiàn) Lonberg， N.等(1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D.等(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851和WO 98/24884。優(yōu)選的小鼠在首 次輸注時(shí)是6-16周齡。例如，可以用CD148抗原純化或富集制備物 (5-20|ig)(例如從表達(dá)CD148的LNCaP細(xì)胞中純化的)，腹膜內(nèi)免疫 HuMAb小鼠。當(dāng)使用CD148抗原的純化或富集制備物進(jìn)行免疫卻 不產(chǎn)生抗體的情況下，也可以用表達(dá)CD148的細(xì)胞(例如胂瘤細(xì)胞系) 來(lái)免疫小鼠，以促進(jìn)免疫應(yīng)答。使用不同抗原所積累的經(jīng)驗(yàn)表明，HuMAb轉(zhuǎn)基因小鼠當(dāng)首次用 抗原和完全弗氏佐劑腹膜內(nèi)(IP)免疫，然后每隔一周用抗原和不完全 弗氏佐劑腹膜內(nèi)免疫(最多共6次)時(shí)，該動(dòng)物的應(yīng)答最佳。在免疫方 案過(guò)程中，可以用眶后(retroorbital)放血獲取血漿樣品，監(jiān)測(cè)免疫應(yīng) 答?？梢酝ㄟ^(guò)ELISA (如下所述)對(duì)血漿進(jìn)行篩選，用具有足夠效價(jià) 的抗CD148人免疫球蛋白的小鼠進(jìn)行融合。在處死小鼠并取出脾臟 之前3天，可以將抗原靜脈內(nèi)給予小鼠，對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。預(yù) 期對(duì)于每種抗原需要進(jìn)行2-3次融合。每種抗原都要免疫很多小鼠。 例如，可以總共免疫12只HC07和HC012品系的HuMAb小鼠。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供能夠表達(dá)與本發(fā)明CD148表位特異 性結(jié)合的人單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠。在 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠(HuMAb 小鼠))的基因組包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因。在一個(gè)實(shí)施方案 中，轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)已經(jīng)用CD148抗原純化或 富集制備物和/或表達(dá)CD148的細(xì)胞進(jìn)行了免疫。優(yōu)選轉(zhuǎn)基因非人類(lèi) 動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)通過(guò)經(jīng)歷V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換，能夠產(chǎn)生 多種抗CD148的人單克隆抗體同種型(例如IgG、 IgA和/或IgE)。同種型轉(zhuǎn)換可通過(guò)例如經(jīng)典或非經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換而發(fā)生。響應(yīng)外源抗原刺激、具有異源抗體庫(kù)的轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物的i殳計(jì)，要求在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)所含有的異源免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因，在B 細(xì)胞發(fā)育途徑中正確發(fā)揮功能。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，異源重 鏈轉(zhuǎn)基因的正確功能包括同種型轉(zhuǎn)換。因此，構(gòu)建本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因， 從而產(chǎn)生同種型轉(zhuǎn)換和以下功能中的一個(gè)或多個(gè)(l)高水平和細(xì)胞 類(lèi)型特異性的表達(dá)，(2)功能性基因重排，(3)激活等位基因排斥和對(duì) 等位基因排斥應(yīng)答，(4)表達(dá)足夠的初級(jí)庫(kù)，(5)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，(6)體細(xì)胞 超突，(7)在免疫應(yīng)答期間轉(zhuǎn)基因抗體基因座的顯性化。并非所有上述標(biāo)準(zhǔn)都要滿(mǎn)足。例如，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物內(nèi)源免疫球 蛋白基因座被功能性破壞的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因不必激活等位基因 排斥。此外，在轉(zhuǎn)基因包括功能性重排的重鏈和/或輕鏈免疫球蛋白 基因的實(shí)施方案中，功能性基因重排的第二條標(biāo)準(zhǔn)是不必要的，至 少對(duì)于已經(jīng)重排的轉(zhuǎn)基因來(lái)說(shuō)。有關(guān)分子免疫學(xué)的背景，參見(jiàn) Fundamental Immunology,第2版(1989), Paul William E.編著.Raven Press, N.Y.，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在某些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生本發(fā)明人單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因非 人類(lèi)動(dòng)物，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生殖細(xì)胞中含有重排、未重排或者重排與 未重排的組合的異源免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因。每個(gè)重鏈轉(zhuǎn)基 因包含至少一個(gè)Ch基因。另外，重鏈轉(zhuǎn)基因可含有功能性同種型轉(zhuǎn) 換序列，所述序列在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物B細(xì)胞中能夠支持編碼多個(gè)Ch基因 的異源轉(zhuǎn)基因的同種型轉(zhuǎn)換。這樣的轉(zhuǎn)換序列可以是天然發(fā)生在來(lái) 自與轉(zhuǎn)基因Ch基因相同來(lái)源的科系免疫球蛋白基因座中的那些序 列，或者這樣的轉(zhuǎn)換序列可以是來(lái)自發(fā)生在接受轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的物 種(轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)中的序列。例如，用于制備轉(zhuǎn)基因小鼠的人轉(zhuǎn)基因構(gòu) 建體可產(chǎn)生更高頻率的同種型轉(zhuǎn)換事件，如果它結(jié)合與小鼠重鏈基 因組內(nèi)天然發(fā)生的轉(zhuǎn)換序列類(lèi)似的轉(zhuǎn)換序列的話，因?yàn)閾?jù)推測(cè)小鼠 轉(zhuǎn)換序列經(jīng)優(yōu)化可與小鼠轉(zhuǎn)換重組酶系統(tǒng)起作用，而人轉(zhuǎn)換序列則 不能。轉(zhuǎn)換序列可以分離得到并通過(guò)常規(guī)克隆方法進(jìn)行克隆，或者 可以從重疊的合成寡核苷酸從頭合成轉(zhuǎn)換序列，所述寡核普酸是根據(jù)免疫球蛋白轉(zhuǎn)換區(qū)序列相關(guān)的公開(kāi)的序列信息而設(shè)計(jì)的(Mills等， Nucl. Acids Res. 15:7305-7316 (1991); Sideras等，Intl. Immunol. 1:631-642 (1989),所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。對(duì)于每種上迷轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物B細(xì)胞的重要部分發(fā)現(xiàn)了功能性重排的異源重 鏈和輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因(至少10%)。用于產(chǎn)生本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因包含重鏈轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn) 基因包含編碼至少一個(gè)可變區(qū)基因區(qū)段、 一個(gè)多樣性基因區(qū)段、一 個(gè)連接基因區(qū)段和至少一個(gè)恒定區(qū)基因區(qū)段的DNA。免疫球蛋白輕 鏈轉(zhuǎn)基因包含至少一個(gè)可變區(qū)基因區(qū)段、 一個(gè)連接基因區(qū)段和至少 一個(gè)恒定區(qū)基因區(qū)段的DNA。編碼輕鏈和重鏈基因區(qū)段的基因區(qū)段 對(duì)轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物來(lái)說(shuō)是異源的，因?yàn)樗鼈儊?lái)源于或?qū)?yīng)于編碼 免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因區(qū)段的DNA,所述DNA來(lái)自不是轉(zhuǎn)基 因非人類(lèi)動(dòng)物的物種?？梢詷?gòu)建這樣的轉(zhuǎn)基因使得各個(gè)基因區(qū)段 是未重排的(即沒(méi)有重排)，以便編碼功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈。 當(dāng)暴露給CD148抗原時(shí)，這樣的未重排轉(zhuǎn)基因支持V、 D和J基因 區(qū)段的重組(功能性重排)，優(yōu)選支持將全部或部分D區(qū)基因區(qū)段摻入 到轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物內(nèi)的所得重排免疫球蛋白重鏈中。轉(zhuǎn)基因也可包含未重排"小基因座"。這樣的轉(zhuǎn)基因通常包含 C、 D和J區(qū)段以及V基因區(qū)段亞類(lèi)的基本部分。在這樣的轉(zhuǎn)基因構(gòu) 建體中，不同調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、類(lèi)別轉(zhuǎn)換區(qū)、用于RNA 加工的剪接供體序列和剪接受體序列、重組信號(hào)等，都包含來(lái)自異 源DNA的相應(yīng)序列。這樣的調(diào)節(jié)序列可摻入到來(lái)自與用于本發(fā)明的 非人類(lèi)動(dòng)物相同或相關(guān)物種的轉(zhuǎn)基因。例如，人免疫球蛋白基因區(qū) 段可以結(jié)合到帶有嚙齒類(lèi)免疫球蛋白增強(qiáng)子序列的轉(zhuǎn)基因中，用于 轉(zhuǎn)基因小鼠?；蛘?，合成調(diào)節(jié)序列可摻入到轉(zhuǎn)基因，其中這樣的合 成調(diào)節(jié)序列與已知天然存在于哺乳動(dòng)物基因組中的功能性DNA序列
不同源。按照公認(rèn)的法則，例如那些用于規(guī)定剪接受體位點(diǎn)或啟動(dòng) 子/增強(qiáng)子基序的容許序列的法則，來(lái)設(shè)計(jì)合成調(diào)節(jié)序列。例如，小 基因座包括部分基因組免疫球蛋白基因座，與天然存在的種系Ig基因座相比，所述基因座具有非必需DNA部分(例如間插序列；內(nèi)含 子或其部分)的至少一個(gè)內(nèi)部(即不在該部分的末端)^:失。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也可用于產(chǎn)生抗CD148的人抗體，所述動(dòng)物含有至 少1個(gè)、通常2-10個(gè)、有時(shí)25-50個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝(參見(jiàn)WO 98/24884的實(shí)施例12)(例如pHCl或pHC2),并用含有一個(gè)拷貝的 輕鏈轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物來(lái)繁育(參見(jiàn)WO 98/24884的實(shí)施例5、 6、 8或14)， 后代用缺失JH的動(dòng)物來(lái)繁育(參見(jiàn)WO 98/24884的實(shí)施例10)，所述 文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文沖。繁育動(dòng)物，達(dá)到這三個(gè)性狀的 每一個(gè)都是純合的。這些動(dòng)物具有以下基因型單拷貝(每套單倍染 色體)的人重鏈未重排小基因座(參見(jiàn)WO 98/24884實(shí)施例12)、單拷 貝(每套單倍染色體)的重排人K輕鏈構(gòu)建體(參見(jiàn)WO 98/24884的實(shí)施 例14)和在每個(gè)內(nèi)源小鼠重鏈基因座上具有缺失，該缺失去除了所有 功能性JH區(qū)段(參見(jiàn)WO 98/24884實(shí)施例10)。這類(lèi)動(dòng)物用Jh區(qū)段缺 失純合的小鼠來(lái)繁育(WO 98/24884實(shí)施例10)，產(chǎn)生對(duì)JH缺失純合 而對(duì)人重鏈和輕鏈構(gòu)建體半合的后代。給所得動(dòng)物注射抗原，用于 產(chǎn)生針對(duì)這些抗原的人單克隆抗體。因?yàn)閺倪@種動(dòng)物分離的B細(xì)胞僅含每個(gè)基因的單拷貝，所以從 這種動(dòng)物分離的B細(xì)胞對(duì)于人重鏈和輕鏈來(lái)說(shuō)是單特異性的。此外， 它們對(duì)于人重鏈或小鼠重鏈來(lái)說(shuō)可以是單特異性的，因?yàn)檫@兩類(lèi)內(nèi) 源小鼠重鏈基因拷貝因跨越JH區(qū)的缺失而成為非功能性的，所述缺 失是4耍WO 98/24884的實(shí)施例9和實(shí)施例12而引入的。此外，B細(xì) 胞的基本部分對(duì)于人輕鏈或小鼠輕鏈來(lái)說(shuō)可以是單特異性的，因?yàn)?單拷貝重排人K輕鏈基因的表達(dá)將會(huì)在B細(xì)胞的重要部分等位且同種 型地排除內(nèi)源小鼠K和入鏈基因的重排。優(yōu)選的實(shí)施方案的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出能產(chǎn)生免疫球蛋白主要庫(kù)，理想的是基本類(lèi)似于天然小鼠。因此，例如，在內(nèi)源Ig基因已失活的實(shí)施方案中，免疫球蛋白總體水平范圍約為0.1-10mg/ml血清， 優(yōu)選0.5-5mg/ml,理想的至少約1.0mg/ml。當(dāng)能夠影響IgM-IgG轉(zhuǎn) 換的轉(zhuǎn)基因?qū)氲睫D(zhuǎn)基因小鼠中時(shí)，成年小鼠血清IgG/IgM之比優(yōu) 選為10:1。在未成年小鼠體內(nèi)的IgG/IgM之比要低得多。 一般而言， 約10%以上，優(yōu)選40-80%的脾臟和淋巴結(jié)B細(xì)胞只表達(dá)人IgG蛋白。 該庫(kù)將會(huì)理想地接近于非轉(zhuǎn)基因小鼠所表現(xiàn)的那樣，通常高至少約 10%，優(yōu)選25-50%以上。 一般而言，產(chǎn)生至少約一千種不同免疫球 蛋白(理想的是IgG)，優(yōu)選104-106以上，這主要取決于引入到小鼠基 因組的不同V、 J和D區(qū)的數(shù)量。這些免疫球蛋白通常識(shí)別約一半或 更多的高度抗原性的蛋白質(zhì)，例如葡萄球菌A蛋白。通常，免疫球 蛋白所表現(xiàn)出的對(duì)預(yù)先選定抗原的親和力為至少約107 M-1,優(yōu)選至 少約1(^M"，更優(yōu)選至少約101Q M"、 1011 M"、 10"M"以上，例如 高達(dá)1013 M"或更高。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選產(chǎn)生具有預(yù)定庫(kù)的小鼠，以限制對(duì)響 應(yīng)預(yù)定抗原類(lèi)型的抗體中存在的V基因進(jìn)行的選擇。具有預(yù)定庫(kù)的 重鏈轉(zhuǎn)基因可包含例如人Vh基因，所述基因優(yōu)先用于針對(duì)預(yù)測(cè)抗原 類(lèi)型的人類(lèi)抗體反應(yīng)?；蛘撸梢砸虿煌?，從確定庫(kù)中排除某 些VH基因(例如具有編碼預(yù)定抗原高親和性V區(qū)的低可能性；具有 經(jīng)歷體細(xì)胞突變和親和性修飾的低傾向性；或者對(duì)某些人具有免疫 原性)。因此，在含不同重鏈或輕鏈基因區(qū)段的轉(zhuǎn)基因重排之前，可通過(guò)雜交或DNA測(cè)序。如上所述，可以用CD148抗原純化或富集制備物和/或表達(dá) CD148的細(xì)胞，來(lái)免疫本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠。小鼠將會(huì)產(chǎn)生B細(xì)胞， 所述細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)基因內(nèi)轉(zhuǎn)換重組(順式轉(zhuǎn)換)經(jīng)歷類(lèi)別轉(zhuǎn)換，并表達(dá)可 與CD148反應(yīng)的免疫球蛋白。免疫球蛋白可以是人序列抗體，其中 重鏈和輕鏈多肽由人轉(zhuǎn)基因序列編碼，所述序列可包含來(lái)自體細(xì)胞
突變和V區(qū)重組連接的序列，以及種系編碼序列；可以認(rèn)為這些人 序列免疫球蛋白與人Vl或Vh基因區(qū)段和人t或Jl區(qū)段所編碼的多 肽序列基本相同，雖然其它非種系序列也是體細(xì)胞突變和不同V-J和 V-D-J重組結(jié)合的結(jié)果。對(duì)于這樣的人序列抗體，每條鏈的可變區(qū)通 常至少80%由人種系V、 J以及(在重鏈情況下)D基因區(qū)段編碼；通 常至少85%的可變區(qū)由轉(zhuǎn)基因上存在的人種系序列編碼；通常90% 或95%或更高可變區(qū)序列由轉(zhuǎn)基因上存在的人種系序列編碼。然而， 因?yàn)榉欠N系序列是通過(guò)體細(xì)胞突變和VJ和VDJ連接引入的，所以人 序列抗體通常具有某些可變區(qū)序歹q(較少具有恒定區(qū)序列)，這些序列 不由小鼠種系中的人轉(zhuǎn)基因上的人V、 D或J基因區(qū)段編碼。通常， 這樣的非種系序列(或各核苷酸位置)在CDR或其附近成蔟，或者在 已知體細(xì)胞突變成簇的區(qū)域成簇。
與預(yù)定抗原結(jié)合的人序列抗體可來(lái)自同種型轉(zhuǎn)換，從而產(chǎn)生包 含人序列Y鏈(例如Yl、 Y2a、 y2B或y3)和人序列輕鏈(例如k輕鏈)的人 抗體。這類(lèi)同種型轉(zhuǎn)換的人序列抗體通常含有一個(gè)或多個(gè)體細(xì)胞突 變，通常是在可變區(qū)內(nèi)并且通常在CDR的約10個(gè)殘基內(nèi)，這是親 和力成熟和抗原對(duì)B細(xì)胞的選擇的結(jié)果，尤其是隨后對(duì)第二(或其后) 抗原進(jìn)行刺激的結(jié)果。
一旦將小鼠種系改造成含有功能性YAC (所述YAC具有擴(kuò)大的 V區(qū)段庫(kù)，該取代基本上不存在于含有J和C基因區(qū)段的人Ig轉(zhuǎn)基 因中)，可以將性狀擴(kuò)增并繁育到其它遺傳背景中，包括這樣的遺傳 背景其中將具有擴(kuò)大的V區(qū)段庫(kù)的功能性YAC繁育到具有不同人 Ig轉(zhuǎn)基因的小鼠種系中。具有擴(kuò)大的V區(qū)段庫(kù)的多功能性YAC可繁 育到種系中，與人Ig轉(zhuǎn)基因(或多個(gè)人Ig轉(zhuǎn)基因)一起發(fā)揮作用。盡 管對(duì)于本文的YAC轉(zhuǎn)基因來(lái)說(shuō)，這樣的轉(zhuǎn)基因當(dāng)整合到基因組中時(shí)， 基本上可缺失酵母序列，例如酵母自主復(fù)制所需的序列；但是當(dāng)不 再需要在酵母中進(jìn)行復(fù)制(即在導(dǎo)入小鼠ES細(xì)胞或小鼠原合子之 前)，所述序列也可任選通過(guò)遺傳工程(例如限制消化和脈沖場(chǎng)凝膠電 泳或其它合適的方法)而去除。人序列免疫球蛋白表達(dá)性狀的繁育方法包括繁育具有人Ig轉(zhuǎn)基因、任選也具有帶有擴(kuò)大的V區(qū)段庫(kù)的功 能性YAC的轉(zhuǎn)基因小鼠。Vh基因區(qū)段和、基因區(qū)段都可存在于YAC 上。技術(shù)人員可將轉(zhuǎn)基因小鼠繁育到任何所需背景中，包括帶有其 它人轉(zhuǎn)基因的背景，所述其它人轉(zhuǎn)基因包括人Ig轉(zhuǎn)基因和/或編碼其 它人淋巴細(xì)胞蛋白的轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明也提供高親和性人序列免疫球 蛋白，所述免疫球蛋白由具有擴(kuò)大的V區(qū)庫(kù)YAC轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小 鼠產(chǎn)生。盡管以上描述了本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的優(yōu)選實(shí)施方案，其它 實(shí)施方案也包括在內(nèi)，其中包括(l)含有未重排重鏈和重排輕鏈免 疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；(2)含有未重排重鏈和未重排輕鏈免 疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；(3)含有重排重鏈和未重排輕鏈免疫 球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；(4)含有重排重鏈和重排輕鏈免疫球蛋 白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。與CD148結(jié)合的雙特異性/多特異性分子在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，抗CD148的人單克隆抗體或其 抗原結(jié)合區(qū)可以衍生或者與另一個(gè)功能性分子(例如另一個(gè)肽或蛋白 (例如Fab'片段)連接，產(chǎn)生可結(jié)合多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)或耙表位的雙特異性 分子或多特異性分子。例如，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合區(qū)可以功能 性連接(例如通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)、遺傳融合、非共價(jià)締合或其它方法)一個(gè) 或多個(gè)其它結(jié)合分子，例如另一個(gè)抗體、抗體片段、肽或結(jié)合模擬 物。因此，本發(fā)明包括雙特異性分子和多特異性分子，所述分子包 含至少一個(gè)針對(duì)CD148的第一結(jié)合特異性和針對(duì)第二耙表位的第二 結(jié)合特異性。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，第二靶表位是Fc受 體，例如人FcyRI(CD64)或人Fcot受體(CD89)。因此，本發(fā)明包括雙 特異性分子和多特異性分子，所述分子能夠同時(shí)結(jié)合表達(dá)Fc7R、 FcaR 或FcsCR的效應(yīng)細(xì)胞(例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或多型核白細(xì)胞(PMN))
和表達(dá)CD148的靶細(xì)胞。這些雙特異性分子和多特異性分子將表達(dá) CD148的細(xì)胞導(dǎo)向效應(yīng)細(xì)胞，并且與本發(fā)明的人單克隆抗體一樣， 觸發(fā)Fc受體介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞活性，例如吞謹(jǐn)表達(dá)CD148的細(xì)胞，抗 體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、釋放細(xì)胞因子或產(chǎn)生超氧化 物陰離子(superanion)。本發(fā)明的雙特異性分子和多特異性分子除了包含抗Fc結(jié)合特異 性和抗CD148結(jié)合特異性之外，還可包括笫三結(jié)合特異性。在一個(gè) 實(shí)施方案中，笫三結(jié)合特異性分子是抗增強(qiáng)因子(EF)部分，例如結(jié)合 表面蛋白的分子，所述蛋白參與細(xì)胞毒活性并因而增加針對(duì)靶細(xì)胞 的免疫應(yīng)答。"抗增強(qiáng)因子部分"可以是抗體、功能性抗體片段或 配體，它們結(jié)合給定分子(例如抗原或受體)并因而導(dǎo)致針對(duì)Fc受體 或靶細(xì)胞抗原的結(jié)合決定子的作用增強(qiáng)。"抗增強(qiáng)因子部分"可結(jié) 合Fc受體或靶細(xì)胞抗原?；蛘撸乖鰪?qiáng)因子部分可結(jié)合這樣的實(shí)體， 所述實(shí)體不同于第一和笫二結(jié)合特異性所結(jié)合的實(shí)體。例如，抗增 強(qiáng)因子部分可結(jié)合細(xì)胞毒T細(xì)胞(例如通過(guò)CD2、 CD3、 CD8、 CD28、 CD4、 CD40、 ICAM-1或其它免疫細(xì)胞，從而增強(qiáng)針對(duì)革巴細(xì)胞的免 疫應(yīng)答)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子和多特異性分子包 含作為結(jié)合特異性的至少一種抗體或其抗體片段，包括例如Fab、 Fab'、 F(ab')2、 Fv或單鏈Fv?？贵w也可以是輕鏈二聚體或重鏈二聚體， 或其任何最小片段，例如Fv或單鏈構(gòu)建體，參見(jiàn)Ladner等的美國(guó)專(zhuān) 利第4,946,778號(hào)，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子和多特異性分子 包括存在于效應(yīng)細(xì)胞表面的FcaR或FcyR的結(jié)合特異性，以及耙細(xì) 胞抗原(例如CD148)的第二結(jié)合特異性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c受體的結(jié)合特異性是由人單克隆抗體 提供的，人免疫球蛋白G (IgG)并不阻斷這樣的結(jié)合。本文所用的術(shù) 語(yǔ)"IgG受體"是指位于1號(hào)染色體上的8個(gè)Y-鏈基因中的任一個(gè)。
這些基因編碼總共12個(gè)跨膜或可溶性受體同種型，它們分為3類(lèi)Fey 受體FcyRI (CD64)、 FcyRII(CD32)和FcyRIII (CD16)。在一個(gè)優(yōu)選 的實(shí)施方案中，F(xiàn)cy受體是人高親和性FcyRI。人FcyRI是72 kDa分 子，表現(xiàn)出對(duì)單體IgG的高親和力(10S-109]^1)。這些優(yōu)選的單克隆抗體的制備和表征參見(jiàn)Fanger等，PCT申請(qǐng) WO 88/00052和美國(guó)專(zhuān)利第4,954,617號(hào)，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié) 合到本文中。這些抗體結(jié)合FcyRI、 FqRII或FcyRIII表位，其結(jié)合 位點(diǎn)不同于FcY受體結(jié)合位點(diǎn)，因此，生理水平的IgG基本上不阻斷 它們的結(jié)合。用于本發(fā)明的特異性抗FcyRI抗體是MAb22、 MAb32、 MAb44、 MAb62和MAb 197。產(chǎn)生MAb 32的雜交瘤可得自美國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection), ATCC保藏號(hào) HB9469?？笷cyRI MAb 22、MAb 22的F(ab')2片段可得自Medarex， Inc. (Aiinandale, N丄)。在其它實(shí)施方案中，抗Fcy受體抗體是羊克隆抗體 22的人源化形式(H22)。 H22抗體的制備和表征參見(jiàn)Graziano, R. F. 等(1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002和PCT/US93/10384。產(chǎn)生H22 抗體的細(xì)胞系于1992年11月4日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 名稱(chēng)為HA022CL1,保藏號(hào)為CRL 11177。在再一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c受體的結(jié)合特異性是由結(jié)合人 IgA受體(例如Fca受體(FcaRI (CD89)))的抗體提供的，人免疫球蛋白 A (IgA)優(yōu)選并不阻斷這樣的結(jié)合。術(shù)語(yǔ)"IgA受體"包括位于19號(hào) 染色體上的一個(gè)a-基因的基因產(chǎn)物(FcaRI)。已知該基因編碼幾種55-110 kDa的可變剪接的跨膜同種型。FcaRI (CD89)在單核細(xì)胞/巨噬細(xì) 胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中是組成型表達(dá)的，但在非效應(yīng) 細(xì)胞群體中卻不是這樣。FcaRI對(duì)于IgAl和IgA2來(lái)說(shuō)具有中等親和 力(約等于5xl07 M-1)，當(dāng)暴露給細(xì)胞因子(例如G-CSF或GM-CSF (Morton等，Critical Reviews in Immunology 16:423-440 (1996》)時(shí)，會(huì) 增加該親和力。已經(jīng)描述了 4種FcaRI-特異性單克隆抗體，分別是 A3、 A59、 A62和A77，它們結(jié)合IgA配體結(jié)合區(qū)外的FcaRI，參見(jiàn)
例如Monteiro等，J. Immunol. 148:1764 (1992)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體為scFv片段與人IgGl同 種型的Fc部分(CH2 & CH3)直接融合的形式(在本文中稱(chēng)為scFv-Fc 構(gòu)建體)。scFv-Fc融合構(gòu)建體參見(jiàn)例如Fredericks等，Protein Engineering Design and Selection 17:95-106 (2003), Powers等，J. Imunological Methods 251:123-135 (2001), Shu等，PNAS 90:7995-7999 (1993)， Hayden等，Therapeutic Immunology 1:3-15 (1994)。FcaRI和FcyRI是用于本發(fā)明的優(yōu)選的觸發(fā)受體，因?yàn)樗鼈?l) 主要是在免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如單核細(xì)胞、PMN、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞) 中表達(dá)；(2)高水平表達(dá)(例如每細(xì)胞5,000-100,000); (3)是細(xì)胞毒活 性(例如ADCC、吞噬作用)的介導(dǎo)物；(4)介導(dǎo)抗原的增強(qiáng)抗原呈遞， 所述抗原包括耙向它們的自身抗原。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子和多特異性分子還 包含結(jié)合特異性，該特異性識(shí)別、例如結(jié)合把細(xì)胞抗原，例如CD148。 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，結(jié)合特異性是由本發(fā)明的人單克隆抗體 提供的。盡管優(yōu)選人單克隆抗體，但是可用于本發(fā)明的雙特異性分子和 多特異性分子的其它抗體是鼠單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和人源 化單克隆抗體。通過(guò)本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)，可制備嵌合小鼠-人單克隆 抗體(即嵌合抗體)。例如，將編碼鼠(或其它物種)單克隆抗體分子的 Fc恒定區(qū)的基因用限制酶消化，去除編碼鼠Fc的區(qū)域，并且取代編 碼人Fc恒定區(qū)的基因的相應(yīng)部分。(參見(jiàn)Robinson等，國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi) PCTYUS86/02269; Akira等，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)184,187; Taniguchi, M.，歐 洲專(zhuān)利申請(qǐng)171,496; Morrison等，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)173,494; Neuberger 等，國(guó)際申請(qǐng)WO 86/01533; Cabilly等，美國(guó)專(zhuān)利第4，816,567號(hào)； Cabilly等，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)125，023; Better等，Science 240:1041-1043 (1988); Liu等，PNAS 84:3439-3443 (1987); Liu等，1987, J. Immunol.139:3521-3526; Sun等(1987) PNAS 84:214-218; Nishimura等，Cane. Res. 47:999-1005 (1987); Wood等，Nature 314:446-449 (1985); Shaw 等，丄Natl Cancer Inst. 80:1553-1559 (1988)。還可用來(lái)自人Fv可變區(qū)的相應(yīng)序列，置換不直接參與抗原結(jié)合 的Fv可變區(qū)序列，使嵌合抗體進(jìn)一步人源化。有關(guān)人源化嵌合抗體 的一般性綜述參見(jiàn)Morrison, Science 229:1202-1207 (1985)和Oi等， BioTechniques 4:214 (1986)。這些方法包括分離、操作和表達(dá)核酸序 列，所述核酸序列編碼來(lái)自至少一條重鏈或輕鏈的所有或部分免疫 球蛋白Fv可變區(qū)。這類(lèi)核酸的來(lái)源是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的， 例如，可得自7E3， 一種產(chǎn)生抗GPIIbII;抗體的雜交瘤。然后可將編 碼嵌合抗體或其片段的重組DNA克隆到合適表達(dá)載體中。或者，還 可通過(guò)CDR取代而制備合適的人源化抗體，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利笫5,225，539 號(hào)；Jones等，Nature 321:552-525 (1986); Verhoeyan等，Science 239:1534 (1988); Beidler等，J. Immunol. 141:4053-4060 (1988)。特定人抗體的CDR可以用至少一部分非人類(lèi)CDR取代，或僅 有部分CDR可以用非人類(lèi)CDR取代。只需要取代人源化抗體與Fc 受體結(jié)合所需的CDR部分?？梢酝ㄟ^(guò)任何方法，使抗體人源化，只要所述方法能夠用來(lái)自 非人類(lèi)抗體的CDR取代人抗體的至少部分CDR。 Winter介紹了 一種 方法，可用于制備本發(fā)明的人源化抗體(英國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)GB 2188638A, 1987年3月26日申請(qǐng))，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。 可以采用國(guó)際申請(qǐng)WO 94/10332 (發(fā)明名稱(chēng)是Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes (針對(duì)人單核吞噬細(xì)胞上免疫球蛋白G的Fc受體的人源化抗體))所描 述的寡核苷酸定點(diǎn)誘變方法，用非人類(lèi)CDR取代人CDR。本發(fā)明范圍之內(nèi)還包括嵌合抗體和人源化抗體，其中具有特異 性氨基酸取代、缺失或添加。具體地講，優(yōu)選的人源化抗體在構(gòu)架 區(qū)具有氨基酸取代，例如為了改善與抗原的結(jié)合。例如，在具有小
鼠CDR的人源化抗體中，位于人構(gòu)架區(qū)的氨基酸可以被位于小鼠抗 體相應(yīng)位置上的氨基酸取代。在某些情況下，這樣的取代已知能改 善人源化抗體與抗原的結(jié)合。具有氨基酸添加、缺失或取代的抗體 在本文中稱(chēng)為修飾抗體或改變抗體。術(shù)語(yǔ)修飾抗體也包括以下抗體，例如已通過(guò)抗體部分的缺失、 添加或取代而修飾的單克隆抗體、嵌合抗體和人源化抗體。例如， 可通過(guò)缺失恒定區(qū)并用能增加抗體半壽期(例如血清半壽期)、穩(wěn)定性 或親和性的恒定區(qū)來(lái)取代所缺失的恒定區(qū)，從而修飾抗體。任何修 飾都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，只要雙特異性分子和多特異性分子 具有至少一個(gè)對(duì)FqR具有特異性的抗原結(jié)合區(qū)，并能觸發(fā)至少一個(gè) 效應(yīng)子功能?？梢允褂没瘜W(xué)技術(shù)(參見(jiàn)例如D. M. Kranz等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807 (1981)、 "polydoma"技術(shù)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4,474,893 號(hào)(Reading))或重組DNA技術(shù)，制備本發(fā)明的雙特異性分子和多特 異性分子。具體地講，可以^使用本領(lǐng)域已知的方法以及本文所提供的實(shí)施 例中描述的方法，將組成結(jié)合特異性分子例如抗FcR和抗CD148結(jié) 合特異性分子綴合，制備本發(fā)明的雙特異性分子和多特異性分子。 例如，可分別產(chǎn)生雙特異性分子和多特異性分子的每種結(jié)合特異性， 再相互連接。當(dāng)結(jié)合特異性分子是蛋白質(zhì)或肽時(shí)，可以用各種各樣 的偶聯(lián)劑或交聯(lián)劑進(jìn)行共價(jià)綴合。交聯(lián)劑的實(shí)例包括A蛋白、碳二 .亞胺、N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰基-疏代乙酸酯(SATA)、 5,5'-二硫代雙 (2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰亞苯基雙馬來(lái)酰亞胺(oPDM)、 N-琥珀酰 亞胺基-3_(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基) 環(huán)己烷-l-曱酸硫代琥珀酰亞胺基酯(sulfo-SMCC)(參見(jiàn)例如 Karpovsky等(l984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, M A等(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。其它方法包括以下文獻(xiàn)中介紹的方法Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan等(Science (1985) 229:81-83)和Glennie等(J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375)。優(yōu)選的 綴合劑是SATA和sulfo-SMCC，這兩種都得自Pierce Chemical Co. (Rockford， IL)。任何"接頭"基團(tuán)都是任選的。如果有的話，其化學(xué)結(jié)構(gòu)并不 重要，因?yàn)樗鼈冎饕亲鳛殚g隔基。接頭優(yōu)選由氨基酸經(jīng)肽鍵連接 在一起而構(gòu)成。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，接頭是由1-20個(gè)氨基 酸經(jīng)肽鍵連接而構(gòu)成的，其中氨基酸選自20種天然存在的氨基酸。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可被糖基化。 在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，這l-20個(gè)氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、 脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴(lài)氨酸。甚至更優(yōu)選的接頭大部分 是由無(wú)立體位阻的氨基酸(例如甘氨酸和丙氨酸)所構(gòu)成的。因此，優(yōu) 選的結(jié)構(gòu)是聚甘氨酸(尤其是(Gly).sub.5、 (Gly).sub.8)、聚(Gly-Ala)和 聚丙氨酸。也優(yōu)選Gly和Ala的組合。也可以用非肽接頭。例如，可以使用烷基接頭，例如-NH-(CH.sub.2)s-C(0)—,其中s=2-20。這些烷基接頭還可被任一無(wú)立體位 阻的基團(tuán)(例如低級(jí)烷基(例如Cl-C6)低級(jí)酰基、卣素(例如C1、 Br)、 CN、 NH2、苯基等)取代。示例性的非肽接頭是PEG接頭，分子量為 100-5000 kDa,優(yōu)選100-500 kDa。可以按照與上述方法相同的方法， 改變肽接頭，以形成衍生物。當(dāng)結(jié)合特異性分子是抗體(例如兩個(gè)人源化抗體)時(shí)，它們可以通 過(guò)兩條重鏈的C端鉸鏈區(qū)的二硫鍵綴合在一起。在一個(gè)具體的優(yōu)選 實(shí)施方案中，在綴合之前，鉸鏈區(qū)經(jīng)修飾后含有奇數(shù)、優(yōu)選一個(gè)巰 基殘基?；蛘撸瑑蓚€(gè)結(jié)合特異性分子可以在同一栽體中編碼并且在同一 宿主細(xì)胞中表達(dá)和裝配。該方法尤其可用于以下情況雙特異性分 子和多特異性分子是MabxMAb、 MabxFab、 FabxF(ab')2或配體xFab 融合蛋白。本發(fā)明的雙特異性分子和多特異性分子，例如雙特異性 分子，可以是單鏈分子，例如單鏈雙特異性抗體、包含一個(gè)單鏈抗
體和結(jié)合決定子的單鏈雙特異性分子、或者兩個(gè)包含結(jié)合決定子的 單鏈雙特異性分子。雙特異性分子和多特異性分子也可以是單鏈分 子，或者可包括至少兩個(gè)單鏈分子。雙特異性分子和多特異性分子的制備方法參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第5,260,203號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第5,455,030 號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第4,881,175號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第5,132,405號(hào)、國(guó)專(zhuān)利第 5,091,513號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第5,476,786號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第5,013,653號(hào)、 美國(guó)專(zhuān)利第5,258,498號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利笫5，482,858號(hào)。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、 FACS分 析、生物測(cè)定(例如生長(zhǎng)抑制)或蛋白質(zhì)印跡測(cè)定，可以證實(shí)雙特異性 分子和多特異性分子與其特異性靶的結(jié)合。這些測(cè)定方法的每一種 通常都是檢測(cè)具體目標(biāo)蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物是否存在，即通過(guò)使用對(duì) 目標(biāo)復(fù)合物具有特異性的標(biāo)記試劑(例如抗體)。例如，可以使用能識(shí) 別并特異性結(jié)合抗體-FcR復(fù)合物的酶聯(lián)抗體或抗體片段，檢測(cè)FcR-抗體復(fù)合物?；蛘?，可以使用各種其它免疫測(cè)定方法來(lái)檢測(cè)復(fù)合物。 例如，可以給抗體加上放射性標(biāo)記并用于放射免疫測(cè)定(RIA)(參見(jiàn) 例^口 Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, 1986 年3月，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)?？梢酝ㄟ^(guò)這些方法，使 用Y計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器，或者通過(guò)放射自顯影技術(shù)，檢測(cè)放射性同 位素?？贵w及其抗原結(jié)合區(qū)也可與載體結(jié)合，用于定向給予指定位置。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū)與至少一個(gè)載體(Fl, F2)通過(guò)肽的N-端、C-端或一個(gè)氨基酸殘基側(cè)鏈相結(jié)合。也可使用多個(gè)栽體；例如Fc在兩端，或者Fc在一端，而PEG基團(tuán)在另一端或側(cè)鏈。Fc區(qū)是一個(gè)優(yōu)選的栽體。Fc區(qū)可與肽的N端或C端或這兩端融合。如上所述，F(xiàn)c變異體是本發(fā)明范圍之內(nèi)的合適載體。天然Fc可 以經(jīng)專(zhuān)門(mén)的修飾，形成本發(fā)明的Fc變異體，只要保持與補(bǔ)救受體 (salvage receptor)的結(jié)合。參見(jiàn)例如WO 97/34631和WO 96/32478。 在這樣的Fc變異體中，可以去除天然Fe的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)，所述 位點(diǎn)提供本發(fā)明融合分子不需要的結(jié)構(gòu)特征或功能活性?？梢酝ㄟ^(guò) 以下方法去除這些位點(diǎn)例如取代或缺失殘基，將殘基插入到所述 位點(diǎn)中，或者截短含有所述位點(diǎn)的部分。插入或取代的殘基也可以 是改變的氨基酸，例如肽模擬物或D-氨基酸。因?yàn)樵S多原因，F(xiàn)c變 異體可能是需要的，其中的一些原因如下所述。示例性的Fc變異體 包括這樣的分子和序列，其中1. 去除參與二硫鍵形成的位點(diǎn)。這樣的去除，可避免與用于產(chǎn) 生本發(fā)明分子的宿主細(xì)胞中存在的其它含半胱氨酸的蛋白質(zhì)發(fā)生反 應(yīng)。為了此目的，N-端含半胱氨酸的區(qū)段可以被截短，或者半胱氨 酸殘基可以缺失或被其它氨基酸(例如丙氨酰、絲氨酰)取代。甚至當(dāng) 半胱氨酸殘基被去除時(shí)，單鏈Fc區(qū)仍可形成二聚體Fc區(qū)，該區(qū)是 非共價(jià)結(jié)合的。2. 修飾天然Fc，使其與所選宿主細(xì)胞更相容。例如，可以去除 典型天然Fc N-端附近的PA序列，該序列在大腸桿菌(五.co/z')中可被 消化酶(例如脯氨酸亞氨基肽酶)識(shí)別。也可以添加N-端甲硫氨酰殘 基，尤其是在大腸桿菌等細(xì)菌細(xì)胞中重組表達(dá)分子時(shí)。3. 去除天然Fc N-端部分，以防止在所選宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)N-端不均一性。為了此目的，可以缺失N-端開(kāi)始的前20個(gè)氨基酸殘基 中的任一個(gè)，尤其是在l、 2、 3、 4和5位上的殘基。4. 去除一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。通常糖基化的殘基(例如天冬酰 胺)可具有細(xì)胞溶解效應(yīng)。這些殘基可缺失或用未糖基化殘基(例如丙 氨酸)取代。5. 去除參與補(bǔ)體相互作用的位點(diǎn)，例如Clq結(jié)合位點(diǎn)。例如， 可以缺失或取代人IgGl的EKK序列。補(bǔ)體募集對(duì)于本發(fā)明分子來(lái) 說(shuō)可能不利，所以可避免用這樣的Fc變異體。
6. 去除影響與Fc受體但不是補(bǔ)救受體結(jié)合的位點(diǎn)。天然Fc可 具有與某些白細(xì)胞相互作用的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)對(duì)本發(fā)明的融合分子 來(lái)說(shuō)是不需要的，所以可以被去除。7. 去除ADCC位點(diǎn)。ADCC位點(diǎn)是本領(lǐng)域已知的。有關(guān)1gGl 的ADCC位點(diǎn)，參見(jiàn)例如Molec. Immunol. 29 (5):633-9 (1992)。這些 位點(diǎn)對(duì)本發(fā)明的融合分子來(lái)說(shuō)也是不需要的，可以被去除。8. 當(dāng)天然Fc來(lái)自非人類(lèi)抗體時(shí)，天然Fc可以被人源化。通常， 為了使天然Fc人源化，可以用人類(lèi)天然Fc中正常存在的殘基取代 非人類(lèi)天然Fc中的所選殘基?？贵w人源化技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。一種替代載體是能夠與補(bǔ)救受體結(jié)合的蛋白質(zhì)、多肽、肽、抗 體、抗體片段或小分子(例如肽模擬物化合物)。例如，可用作栽體的 多肽參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,739,277號(hào)，1998年4月14日授予Presta等。 也可以通過(guò)噬菌體展示，來(lái)選擇與FcRn補(bǔ)救受體結(jié)合的肽。這類(lèi)補(bǔ) 救受體結(jié)合化合物也可包括在"載體"含義之內(nèi)以及本發(fā)明的范圍 之內(nèi)。應(yīng)選擇半壽期增加(例如通過(guò)避免蛋白酶識(shí)別的序列)和免疫原 性下降(例如通過(guò)支持非免疫原性序列，正如在抗體人源化中發(fā)現(xiàn)的 那樣)的所述載體。如上所述，聚合物栽體也可用于Fl和F2?；瘜W(xué)部分用作栽體 的連接方法是目前現(xiàn)有的方法，參見(jiàn)例如專(zhuān)利合作條約(Patent Cooperation Treaty, PCT)國(guó)際公布號(hào)WO 96/11953，發(fā)明名稱(chēng)是"N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods", 所述文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。該P(yáng)CT申請(qǐng)公開(kāi)了水溶性聚 合物與蛋白質(zhì)N-端的選擇性連接。優(yōu)選的聚合物載體是聚乙二醇(PEG)。 PEG可以具有任何常規(guī)分 子量，可以是直鏈也可以是支鏈。PEG的平均分子量范圍優(yōu)選約2 千道爾頓(kDa)至約100 kDa,更優(yōu)選約5 kDa至約50 kDa，最優(yōu)選 約5 kDa至約10 kDa。 PEG基團(tuán)通常是通過(guò)酰化或還原性烷基化， 通過(guò)PEG部分上的活性基團(tuán)(例如餒基、氨基、巰基或酯基)與本發(fā)
明化合物連接。用于合成肽的PEG化(PEGylation,加入聚乙二醇)的策略包括 通過(guò)在溶液中形成共軛鍵，將各自攜帶可彼此反應(yīng)的特定官能團(tuán)的 肽與PEG部分結(jié)合在一起。用本領(lǐng)域已知的常規(guī)固相合成，可以容 易地合成肽。肽在特定位點(diǎn)上用合適官能團(tuán)"預(yù)先活化"。在與PEG 部分反應(yīng)之前，純化并徹底表征前體。肽與PEG的連接通常在水相 中進(jìn)行，可以通過(guò)反相分析型HPLC容易地進(jìn)行監(jiān)測(cè)。通過(guò)制備型 HPLC可以容易地純化PEG化肽，并通過(guò)分才斤型HPLC、氨基酸分 析和激光解吸質(zhì)i普進(jìn)行表征。多糖聚合物是可用于蛋白質(zhì)修飾的另 一 類(lèi)水溶性聚合物。葡聚 糖是多糖聚合物，由主要以al-6鍵連接的各葡萄糖亞單位組成?？?以得到多種分子量范圍的葡聚糖，容易得到的分子量為約1 kDa至約 70kDa。葡聚糖是用作本發(fā)明載體的合適水溶性聚合物，可以單獨(dú)或 與另一個(gè)載體(例如Fc)聯(lián)用。參見(jiàn)例如WO 96/11953和WO 96/05309。已經(jīng)報(bào)道了與治療用或診斷用免疫球蛋白綴合的葡萄糖的 應(yīng)用；參見(jiàn)例如歐洲專(zhuān)利公布號(hào)0 315 456,所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合 到本文中。當(dāng)葡聚糖用作本發(fā)明的載體時(shí)，優(yōu)選約1 kDa至約20 kDa 的葡聚糖?？贵w綴合物/免疫毒素另一方面，本發(fā)明的特征在于與治療部分綴合的人抗CD148單 克隆抗體或其片段，所述治療部分例如細(xì)胞毒素、藥物或放射性同 位素。當(dāng)與細(xì)胞毒素綴合時(shí)，這些抗體綴合物被稱(chēng)為"免疫毒素"。 細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒劑包括對(duì)細(xì)胞有害(例如殺傷細(xì)胞)的任何藥物。實(shí) 例包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依未丁、絲 裂霉素、依'托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、 秋水仙素、多柔比星、柔紅霉'素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、 普卡霉素、放線菌素D、 l-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡
因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素及其類(lèi)似物或同系物。治療藥包括但不限于抗代謝藥(例如曱氨蝶呤、6-巰基噤呤、6-硫鳥(niǎo)噤呤、 阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶decarbazine)、烷化劑(例如氮芥、thioepa苯丁 酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺 (cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、鏈脲菌素、絲裂霉素C 和順-二氯二胺鉑(II) (DDP)順鉑)、蒽環(huán)類(lèi)抗生素(例如柔紅霉素(舊稱(chēng) 道諾霉素)和多柔比星)、抗生素(例如放線菌素D(舊稱(chēng)放線菌素)、博 來(lái)霉素、普卡霉素和安曲霉素(AMC))和抗有絲分裂劑(例如長(zhǎng)春新堿 和長(zhǎng)春花堿)?？梢耘c本發(fā)明抗體綴合的治療用細(xì)胞毒素的其它實(shí)例 包括加利車(chē)霉素和倍癌霉素。本發(fā)明的抗體可以與放射性同位素(例 如放射性碘)綴合，得到用于治療CD148相關(guān)疾病例如癌癥的細(xì)胞毒 性放射性藥物。本發(fā)明的抗體綴合物可用于修飾給定的生物反應(yīng)，其藥物部分 不得視為對(duì)經(jīng)典化學(xué)治療藥的限制。例如，藥物部分可以是具有所 需生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這類(lèi)蛋白質(zhì)可包括例如酶活性毒素或 其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素 或白喉毒素；蛋白質(zhì)，例如腫瘤壞死因子或干4^0素-丫；或生物反應(yīng)調(diào) 節(jié)劑，例如淋巴因子、白介素-1 ("IL-r)、白介素-2 ("IL-2")、白介素 -6 ("IL-6")、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子("GM-CSF")、粒細(xì)胞集落 刺激因子("G-CSF")或其它生長(zhǎng)因子。將所述治療部分與抗體綴合的技術(shù)是眾所周知的，參見(jiàn)例如 Arnon等，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 等(編著)，第243-56頁(yè)(Alan R. Liss， Inc. 1985); Hellstrom等， "Antibodies For 'Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (笫2版), Robinson等(編著)，第623-53頁(yè)(Marcel Dekker， Inc. 1987); Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications,Pinchera等(編著)，第475-506頁(yè)(1985); "Analysis, Results, And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin等(編著)，第303-16頁(yè)(Academic Press 1985),和Thorpe等，"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)。藥物組合物抗CD148抗體的藥物組合物包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。包含抗體的 藥物組合物詳見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第6,171,586號(hào)(Lam等)，2001年1月 9曰授權(quán)。這類(lèi)組合物包含治療有效量或預(yù)防有效量的如上所述的抗 體或其片段、變異體、衍生物或融合物，以及藥學(xué)上可接受的載體 和/或藥學(xué)上可接受的鹽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物包 含與CD148表位結(jié)合并激活CD148活性的抗體以及藥學(xué)上可接受的 載體和/或藥學(xué)上可接受的鹽。通常，特異性結(jié)合劑將是足夠純化的， 供動(dòng)物給藥用。藥學(xué)上可接受的載體本文所用的"藥學(xué)上可接受的載體"包括生理上相容的任何和 所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸 收延遲劑等。在具體的實(shí)施方案中，載體適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、 胃腸外、脊柱或表皮給藥(例如通過(guò)注射或輸注)。根據(jù)給藥途徑，活 性化合物即抗體、雙特異性分子和多特異性分子，可用材料進(jìn)行包 衣，以保護(hù)所述化合物免遭酸或其它自然條件的作用而失活。在另 一個(gè)具體的實(shí)施方案中，藥物組合物與藥學(xué)上可接受的載體配制在 一起，用于人類(lèi)。可用于本發(fā)明藥物組合物的合適水性或非水性載體的實(shí)例包括 水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合 物、植物油(例如橄欖油)和注射用有機(jī)酯類(lèi)(例如油酸乙酯)?？梢酝?br> 過(guò)例如使用包衣材料(例如卵磷脂)，通過(guò)在分散條件下保持所需粒 徑，以及通過(guò)使用表面活性劑，乂人而保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。這些組合物也可含有輔劑，例如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分 散劑。通過(guò)滅菌工藝(參見(jiàn)上文)并通過(guò)加入不同抗細(xì)菌劑和抗真菌劑(例如對(duì)羥基苯曱酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)，能夠確保預(yù)防耀 生物的存在。組合物中最好還可包括等滲劑，例如糖、氯化鈉等。 另外，可以通過(guò)添加延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)達(dá)到注射用 藥物形式的延遲吸收。"藥學(xué)上可接受的鹽"是指保持母體化合物所需生物活性、又 沒(méi)有任何不想要的毒理學(xué)效應(yīng)的鹽(參見(jiàn)例如Berge， S. M.等(1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19)。這類(lèi)鹽的實(shí)例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加 成鹽包括由無(wú)毒無(wú)機(jī)酸和無(wú)毒有;^幾酸衍生的鹽，所述無(wú)機(jī)酸例如鹽 酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等，所述有機(jī)酸 例如脂族一羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族 酸、脂族磺酸和芳族磺酸等。堿加成鹽包括由堿土金屬衍生的鹽(例 如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽等)以及由無(wú)毒有機(jī)胺(例如N,N'-二千基 乙二胺、N-曱基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、 普魯卡因等)衍生的鹽。本發(fā)明的藥物組合物可含有用于調(diào)節(jié)、維持或預(yù)防以下特性的 制劑材料例如pH、滲透壓、粘度、澄明度、顏色、等滲性、氣味、 無(wú)菌性、穩(wěn)定性、溶出率或釋放率、組合物的吸收或滲透性。合適 的制劑材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、 精氨酸或賴(lài)氨酸)；抗孩t生物藥；抗氧化劑(例如抗壞血酸、亞斬u酸鈉 或亞硫酸氬鈉)；緩沖劑(例如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸 鹽、磷酸鹽、其它有機(jī)酸)；增量劑(例如甘露醇或甘氨酸)、螯合劑[例 如乙二胺四乙酸(EDTA)];絡(luò)合劑(例如咖啡因、聚乙烯吡咯:院酮、p-環(huán)糊精或羥丙基-P-環(huán)糊精)；填充劑；單糖；二糖和其它糖(例如葡萄 糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(zhì)(例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；
著色劑；矯味劑和稀釋劑；乳化劑；親水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷 酮)；低分子量多肽；成鹽抗衡離子(例如鈉)；防腐劑(例如苯扎氯銨、 苯曱酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對(duì)羥基苯甲酸曱酯、對(duì)羥基苯 曱酸丙酯、氯己定、山梨酸或過(guò)氧化氫)；溶劑(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)；懸浮劑；表面活性劑 或潤(rùn)濕劑(例如pluronics、 PEG、脫水山梨酸酯、聚山梨酯(例如聚山 梨酯20、聚山梨酯80)、曲拉通、三羥曱基M甲烷、卵磷脂、膽固 醇、四丁酚醛(tyloxapal));穩(wěn)定增強(qiáng)劑(蔗糖或山梨醇)；張力增強(qiáng)劑(例 如卣化堿金屬(優(yōu)選氯化鈉或氯化鉀、甘露醇、山梨醇)；給藥載體； 稀釋劑；賦形劑和/或藥用輔料。(Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版,A. R. Gennaro編著，Mack Publishing Company, 1990)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)例如預(yù)期給藥途徑、給藥方式和所需劑 量，確定最佳藥物組合物。參見(jiàn)例如Remington's Pharmaceutical Sciences,出處同上。這樣的組合物可影響特異性抗體的物理狀態(tài)、 穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放率和體內(nèi)清除率。藥物組合物中主要溶媒或載體可以是水性或非水性的。例如， 合適的溶媒或載體可以是注射用水、生理鹽水或人工腦脊液，可補(bǔ) 充其它常用于胃腸外給藥的組合物的材料。中性緩沖鹽溶液或摻入 血清白蛋白的鹽水是另 一示例性載體。其它示例性的藥物組合物包 括Tris緩沖液(約pH7.0-8.S)或乙酸鹽緩沖液(約pH4.0-5.5),這些緩 沖液中還可包含山梨醇或其合適代用品。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案 中，可通過(guò)將含有所需純度的所選組合物與任選的配方劑混合在一 起，制備呈凍干餅或水溶液形式的結(jié)合劑組合物(Remington's Pharmaceutical Sciences,出處同上)。此外，結(jié)合劑產(chǎn)物可用合適貝武 形劑(例如蔗糖)配制成凍干劑?？蛇x擇用于胃腸外給藥的藥物組合物?；蛘撸蛇x擇用于吸入 或腸內(nèi)給藥用組合物，例如口服、耳用、眼用、直腸或陰道用。這 類(lèi)藥學(xué)上可接受的組合物的制備方法是在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。
制劑成分的濃度是給藥部位能夠接受的濃度。例如，用于使組合物保持在生理pH或稍低pH的緩沖液的pH范圍通常為約5至約8。 當(dāng)本發(fā)明的化合物是作為藥物給予人和動(dòng)物時(shí)，它們可單獨(dú)給 予，或者作為含有0.01-99.5%、更優(yōu)選0.1-90%的活性成分以及藥學(xué) 上可接受的載體的藥物組合物。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的藥物組合物可 含有抗CD148抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，其濃度為約lmg/ml至約 30mg/ml,或者約5mg/ml至約30mg/ml。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體可以配制為確保適 當(dāng)?shù)捏w內(nèi)分布。例如，血腦屏障(BBB)排除了許多高度親水性化合物。 為了保證本發(fā)明的治療用化合物能夠穿過(guò)BBB (如果需要的話)，可 以將它們配制在例如脂質(zhì)體中。關(guān)于脂質(zhì)體的制備方法，參見(jiàn)例如 美國(guó)專(zhuān)利第4,522,811號(hào)、第5,374,548號(hào)和笫5,399,331號(hào)。脂質(zhì)體 可包含一個(gè)或多個(gè)選擇性運(yùn)輸?shù)教囟?xì)胞或器官的部分，因而能增 加把向給藥(參見(jiàn)例如V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:68》。示例性的靶向部分包括葉酸或生物素(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第 5,416,016號(hào)(Low等))；甘露糖苦(Umezawa等，(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038);抗體(P. G. Bloeman等(1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais等(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 表面A蛋白受體(Briscoe等(1995) Am. J. Physiol. 1233:134)，這些不 同類(lèi)型的部分都可包括在本發(fā)明的制劑以及本發(fā)明分子的組分之 內(nèi)；p120 (Schreier等(1994) J. Biol. Chem. 269:9090);另參見(jiàn)K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273。在一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中， 本發(fā)明的治療用化合物配制在脂質(zhì)體中；在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案 中，脂質(zhì)體包含靶向部分。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)快速 大劑量注射(推注)到接近腫瘤或感染的部位而給予脂質(zhì)體中的本發(fā)明 治療用化合物。組合物必須具有流動(dòng)性，使得容易注射。它在制造 和貯存條件下必須穩(wěn)定，并且必須防止細(xì)菌和真菌等微生物的污染 作用。治療有效量無(wú)論所選給藥途徑如何，都可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī) 方法，將用于合適水合形式和/或本發(fā)明藥物組合物的本發(fā)明4匕合物 配制成藥學(xué)上可接受的劑型。與未經(jīng)治療的患者相比，"治療有效量"優(yōu)選抑制腫瘤生長(zhǎng)至少約20%,更優(yōu)選至少約40%,甚至更優(yōu) 選至少約60%,還更優(yōu)選至少約80%?？梢栽陬A(yù)測(cè)對(duì)人類(lèi)腫瘤功效 的動(dòng)物模型系統(tǒng)中，評(píng)價(jià)化合物抑制癌癥的能力?；蛘?，可以通過(guò) 技術(shù)人員已知的測(cè)定方法，檢查化合物的抑制能力(例如體外抑制能 力)，來(lái)評(píng)價(jià)組合物的這一特性。治療有效量的治療用化合物可以縮 小患者的腫瘤大小，或改善其它癥狀。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠根 據(jù)患者體型、患者癥狀的嚴(yán)重程度、具體組合物或所選給藥途徑等 因素，來(lái)確定所述劑量。用于治療的有效量的藥物組合物將取決于治療情況和治療對(duì) 象。本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解，治療用合適的劑量水平將會(huì)部分因以 下因素的變化而異所給予的分子、所用抗體或抗原結(jié)合區(qū)的適應(yīng) 癥、給藥途徑和患者體型(體重、體表或器官大小)和狀況(年齡和一 般健康狀況)。因此，臨床醫(yī)師可決定劑量并調(diào)整給藥途徑，以獲得 最佳療效。優(yōu)選的抗CD148抗體或其抗原結(jié)合區(qū)在溶液中能夠充分結(jié)合 CD148，其濃度小于lpM，優(yōu)選小于0.1^M,更優(yōu)選小于O.OlnM。 "充分"是指觀察到因抗CD148抗體或其抗原結(jié)合區(qū)的調(diào)節(jié)作用， 使內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移至少降低50%,降低50%在本文中稱(chēng)為IC50值。當(dāng)給予生理上可耐受的組合物時(shí)，治療有效量的本發(fā)明抗CD148 抗體或其抗原結(jié)合區(qū)的通常劑量足以達(dá)到的血漿濃度(根據(jù)單次給予 抗體后的cmax數(shù)據(jù))為例如約0.01pg/ml至約300嗎/ml。在另一個(gè)實(shí)
施方案中，濃度可以是約lug/ml至約300ug/ml。在又一個(gè)實(shí)施方案 中，濃度可以是約lpg/ml至約75ng/ml。在再一個(gè)實(shí)施方案中，濃 度可以是約15pg/ml至約50pg/ml。當(dāng)然，劑量因給藥頻率和持續(xù)時(shí) 間而異。當(dāng)給予生理上可耐受的組合物時(shí)，治療有效量的呈多肽形式的 本發(fā)明抗CD148抗體或其抗原結(jié)合區(qū)的多肽含量足以達(dá)到的血漿濃 度為約0.001jxg/ml至約10ng/ml，或約0.05昭/ml至約1.0|Lig/ml。才艮 據(jù)多肽分子量為約15,000克/摩爾(即15,000Da),血漿濃度(摩爾濃度) 可以是例如約O.OOOIiliM至約lmM。換句話說(shuō)，按體重算的劑量可 以是約0.01mg/kg至約30mg/kg,或約0.05mg/kg至約20mg/kg，每 天給予一次或多次，持續(xù)給予一天或幾天。通常的劑量范圍為約 0.1mg/kg至約100mg/kg以上，這取決于上述因素。在其它實(shí)施方案 中，劑量范圍為lmg/kg至約100mg/kg;或5mg/kg至約100mg/kg。對(duì)于任何化合物，最初可以在細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定或動(dòng)物模型(例如d、 鼠、大鼠、兔、狗、豬或猴子)中，估計(jì)治療有效劑量。動(dòng)物才莫型也 可用于確定合適濃度范圍和給藥途徑。這樣的信息隨后可用于確定 用于人體的有用劑量和給藥途徑?？筛鶕?jù)需要治療患者的相關(guān)因素，來(lái)確定準(zhǔn)確劑量?？梢哉{(diào)整 劑量和給藥，以提供足夠水平的活性化合物或維持所需效果。要考 慮的因素包括疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度、患者一般健康狀況、患者年齡、 體重和性別、給藥時(shí)間和頻率、藥物聯(lián)用、反應(yīng)敏感性和對(duì)治療的 反應(yīng)如何。長(zhǎng)效藥物組合物可每3-4天、每周、每?jī)芍芙o予一次，這 取決于特定制劑的半壽期和清除率。給藥頻率取決于所用制劑中結(jié)合劑分子的藥代動(dòng)力學(xué)參凄t。通 常給予組合物，直到劑量已達(dá)到所需效果。因此，組合物可在一段 時(shí)間內(nèi)以單劑量、或多劑量(以相同或不同濃度/劑量)給予，或以連續(xù) 輸注方式給予。更準(zhǔn)確的合適劑量可按常規(guī)方式確定?？梢酝ㄟ^(guò)使 用合適劑量-反應(yīng)數(shù)據(jù)，確定合適劑量。
本發(fā)明的藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可以不同，以 達(dá)到能有效實(shí)現(xiàn)特定患者、組合物和給藥方式的所需治療反應(yīng)的活 性成分用量，而且對(duì)患者無(wú)毒。所選劑量水平將取決于各種藥^動(dòng) 力學(xué)因素，包括具體使用的本發(fā)明組合物或其酯、鹽或酰胺的活性、 給藥途徑、給藥時(shí)間、具體使用的化合物的排泄率、治療持續(xù)時(shí)間、 與具體使用的組合物聯(lián)用的其它藥物、化合物和/或材料、患者的年 齡、性別、體重、病癥、 一般健康狀況和所治療患者先前的醫(yī)療史、 以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的其它因素。具有本領(lǐng)域普通知識(shí)的醫(yī)師或獸醫(yī)可容易地確定有效量的所需藥物組合物并開(kāi)出處方。例如，醫(yī)師或獸醫(yī)在開(kāi)始使用本發(fā)明化合 物時(shí)，在藥物組合物中本發(fā)明化合物的劑量低于要達(dá)到所需療效的 水平，然后再逐步增加劑量，直到達(dá)到所需效果。 一般而言，本發(fā) 明組合物的合適日用量是有效產(chǎn)生療效的最低劑量的化合物用量。 這樣的有效量通常取決于上述因素。優(yōu)選的給藥途徑可以是靜脈內(nèi)、 肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下，優(yōu)選給予粑部位附近。如有必要，治療用組合物的有效日用量可在一天內(nèi)、以合適間隔分別給予2、 3、 4、 5、 6......次亞劑量，任選以單位劑型給予。盡管本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)給 予，但是優(yōu)選以藥物制劑(組合物)的形式給予化合物。組合物可以是無(wú)菌的并且具有流動(dòng)性，使得可以通過(guò)注射給予 該組合物。載體除了可以是水之外，還可以是等滲緩沖鹽溶液、乙 醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物。 可以通過(guò)例如使用包衣材料(例如卯磷脂)，通過(guò)在分散條件下保持所 需粒徑，以及通過(guò)使用表面活性劑，從而保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許 多情況下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇 或山梨醇)和氯化鈉?？梢酝ㄟ^(guò)向組合物中添加延遲吸收劑(例如單石更 脂酸鋁和明膠)達(dá)到注射用藥物形式的長(zhǎng)期吸收。當(dāng)如上所述適當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)活性化合物時(shí)，化合物可以口服給予， 例如與惰性稀釋劑或可同化的可食載體一起給予。
本發(fā)明組合物(例如人抗體、多特異性分子和雙特異性分子)的給 藥方法是本領(lǐng)域已知的。所用分子的合適劑量取決于患者年齡和體重以及具體使用的藥物。所述分子可以與放射性核素(例如1311、 90Y、 105Rh、銦-lll等)偶聯(lián)，參見(jiàn)Goldenberg，D.M.等(1981) Cancer Res. 41: 4354-4360和EP 0365 997。另一方面，本發(fā)明涉及免疫綴合 物，所述綴合物包含與放射性同位素、細(xì)胞毒劑(例如加利車(chē)霉素和 倍癌霉素)、細(xì)胞抑制劑或化療藥物連接的本發(fā)明抗體。本發(fā)明的組 合物(例如人抗體、多特異性分子和雙特異性分子)也可以與抗感染藥 連接。給藥途徑藥物組合物的給藥途徑按照已知方法進(jìn)行，例如口服、通過(guò)以 下途徑注射靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)(實(shí)質(zhì)內(nèi)(intra-parenchymal))、腦 室內(nèi)、肌內(nèi)、目艮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、門(mén)靜脈內(nèi)(intraportal)、損害內(nèi)途徑、髓 內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、腹膜內(nèi)注射、鼻內(nèi)、腸內(nèi)、局部、 舌下、尿道內(nèi)、陰道內(nèi)或直腸，以及通過(guò)緩釋系統(tǒng)或通過(guò)植入禁置二 如有必要，可以通過(guò)快速注射(推注)或連續(xù)輸注(滴注)或植入裝置給 予組合物?；蛘撸梢酝ㄟ^(guò)將吸附或包埋所需分子的膜、海綿或另一合適 材料植入體內(nèi)，局部給予組合物。當(dāng)使用植入裝置時(shí)，該裝置可植 入到任何合適的組織或器官中，可以通過(guò)擴(kuò)散、定時(shí)釋放大丸劑或 連續(xù)給予所需分子。在某些情況下，最好以離體方式使用藥物組合物。在這類(lèi)情況 下，可從患者體內(nèi)取出細(xì)胞、組織或器官，暴露給藥物組合物，然 后再將這些細(xì)胞、組織和/或器官重新植入患者體內(nèi)。在其它情況下，可以使用例如本文所述的方法，通過(guò)植入某些 經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，以表達(dá)和分泌所述多肽，從而給予本發(fā)明 的結(jié)合劑(例如抗體或其抗原結(jié)合區(qū))。所述細(xì)胞可以是動(dòng)物細(xì)胞或人
體細(xì)胞，可以是同源、異源或異種細(xì)胞。任選細(xì)胞是無(wú)限增殖化細(xì) 胞。為了減少免疫反應(yīng)的機(jī)會(huì)，可以將細(xì)胞包成膠嚢，以免向周?chē)?組織浸潤(rùn)。包膠嚢材料通常是生物相容性的、半滲透性聚合外殼或 膜，能允許釋放蛋白質(zhì)產(chǎn)物，但防止細(xì)胞受到患者免疫系統(tǒng)或來(lái)自 周?chē)M織的其它有害因素的破壞。治療用組合物可以用本領(lǐng)域已知的醫(yī)療裝置來(lái)給予。例如，在 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療用組合物可以用例如以下文獻(xiàn)中公開(kāi)的無(wú)針皮下注射裝置來(lái)給予美國(guó)專(zhuān)利5，399，163、 5,383,851、 5，312,335、 5,064,413、 4,941，880、 4,790,824或4,596,556。 可用于本發(fā)明的眾所周知的植入物和組件的實(shí)例包括美國(guó)專(zhuān)利笫 4,487,603號(hào)，它公開(kāi)了一種用于以受控速率分配藥物的可植入微量 輸注泵；美國(guó)專(zhuān)利第4，486，194號(hào)，它公開(kāi)了 一種用于透過(guò)皮膚給藥 的治療裝置；美國(guó)專(zhuān)利第4,447,233號(hào)，它公開(kāi)一種用于以精確的輸 注速率遞藥的藥物輸注泵；美國(guó)專(zhuān)利笫4,447，224號(hào)，它公開(kāi)了一種 用于連續(xù)遞藥的可變流動(dòng)可植入輸注裝置；美國(guó)專(zhuān)利笫4,439,1%號(hào)， 它公開(kāi)了 一種具有多室區(qū)室的滲透性遞藥系統(tǒng)；和美國(guó)專(zhuān)利第 4,475,196號(hào)，它公開(kāi)了一種滲透性遞藥系統(tǒng)。這些專(zhuān)利都通過(guò)引用 結(jié)合到本文中。許多其它這樣的植入物、遞藥系統(tǒng)和組件是本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的。當(dāng)需要胃腸外給藥時(shí)，用于本發(fā)明的治療用組合物可以呈無(wú)熱 源的、胃腸外可接受的水溶液劑形式，其中包含所需特異性結(jié)合劑 以及藥學(xué)上可接受的溶媒。用于胃腸外注射的特別合適的溶媒是無(wú) 菌蒸餾水，其中結(jié)合劑配制成無(wú)菌、等滲溶液，被適當(dāng)保存。又一 種制劑可包括所需分子與例如注射用孩t球體、生物可蝕解的顆粒、 聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、微珠或脂質(zhì)體等試劑的制劑，以便 能提供控釋或緩釋產(chǎn)品，可通過(guò)緩釋型注射劑給藥。也可使用透明 質(zhì)酸，它可具有在循環(huán)中延長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間的效果。引入所需分子的其 它合適方法包括可植入給藥裝置。
另一方面，適于胃腸外給藥用的藥物制劑可配制在水溶液中，優(yōu)選在生理相容的緩沖液(例如Hanks溶液、林格液)或生理緩沖鹽溶 液中。注射用水性混懸劑可含有增加混懸劑粘度的物質(zhì)，例如羧甲 基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。而且，活性化合物的混懸劑可以制 成合適的注射用油性混懸劑。合適的親脂溶劑或溶^^某包括脂肪油(例 如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯、甘油三酯)或脂質(zhì)體。非 脂聚陽(yáng)離子氨基聚合物也可用于給藥。任選混懸劑也可含有合適的 穩(wěn)定劑或增加化合物溶解度的增溶劑以及允許制備高濃度溶液劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物可配制成用于吸入給藥。例 如，結(jié)合劑可配制成吸入用干粉。多肽或核酸分子吸入溶液劑也可 與拋射劑一起配制，用于給予氣溶膠，在又一個(gè)實(shí)施方案中，溶液 劑可以霧化。肺部給藥進(jìn)一步描述于以下文獻(xiàn)PCT申請(qǐng)?zhí)?PCT/US94/001875，所述文獻(xiàn)描述了化學(xué)修飾蛋白的肺部給藥。使用適于口服給藥劑量的本領(lǐng)域眾所周知的藥學(xué)上可接受的載 體，也可配制供口服給藥的藥物組合物。所述載體能讓藥物組合物 配制成片劑、丸劑、錠劑、膠嚢劑、液體制劑、凝膠劑、糖漿劑、 膏劑(slurry)、混懸劑等，供患者服用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，片劑和膠嚢劑)的載體一起配制。例如，膠嚢劑可以設(shè)計(jì)成在胃腸道 內(nèi)釋放制劑的活性部分，當(dāng)生物利用度最佳、而系統(tǒng)前(pre-systemic) 降解最低時(shí)。可以包括其它添加劑，以促進(jìn)結(jié)合劑分子的吸收。稀 釋劑、矯味劑、低熔點(diǎn)蠟、植物油、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、片劑崩解劑 和粘合劑也可使用?？诜盟幬镏苿┛芍苽淙缦峦ㄟ^(guò)將活性化合物與固體賦形劑 混合在一起，然后加工所得顆粒狀混合物(任選在碾磨后)，以得到片 心或或錠心。如有必要，可添加合適的輔料。合適的賦形劑包括碳 水化合物或蛋白質(zhì)填充劑，例如糖類(lèi)，包括乳糖、蔗糖、甘露醇和 山梨醇；玉米淀粉、小麥淀粉、水稻淀粉、馬鈴薯淀粉或其它植物
淀粉；纖維素，例如曱基纖維素、羥丙基曱基-纖維素或羧曱基纖維 素鈉；樹(shù)膠，包括阿拉伯樹(shù)膠和西黃蓍膠；和蛋白質(zhì)，例如明膠和 膠原。如有必要，可加入崩解劑或增溶劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷 酮、瓊脂和海藻酸或其鹽，例如藻酸鈉。錠心可用于包上合適的包衣，例如濃糖液，其中也可含有阿4立 伯樹(shù)膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普膠、聚乙二醇和/或二氧 化鈦、拋光溶液和合適的有機(jī)溶劑或混合溶劑。片劑或錠劑包衣中 可添加染料或顏料，用于產(chǎn)品的識(shí)別，或者用于表征活性化合物的 用量，即劑量?？晒┛诜乃幬镏苿┻€包括明膠制成的兩節(jié)式(push-fit)膠嚢劑， 以及明膠制成的軟質(zhì)密封膠嚢劑和包衣，例如甘油或山梨醇。兩節(jié) 式膠嚢劑可含有活性成分以及填充劑或粘合劑(例如乳糖或淀粉)、潤(rùn) 滑劑(例如滑石粉或硬脂酸鎂)以及任選的穩(wěn)定劑。在軟質(zhì)膠嚢劑中， 活性化合物可溶于或懸浮于合適的液體中，例如含有或不含穩(wěn)定劑 的脂肪油、液體或液態(tài)聚乙二醇。另 一種藥物組合物可涉及將有效量的結(jié)合劑與適于制備片劑的 無(wú)毒賦形劑混合在一起。將片劑溶于無(wú)菌水、或其它合適溶媒中， 可以制備單位劑型的溶液劑。合適的賦形劑包括但不限于惰性稀釋 劑，例如碳酸4丐、碳酸鈉或碳酸氬鈉、乳糖或磷酸4丐；或粘合劑， 例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；或潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂、》更脂酸或 滑石粉。另外的藥物組合物對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，包括 含有結(jié)合劑分子的緩釋或控釋制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道各種其 它緩釋或控釋制劑的配制技術(shù)，例如脂質(zhì)體載體、生物可蝕解的獨(dú): ?；蚨嗫字楹途忈屝妥⑸鋭⒁?jiàn)例如PCT/US93/00829,所述文獻(xiàn) 描述了多孔聚合微粒的控制釋放，以給予藥物組合物。緩釋制劑的 其它實(shí)例包括成型產(chǎn)品形式的半透性聚合物基質(zhì)，例如膜片或微膠 嚢劑。緩釋基質(zhì)可包括聚酯、水凝膠、聚交酯(美國(guó)專(zhuān)利笫3,773,919
號(hào)，EP 58,481)、 L-谷氨酸和Y-乙基-L-谷氨酸的共聚物[Sidman等， Biopolymers, 22:547-556 (1983)]、聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯)[Langer 等，J. Biomed. Mater. Res" 15:167-277, (1981)]和[Langer等，Chem. Tech., 12:98-105 (1982)]、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，出處同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。緩釋組合物也包括脂質(zhì)體，脂質(zhì)體可 用本領(lǐng)域已知的幾種方法中的任一種來(lái)制備。參見(jiàn)例如Eppstein等， Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82:3688-3692 (1985); EP 36，676; EP 88，046; EP 143,949.供體內(nèi)給藥用的藥物組合物通常必須是無(wú)菌的?？赏ㄟ^(guò)除菌濾 膜過(guò)濾而做到這一點(diǎn)。當(dāng)組合物是凍干的，則可在凍干前后和重配 前后，用該方法除菌。胃腸外給藥用組合物可以?xún)龈尚问交蛞匀芤?形式貯存。另外，胃腸外組合物通常放置在帶有無(wú)菌接口(access port) 的容器中，例如帶有塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶，而塞子可用皮下 注射針頭剌穿。當(dāng)配制成藥物組合物時(shí)，它可貯存在無(wú)菌小瓶中，作為溶液劑、 混懸劑、凝膠劑、乳劑、固體或脫水或凍干粉針劑。這樣的制劑可 以即用形式(ready-to-use form)或臨用前需要重配的形式(例如凍干形 式)來(lái)貯存。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生單劑量給藥單 位的藥盒。每個(gè)藥盒可以包括第一容器和第二容器，其中笫一容器 中裝有干燥的蛋白質(zhì)，第二容器中裝有水性制劑。本發(fā)明范圍之內(nèi) 還包括藥盒，所述藥盒包含單室和多室預(yù)灌裝注射器(例如液體注射 器和凍干注射器(lyosyringe))。聯(lián)合療法另一方面，本發(fā)明提供組合物，例如藥物組合物，其中含有一 種或多種本發(fā)明的人抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，以及藥學(xué)上可接受的載 體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含多種(例如兩種以上)本發(fā)明的
分離的人抗體或其抗原結(jié)合區(qū)。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，組合物中的每種抗體或其抗原結(jié)合區(qū)與不同的預(yù)先選擇的CD148表位結(jié) 合。在一個(gè)實(shí)施方案中，聯(lián)合藥物中使用具有補(bǔ)體活性的人抗CD148 單克隆抗體，例如作為包含兩種以上的人抗CD148單克隆抗體的藥 物組合物。例如，抑制血管生成或表達(dá)CD148的細(xì)胞生長(zhǎng)的人單克 隆抗體，也可以與另一種能在效應(yīng)細(xì)胞存在下介導(dǎo)對(duì)扭細(xì)胞高效殺 傷的人抗體聯(lián)合使用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包括一種或多種本發(fā)明的雙特異 性分子或多特異性分子(例如含有至少一個(gè)針對(duì)Fc受體的結(jié)合特異性 和至少一個(gè)針對(duì)CD148的結(jié)合特異性的分子)。因此，本發(fā)明包括將本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)給予同 一 患 者，并聯(lián)合給予一種或多種其它的合適藥物，各自都按照適于所述 藥物的合適方案來(lái)給予。這包括同時(shí)給予本發(fā)明的特異性結(jié)合劑以 及一種或多種合適藥物。本文所用的術(shù)語(yǔ)"同時(shí)給予"包括基本上 同時(shí)給予一種或多種本發(fā)明的抗體以及一種或多種其它合適藥物。本文所用的術(shù)語(yǔ)"非同時(shí)"給予包括在不同時(shí)間內(nèi)、以任何順 序(無(wú)論是否重疊)給予一種或多種本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)以及 一種或多種其它合適藥物。這包括但不限于用聯(lián)合療法中的各組分， 以及方案(其中藥物可交替使用，或者其中一種組分是長(zhǎng)期給予，而 其它組分則是間歇給予)，來(lái)序貫治療(例如預(yù)處理、后處理或重疊處 理)?？梢栽谕唤M合物或單獨(dú)的組合物中，以及通過(guò)相同或不同給 藥途徑，給予各組分。與生長(zhǎng)因子的聯(lián)合療法可包括細(xì)胞因子、淋巴因子、生長(zhǎng)因子 或其它造血因子，例如M-CSF、 GM-CSF、 TNF、 IL-1、 1L-2、 IL-3、 IL畫(huà)4、 IL-5、 IL-6、 IL陽(yáng)7、 IL-8、 IL-9、 IL-IO、 IL-ll、 IL誦12、 IL-13、 IL國(guó)14、 IL-15、 IL誦16、 IL-17、 IL國(guó)18、 IFN、 TNF0、 TNF1、 TNF2、 G曙CSF、 Meg-CSF、 GM-CSF、血小板生成素、干細(xì)胞因子和紅細(xì)胞生成素。
其它組合物可包括已知的血管生成素(angiopoietin)，例如Ang-l、 -2、 -4、 —Y和/或人Ang樣多肽和/或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。生長(zhǎng)因 子包括血管生成素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨形態(tài) 發(fā)生蛋白-3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-5、骨形態(tài)發(fā)生蛋 白-6、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-8、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9、 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-10、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-11、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-12、骨 形態(tài)發(fā)生蛋白-13、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-14、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15、骨形 態(tài)發(fā)生蛋白受體IA、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB、腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、 睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的嗜中 性粒細(xì)胞趨化因子1、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化因子2、細(xì) 胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趁化因子2、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮素 1、表皮生長(zhǎng)因子、上皮衍生嗜中性粒細(xì)胞引誘劑、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 因子4、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子6、成纖維細(xì) 胞生長(zhǎng)因子7、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8b、成 纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8c、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 10、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)膠 質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體-1 、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因 子受體-2、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-1、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-2、生長(zhǎng) 相關(guān)蛋白-3、肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng) 因子受體、胰島素樣生長(zhǎng)因子I、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體、胰島素樣 生長(zhǎng)因子II、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白、角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子、 白血病抑制因子、白血病抑制因子受體-1、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng) 因子受體、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子、胎盤(pán) 生長(zhǎng)因子2、血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、 血小板衍生生長(zhǎng)因子A鏈、血小板衍生生長(zhǎng)因子AA、血小板衍生生 長(zhǎng)因子AB、血小板衍生生長(zhǎng)因子B鏈、血小板衍生生長(zhǎng)因子BB、 血小板衍生生長(zhǎng)因子受體-1、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體-2、 pre-B細(xì) 胞生長(zhǎng)刺激因子、干細(xì)胞因子、干細(xì)胞因子受體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1、
轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1.2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因 子-2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-3、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-5、潛伏轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1、轉(zhuǎn) 化生長(zhǎng)因子-1結(jié)合蛋白I、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-I結(jié)合蛋白II、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因 子-I結(jié)合蛋白III、腫瘤壞死因子受體I型(TNF-Rl)、腫瘤壞死因子 受體II型(TNF-R2)、尿激酶型纖溶酶原激活物受體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子和嵌合蛋白質(zhì)及其生物活性片段或免疫活性片段?？梢岳斫?，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)可以與一種或多種抗 炎藥一起給予。本文所用的術(shù)語(yǔ)"抗炎藥"通常是指能減少患者的 炎癥或肺脹的任何藥物。本文列舉了大量示例性抗炎藥，但是可以 理解,也有其它合適抗炎藥在本文中沒(méi)有具體列舉，但也包括在本 發(fā)明之內(nèi)?？寡姿幙梢允抢缫种蒲仔约?xì)胞因子與其受體間相互作用的化 合物。用于與本發(fā)明特異性結(jié)合劑聯(lián)用的細(xì)胞因子抑制劑的實(shí)例包 括例如TGF-(3拮抗劑(例如抗體)，以及針對(duì)涉及炎癥的白介素的拮抗 劑(例如抗體)。這類(lèi)白介素在本文中有說(shuō)明，優(yōu)選包括但不限于IL-1、 IL畫(huà)2、 IL-3、 IL國(guó)4、 IL-5、 IL誦6、 IL-8、 IL-9、 IL-ll、 IL國(guó)12、 IL-13、 IL-17 和IL-18。參見(jiàn)Feghali等，F(xiàn)rontiers in Biosci., 2:12-26 (1997)。示例性 抗體拮抗劑也包括針對(duì)21-28kD細(xì)胞表面糖蛋白CD52的抗體(例如 CamPath , Berlex Laboratories),抗IL-8抗體(和抗IL8-RB抗體)、抗 B-FGF抗體(和抗B-FGF受體抗體)、抗TWEAK抗體(和抗TWEAK 受體(即TWEAKR)抗體)、抗Adam/解聯(lián)蛋白抗體、抗eph受體、抗 肝配蛋白抗體和抗PDGF-BB抗體。本發(fā)明的特異性抗體或其抗原結(jié)合區(qū)也可與蛋白激酶A 1型抑 制劑聯(lián)用，以增強(qiáng)HIV感染者的T細(xì)胞增殖，所述患者同時(shí)接受抗 逆轉(zhuǎn)錄病毒療法。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(N GF)也可以與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)聯(lián) 用，以治療某些病癥。所述病癥包括神經(jīng)變性行疾病、脊髓損傷和 多發(fā)性硬化?？捎迷撀?lián)合療法治療的其它病癥是青光眼和糖尿病。
優(yōu)選的聯(lián)合療法涉及將本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)以及一種或多種合適的IL-1抑制劑一起給予患者。IL-1抑制劑包括但不限于 IL-1的受體結(jié)合肽片段、針對(duì)IL-1或IL-lp或IL-1受體I型的抗體、 以及重組蛋白，所述重組蛋白包含IL-1或其修飾變異體的全部或部 分受體，包括遺傳修飾的突變蛋白、多聚體形式和緩釋制劑。特異 性拮抗劑包括IL-Ira多肽、IL-ip轉(zhuǎn)化酶(ICE)抑制劑、拮抗型I IL-1 受體抗體、I型IL-1受體和II型IL-1受體的IL-1結(jié)合形式、抗IL-1 (包 括IL-la和IL-1(3和其它IL-1家族成員)的抗體、以及稱(chēng)為IL-1 Trap (Regeneron)的治療藥。IL-Ira多肽包括IL-Ira形式(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第 5,075,222號(hào))和修飾形式和變異體(包括以下文獻(xiàn)中描述的那些美國(guó) 專(zhuān)利笫5,922,573號(hào)、WO 91/17184、 WO 92/16221和WO 96/09323)。 IL-1(3轉(zhuǎn)化酶(ICE)抑制劑包括肽酰ICE抑制劑和小分子ICE抑制劑， 包括以下文獻(xiàn)中描述的那些PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO 91/15577、 WO 93/05071、 WO 93/09135、 WO 93/14777和WO 93/16710;歐洲專(zhuān)利 申請(qǐng)0 547 699 。非肽?；衔锇ㄒ韵挛墨I(xiàn)中介紹的那些化合物PCT 專(zhuān)利申請(qǐng)WO 95/26958、美國(guó)專(zhuān)利第5，552,400號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第 6,121,266號(hào)和Dolle等，J. Med. Chem., 39，笫2438-2440頁(yè)(1996)。 其它ICE抑制劑描述于以下文獻(xiàn)美國(guó)專(zhuān)利6,162,790、 6,204,261、 6,136,787、 6,103,711、 6,025,147、 6,008,217、 5,973，111、 5,874，424、 5,847,135、 5,843,904、 5,756，466、 5,656,627、 5,716,929。 I型IL-1受 體和II型IL-1受體的IL-1結(jié)合形式描述于以下文獻(xiàn)美國(guó)專(zhuān)利 4,968,607、 4,968，607、 5,081,228、 Re 35,450、 5,319,071和5,350,683。 其它合適的IL-1拮抗劑包括但不限于衍生自IL-1的肽，所述肽能夠 竟?fàn)幮砸种艻L-1信號(hào)受體、IL-1 RI型的結(jié)合。有關(guān)某些IL-1 (和其 它細(xì)胞因子)拮抗劑的其它指南可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利笫6，472,179號(hào)。另外，TNF抑制劑是合適的，包括但不限于TNF-a受體結(jié)合肽 片段、反義寡核苷酸或抑制TNF-a產(chǎn)生的核酶、針對(duì)TNF-a的抗體 和重組蛋白，所述重組蛋白包括TNF-a或其^f參飾變異體的所有或部
分受體，包括遺傳修飾的突變蛋白、多聚形式和緩釋制劑。TACE(胂 瘤壞死因子-a轉(zhuǎn)化酶)抑制劑，例如TAPI (Immunex Corp.)和GW-3333X (Glaxo Wellcome Inc.),也是合適的。抑制IgA-oc-lAT復(fù)合物 形成的分子也是合適的，例如EP 0 614 464 B中公開(kāi)的肽，或針對(duì)該 復(fù)合物的抗體也是合適的。其它合適的分子包括但不限于TNF-a-抑 制二糖、葡糖胺的硫酸衍生物，或美國(guó)專(zhuān)利第6,020,323號(hào)所介紹的 其它類(lèi)似糖。合適的分子還包括肽TNF-a抑制劑(公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利第 5,641,751和5,519，000號(hào))和含有D-氨基酸的肽(公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利笫 5,753,628號(hào))。另外，TNF-a轉(zhuǎn)化酶抑制劑也是合適的。WO 01/03719 介紹了更多可與本發(fā)明聯(lián)用的藥物。合適的化合物還包括但不限于小分子，例如沙利度胺或沙利度 胺類(lèi)似物、己酮可可石威或基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制劑或其它小分 子。用于該目的的合適的MMP抑制劑包括例如美國(guó)專(zhuān)利第 5,883,131、 5，863，949和5,861,510號(hào)所介紹的那些，以及美國(guó)專(zhuān)利第 5,872,146號(hào)所介紹的巰基烷基肽?；衔铩Ｄ軌驕p少TNF-a產(chǎn)生的 其它小分子包括例如美國(guó)專(zhuān)利5,508,300、 5,596,013和5,563,143所 介紹的分子。其它合適的小分子包括但不限于MMP抑制劑(例如參 見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5/747,514號(hào)和第5，691，382號(hào))，以及異羥肟酸衍生物(例 如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,821,262號(hào))。合適的分子還包括例如能抑制磷酸 二酯酶IV和TNF-a產(chǎn)生的小分子，例如取代的肝衍生物(WO 96/00215)、喹啉磺酰胺(美國(guó)專(zhuān)利第5,834,485號(hào))、芳基呋喃衍生物 (WO 99/18095)和雜雙環(huán)衍生物(WO 96/01825; GB 2 291 422 A)。也 可使用抑制TNF-a和IFN-y的噻唑衍生物(WO 99/15524)、以及抑制 TNF-a和其它促炎細(xì)胞因子的黃嘌呤衍生物(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利 5,118,500、 5,096,906和5,196,430)。用于治療本文所述病癥的其它小 分子包括美國(guó)專(zhuān)利第5,547,979號(hào)中公開(kāi)的小分子。聯(lián)合療法中可以一起給藥的藥物和藥物類(lèi)型的其它實(shí)例包括但 不限于抗病毒藥、抗生素、鎮(zhèn)痛藥(例如對(duì)乙酰氨基酚、可待因、萘 碌酸右丙氧酚、鹽酸氧可酮、酸式酒石酸氬可酮(hydrocodone bitartmte)、曲馬多)、皮質(zhì)類(lèi)固醇、炎性細(xì)胞因子拮抗劑、調(diào)節(jié)疾病 的抗風(fēng)濕藥(DMARD)、非甾體類(lèi)抗炎藥(NSAID)和長(zhǎng)效抗風(fēng)濕藥 (SAARD)。示例性的疾病調(diào)節(jié)性抗風(fēng)濕藥(DMARD)包括但不限于 Rheumatrex (曱氨蝶呤)；Enbrel (依那西普)；Remicade (英夫利 昔單抗(infliximab)); Humira (阿達(dá)木單抗(adalimumab)); Segard (阿 非莫單抗(afdimomab)); Arava (來(lái)氟米特)；Kineret (阿那白滯素 (anakinra)); AravaTM (來(lái)氟米特)；D-青霉胺；Myochrysine; Plaquenil; Ridaura頂(金諾芬)；Solganal;來(lái)那西普(Hoffman-La Roche); CDP870 (Celltech); CDP571 (Celltech)、以及EP 0 516 785 Bl、美國(guó)專(zhuān)利第 5,656,272號(hào)、EP 0 492 448 Al中介紹的抗體；奧那西普(Serono; CAS 注冊(cè)號(hào)199685-57-9); MRA (Chugai); Imuran (硫峻噪呤)；NFKB 抑制劑；磷酰胺制劑TM (環(huán)磷酰胺)；環(huán)孢菌素；硫酸羥氯喹；米諾環(huán) 素(二甲胺四環(huán)素)；柳氮磺吡啶；和金化合物，例如口服金、硫代蘋(píng) 果酸金鈉和金硫葡糖。合適的分子還包括例如來(lái)自TNF-a受體分子、而非p55和p75 TNFR的胞外區(qū)的可溶性TNFR，例如WO 99/04001中介紹的TNFR, 包括來(lái)自該TNFR的TNFR-Ig。其它合適的TNF-ot抑制劑也適用于 本發(fā)明。這些抑制劑包括不僅適用如本文所述的針對(duì)TNF-a或TNFR 的抗體，而且也適用來(lái)自TNF-a的肽(所述肽可作為T(mén)NF-a的竟?fàn)幮?抑制劑，例如美國(guó)專(zhuān)利笫5，795,859號(hào)或美國(guó)專(zhuān)利第6,107,273號(hào)中 描述的那些)、TNFR-IgG融合蛋白(例如含有p55 TNF-a受體胞外部 分的融合蛋白)、可溶性TNFR (而非IgG融合蛋白)或降低內(nèi)源TNF-a水平的其它分子(例如TNF-a轉(zhuǎn)化酶抑制劑(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第 5,594,106號(hào))、或小分子或TNF-a抑制劑)，本文描述了許多這樣的 分子。對(duì)于抗TNF的抗體，盡管有經(jīng)驗(yàn)的衛(wèi)生保健提供者可按患者的 具體需要來(lái)確定優(yōu)化劑量，但是抗TNF-a抗體的示例性?xún)?yōu)選劑量范 圍為0.1-20mg/kg，更優(yōu)選l-10mg/kg?？筎NF-a抗體的另一個(gè)優(yōu)選 劑量范圍為0.75-7.5mg/kg體重。本發(fā)明也可使用特異性結(jié)合劑和一種或多種非甾體抗炎藥 (NSAID)的任一種。NSAID具有抗炎作用，至少部分抑制前列腺素 的合成。Goodman和Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan第7版(1985)。 NSAID按其性質(zhì)可分為九大類(lèi)(l)水楊 酸衍生物；(2)丙酸衍生物；(3)乙酸衍生物；(4)芬那酸類(lèi)(fenamic acids) 衍生物；(5)羧酸衍生物；(6)丁酸衍生物；("昔康類(lèi)(oxicams); (8)吡 唑；和(9)吡唑啉酮。NSAID的實(shí)例包括但不限于AnaproxTM、 Anaprox DS (奈普生鈉)；Ansaid (氟比洛芬)；Arthrotec (雙氯芬酸鈉+米 索前列醇(misoprostil)); Cataflam.TM./VoltarenTM (雙氯芬酸鐘)； ClinorilTM (舒林酸)；Daypro (螺丙溱)；Disalcid (雙水楊酯)； Dolobid (二氟尼柳)；EC Naprosyn (奈普生鈉)；Feldene (吡羅 昔康)；IndocinTM、 Indocin SRTM (。引咮美辛)；LodineTM、 Lodine XLTM (依托度酸)；Motrin (布洛芬)；Naprelan (奈普生)；Naprosyn (奈 普生)；OrudisTM、(酮洛芬)；OruvailTM (酮洛芬)；Relafen (萘丁美 酮)；TolectinTM、(托美丁鈉)；Trilisate (三水楊酸膽磁j美)；Cox-1 抑制劑；Cox-2抑制劑，例如Vioxx (羅非考昔)；Arcoxia (艾托 考昔)、Celebrex (塞來(lái)考昔)；Mobic (美洛昔康)；Bextra.TM.(伐 i也考昔)、DynastatTM巾白雷考昔(paracoxib)4內(nèi)；PrexigeTM (lumiracoxib) 和nambumetone。其它合適的NSAID包括但不P艮于以下s-乙酰氨 基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羥基丁酸、阿米西群、阿尼扎芬、 安曲非寧、千達(dá)酸、芐達(dá)賴(lài)氨酸、芐達(dá)明、b叩rozin、溴哌莫、布可 隆、丁苯唑酸、環(huán)丙喹宗、氯克昔酯、達(dá)齊胺、地波沙美、地托咪 定、g關(guān)苯p比胺、difenpyramide 、 difisalamine、 J4他p坐(ditazo1)、依莫 法宗、曱磺酸法奈替唑、芬氟咪唑、夫洛非寧、氟咪唑、氟尼辛、 氟丙會(huì)宗、福吡托林、磷柳酸、p瓜美柳、愈創(chuàng)藍(lán)油烴(guaiazolene)、 異尼辛(isonixira)、鹽酸來(lái)苯胺、來(lái)氟米特、洛非咪唑、氯替法唑、 氯胺煙酸細(xì)胞溶素(lysin clonixinate)、美西拉宗、萘丁美酮、尼克吲 哚、尼美舒利、奧古蛋白、奧帕諾辛、奧沙西羅(oxaceprolm)、奧沙 帕多、瑞尼托林、派立索哇、檸檬酸派立索唑、p底福將、piproxen、 吡拉唑酸、吡非尼酮、普羅喹宗、普羅沙唑、梭孢殼素B(thielavinB)、 替氟咪唑、替美加定、托來(lái)汀、托帕朵、色胺以及那些按公司代碼 來(lái)命名的藥物，例如480156S、 AA861、 AD1590、 AFP802、 AFP860、 A177B、 AP504、 AU8001、 BPPC、 BW540C、 C顧OIN 127、 CNIOO、 EB382、 EL508、 F1044、 FK-506、 GV3658、 ITF182、 KCNTEI6090、 KME4、 LA2851、 MR714、 MR897、 MY309、 ONO.sub.3144、 PR823、 PV102、 PV亂R830、 RS2131、 SCR152、 SH440、 SIR133、 SPAS510、 SQ27239、 ST281、 SY6001、 TA60、 TAI-901 (4-苯曱?；?l-茚滿(mǎn)羧 酸)、TVX2706、 U60257、 UR2301和WY41770。該組藥物內(nèi)也包括 具有與NSAID類(lèi)似的鎮(zhèn)痛和抗炎特性的結(jié)構(gòu)相關(guān)NSAID。合適的SAARD或DMARDS包括但不限于阿洛銅鈉、金諾芬、 金硫葡糖、金硫醋苯胺(aurothioglycamide)、硫唑嘌呤、布唾那鈉、 布西拉明、3-金硫-2-丙醇-l-磺酸鉤、苯丁酸氮芥、氯喹、氯丁扎利、 銅克索林、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢菌素、氨苯砜、15-脫氧精胍菌素、雙醋 瑞因、葡糖胺、金鹽(例如環(huán)壹金鹽、金硫丁二鈉、金硫代硫酸鈉)、 羥氯喹、雍基脲、凱布宗、左旋咪唑、氯苯扎利、蜂毒肽、6-巰基嘌 呤、甲氨蝶呤、咪唑立賓、麥考酚酸嗎乙酯、myoml、氮芥、D-青霉 胺、吡咬咪唑(pyridinol imidazole)(例如SKNF86002和SB203580)、 雷帕霉素、硫醇類(lèi)、胸腺生成素和長(zhǎng)春新堿。該組藥物內(nèi)也包括具 有類(lèi)似的鎮(zhèn)痛和抗炎特性的結(jié)構(gòu)相關(guān)SAARD或DMARD。信號(hào)級(jí)聯(lián)中的激酶抑制劑也是與本發(fā)明的特異性結(jié)合劑聯(lián)用的 合適藥物。它們包括但不限于能夠抑制P-38 (也稱(chēng)為"RK"或 "SAPK-2" , Lee等，Nature, 372:739 (1994》的藥物。作為絲氨酸/蘇 氨酸激酶的P-38已有描述(參見(jiàn)Han等，Biochimica Biophysica Acta, 1265:224-227 (1995)。已經(jīng)知道P-38抑制劑干預(yù)胞外刺激物與IL-1 和TNF-ot從細(xì)胞沖分泌，所述細(xì)胞通過(guò)抑制位于信號(hào)途徑上的激酶 而參與阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。其它合適的是MK2抑制劑和tpl-2抑制劑。另外，T細(xì)胞抑制 劑也是合適的，包括例如ctla-4、 CsA、 Fk-506、 0X40、 OX40R-Fc、 OX40抗體、OX40配體、OX40配體抗體、lck和ZAP70。類(lèi)視色素 (包括口服類(lèi)視色素)以及TGF-(3拮抗劑也是合適的。與本發(fā)明特異性結(jié)合劑聯(lián)用的其它合適藥物包括例如任何一種 或多種水楊酸衍生物、其前體藥物的酯或藥學(xué)上可接受的鹽。這類(lèi) 水楊酸衍生物、其前體藥物的酯及其藥學(xué)上可接受的鹽包括醋氨 沙洛、阿洛普令、阿司匹才木、貝i若酯、溴水楊醇(bromosaligenin)、乙 酰水楊酸鈣、三水楊酸膽堿鎂二氟尼柳、依特柳酯、芬度柳、龍膽 酸、乙二醇水楊酸酯、水楊酸咪唑、賴(lài)氨酸乙酰水楊酸、5-羥基水楊 酸、水楊酸嗎啉、水楊酸l-萘酯、奧沙拉秦、帕沙米特、乙酰水楊 酸苯酯、水楊酸苯酯、醋水楊胺、水楊酰胺O-乙酸、雙水楊酯和柳 氮磺吡啶。該組藥物內(nèi)也包括具有類(lèi)似鎮(zhèn)痛和抗炎特性的結(jié)構(gòu)相關(guān) 的水楊酸衍生物。其它合適的藥物包括例如丙酸衍生物、其前體藥 物的酯或藥學(xué)上可接受的鹽。丙酸衍生物、其前體藥物的酯及其藥 學(xué)上可接受的鹽包括阿明洛芬、苯嗨洛芬、布氯酸、卡洛芬、右 、引咮洛芬、非諾洛芬、氟諾洛芬、氟洛芬、氟比洛芬、呋洛芬、布 洛芬、布洛芬鋁、異丁普生、吲哚洛芬、異洛芬、酮洛芬、洛索洛 芬、咪洛芬、奈普生、瞎丙嗪、吡酮洛芬、pimeprofen、吡洛芬、普 拉洛芬、丙替溱酸、pyridoxiprofen、舒洛芬、漆洛芬酸和硫螺洛芬。物。其它適用的藥物是乙酸衍生物、其前體藥物的酯或其藥學(xué)上可 接受的鹽。乙酸衍生物、其前體藥物的酯及其藥學(xué)上可接受的鹽包 括阿西美辛、阿氯芬酸、氨芬酸、丁苯羥酸、桂美辛、氯吡酸、 地美辛、雙氯芬酸鈉、依托度酸、聯(lián)苯乙酸、芬氯酸、苯克洛酸、 芬克洛酸、芬替酸、呋羅芬酸、葡美辛、異丁芬酸、吲哚美辛、三苯唑酸、伊索克酸、氯那唑酸、曱溱酸、奧沙美辛、oxpinac、吡美 辛、丙谷美辛、舒林酸、他美辛、噻拉米特、硫平酸、托美丁、齊 多美辛和佐美酸。該組藥物內(nèi)也包括具有類(lèi)似鎮(zhèn)痛和抗炎特性的結(jié) 構(gòu)相關(guān)的乙酸衍生物。本文所述的其它適用的藥物是芬那酸衍生物、 其前體藥物的酯或藥學(xué)上可接受的鹽。芬那酸衍生物、其前體藥物 的酯及其藥學(xué)上可接受的鹽包括恩芬那酸、依托芬那酯、氟芬那 酸、異尼辛、甲氯芬那酸、甲氯芬那酸鈉、medofenamic acid、甲芬 那酸(mefanamic acid)、尼氟酸、他尼氟酯、特洛芬那酯、托芬那酸 和烏芬那酯。該組藥物內(nèi)也包括具有類(lèi)似鎮(zhèn)痛和抗炎特性的結(jié)構(gòu)相 關(guān)的芬那酸衍生物。其它適用的藥物是羧酸衍生物、其前體藥物的酯及其藥學(xué)上可 接受的鹽，包括環(huán)氯茚酸、二氟尼柳、氟苯柳、inoridine、酮咯酸 和替諾立定。該組藥物內(nèi)也包括具有類(lèi)似鎮(zhèn)痛和抗炎特性的結(jié)構(gòu)相 關(guān)的羧酸衍生物。其它合適的藥物是丁酸衍生物、其前體藥物的酯 或藥學(xué)上可接受的鹽。丁酸衍生物、其前體藥物的酯及其藥學(xué)上可 接受的鹽包括布馬地宗、丁布芬、芬布芬和聯(lián)苯丁酸。該組藥物類(lèi)、其前體藥物的酯或其藥學(xué)上可接受的鹽也是合適的。昔康類(lèi)、 其前體藥物的酯及其藥學(xué)上可接受的鹽包括屈瞎昔康、依諾利康、 伊索昔康、吡羅昔康、舒多昔康、替諾昔康和4-羥基-l，2-苯并噻嗪1,1-二氧化物4-(N-苯基)-甲酰胺。該組藥物內(nèi)也包括具有類(lèi)似鎮(zhèn)痛和抗 炎特性的結(jié)構(gòu)相關(guān)的昔康類(lèi)。吡唑、其前體藥物的酯或其藥學(xué)上可 接受的鹽也是合適的?？墒褂玫倪吝颉⑵淝绑w藥物的酯和其藥學(xué)上 可接受的鹽包括二苯咪唑和依匹唑。該組藥物內(nèi)也包括具有類(lèi)似 鎮(zhèn)痛和抗炎特性的結(jié)構(gòu)相關(guān)的吡唑。此外，吡唑啉酮、其前體藥物 的酯或其藥學(xué)上可接受的鹽是合適的?？蒦f吏用的吡唑啉酮、前體藥 物的酯和其藥學(xué)上可接受的鹽包括apazone、阿扎丙宗、千哌立隆(benzpiperylon)、非普拉宗、莫非布宗、嗎拉宗、幾布宗、保泰松、 哌布宗、丙基安替比林、雷米那酮、琥布宗和噻唑啉并保泰松 (thiazolinobutazone)。該組藥物內(nèi)也包括具有類(lèi)似鎮(zhèn)痛和抗炎特性的 結(jié)構(gòu)相關(guān)的吡唑啉酮。其它合適的藥物是用于治療TNF-介導(dǎo)的疾病的皮質(zhì)類(lèi)固醇、其 前體藥物的酯或其藥學(xué)上可接受的鹽。皮質(zhì)類(lèi)固醇、其前體藥物的 酯及其藥學(xué)上可接受的鹽包括氫化可的松和衍生自氬化可的松的化 合物，例如21-乙酰氧基-孕烯諾龍、阿氯米松(alclomerasone)、阿爾 孕酮、安西奈德、倍氯米松、倍他米松、戊酸倍他米松、布地奈德、 氯潑尼松、氯倍他索、丙酸氯倍他索、氯倍他松、丁酸氯倍他松、 氯可托龍、氯潑尼醇、皮質(zhì)酮、可的松、可的伐唑、地夫可特 (deflazacon)、地奈德、去輕米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龍、 二氟潑尼酯、甘草次酸、氟扎可特、氟氯奈德、氟米松、新戊酸氟 米松、氟尼縮松、氟輕松(flucinolone acetonide)、醋酸氟輕松、 fluorocinolone acetonide、氟可丁酉旨、氟可龍、己酸氟可龍、戊酸二 氟可龍、氟米龍、醋酸氟培龍、醋酸氟潑尼定、氟潑尼龍、氟氫縮 松、福莫可他、哈西奈德、面米松、醋酸卣潑尼松、氬可他酯、氬 化可的松、醋酸氬化可的松、丁酸氬化可的松、磷酸氬化可的松、 氫化可的松21-琥珀酸鈉、特布酸氫化可的松、馬潑尼酮、甲輕松、 曱潑尼松、曱潑尼龍、莫米松糠酸酯、帕拉米松、潑尼卡酯、潑尼 松龍、潑尼松龍21-氨基乙酸二乙酯、潑尼松龍磷酸鈉、潑尼松龍琥 珀酸鈉、潑尼松龍21-間磺基苯曱酸鈉、潑尼松龍21-硬脂酸乙醇酸 鈉、潑尼松龍叔丁乙酯、潑尼松龍21-醋酸三曱酯、潑尼松、強(qiáng)的松 龍戊酸酯、潑尼立定、潑尼立定21-二乙氨基醋酸酯、替可的松、曲 安西龍、曲安奈德、苯曲安奈德和己曲安奈德。該組藥物內(nèi)也包括 具有類(lèi)似鎮(zhèn)痛和抗炎特性的結(jié)構(gòu)相關(guān)的皮質(zhì)類(lèi)固醇?？?徵生物藥(及其前體藥物的酯或藥學(xué)上可接受的鹽)也適用于本 文所述的聯(lián)用。合適的抗微生物藥包括例如氨千青霉素、羥氨千青 霉素、金霉素、桿菌肽、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢P塞肟、頭孢克洛(cephachlor)、頭孢氨千、頭孢拉定、環(huán)丙沙星、克拉維酸、氯唑 西林、雙氯西林(dicloxacillan)、紅霉素、氟氯西林(flucloxacillan)、 慶大霉素、短桿菌肽、曱氧西林(methicillan)、新霉素、苯唑西林 (oxacillan)、青霉素和萬(wàn)古霉素。該組藥物內(nèi)也包括具有類(lèi)似鎮(zhèn)痛和 抗炎特性的結(jié)構(gòu)相關(guān)的抗」微生物藥。其它合適的化合物包括但不限于BN 50730;替尼達(dá)普；E 5531; tiapafantPCA4248;尼美舒利；panavir;咯利普蘭；RP 73401;肽T; MDL 201,449A; (lR,3S)-順-l-[9-(2,6-二氨基-"票呤基)]-3-羥基-4-環(huán)戊 烯鹽酸鹽；(lR,3R)-反-l-[9-(2,6-二氨基)噪呤]-3-乙酰氧基環(huán)戊烷； (lR,3R)-反-l-[9-腺苷)-3-疊氮基-環(huán)戊烷鹽酸鹽和(lR,3R)-反-l-[6-幾基 -噤呤-9-基)-3-疊氮基-環(huán)戊烷。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在某些情況下(例如哮喘)，IL-4可誘導(dǎo)炎性效應(yīng)，其 中IL-4在肺部過(guò)量表達(dá)，導(dǎo)致上皮細(xì)胞肥大并積累淋巴細(xì)胞、嗜酸 性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。該反應(yīng)是其它Th2細(xì)胞因子所誘導(dǎo)的促 炎反應(yīng)的主要特征的代表。如上所述，因此，1L-4抑制劑也可用于 本發(fā)明。另外，可以理解，某些免疫抑制劑藥物也可用于治療關(guān)節(jié) 炎，包括但不限于iNOS抑制劑和5-脂氧合酶抑制劑。已經(jīng)知道，生姜具有某些抗炎特性，因此適合作為抗炎藥用于 本發(fā)明，例如與軟骨素聯(lián)用。本發(fā)明的藥物組合物也可用于聯(lián)合療法，即與其它藥物和療法 聯(lián)用，用于治療CD148活化相關(guān)疾病。本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合區(qū) 也可與其它藥物和療法聯(lián)合用于治療癌癥或胂瘤。所述藥物包括但 不限于體外合成制備的化學(xué)組合物、抗體、抗原結(jié)合區(qū)、放射性核 素及其組合和它們的綴合物。藥物可以是激動(dòng)劑、拮抗劑、別構(gòu)調(diào) 節(jié)劑、毒素，或者，總的來(lái)講可以起到抑制或剌激其把標(biāo)(例如受體 或酶活化或抑制)的作用，因此促進(jìn)細(xì)胞死亡或阻止細(xì)胞生長(zhǎng)。其它 療法也包括例如放射治療、化學(xué)治療和使用抗腫瘤藥的靶向治療等。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，人抗CD148抗體或其抗原結(jié)合片^:可以 與一種或多種治療藥聯(lián)合給予，所述治療藥例如抗血管生成藥、抗 胂瘤藥、化療藥、免疫抑制藥、抗炎藥或抗4艮屑病藥。人抗CD148 抗體或其抗原結(jié)合片段也可與其它已知療法聯(lián)用，所述療法例如物 理治療，例如放射治療、熱療(hyperthermia),移植(例如骨髓移植)、 手術(shù)治療、日光治療或光線療法。在本文中沒(méi)有具體列出的其它聯(lián) 合療法也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。示例性的抗肺瘤藥包括例如多柔比星(阿霉素)、順鉑、硫酸博來(lái) 霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和環(huán)磷酰胺、羥基脲，所述藥物單獨(dú) 使用時(shí)，僅在對(duì)患者有毒或亞毒性水平時(shí)才有效。順鉑經(jīng)靜脈內(nèi)給 藥，劑量為100mg/m2，每4周一次；而阿霉素經(jīng)靜脈內(nèi)給藥，劑量 為60-75mg/m2,每21天一次。其它示例性的抗腫瘤藥包括 HERCEPTIN (曲妥單抗，可用于治療乳癌和其它形式的癌癥)和 RITUXAN (利妥昔單抗)、ZEVALIN (替伊莫單抗)和 LYMPHOCIDE (依帕珠單抗，可用于治療非霍奇金淋巴瘤和其它 形式的癌癥)、GLEEVAC (可用于治療.慢性髓細(xì)胞性白血病和胃腸 道基質(zhì)腫瘤)和BEXXARtm (碘131托西莫單抗，可用于治療非霍奇 金淋巴瘤)。可用于聯(lián)合化療的其它抗腫瘤藥包括例如烷化劑，包括氮芥， 例如氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖和苯丁酸氮芥；亞硝基 脲，例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(甲基-CCNU);乙烯亞胺/甲基蜜胺，例如曲他胺(thriethylenemelamine, TEM)、三乙烯、硫代磷酰胺(塞替派)、六曱基蜜胺(HMM、六曱蜜胺)； 磺酸烷基酯，例如白消安；三嗪，例如達(dá)卡巴嗪(DTIC);抗代謝藥， 包括葉酸類(lèi)似物(例如曱氨蝶呤和三曱曲沙)，嘧啶類(lèi)似物(例如5-氟 尿嘧啶、氟脫氧尿苷、吉西他濱、阿糖胞苷(AraC、阿糖胞嘧啶)、5-氮雜胞苷、2,2'-二氟脫氧胞苷)，嘌呤類(lèi)似物(例如6-巰基嘌呤、6-硫 鳥(niǎo)噤呤、硫唑。票呤、2'-脫氧考福霉素(噴司他丁 )、
erythrohydroxynonyladenine (EHNA)、磷酸氟達(dá)拉濱和2-氯脫氧腺普 (克拉屈濱、2-CdA));天然產(chǎn)物，包括抗有絲分裂藥，例如紫杉醇、 長(zhǎng)春花屬生物堿(包括長(zhǎng)春花堿(VLB)、長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春瑞濱)、泰索 帝、雌莫司汀和磷酸雌莫司?。籶pipodophylotoxin，例如依托泊苦和 替尼泊苷；抗生素，例如放射菌素D、道諾霉素(柔紅霉素)、多柔比 星、米托蒽醌、伊達(dá)比星、博來(lái)霉素、普卡霉素(光輝霉素)、絲裂霉 素C和放線菌素；酶，例如L-天冬酰胺酶；生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，例如 干擾素-a、 IL-2、 G-CSF和GM-CSF;其它藥物，包括鉑配位絡(luò)合物 (例如順鈉和卡柏)，蒽二S同(anthracenedione)(例如米托蒽醌)，取代的 脲(例如羥基脲)，曱基肼衍生物(包括N-甲基肼(M1H)和丙卡巴肼)， 腎上腺皮質(zhì)抑制藥，例如米托坦(o,p'-DDD)和氨基格魯米特；激素和 拮抗劑，包括腎上腺皮質(zhì)類(lèi)固醇拮抗劑，例如潑尼松及其等同物、 地塞米松和氨基格魯米特；孕酮，例如己酸羥孕酮、醋酸甲羥孕酮 和醋酸曱地孕酮；雌激素，例如二乙基己烯雌酚和乙炔雌二醇等同 物；抗雌激素，例如他莫昔芬；雄激素，包括丙酸睪酮和氟曱睪酮/ 等同物；抗雄激素，例如氟他胺、促性腺激素釋放激素類(lèi)似物和亮 丙立德；和非甾體抗雄激素，例如氟他胺。
示例性的抗血管生成藥包括ERBITUXTM (IMC-C225)、 KDR (激酶域受體)抑制劑(例如與激酶域受體特異性結(jié)合的抗體和抗原結(jié)合 區(qū))、抗VEGF藥(例如特異性結(jié)合VEGF或可溶性VEGF受體或其 配體結(jié)合區(qū)的抗體或抗原結(jié)合區(qū)，例如AVASTINtm或VEGF-TRAP ) 和抗VEGF受體藥(例如與其特異性結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合區(qū))、EGFR 抑制劑(例如與其特異性結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合區(qū))例如ABX-EGF (panitumumab)、 IRESSA (吉非替尼)、TARCEVA (埃羅替尼)、 抗Angl和抗Ang2藥(例如與其特異性結(jié)合、或與其受體(例如Tie2/Tek) 特異性結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合區(qū))和抗Tie-2激酶抑制劑(例如與其特 異性結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合區(qū))。本發(fā)明的藥物組合物也可包含特異 性結(jié)合并抑制生長(zhǎng)因子的活性的一種或多種藥物(例如抗體、抗原結(jié)
合區(qū)或可溶性受體)，所述藥物例如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF，也稱(chēng)為分 散因子)拮抗劑，以及與其受體"c-met"特異性結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合區(qū)。其它抗血管生成藥包括Campath、IL-8、B-FGF、Tek拮抗劑(Ceretti 等，美國(guó)公布號(hào)2003/0162712;美國(guó)專(zhuān)利第6,413,932號(hào))、抗TWEAK 藥(例如特異性結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合區(qū)、或可溶性TWEAK受體拮 抗劑；參見(jiàn)Wiley,美國(guó)專(zhuān)利第6,727,225號(hào))、拮抗整聯(lián)蛋白與其配 體的結(jié)合的ADAM解聯(lián)蛋白域(Fanslow等，美國(guó)7>布號(hào) 2002/0042368)、特異性結(jié)合的抗印h受體和/或抗肝配蛋白抗體或抗 原結(jié)合區(qū)(美國(guó)專(zhuān)利第5，981，245; 5,728,813; 5,969,110; 6,596,852; 6,232,447; 6,057,124號(hào)及其同族專(zhuān)利)、和抗PDGF-BB拮抗劑(例如 特異性結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合區(qū))以及與PDGF-BB配體特異性結(jié)合 的抗體或抗原結(jié)合區(qū)、和PDGFR激酶抑制劑(例如與其特異性結(jié)合 的抗體或抗原結(jié)合區(qū))。其它示例性的抗血管生成藥包括Ang-1和 CD148 (及其受體)的拮抗劑、VEGF (Avastin、 VEGF-TRAP等)、VEGF 受體和IL-8、 B-FGF和KDR小分子抑制劑和其它血管生成介導(dǎo)物。其它抗血管生成藥/抗腫瘤藥包括SD-7784 (Pfizer,美國(guó))；西 侖吉肽(Merck KGaA，德國(guó)，EPO 770622); pegaptanib octasodium (Gilead Sciences,美國(guó))；Alphastatin (BioActa,英國(guó))；M-PGA (Celgene, 美國(guó)，US 5712291);伊洛馬司他(Arriva，美國(guó)，US 5892112); emaxanib (Pfizer,美國(guó)，US 5792783); vatalanib (Novartis，瑞士)； 2-甲氧基雌二 醇(EntreMed,美國(guó))；TLC ELL-12 (Elan,愛(ài)爾蘭)；醋酸阿奈可他 (Alcon,美國(guó))；a國(guó)D148 Mab (Amgen,美國(guó))；CEP-7055 (C印halon,美 國(guó))；抗Vn Mab (Crucell,荷蘭)DAC:抗血管生成藥(ConjuChem,加 拿大)；Angiocidin (InKine Pharmaceutical,美國(guó))；KM-2550 (Kyowa Hakko,曰本)；SU-0879 (Pfizer,美國(guó))；CGP-79787 (Novartis,瑞士，EP 970070); ARGENT技術(shù)(Ariad,美國(guó))；YIGSR-Stealth (Johnson & Johnson，美國(guó))；血纖蛋白原-E片段(BioActa,英國(guó))；血管生成抑制
劑(Trigen,英國(guó))；TBC-1635 (Encysive Pharmaceuticals,美國(guó))；SC-236 (Pfizer,美國(guó))；ABT-567 (Abbott,美國(guó))；Metastatin (EntreMed,美國(guó))； 血管生成抑制劑(Trip印，瑞典)；乳腺絲抑蛋白(Sosei,曰本)；2-甲氧 基雌二醇(Oncology Sciences Corporation,美國(guó))；ER-68203-00 (IVAX, 美國(guó))；Benefin (Lane Labs,美國(guó))；Tz-93 (Tsumura,日本)；TAN-1120 (Takeda,日本)；FR-111142 (Fujisawa,日本，JP 02233610);血小板因 子4(RepliGen,美國(guó)，EP 407122);血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子拮抗劑(Borean, 丹麥)；癌癥治療(University of South Carolina,美國(guó))；貝伐單抗(pINN) (Genentech,美國(guó));血管生成抑制劑(SUGEN,美國(guó))；XL 784 (Exelixis, 美國(guó));XL647 (Exelixis，美國(guó));MAb，a5p3整聯(lián)蛋白，第二代(Applied Molecular Evolution,美國(guó)和Medlmmune,美國(guó))； 一見(jiàn)網(wǎng)膜病的基因治 療(Oxford BioMedica,英國(guó))；enzastaurin hydrochloride (USAN) (Lilly, 美國(guó))；CEP 7055 (Cephalon,美國(guó)和Sanofi-Synthelabo，法國(guó))；BC 1 (Genoa Institute of Cancer Research,意大利)；血管生成才中制劑 (Alchemia,澳大利亞)；VEGF拮抗劑(Regeneron,美國(guó))；rBPI 21和 BPI衍生血管生成藥(XOMA,美國(guó))；P188(Progen,澳大利亞)；西侖 吉肽(pINN) (Merck KGaA,德國(guó)；Munich Technical University,德、國(guó)， Scripps Clinic and Research Foundation,美國(guó))；西妥昔單4元(INN) (Aventis，法國(guó))；AVE 8062 (Ajinomoto,日本)；AS 1404 (Cancer Research Laboratory,新西蘭)；SG 292 (Telios,美國(guó))；內(nèi)皮生長(zhǎng)抑素 (Boston Childrens Hospital,美國(guó))；ATN 161 (Attenuon，美國(guó))；血管 生長(zhǎng)抑素(Boston Childrens Hospital,美國(guó))；2-甲氧基雌二醇(Boston Childrens Hospital,美國(guó))；ZD 6474 (AstraZeneca,英國(guó))；ZD 6126 (Angiogene Pharmaceuticals,英國(guó))；PPI 2458 (Praecis,美國(guó))；AZD 9935 (AstraZeneca,英國(guó))；AZD 2171 (AstraZeneca,英國(guó))；vatalanib (pINN), (Novartis,瑞士和Schering AG,德國(guó))；組織因子途徑抑制劑 (EntreMed, 美國(guó))；pegaptanib (Pinn) (Gilead Sciences, 美國(guó))； xanthorrhizol (Yonsei University,韓國(guó))；疫苗，基于基因，VEGF國(guó)2
(Scripps Clinic and Research Foundation,美國(guó))；SPV5.2 (Supratek,力口 拿大)；SDX 103 (University of California at San Diego，美國(guó))；PX 478 (ProlX，美國(guó))；METASTATIN (EntreMed,美國(guó))；肌原蛋白I (Harvard University,美國(guó))；SU 6668 (SUGEN,美國(guó))；OXI4503 (OXiGENE,美 國(guó))；o-胍(Dimensional Pharmaceuticals,美國(guó))；motuporamine C (British Columbia University,力口拿大)；CDP 791 (Celltech Group,英國(guó))； atiprimod (pINN) (GlaxoSmithKline,英國(guó))；E 7820 (Eisai,日本)；CYC 381 (Harvard University,美國(guó))；AE 941 (Aeteraa,力口拿大)；疫苗，血 管生成(EntreMed,美國(guó))；尿激酶纖溶酶原激活物抑制劑(Dendreon, 美國(guó))；oglufanide(p匪)(Mdmotte，美國(guó))；HIF-lct抑制劑(Xenova,英 國(guó))；CEP 5214 (Cephalon，美國(guó))；BAY RES 2622 (Bayer,德國(guó))； Angiocidin (InKine,美國(guó))；A6 (Angstrom,美國(guó))；KR 31372 (Korea Research Institute of Chemical Technology, 韓國(guó))；GW 2286 (GlaxoSmithKline,英國(guó))；EHT 0101 (ExonHit,法國(guó))；CP 868596 (Pfizer，美國(guó))；CP 564959 (OSI，美國(guó))；CP 547632 (Pfizer,美國(guó))； 786034 (GlaxoSm池Kline,英國(guó))；KRN 633 (Kirin Brewery,日本)； 給藥系統(tǒng)，目艮內(nèi)，2-曱氧基站,二醇(EntreMed,美國(guó))；anginex (Maastricht University,荷蘭和Minnesota University,美國(guó))；ABT 510 (Abbott,美國(guó))；AAL 993 (Novartis,瑞士)； VEGI (ProteomTech,美 國(guó))；腫瘤壞死因子-a抑制劑(National Institute on Aging,美國(guó))；SU 11248 (Pfizer,美國(guó)和SUGEN美國(guó))；ABT 518 (Abbott，美國(guó))；YH16 (Yantai Rongchang,中國(guó))；S國(guó)3APG (Boston Childrens Hospital,美國(guó) 和EntreMed,美國(guó))；MAb KDR, (ImClone Systems,美國(guó))；MAb a5 pi (Protein Design,美國(guó))；KDR激酶抑制劑(Celltech Group,英國(guó)和 Johnson & Johnson,美國(guó))；GFB 116 (South Florida University,美國(guó)和 Yale University,美國(guó))；CS 706 (Sankyo,日本)；考布他汀A4前體藥 物(Arizona State University,美國(guó))；軟骨素酶AC (IBEX,加拿大)； BAY RES 2690 (Bayer，德國(guó))；AGM 1470 (Harvard University,美國(guó)，Takeda,日本和TAP,美國(guó))；AG 13925 (Agouron,美國(guó))； Tetrathiomolybdate (University of Michigan,美國(guó))；GCS 100 (Wayne State University,美國(guó))CV 247 (Ivy Medical,英國(guó))；CKD 732 (Chong Kim Dang,韓國(guó))；MAb血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Xenova,英國(guó))；伊索拉 定(麗)(Nippon Shinyaku,日本)；RG 13577 (Aventis，法國(guó))；WX 360 (Wilex，德國(guó))；角鯊胺(p麗)(Genaera,美國(guó))；RPI 4610 (Sirna，美 國(guó))；癌癥治療(Marinova,澳大利亞)；類(lèi)肝素酶抑制劑(InSight,以色 列)；KL3106(Kolon，韓國(guó))；Honokiol (Emory University,美國(guó))；ZK CDK(ScheringAG,德國(guó))；ZK Angio (Schering AG,德國(guó))；ZK 229561 (Novartis,瑞士； Schering AG,德國(guó))；XMP 300 (XOMA,美國(guó))；VGA 1102 (Taisho,曰本)；VEGF受體調(diào)節(jié)劑(Pharmacopeia,美國(guó))；VE-鉤粘著蛋白-2拮抗劑(ImClone Systems,美國(guó))；Vasostatin (National Institutes of Health,美國(guó))；疫苗，F(xiàn)lk-1 (ImClone Systems,美國(guó))；TZ93 (Tsumura,曰本)；TumStatin (Beth Israel Hospital,美國(guó))；截短的可溶 性FLT 1 (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1) (Merck & Co，美國(guó))；Tie-2配體 (Regeneron,美國(guó))；血小板反應(yīng)蛋白1抑制劑(Allegheny Health, Education and Research Foundation,美國(guó)》本發(fā)明的藥物組合物也可包括一種或多種生長(zhǎng)因子抑制劑藥 物，例如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF,也稱(chēng)為分散因子，及其受體"c-met") 拮抗劑。與本發(fā)明組合物(例如人抗體、多特異性分子和雙特異性分子)連 接的耙特異性效應(yīng)細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)也可用作治療藥。草巴向效應(yīng)細(xì) 胞可以是人白細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)月包。其 它細(xì)胞包括嗜酸性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和其它攜帶IgG受體或IgA 受體的細(xì)胞。如有必要，效應(yīng)細(xì)胞可得自受治療的患者?？梢约?xì)胞 懸液/生理上可接受的溶液的形式，給予乾特異性效應(yīng)細(xì)^^。所給予 的細(xì)胞數(shù)約為108-109，但也可因治療目的而異。 一般而言，數(shù)量應(yīng) 足以定位于靶細(xì)胞(例如表達(dá)CD148的腫瘤細(xì)胞)并能通過(guò)例如吞噬 作用而起到殺傷細(xì)胞的作用。給藥途徑也可以不同。采用靶-特異性效應(yīng)細(xì)胞的治療，也可以與其它技術(shù)聯(lián)用，以去 除靶細(xì)胞。例如，使用本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性分子 和雙特異性分子)和/或用這些組合物武裝起來(lái)的效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤治 療，可以與化療聯(lián)用。另外，聯(lián)合免疫療法可用于將兩種不同細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞群體靶向肺瘤細(xì)胞排斥。例如，與抗FcyRi或抗CD3連 接的抗CD148抗體可用于與IgG受體或IgA受體特異性結(jié)合劑聯(lián)用。本發(fā)明的雙特異性分子和多特異性分子也可用于調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞 的FcotR或FcyR水平，例如通過(guò)加帽和消除細(xì)胞表面的受體?？笷c 受體混合物也可用于該目的。在補(bǔ)體存在時(shí)，也可使用具有補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)的本發(fā)明組合物(例 如人抗體、多特異性分子和雙特異性分子)，例如結(jié)合補(bǔ)體的IgGl、 IgG2、 IgG3或IgM部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)添加補(bǔ)體或 含有補(bǔ)體的血清，用本發(fā)明的結(jié)合劑和合適效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)包含輩巴細(xì) 胞的細(xì)胞群體進(jìn)行離體處理。可以通過(guò)補(bǔ)體蛋白的結(jié)合，改善包被 本發(fā)明結(jié)合劑的靶細(xì)胞的吞噬作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包被本 發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性分子和雙特異性分子)的靶細(xì)胞 也可以被補(bǔ)體溶解。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物不激活 補(bǔ)體。本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性分子和雙特異性分子)也 可以與補(bǔ)體一起給予。因此，本發(fā)明范圍內(nèi)也包括含有人抗體、多特異性分子或雙特異性分子和血清或補(bǔ)體的組合物。這些組合物的 優(yōu)勢(shì)在于補(bǔ)體的位置非常接近人抗體、多特異性分子或雙特異性分 子?；蛘?，可以單獨(dú)給予本發(fā)明的人抗體、多特異性分子或雙特異 性分子和補(bǔ)體或血清。本發(fā)明范圍內(nèi)也包括裝有本發(fā)明組合物(例如人抗體、多特異性 分子和雙特異性分子)和使用說(shuō)明書(shū)的藥盒。藥盒還可裝有至少一種 附加藥物，例如補(bǔ)體或一種或多種本發(fā)明的其它人抗體(例如具有補(bǔ)
體活性的人抗體，該抗體與CD148抗原上不同于第一人抗體的表位) 結(jié)合。在其它實(shí)施方案中，還可用調(diào)節(jié)(例如增強(qiáng)或抑制)Fca或Fcy受 體表達(dá)或活性的藥物，對(duì)患者進(jìn)行補(bǔ)充治療，例如用細(xì)胞因子治療 患者。在治療中與多特異性分子 一 起給予的優(yōu)選細(xì)胞因子包括粒細(xì) 胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、 干擾素-y (IFN-力和腫瘤壞死因子(TNF)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，還可用淋巴因子制劑對(duì)患者進(jìn)行補(bǔ)充治 療。用淋巴因子制劑，誘導(dǎo)不高度表達(dá)CD148的癌細(xì)胞，可進(jìn)行這 樣的治療。淋巴因子制劑可使CD148在腫瘤細(xì)胞中更均勻地表達(dá)，達(dá)到更有效的治療。適于給藥的^fr巴因子制劑包括干擾素-y、腫瘤壞 死因子及其組合。它們可經(jīng)靜脈內(nèi)給予。淋巴因子的合適劑量是 io，ooo-i,ooo,ooo單位/患者。本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性分子和雙特異性分子)也 可用于靶向表達(dá)Fc丫R或CD148的細(xì)胞，例如用于標(biāo)記所述細(xì)月包。對(duì) 于這樣的用途，可以將結(jié)合劑與待測(cè)分子連接在一起。因此，本發(fā) 明提供離體或體外表達(dá)Fc受體(例如FcyR)或CD148的細(xì)胞的定位方 法?？蓹z測(cè)標(biāo)記可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中是否存在CD148抗 原或定量檢測(cè)CD148抗原的方法，所述方法包括在允許形成抗體 或其部分與CD148的復(fù)合物的條件下，使樣品和對(duì)照樣品接觸與 CD148特異性結(jié)合的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合區(qū)。然后;f企測(cè)形成的復(fù)合物，其中樣品與對(duì)照樣品之間復(fù)合物形成有差異就說(shuō)明樣品 中存在CD148抗原。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在體內(nèi)或體外檢測(cè)表達(dá)Fc的 細(xì)胞是否存在或其數(shù)量的方法。所述方法包括(i)給予患者本發(fā)明的 組合物(例如多雙特異性分子或雙特異性分子或其片段)，所述組合物 與可檢測(cè)標(biāo)記綴合在一起；(ii)將患者暴露于檢測(cè)所述可檢測(cè)標(biāo)記的
裝置，以鑒定含有表達(dá)Fc的細(xì)胞的部位。本發(fā)明的用途和方法本發(fā)明提供與CD148表位結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，用于治 療人類(lèi)疾病和病理癥狀?？杉せ頒D148活性或其它細(xì)胞活性的藥物 可與其它治療藥聯(lián)用，以增強(qiáng)其療效或降低潛在副作用。一方面，本發(fā)明提供用于治療以不想要的或異常的細(xì)胞CD148 活性7jc平為特;^正的疾病和病癥的藥物和方法。這些疾病包4舌癌癥和其它過(guò)度增殖性疾病，例如增生、銀屑病、接觸性皮炎、免疫性疾 病和不育癥。首先，可以測(cè)定本發(fā)明組合物(例如人抗體、多特異性分子和雙 特異性分子)的治療或體外診斷用途相關(guān)的結(jié)合活性。例如，可以用 本文所述的ELISA和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定，檢測(cè)本發(fā)明的組合物。此外， 也可以測(cè)定這些分子在觸發(fā)至少 一種效應(yīng)物介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)月包活性方 面的活性，包括對(duì)表達(dá)CD148的細(xì)胞的細(xì)胞溶解作用。效應(yīng)細(xì)胞介 導(dǎo)的吞噬作用的測(cè)定方案如本文所述。本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性分子和雙特異性分子)在 治療和診斷CD148相關(guān)疾病中還具有其它用途。例如，人單克隆抗 體、多特異性分子或雙特異性分子可用于在表達(dá)CD148的細(xì)月包中促 進(jìn)CD148誘導(dǎo)的脫磷酸化，以抑制表達(dá)CD148的細(xì)胞生長(zhǎng)，或者抑 制表達(dá)CD148的細(xì)胞的血管生成。本發(fā)明的抗CD148抗體可用于治 療任何血管生成依賴(lài)性疾病，包括但不限于眼新血管形成，例如牙見(jiàn) 網(wǎng)膜病(包括糖尿病性視網(wǎng)膜病)、年齡相關(guān)性黃斑變性、4艮屑病、成 血管細(xì)胞瘤、血管瘤、動(dòng)脈硬化，炎性疾病，例如類(lèi)風(fēng)濕性或風(fēng)濕 性炎性疾病(尤其是關(guān)節(jié)炎，包括類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)或其它慢性炎性疾 病，例如慢性哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化或移植后動(dòng)脈粥樣硬4t、子宮內(nèi) 膜異位癥和腫瘤性疾病，例如所謂的實(shí)體瘤和液體(或血液)瘤(例如 白血病和淋巴瘤)。與不想要的血管生成相關(guān)的其它疾病對(duì)于本領(lǐng)域
技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，人抗體及其衍生物用于在體內(nèi)治療、預(yù)防或診斷各種CD148相關(guān)的腫瘤性疾病。CD148相關(guān)疾病的實(shí)刊 包括各種癌癥，例如膀胱癌、乳癌、子宮癌/宮頸癌、結(jié)腸癌、^!腺 癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、鱗 狀細(xì)胞癌、肺(非小細(xì)胞)癌、食道癌和頭頸部癌。本發(fā)明也提供治療動(dòng)物(包括人)的癌癥的方法，所述方法包括給 予動(dòng)物有效量的能激活CD148活性的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)。本發(fā)明 還涉及抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述癌細(xì)胞生長(zhǎng)包括在生物體系統(tǒng) 內(nèi)的細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程。該方法包括使用本發(fā)明的化合 物作為癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制劑。優(yōu)選該方法用于抑制或減少活體動(dòng)物 例如哺乳動(dòng)物的細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移或腫瘤發(fā)生率。本發(fā)明的方 法也適用于測(cè)定系統(tǒng)，例如測(cè)定癌細(xì)胞生長(zhǎng)及其特性，以及鑒定可 影響癌細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物。用本發(fā)明方法能治療的癌癥優(yōu)選發(fā)生在哺乳動(dòng)物內(nèi)。哺乳動(dòng)物 包括例如人和其它靈長(zhǎng)類(lèi)，以及寵物或陪伴動(dòng)物(例如狗和貓)，實(shí)驗(yàn) 室動(dòng)物(例如大鼠、小鼠和兔)和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物(例如馬、豬、羊和牛)。腫瘤或贅生物包括細(xì)胞繁殖不受控制并且是進(jìn)行性的組織細(xì)胞 的生長(zhǎng)。某些這樣的生長(zhǎng)是良性的，但是另一些則是惡性的并可導(dǎo) 致生物體死亡。惡性腫瘤或癌癥不同于良性生長(zhǎng)，它們除了表現(xiàn)出 侵襲性細(xì)胞增殖之外，還可侵襲周?chē)M織并可轉(zhuǎn)移。此外，惡性腫 瘤的特征是，它們表現(xiàn)出更多地喪失分化(更多的去分化)并且喪失彼 此間和與其周?chē)M織間的組織性。該特性也稱(chēng)為"退行發(fā)育 (anaplasia)"。由本發(fā)明可治療的腫瘤還包括實(shí)體瘤，即癌和肉瘤。癌包括源 自上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，這類(lèi)腫瘤浸潤(rùn)(侵襲)周?chē)M織并且會(huì)轉(zhuǎn)移。 腺癌是源自腺體組織、或構(gòu)成可識(shí)別的腺體組織的組織的癌。另一 個(gè)廣泛的范疇即癌癥包括肉瘤，這類(lèi)腫瘤的細(xì)胞著生在象胚胎結(jié)締
組織一樣的纖維或均質(zhì)體內(nèi)。本發(fā)明也能治療骨髓或淋巴系統(tǒng)的癌 癥，包括白血病、淋巴瘤和其它癌癥，這些癌癥通常不存在瘤塊， 而是分布在血管或淋巴網(wǎng)狀系統(tǒng)內(nèi)。適于用本發(fā)明來(lái)治療的癌癥或腫瘤細(xì)胞的種類(lèi)包括例如產(chǎn)生ACTH的胂瘤、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性非淋巴細(xì)胞性白血病、 腎上腺皮質(zhì)癌、膀胱癌、腦癌、乳癌、宮頸癌、慢性淋巴細(xì)胞性白 血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、結(jié)腸直腸癌、皮膚性T細(xì)胞淋巴瘤、 子宮內(nèi)膜癌、食道癌、尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)、膽嚢癌、毛細(xì)胞 性白血病、頭頸部癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin，s lymphoma),卡波西 肉瘤(Kaposi's sarcoma)、腎癌、肝癌、肺癌(小細(xì)胞和非小細(xì)胞)、惡 性腹水、惡性胸腔積液、黑素瘤、間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤、成神經(jīng) 細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌(生殖 細(xì)胞癌)、胰腺癌、陰莖癌、前列腺癌、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、皮膚癌、 軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、滋養(yǎng)層贅生 物(trophoblastic neoplasm)、 子宮癌、睪丸萃肖膜癌(vaginal cancer)、夕卜 陰癌和維爾姆斯瘤(Wilms' tumor)。本發(fā)明在本文中特別說(shuō)明了對(duì)某些實(shí)驗(yàn)限定的癌癥類(lèi)型的治 療。在這些說(shuō)明性治療中，使用了標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)有技術(shù)的體外和體內(nèi)模型。 這些方法可用于鑒定希望能有效用于體內(nèi)治療方案的藥物。然而， 可以理解，本發(fā)明的方法并不限于治療這些腫瘤類(lèi)型，而是延伸到 任何器官系統(tǒng)所來(lái)源的任何實(shí)體瘤。對(duì)于在侵襲或轉(zhuǎn)移方面與CD148 活性相關(guān)的癌癥來(lái)說(shuō)，特別容易受到本發(fā)明方法的抑制，甚至能誘 導(dǎo)其消退。也可以使用本發(fā)明的化合物(例如肽抗體(peptibody))以及其它抗 癌化療藥(例如任何常規(guī)化療藥)，實(shí)施本發(fā)明。特異性結(jié)合劑與所述 其它藥物的聯(lián)用可加強(qiáng)化療方案。熟練醫(yī)師知道大量化療方案都能 與本發(fā)明的方法結(jié)合使用。可以使用任何化療藥，包括烷化劑、抗 代謝藥、激素和拮抗劑、放射性同位素以及天然產(chǎn)物。例如，本發(fā)
明的化合物可以與以下藥物一起給予抗生素(例如多柔比星和其它 蒽環(huán)類(lèi)似物)、氮芥類(lèi)(例如環(huán)磷酰胺)、嗜啶類(lèi)似物(例如5-氟尿嘧咬)、 順鉬、羥基脲、紫杉醇及其天然和合成衍生物等。作為另一個(gè)實(shí)例， 在混合型腫瘤(例如乳腺癌，其中腫瘤包括促性腺激素依賴(lài)性細(xì)胞和 促性腺激素非依賴(lài)性細(xì)胞)的情況下，化合物可以與亮丙立德或戈舍 瑞林(LH-RH的合成肽類(lèi)似物)聯(lián)合給予。包括使用四環(huán)素化合物以 及另一種治療方式(例如手術(shù)、放射療法等)在內(nèi)的其它抗腫瘤方案， 在本文中也稱(chēng)為"輔助抗腫瘤方式"。因此，本發(fā)明的方法可以與 這類(lèi)常規(guī)方案一起使用，以減少副作用并增強(qiáng)功效。因此，本發(fā)明提供用于治療包括實(shí)體瘤和白血病在內(nèi)的各種癌 癥的組合物和方法?？芍委煹陌┌Y種類(lèi)包括但不限于乳腺癌、前列 腺癌和結(jié)腸腺癌；所有類(lèi)型的肺部支氣管癌；骨髓瘤；黑素瘤；肝 癌；成神經(jīng)細(xì)胞瘤；乳頭狀瘤；胺前體攝取脫羧細(xì)胞瘤(apudoma); 迷芽瘤；腮原瘤；惡性類(lèi)癌綜合征；類(lèi)癌心臟??；癌(例如Walker癌、 基細(xì)胞癌、basosquamous、 Brown-Pearce癌、導(dǎo)管癌、Ehrlich瘤、Krebs 2癌、梅克爾細(xì)胞癌、粘蛋白癌、非小細(xì)胞肺癌、燕麥細(xì)胞癌、乳頭 狀癌、硬癌、支氣管癌、支氣管源性癌、鱗狀細(xì)胞癌和移行細(xì)胞癌)； 組織細(xì)胞障礙；白血??；惡性組織細(xì)胞增多癥；霍奇金??；免疫增 殖性小細(xì)胞肺細(xì)胞癌；非霍奇金淋巴瘤；漿細(xì)胞瘤；網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞 增生??；黑素瘤；軟骨母細(xì)胞瘤；軟骨瘤；軟骨肉瘤；纖維瘤；纖 維肉瘤；巨細(xì)胞瘤；組織細(xì)胞瘤；脂肪瘤；脂肪肉瘤；間皮瘤；粘 液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；顱咽管瘤；無(wú)性細(xì)胞瘤； 錯(cuò)構(gòu)瘤；間質(zhì)瘤；中腎瘤；肌肉瘤；成釉細(xì)胞瘤；牙骨質(zhì)瘤；牙瘤； 畸月臺(tái)瘤；胸腺瘤；tophoblastic tumor。此夕卜，也可治療以下類(lèi)型的癌 癥腺瘤；膽管瘤；膽脂瘤；cyclindroma;嚢腺癌；嚢腺瘤；粒膜 細(xì)胞瘤；兩性胚細(xì)胞瘤；肝細(xì)胞瘤；汗腺腺瘤；胰島細(xì)胞瘤；Leydig 細(xì)胞瘤；乳頭狀瘤；睪丸支持細(xì)胞瘤；卵泡膜細(xì)胞瘤；平滑肌瘤； 平滑肌肉瘤；成肌細(xì)胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；橫紋肌瘤；橫紋肌肉瘤；
室管膜瘤；神經(jīng)節(jié)瘤；膠質(zhì)瘤；成神經(jīng)管細(xì)胞瘤；腦膜瘤；神經(jīng)鞘 瘤；成神經(jīng)細(xì)胞瘤；神經(jīng)上皮瘤；神經(jīng)纖維瘤；神經(jīng)瘤；副神經(jīng)節(jié) 瘤；非嗜鉻副神經(jīng)節(jié)瘤；血管角化瘤；血管淋巴樣增生并伴有嗜酸 粒細(xì)胞增多；硬化性血管瘤；血管瘤?。谎芮蛄?；血管內(nèi)皮細(xì)胞 瘤；血管瘤；血管外皮細(xì)胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤； 淋巴管肉瘤；松果體瘤；癌肉瘤；軟骨肉瘤；葉狀嚢肉瘤；纖維肉 瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；白血病性肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉 瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；橫紋肌肉瘤；肉瘤；贅生物；纖 維瘤??；和子宮頸發(fā)育異常。本發(fā)明的另 一方面是使用本發(fā)明的材料和方法，來(lái)預(yù)防和/或治 療任何過(guò)度增殖的皮膚病(包括銀屑病和接觸性皮炎)或其它過(guò)度增殖 性疾病。優(yōu)選的對(duì)CD148具有特異性的特異性結(jié)合劑可以與其它藥 物聯(lián)用，用于治療表現(xiàn)出這些臨床癥狀的人?？梢酝ㄟ^(guò)本文所述的 給藥途徑以及本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其它途徑，使用任何不同 的載體，給予所述特異性結(jié)合劑。本發(fā)明的其它方面包括治療各種涉及血管生成的視網(wǎng)膜病(包括 糖尿病性視網(wǎng)膜病和年齡相關(guān)性黃斑變性)，以及雌性生殖道障礙/疾 病，例如子宮內(nèi)膜異位癥、子宮纖維瘤和其它在雌性生殖期間與異 常功能的血管增殖(包括子宮內(nèi)膜孩i血管生長(zhǎng))相關(guān)的這類(lèi)病癥。本發(fā)明的再一方面涉及治療異常血管生長(zhǎng)，包括腦動(dòng)靜脈畸形 (AVM)、治療具有消化性潰瘍病史患者的胃腸粘膜損傷和修復(fù)、胃 及十二指腸粘膜潰瘍，包括中風(fēng)所致的局部缺血、各種肺血管疾病、治療患有非肝門(mén)靜脈血壓過(guò)高的患者的肝病和肝門(mén)靜脈血壓過(guò)高。本發(fā)明的另一方面是采用本發(fā)明的組合物和方法預(yù)防癌癥。這 類(lèi)藥物可包括特異性結(jié)合劑，例如抗CD148抗體或其抗原結(jié)合區(qū)。CD148表位結(jié)合分子的鑒定本發(fā)明的CD148表位和抗體可用于鑒定能激活CD148活性的藥 物，所述藥物可用于治療某些生理障礙，包括但不限于抑制血管生成。在本發(fā)明的一方面，提供與人CD148表位特異性結(jié)合的化合物 的鑒定方法，所述人CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQIDNO: 33的氨基酸447-725、 533-725、 715-973、 324-335、 200-536、 533-725 和200-725的多肽序列；所述方法包括使試驗(yàn)化合物與人CD148 表位接觸足夠時(shí)間以形成復(fù)合物，所述人CD148表位定義為一個(gè)或 多個(gè)選自SEQ ID NO: 33的氨基酸447-725、 533-725、 715-973、 324-335、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列；然后通過(guò)檢測(cè) 復(fù)合物中的所述CD148表位或所述化合物，來(lái)檢測(cè)復(fù)合物的形成， 因此，如果檢出復(fù)合物的話，就鑒定出與所述CD148表位結(jié)合的化 合物。例如，用編碼目標(biāo)蛋白的DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用不同藥物處理， 然后進(jìn)行共免疫沉淀。因?yàn)镃D148參與轉(zhuǎn)導(dǎo)與抑制所述生理障礙(例 如血管生成)有關(guān)的生理信號(hào)，所以能激活CD148活性的藥物的鑒定 將提供可用于治療生理障礙的藥物，或使用先導(dǎo)化合物，用于治療 藥開(kāi)發(fā)的藥物。藥物可以通過(guò)引發(fā)CD148脫磷酸化的方式，來(lái)結(jié)合 本文定義的CD148表位而激活CD148?？捎糜诩せ頒D148的藥物包 括肽、抗體、核酸、反義化合物或核酶。核酸可編碼抗體或反義化 合物。肽可以是結(jié)合蛋白序列的至少4個(gè)氨基酸?；蛘?，肽可以是4-30 個(gè)氨基酸(或8-20個(gè)氨基酸)，所述肽與結(jié)合蛋白質(zhì)毗連全長(zhǎng)的氨基 酸具有至少75%同一性?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的 技術(shù)，使用例如本文所述的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、細(xì)胞系、細(xì)胞模型或動(dòng) 物，測(cè)定藥物；所述技術(shù)例如公開(kāi)以下文獻(xiàn)美國(guó)專(zhuān)利笫5,622,852 和5,773,218號(hào)，以及PCT申請(qǐng)公布號(hào)WO 97/27296和WO 99/65939， 所述文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中?？稍隗w內(nèi)或體外測(cè)定藥物的調(diào) 節(jié)作用?？梢蕴峁┧幬铮糜谠谑删w展示文庫(kù)或組合文庫(kù)中進(jìn)行 測(cè)定。篩選藥物的示例性方法是測(cè)定藥物對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物形成的效 果。本發(fā)明的CD148表位也可用于制備生物活性目標(biāo)多肽或小分子
多肽的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，這些結(jié)構(gòu)類(lèi)似物可與CD148表位作用(例如激動(dòng) 劑、拮抗劑、抑制劑)，以便形成藥物，所述藥物是例如多肽的更具 活性或更穩(wěn)定形式，或者所述藥物例如可在體內(nèi)增加或干擾多肽功 能。本發(fā)明一方面提供與人CD148表位特異性結(jié)合的化合物的鑒定 方法，所述人CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQ ED NO: 33的 氨基酸447-725、 533-725、 715-973、 324-335、 200-536、 533-725和 200-725的多肽序列，所述方法包括提供限定CD148表位三維結(jié) 構(gòu)的原子坐標(biāo)，所述CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQIDNO: 33的氨基酸447-725、 533-725、 715-973、 324-335、 200-536、 533-725 和200-725的多肽序列；然后根據(jù)所述原子坐標(biāo)來(lái)設(shè)計(jì)或選擇能夠結(jié) 合所述CD148表位的化合物。用于合理藥物設(shè)計(jì)的一些方法包括三 維結(jié)構(gòu)分析、丙氨酸掃描、分子建模和使用抗獨(dú)特型抗體。這些技 術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。這些技術(shù)可包括提供限定由所述 笫 一多肽與所述第二多肽形成的蛋白復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)， 根據(jù)所述原子坐標(biāo)來(lái)設(shè)計(jì)或選擇能夠干擾笫 一 多肽與笫二多肽之間 相互作用的化合物。鑒定了調(diào)節(jié)或影響多肽活性的物質(zhì)之后，可以對(duì)其做進(jìn)一步研 究。此外，可以制備所述物質(zhì)和/或?qū)⑵溆糜谥苿?，即制備或配制?或者將其用于組合物，例如藥物、藥物組合物或藥物。這些都可以 給予個(gè)體。已鑒定作為多肽功能調(diào)節(jié)劑的物質(zhì)可以是天然肽或非肽。通常 優(yōu)選非肽"小分子"用于各種體內(nèi)藥物用途。因此，可以設(shè)計(jì)物質(zhì) 的模擬物(尤其是在肽的情況下)，用于藥物用途。已知藥物活性化合物模擬物的設(shè)計(jì)，對(duì)于開(kāi)發(fā)基于"先導(dǎo)"化 合物的藥物來(lái)說(shuō)是已知的。在以下情況下，需要這一該方法當(dāng)活 性化合物是不同的，或者其合成很昂貴，或者它不適于特定給藥方 法，例如純肽對(duì)口服組合物來(lái)說(shuō)就是不合適的活性藥，因?yàn)樗鼘⒃?消化道內(nèi)很快被蛋白酶降解。通常采用模擬物設(shè)計(jì)、合成和測(cè)定，
以避免隨機(jī)篩選大量分子的目標(biāo)特性。采用分光技術(shù)、X射線衍射數(shù)據(jù)和MNR等各種來(lái)源的數(shù)據(jù)，一 旦發(fā)現(xiàn)藥效團(tuán)，則按其物理性能例如立體化學(xué)、鍵、大小和/或電荷， 模擬其結(jié)構(gòu)。在這樣的建模過(guò)程中，可采用計(jì)算機(jī)分析、相似性作 圖(其模擬藥效團(tuán)的電荷和/或體積，但不是原子間的鍵)和其它技術(shù)。然后選擇模板分子，在模板分子上可以接枝模擬藥效團(tuán)的化學(xué) 基團(tuán)?？梢苑奖愕剡x擇模板分子及其上接枝的化學(xué)基團(tuán)，從而容易 合成模擬物，所述模擬物可能是藥理上可接受的，并且在體內(nèi)不降 解，同時(shí)又保留先導(dǎo)化合物的生物活性?；蛘撸?dāng)模擬物是基于肽 的模擬物時(shí)，可以通過(guò)將肽環(huán)化而增加它的剛性，使它更穩(wěn)定。然 后可以篩選由該方法發(fā)現(xiàn)的模擬物，看它們是否具有目標(biāo)特性，或 者看其表現(xiàn)程度如何。還可以進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化或修飾，得到一種或 多種最終模擬物，用于體內(nèi)或臨床試驗(yàn)。結(jié)合測(cè)定免疫結(jié)合測(cè)定通常采用捕獲劑，以特異性結(jié)合、且通常是固定 所分析的靶抗原。捕獲劑是特異性結(jié)合分析物的部分。在本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲劑是特異性結(jié)合本發(fā)明的CD148表位的抗體 或其抗原結(jié)合區(qū)。這些免疫結(jié)合測(cè)定是本領(lǐng)域眾所周知的[Asai編著， Methods in Cell Biology,笫37巻，Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc.， New York (1993)]。免疫結(jié)合測(cè)定經(jīng)常使用標(biāo)記物，所述標(biāo)記物可顯示由捕獲劑與 抗原形成的結(jié)合復(fù)合物的存在。標(biāo)記物可以是包含結(jié)合復(fù)合物的分 子中的一部分；即它可以是標(biāo)記的特異性結(jié)合劑或標(biāo)記的抗特異性 結(jié)合劑抗體?；蛘?，標(biāo)記物可以是笫三分子，通常是另一種抗體， 它可以與結(jié)合復(fù)合物結(jié)合。標(biāo)記物可以是例如帶有標(biāo)記的抗特異性 結(jié)合劑抗體。對(duì)結(jié)合復(fù)合物具有特異性的第二抗體可以缺乏標(biāo)記， 但是可以與笫四分子結(jié)合，這第四種分子對(duì)屬于第二抗體成員的抗
體種類(lèi)具有特異性。例如，第二抗體可以用可檢測(cè)部分(例如生物素) 修飾，然后該部分又可與第四分子(例如酶標(biāo)的鏈霉抗生物素)結(jié)合。能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白恒定區(qū)的其它蛋白質(zhì)(例如A蛋白或G蛋 白)也可用作標(biāo)記物。這些結(jié)合蛋白是鏈球菌細(xì)胞壁的正常成分，對(duì) 不同物種的免疫球蛋白恒定區(qū)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的非免疫原性反應(yīng)性。 Akerstrom， J. Immunol., 135:2589-2542 (1985); Chaubert， Mod. Pathol., 10:585-591 (1997)。在測(cè)定過(guò)程中，每次混合試劑后都可能需要孵育和/或洗滌步驟。 孵育步驟可以不同，約5秒至幾小時(shí)，優(yōu)選約5分鐘至約24小時(shí)。 然而，孵育時(shí)間將取決于測(cè)定方式、分析物、溶液體積、濃度等。 通?？梢栽诃h(huán)境溫度下進(jìn)行測(cè)定，盡管它們也可以在一段溫度范圍 內(nèi)進(jìn)行。A. 非竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定免疫結(jié)合測(cè)定可以是非竟?fàn)幮詼y(cè)定。這些測(cè)定具有大量捕獲的 分析物，它們可以被直接測(cè)定。例如在一個(gè)優(yōu)選的"夾心，，測(cè)定中， 捕獲劑(抗體)可以直接結(jié)合在固體基質(zhì)上并被固定。再用這些固定的 捕獲劑去捕獲(結(jié)合)試驗(yàn)樣品中的抗原。由此固定的蛋白質(zhì)再結(jié)合標(biāo) 記物，例如帶有標(biāo)記的笫二抗體。在另一個(gè)優(yōu)選的"夾心"測(cè)定中， 第二抗體缺乏標(biāo)記，但是可以結(jié)合標(biāo)記抗體，所述標(biāo)記抗體對(duì)第二 抗體來(lái)源物種的抗體具有特異性。第二抗體也可用可檢測(cè)部分(例如 生物素)修飾，而該部分又可被笫三標(biāo)記分子(例如鏈霉抗生物素)特 異性結(jié)合。參見(jiàn)Harlow和Lane, Antibodies, A Laboratory Manual,第 14章，Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988),所述文獻(xiàn)通過(guò)引用 結(jié)合到本文中。B. 竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定免疫結(jié)合測(cè)定可以是竟?fàn)幮詼y(cè)定?？梢酝ㄟ^(guò)以下方法，間接測(cè)
定樣品中的分析物數(shù)量通過(guò)測(cè)定所添加的替代分析物，或與樣品 中的分析物竟?fàn)幉东@劑(抗體)。在一個(gè)優(yōu)選的竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定中，將 已知量的分析物(通常帶有標(biāo)記)加入到樣品中，再使樣品接觸捕獲 劑。與抗體結(jié)合的標(biāo)記的分析物數(shù)量，同樣品中分析物的濃度成反 》匕(參見(jiàn)Harlow和Lane, Antibodies, A Laboratory Manual,第14章,第 579-583頁(yè)，出處同上)。在另一個(gè)優(yōu)選的竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定中，將捕獲劑固定在固體基質(zhì) 上?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)定蛋白/抗體復(fù)合物中的蛋白量，或者通過(guò)測(cè)定未結(jié) 合的蛋白量，來(lái)測(cè)定與捕獲劑結(jié)合的蛋白量。可以通過(guò)提供帶標(biāo)記 的蛋白質(zhì)，來(lái)檢測(cè)蛋白量。Harlow和Lane (出處同上)。再一個(gè)優(yōu)選的竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定中，采用了半抗原抑制。在此， 將已知分析物固定在固體基質(zhì)上。將已知量的抗體加入到樣品中， 再使樣品接觸固定的分析物。與固定的分析物結(jié)合的抗體數(shù)量，同 樣品中分析物的數(shù)量成反比?？梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)抗體的固定部分或保留 在溶液中的部分，來(lái)檢測(cè)固定的抗體數(shù)量。當(dāng)抗體被標(biāo)記、或者被 隨后添加的標(biāo)記部分間接標(biāo)記(所述標(biāo)記部分特異性結(jié)合如上所述的 抗體)時(shí)，可以進(jìn)行檢測(cè)。C.竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定的應(yīng)用竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定可用于交叉反應(yīng)性測(cè)定，以便讓技術(shù)人員能確 定被本發(fā)明肽抗體所識(shí)別的蛋白質(zhì)或酶復(fù)合物是否是所需蛋白'質(zhì)但 不是交叉反應(yīng)分子，或者確定肽抗體對(duì)抗原是否具有特異性但不是 結(jié)合非相關(guān)抗原。在該項(xiàng)測(cè)定中，可將抗原固定在固體支持物上， 將未知蛋白混合物加入到測(cè)定中，與肽抗體竟?fàn)幮越Y(jié)合固定的蛋白 質(zhì)。竟?fàn)幏肿右步Y(jié)合一個(gè)或多個(gè)與所述抗原無(wú)關(guān)的抗原。蛋白質(zhì)與 肽抗體竟?fàn)幮越Y(jié)合固定的抗原的能力，與固定到固體支持物上的相 同蛋白進(jìn)行比較，以確定蛋白混合物的交叉反應(yīng)性。
D. 其它結(jié)合測(cè)定本發(fā)明也提供蛋白質(zhì)印跡方法，以檢測(cè)或定量檢測(cè)樣品中存在 的CD148表位或其片段。該技術(shù)通常包括采用凝膠電泳，按分子量 大小來(lái)分離樣品蛋白，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到合適的固體支持物(例如硝 酸纖維素濾膜、尼龍濾膜或衍生化尼龍濾膜)上。將樣品與特異性結(jié) 合CD148表位的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)一起孵育，再檢測(cè)所得復(fù)合物。 這些肽抗體可直接標(biāo)記，或者隨后采用特異性結(jié)合肽抗體的標(biāo)記抗 體來(lái)測(cè)定。E. 診斷測(cè)定本發(fā)明的衍生結(jié)合劑(例如肽和肽抗體或其片段)可用于診斷以 CD148或亞基表達(dá)為特征的病癥或疾病，或者可用于正在使用CD148 及其片段活化劑、CD148活性激動(dòng)劑或抑制劑進(jìn)行治療的患者的監(jiān) 測(cè)測(cè)定。CD148的i貪斷測(cè)定包括利用抗體和標(biāo)記來(lái)測(cè)定人體液或細(xì) 胞及組織^是取物中CD148的方法。本發(fā)明的抗體可以有或無(wú)^f奮飾。 在一個(gè)優(yōu)選的診斷測(cè)定中，通過(guò)將抗體與標(biāo)記或報(bào)道分子等連接而 標(biāo)記抗體。已知大量的標(biāo)記和報(bào)道分子，它們中的某些已在本文中 描述。具體地講，本發(fā)明用于診斷人類(lèi)疾病。本領(lǐng)域已知使用對(duì)相應(yīng)蛋白質(zhì)具有特異性的抗體對(duì)CD148進(jìn)行 測(cè)定的多種方案。實(shí)例包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè) 定(RIA)和熒光激活細(xì)胞分選(FACS)。優(yōu)選兩位點(diǎn)的基于單克隆的免 疫測(cè)定，該測(cè)定使用對(duì)CD148上的兩個(gè)非干擾表位具有反應(yīng)性的單 克隆抗體，但是也可采用竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定。這些測(cè)定在例如以下文 獻(xiàn)中有說(shuō)明Maddox等，J. Exp. Med., 158:1211 (1983)。為了提供診斷依據(jù)，通常要建立人CD148表達(dá)的正常值或標(biāo)準(zhǔn) 值。該測(cè)定通過(guò)以下方法來(lái)完成在本領(lǐng)域眾所周知的適于形成復(fù) 合物的條件下，將正常受試者(優(yōu)選人)的體液或細(xì)胞提取物與抗 CD148抗體混合?？梢酝ㄟ^(guò)將抗體與已知數(shù)量的CD148蛋白結(jié)合，
與對(duì)照和疾病樣品進(jìn)行比較，定量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合物形成的數(shù)量。然 后，將得自正常樣品的標(biāo)準(zhǔn)值與得自可能受疾病影響的患者的樣品進(jìn)行比較。標(biāo)準(zhǔn)值和患者值之間的偏差表明CD148在疾病狀態(tài)中的 作用。對(duì)于診斷應(yīng)用，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié) 合區(qū)通常用可檢測(cè)部分標(biāo)記?？蓹z測(cè)部分可以是能夠直接或間接產(chǎn) 生可檢測(cè)信號(hào)的任何部分。例如，可檢測(cè)部分可以是放射性同位素， 例如3H、 4C、 32P、 35S或125I;熒光化合物或化學(xué)發(fā)光化合物，例如異硫氰酸熒光素、羅丹明或螢光素；或酶，例如堿性磷酸酶、P-半乳 糖苷酶或辣根過(guò)氧化物酶。Bayer等，Meth. Enz., 184: 138-163, (1990)。下述實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)視為限制性 實(shí)施例。本申請(qǐng)全文中所引用的所有附圖和所有參考文獻(xiàn)、專(zhuān)利和 已公布專(zhuān)利申請(qǐng)的內(nèi)容都通過(guò)？I用結(jié)合到本文中。實(shí)施例1 -抗CD148表位抗體的產(chǎn)生采用以下篩選方法，鑒定了本發(fā)明的抗體重鏈和輕鏈區(qū)的親本 形式。針對(duì)huCD148蛋白革巴標(biāo)，體外查詢(xún)了 Cambridge Antibody Technologies (CAT)的重組scFv (單鏈可變區(qū)片段)噬菌體展示文庫(kù)。 篩選了超過(guò)10,000個(gè)克隆，用噬菌體展示進(jìn)行回收(第2和第3輪輸 出)，然后鑒定了超過(guò)250種獨(dú)特的scFv抗體，所述抗體與CD148 特異性結(jié)合。在這些試劑中，根據(jù)其預(yù)測(cè)的治療潛力，選取83種用 于進(jìn)一步研究。例如，分離了幾種抗體，通過(guò)竟?fàn)幮訣LISA或TRF (時(shí) 間分辨熒光)報(bào)告進(jìn)行測(cè)定，所述抗體能夠與N24竟?fàn)幮越Y(jié)合同一表 位。通過(guò)ELISA或TRF (例如把結(jié)合，與鏈霉抗生物素結(jié)合進(jìn)行比 較),根據(jù)其相對(duì)高的信噪比，選取其它抗體；或者因?yàn)樗鼈兣c鼠CD 148 直向同源物具有交叉反應(yīng)性，所以選取它們。測(cè)定所有抗CD148抗 體與muCD148 (對(duì)于體內(nèi)小鼠研究)交叉反應(yīng)的能力，以及結(jié)合細(xì)胞表達(dá)的huCD148的能力。8種scFv人N24類(lèi)似物抗體表現(xiàn)出與IgG4、 大抗體(maxibodies) (二價(jià)scFv-Fc)或這兩者竟?fàn)嶯24的最高竟?fàn)幮裕?表達(dá)這8種以及7種其它克隆，證實(shí)其結(jié)合活性和特異性?？寺≡?始小鼠N24抗體，將Vh和VL基因亞克隆到不同抗體"平臺(tái)"上， 在比較結(jié)合(即ELISA或FACS)和功能性體外和體內(nèi)試驗(yàn)中作為陽(yáng)性 對(duì)照。完成了最初"top 14"先導(dǎo)候選抗體的主要功能性篩選。在體 外平面遷移測(cè)定中，這些克隆中有8種能激動(dòng)huCD148。此外，在 體內(nèi)小鼠角膜袋測(cè)定中，這些與muCD148具有交叉反應(yīng)的先導(dǎo)克隆 中有4種抑制FGF-2誘導(dǎo)的血管生成。圖1-8所示的8種抗體在人 內(nèi)皮細(xì)胞遷移測(cè)定和角膜袋測(cè)定中，都能夠抑制血管生成，在20|ig/ml 濃度時(shí)，在體外與對(duì)照相比，具有至少20%的能力。按照以上方法產(chǎn)生的抗體見(jiàn)圖1-8。圖1A和圖1B顯示本發(fā)明 的抗體即1號(hào)抗體(Ab-l)重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的核苷酸 序列及其所編碼的氨基酸序列重疊。圖上的陰影區(qū)表示CDR1、 CDR2 和CDR3 (分別從氨基端到羧基端)。查詢(xún)序列和讀框l分別表示核苷酸序列和氨基酸序列。圖2A和2B顯示2號(hào)抗體(Ab-2)重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列重疊。圖上的陰影區(qū)表 示CDR1、 CDR2和CDR3 (分別從氨基端到羧基端)。圖3A和3B顯示3號(hào)抗體(Ab-3)重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū) (VL)的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列重疊。圖上的陰影區(qū)表 示CDR1 、 CDR2和CDR3 (分別從氨基端到羧基端)。圖4A和4B顯示4號(hào)抗體(Ab-4)重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū) (VL)的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列重疊。圖上的陰影區(qū)表 示CDR1、 CDR2和CDR3(分別從氨基端到羧基端)。圖5A和5B顯示5號(hào)抗體(Ab-5)重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū) (VL)的核苦酸序列及其所編碼的氨基酸序列重疊。圖上的陰影區(qū)表 示CDR1、 CDR2和CDR3 (分別從氨基端到羧基端)。
圖6A和6B顯示6號(hào)抗體(Ab-6)重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū) (VL)的梭苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列重疊。圖上的陰影區(qū)表 示CDR1 、 CDR2和CDR3 (分別從氨基端到羧基端)。圖7A和7B顯示7號(hào)抗體(Ab-7)重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū) (VL)的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列重疊。圖上的陰影區(qū)表 示CDR1 、 CDR2和CDR3 (分別從氨基端到羧基端)。圖8A和8B顯示8號(hào)抗體(Ab-8)重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū) (VL)的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列重疊。圖上的陰影區(qū)表 示CDR1 、 CDR2和CDR3 (分別從氨基端到氯基端)。實(shí)施例2 - CD148結(jié)合表位的作圖合成對(duì)應(yīng)于人CD148 —級(jí)蛋白質(zhì)序列胞外域的合成肽15聚體， 并與PVDF膜上的部分共價(jià)N-連接。不同組成的肽序列有3個(gè)氨基 酸重疊。含肽膜與MeOH預(yù)孵育10分鐘，用PBST洗滌3次，與4%牛 奶/PBST —起孵育過(guò)夜。將膜用PBST洗滌3次后，與稀釋在4%牛 奶中的lpM抗CD148抗體一起孵育3小時(shí)。再將膜洗滌3次，然后 與抗人Fc-HRP或抗小鼠Fc-HRP(Jackson)—起孵育1小時(shí)。用PBST 洗滌3次后，用Super Signal試劑盒(Pierce)測(cè)定結(jié)合。在使用一次后，立即用水將含肽膜洗涂2次，再與DMF—起孵 育過(guò)夜，從而再生含肽膜，用于新的實(shí)驗(yàn)。將膜用水洗滌2次后， 用再生緩沖液A(1。/。 SDS、 0.1%|3-巰基乙醇、8M尿素)洗滌幾小時(shí)， 然后再用再生緩沖液B (50% EtOH、 10%乙酸)洗滌2次。單獨(dú)使用 第二抗體對(duì)膜進(jìn)行染色并顯影，證實(shí)再生步驟的效果。完成再生步 驟后，將膜用MeOH漂清，干燥并貯存于-2(TC。按照上述方法，測(cè)定Ab-l、 Ab-2、 Ab-3和Ab-5、鼠抗CD148 抗體和抗CD148抗體143-41 (Biosource)與含肽膜的結(jié)合，結(jié)果如下鼠抗體能與以下肽結(jié)合1號(hào)膜上的肽114-117以及2號(hào)膜上的
肽90-93 (114 & 90: GPVDPSSGQQSRD1E (殘基315-329),115 & 91: DPSSGQQSRD1EVLL (殘基318-332),116 & 92: SGQQSRD1EVLLVGL (殘基321-335)，117 & 93: QSED1EVLLVGLEPG (殘基324-338)),它們具有共同表 位QSRDTE (殘基324-329)。鼠抗體也結(jié)合八肽QSRDTEVLL (殘基 324-332)。Ab-l結(jié)合l號(hào)膜上的肽116和117以及2號(hào)膜上的肽92和93 (116 & 92: SGQ0SRD1EYLLYGL (殘基321-335), 117 & 93: QSRPTEVLLVGLEPG (殘基324-338》，它們具有共同表位 QSRDTEVLLVGL (殘基324-335),但是不結(jié)合八肽QSRDTEVL (殘 基324-331)。所測(cè)的其它抗CD148抗體都沒(méi)有表現(xiàn)出結(jié)合這些含肽 膜的證據(jù)。因此，Ab-l抗體結(jié)合具有氨基酸殘基324-338和321-335 序列的肽，但是不結(jié)合具有人CD148氨基酸殘基324-331的序列的 八肽。根據(jù)肽作圖結(jié)果，鼠抗CD148抗體的最小所需表位縮小到6個(gè) 氨基酸QSRDTE(殘基324-329)。 Ab-l所需的最小表位也經(jīng)測(cè)定為12 個(gè)氨基酸QSRDTEVLLVGL (殘基324-335)。因?yàn)槠渌鶞y(cè)的抗CD148 抗體都顯示出不與含肽膜結(jié)合，所以可以確定，這些抗體的表位是 結(jié)構(gòu)依賴(lài)性的。實(shí)施例3-FLAG、多聚組氨酸和Fc融合蛋白的構(gòu)建和測(cè)定將以下構(gòu)建體亞克隆到p412哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，IgK前導(dǎo)序列 和Flag多聚組氨酸標(biāo)記融合物都鄰接其N(xiāo)-端huCD14S-ECTO (殘 基36-973); huCD148-NFn111 (殘基36-210); huCD148-FnlII2一3 (殘基 175-536); huCD148-Fn1114—5 (殘基533-725); huCD148-Cterm:(殘基 715-973)。將這些克隆瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS PKB (E5)細(xì)胞中，用IMAC 柱純化。用兩種不同的ELISA方法，測(cè)定不同抗CD148抗體的結(jié)合。第
一種方法是在Ni-NTA板上進(jìn)行的直接ELISA。Ni-NTA板(Invitrogen) 用4個(gè)稀釋度(1:10-1:10.000)的5種蛋白質(zhì)/3°/0 BSA/PBS包被，并在 4'C孵育過(guò)夜。該板用PBST洗滌，與1]Lig/ml Ab-2-huIgG4、 Ab-5-huIgG4、鼠抗CD148抗體和143-41 (Biosource)—起在室溫下賻育2 小時(shí)。再次洗涂后，該板與抗hu-IgG4-HRP(Zymed)或抗小鼠-FC-HRP (Jackson)在室溫下孵育1小時(shí)。再次洗滌后，加入lOO)ul 10mg ABTS (Amersham)和45ml 0.05M檸檬酸(pH 4.0)和77pl 30% H202,使信號(hào) 顯影。第二種方法是間接ELISA。在4。C，將Maxisorp板用5pg/ml抗 huFc或抗muFc (Jackson)包被過(guò)夜。該板用PBST洗滌后，再用3% BSA/PBS封閉1.5小時(shí)。再次洗滌后，該板與5貼/ml Ab-2-huIgG4、 Ab-5-huIgG4、鼠抗CD148抗體和143-41 (Biosource)在室溫下孵育2 小時(shí)。再次洗滌該板，與2個(gè)稀釋度(1:10, 1:100)的5種蛋白質(zhì)在室 溫下聘育2小時(shí)，再次洗滌，然后與抗FLAG M2-HRP (Sigma)在室 溫下孵育1小時(shí)。不出所料，基于肽作圖，鼠抗CD148抗體結(jié)合huCD148-Fn1112—3 蛋白(殘基175-536)。市售143-41抗體(Biosource)結(jié)合huCD148-NFn111 蛋白(殘基36-210)。另外，Ab-5結(jié)合huCD148-Fn1114—5蛋白(殘基 533-725)和huCD148-Cterm蛋白(殘基715-973)。因?yàn)樵摷兓椒ǖ牡鞍踪|(zhì)收率非常低，所以將FLAG poly-his標(biāo) 記轉(zhuǎn)變成Fc標(biāo)記。再次將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到CHO PBK E5細(xì)胞中，用A 蛋白柱純化，通過(guò)另一種ELISA法測(cè)定抗CD148抗體的結(jié)合。 Maxisorp板用5fxg/ml 4元huFc (Jackson)在4°C包凈皮過(guò)夜，洗'條,再用 3Q/o奶/PBS封閉1.5小時(shí)。該板經(jīng)再次洗滌后，與5ng/ml不同CD148-Fc 構(gòu)建體一起在室溫下孵育2小時(shí)。再次洗滌后，將該板與lpg/mlAb-2-huIgG4、 Ab-5-huIgG4、 Ab-l-huIGg4、鼠抗CD148抗體和143-41 (Biosource)在室溫下孵育2小時(shí)。該板經(jīng)再次洗滌后，與抗huIgG4-HRP(Zymed)或抗小鼠Fc-HRP(Jackson)在室溫下將育1小時(shí)。
將分別帶有Flag、 Poly-His tags或Fc tag的5個(gè)CD148構(gòu)建體， 在293 E5細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，并分別用MAC柱或A蛋白柱純化。如 方法所述，通過(guò)ELISA,檢測(cè)抗CD148克隆與不同構(gòu)建體的結(jié)合。 當(dāng)使用Flag、 Poly-His tags構(gòu)建體時(shí)，人抗CD148克隆Ab-5同時(shí)結(jié) 合Fnl11(5 (殘基533-725)片段和C-端片段(殘基715-973);而當(dāng)使用 Fctag構(gòu)建體時(shí)，則結(jié)合FnIII4—5 (殘基533-725)。它也結(jié)合帶有這 兩種標(biāo)記的全長(zhǎng)ECTO域蛋白(殘基36-973)。人抗CD148克隆Ab-2 顯示出結(jié)合帶有這兩種標(biāo)記的全長(zhǎng)ECTO域蛋白(殘基36-973)以及低 水平地結(jié)合帶有Fc標(biāo)記的FnlH4—5 (殘基533-725),但不結(jié)合任何其 它3種構(gòu)建體。人抗CD148克隆Ab-l僅在ELISA中用于Fc構(gòu)建體。 它僅結(jié)合FnlII2一3片段(殘基175-536)。在所有測(cè)定中，市售鼠抗CD148 143-41 (Biosource)都結(jié)合全長(zhǎng)ECTO域蛋白(殘基36-973)和NFnIII片 段(殘基36-210)，但不結(jié)合任何其它3種構(gòu)建體。在所有測(cè)定中，鼠 抗CD148抗體用作陽(yáng)性對(duì)照，因?yàn)橐阎茏R(shí)別殘基324-332中的 八肽。鼠抗CD148抗體識(shí)別所有測(cè)定中的FnlH2—3片段(殘基175-1536) 以及帶有Fc標(biāo)記的全長(zhǎng)ECTO域蛋白(殘基36_973)。根據(jù)所有3次ELISA的綜合結(jié)果，結(jié)論是市售鼠抗CD148 143-41 (Biosource)抗體識(shí)別結(jié)構(gòu)依賴(lài)性表位，所述表位存在于殘基 36-210內(nèi)。Ab誦5識(shí)別FnlII4一5 (殘基533-725)片段和C-端片段(殘基 715-973)。這些片段彼此之間具有11個(gè)AA的重疊。因此，這11個(gè) AA對(duì)于Ab-5的結(jié)合是必不可少的。實(shí)施例4-抗生物素蛋白融合蛋白的構(gòu)建和測(cè)定將以下構(gòu)建體亞克隆到pCep4-抗生物素蛋白-N載體中 huCD148-NFnlH (殘基36-210); huCD148畫(huà)FnlII2一3 (殘基36-536); huCD148誦F週4一5 (2)(殘基36-715); huCD148-FnlII4一，(殘基36-725); huCD148隱ECTO (殘基36-973); huCD148Fn1112—3—4—5 (殘基 200-725); huCD148FnlIB一4一5 (殘基447-725); huCD148-FnlII4一5 (only)(殘基533-725); huCD148-FnIII—5 (殘基616-725); huCD148-Fnin一5.5 (殘基672-725)。按照生產(chǎn)商的方案，使用脂轉(zhuǎn)染胺試劑(Lipofectamine 2000， Invitrogen)，將所有抗生物素蛋白表達(dá)構(gòu)建體都轉(zhuǎn)染到293 T細(xì)胞中。 轉(zhuǎn)染后2天，收集條件培養(yǎng)基，用生物素珠(Spherotechlnc.)測(cè)定抗生 物素蛋白-融合蛋白水平。對(duì)于每種構(gòu)建體來(lái)說(shuō)，使用5pl珠子。這 些珠子與3% BSA在室溫下一起孵育30分鐘而預(yù)封閉，用0.2% BSA/PBS洗滌一次后，加入到200)li1各種條件培養(yǎng)基中，再孵育1 小時(shí)。2次洗滌后，加入lpg/ml抗抗生物素蛋白-FITC (載體)，再孵 育30分鐘，然后再次洗滌珠子，重懸于500pl洗滌緩沖液中，用FACS 讀數(shù)。根據(jù)表達(dá)水平的結(jié)果，可以確定結(jié)合測(cè)定中所用的條件培養(yǎng) 基的用量。結(jié)合測(cè)定方案與上述方案相同，只是用lpg/ml FITC標(biāo)記 的抗CD148 Ab-2替代抗抗生物素蛋白-FITC，并加入Ab-5抗體。該 測(cè)定方法的一個(gè)改動(dòng)包括將抗生物素蛋白融合蛋白與目標(biāo)FITC標(biāo)記 的抗體以及50x過(guò)量的未標(biāo)記抗體共孵育，以測(cè)定未標(biāo)記抗體是否 能有效竟?fàn)?阻止待測(cè)FITC-標(biāo)記的抗體的結(jié)合。該竟?fàn)帨y(cè)定可用于 測(cè)定任何抗體是否可與另 一個(gè)抗體竟?fàn)幮越Y(jié)合同一表位空間。Ab-2和Ab-5都能識(shí)別全長(zhǎng)huCD148-ECTO (殘基36-973)和 huCD148-Fn1114—5 (殘基36_725)構(gòu)建體。然而，這些抗體都不與 huCD148-NFnl11 (殘基36-210)、 huCD148-Fn1112—3 (殘基36-536)和 huCD148-Fnni4一5 (2)(殘基36-715)構(gòu)建體結(jié)合。Ab-5也結(jié)合 huCD148Fn1112—3—4—5 (殘基200-725); huCD148Fn1113—4—5 (殘基 447-725)和huCD148-FnlII4一5 (only)(殘基533-725)構(gòu)建體，但不結(jié)合 huCD148-Fnl11—5 (殘基616-725)和huCD148-FnlII一5.5 (殘基672-725) 構(gòu)建體。Ab-2結(jié)合huCD148Fn1112—3—4—5 (殘基200-725); huCD148FnlIB—4_5 (殘基447-725)構(gòu)建體，但不結(jié)合huCD148-FnlII4一5 (only)(殘基533-725)、 huCD148-FnlII一5 (殘基616-725)和 huCD148-FnlII一5.5 (殘基672-725)構(gòu)建體。
在竟?fàn)帨y(cè)定中，Ab-2能夠完全抑制Ab-5與huCD148-ECTO構(gòu) 建體的結(jié)合以及與FnlII4一5構(gòu)建體的結(jié)合。Ab-5能夠完全竟?fàn)嶢b-2 與huCD148-ECTO的結(jié)合，但僅部分抑制Ab-2與huCD148-Fn1114—5構(gòu)建體的結(jié)合。因?yàn)锳b-2和Ab-5都結(jié)合全長(zhǎng)huCD148-ECTO (殘基36_9")和 huCD148-Fn1114—5 (殘基36-725)構(gòu)建體，但不結(jié)合huCD148-FnlII4一5 (2)(殘基36-715)構(gòu)建體，后者與huCD148-FnIII4_5 (殘基36-725)構(gòu) 建體的不同之處僅在于C端的11個(gè)AA,而且因?yàn)檫@些抗體都不識(shí) 別我們的肽結(jié)合膜中的任何肽，所以結(jié)論是在殘基715-725中的11 個(gè)AA對(duì)于這些抗體的結(jié)合來(lái)說(shuō)是必要的，但并非充分的。根據(jù)這些 抗體與構(gòu)建體 huCD148FnlII2一3—4—5 (殘基 200-725)、 huCD148FnIII3_4—5 (殘基447-725)、 huCD148-FnlII4一5 (only)(殘基 533-725)、 huCD148國(guó)Fn111—5 (殘基616-725)和huCD148-FnIII_5.5 (殘 基672-725)的結(jié)合結(jié)果，可以確定Ab-5的最小結(jié)合區(qū)是殘基533-725,而Ab-2的最小結(jié)合區(qū)是殘基447-725。實(shí)施例5-平面遷移測(cè)定中抗CD148抗體的抗血管生成活性基本按照美國(guó)專(zhuān)利第6,248,327號(hào)所述，采用平面內(nèi)皮細(xì)胞遷移 (傷口閉合)測(cè)定，在體外定量測(cè)定圖1-8中公開(kāi)的所有抗體對(duì)血管生 成的抑制作用，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。在該測(cè)定中， 用在培養(yǎng)的細(xì)胞單層中的環(huán)形傷口閉合速率來(lái)測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞遷移。 傷口閉合速率是線性的，在體內(nèi)刺激和抑制血管生成的試劑能有效 控制傷口閉合速率。按照以下文獻(xiàn)所述，分離并培養(yǎng)原代人腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞 HRMEC，在笫三代，融化后使用Martin等，In Vitro Cell Dev Biol 33:261, 1997。用硅頭鉆床(silicon-tipped drill press)，在長(zhǎng)滿(mǎn)HRMEC 單層中重復(fù)打出圓形"傷口"(直徑600-800微米)。在制造傷口的時(shí) 間，向培養(yǎng)基(DMEM + 1% BSA)中補(bǔ)充20ng/ml PMA (佛波醇-12-豆 蔻酸-13-乙酸酯)，單獨(dú)或者在5-50嗎/ml對(duì)照或Ab-l至Ab-8的存在 下。用顯微鏡和圖像分析軟件(Bioquant, Nashville, TN),測(cè)定殘留傷 口面積與時(shí)間(0-12小時(shí))的函數(shù)。對(duì)每種試劑和試劑組合，通過(guò)殘留 傷口面積對(duì)時(shí)間作圖的線性回歸，計(jì)算相對(duì)遷移率。Ab-l、 Ab-2、 Ab-3、 Ab-4、 Ab-5、 Ab-6、 Ab-7和Ab-8各自以 劑量反應(yīng)方式抑制PMA誘導(dǎo)的內(nèi)皮遷移，遷移率顯著降低到未刺激 水平范圍15-50)iig/ml。實(shí)施例6-在角膜袋測(cè)定中，抗CD148抗體的抗血管生成活性基本按照美國(guó)專(zhuān)利第6,248,327號(hào)所述，在小鼠角膜袋測(cè)定中， 測(cè)定本發(fā)明抗體體內(nèi)抑制血管生成的能力。在該測(cè)定中，將有待檢 測(cè)血管生成或抗血管生成活性的試劑以緩釋形式固定在吸水性丙烯 酸聚合物小片上，將其植入到麻醉小鼠角膜上皮產(chǎn)生的微袋中。測(cè) 定血管化角膜緣向正常無(wú)血管角膜生長(zhǎng)的血管生成的現(xiàn)象、密度和 血管生長(zhǎng)范圍。聚乙烯醇海綿小片含有FGF-2 (50ng/小片)、bFGF和IgG (12昭/ 小片，對(duì)照)或bFGF和Ab-l至Ab-8 (12^g/小片)。將小片經(jīng)手術(shù)植 入角膜基質(zhì)微袋中，所述艱i袋是由6-8周齡雄性C57BL/6小鼠的中 到后角膜緣的lmm顯微解剖而產(chǎn)生的。5天后，在新血管對(duì)FGF-2 響應(yīng)的高峰期，用MZ9.5 steriomicrosope (Leica),以35-50°初始角(從 極性軸到子午線)，對(duì)含有小片的角膜拍照。用相減濾色器(Adobe Photoshop 4.0)使圖像數(shù)字化并進(jìn)行處理，用血紅蛋白含量來(lái)描繪已 建立的微血管。用圖像分析軟件(Bioquant, Nashville, TN)計(jì)算形成血 管的角膜圖像部分中血管形.成區(qū)的血管密度，以及整個(gè)角膜內(nèi)的總 血管密度。Ab-2、 Ab-4、 Ab-5和Ab-7抑制bFGF誘導(dǎo)的角膜血管生成，將 血管密度明顯降低到小于僅用FGF所誘導(dǎo)的密度。
權(quán)利要求
1. 一種與人CD148表位特異性結(jié)合的分離的抗體或其抗原結(jié)合 區(qū)，所述人CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQ ID NO: 33的氨 基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列。
2. 權(quán)利要求1的分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，其中所述抗體或 其抗原結(jié)合區(qū)抑制血管生成。
3. 權(quán)利要求1或2的分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，其中所述抗 體或其抗原結(jié)合區(qū)是單克隆抗體。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，其中 所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū)是人抗體或其抗原結(jié)合區(qū)。
5. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，其中 所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū)是選自scFv、 Fab、 F(ab')2、 Fv和單鏈抗體 的抗體片段。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的分離的人抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，其 中所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū)包含scFv片段。
7. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，其中 所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū)包含scFv-Fc融合物，或者是scFv-Fc融合 物。
8. —種竟?fàn)幮砸种茩?quán)利要求l- 中任一項(xiàng)的單克隆抗體與人 CD148表位的結(jié)合的分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，所述人CD148表 位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQIDNO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列。
9. 權(quán)利要求8的分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，其中所述抗體或 其抗原結(jié)合區(qū)抑制血管生成。
10. 權(quán)利要求8或9的分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，其中所述抗 體或其抗原結(jié)合區(qū)是單克隆抗體。
11. 權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，其 中所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū)是人抗體。
12. 權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)的分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，其 中所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū)是選自scFv、 Fab、 F(ab')2、 Fv和單鏈抗 體的抗體片段。
13. 權(quán)利要求8-12中任一項(xiàng)的分離的人抗體或其抗原結(jié)合區(qū)， 其中所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū)包含scFv片段。
14. 權(quán)利要求8-13中任一項(xiàng)的分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，其 中所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū)包含scFv-Fc融合物，或者是scFv-Fc融 合物。
15. —種雜交瘤細(xì)胞，它產(chǎn)生權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的抗體或 其抗原結(jié)合區(qū)。
16. —種轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞，它產(chǎn)生^l利要求1-14中任一項(xiàng)的抗體或 其抗原結(jié)合區(qū)。
17. 權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，它 由雜交瘤產(chǎn)生，所述雜交瘤包含與無(wú)限增殖化細(xì)胞融合的B細(xì)胞， 所述B細(xì)胞得自轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物的基因 組包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因。
18. 權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，它 由轉(zhuǎn)染瘤產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)染瘤包含編碼人重鏈和人輕鏈的核酸。
19. 權(quán)利要求15的雜交瘤細(xì)胞或權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞所產(chǎn) 生的單克隆抗體或其抗原結(jié)合區(qū)。
20. —種表達(dá)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)的 轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物的基因組包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因。
21. —種產(chǎn)生與人CD148表位特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合 區(qū)的方法，所述人CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQEDNO:33 的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725 的氨基酸序列；所述方法包括用人CD148表位或表達(dá)所述人CD148 表位的細(xì)胞來(lái)免疫轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物，所述動(dòng)物的基因組包含人重 鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因，所述人CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè)選 自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸序列；使所述動(dòng)物的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體； 分離所述動(dòng)物的B細(xì)胞；將所述B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成分 泌所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū)的無(wú)限增殖化雜交瘤細(xì)胞。
22. —種藥物組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-14或17-19 中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)以及藥學(xué)上可接受的人用載體。
23. 權(quán)利要求22的組合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū)以治 療有效量存在。
24. 權(quán)利要求22或23的組合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū) 的濃度為至少約10)Lig/ml。
25. 權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)的組合物，其中所述抗體或其抗原 結(jié)合區(qū)是IgG抗體或其抗原結(jié)合區(qū)。
26. 權(quán)利要求1-14或17-19中任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合區(qū)，其用于治療。
27. 有特定用途的權(quán)利要求26的抗體或抗原結(jié)合區(qū)，其中所述 抗體或抗原結(jié)合區(qū)用于抑制血管生成。
28. 權(quán)利要求1-14或17-19中任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合區(qū)在制備用于抑制血管生成的藥物組合物中的用途。的抗體或抗原結(jié)合區(qū)，其中所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū)是IgG抗體或 其抗原結(jié)合區(qū)。
29.
30. 有特定用途的或者有權(quán)利要求28或29的用途的權(quán)利要求 26-27或29中任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合區(qū)，其中所述抗體或其抗原 結(jié)合區(qū)包括scFv、 Fv、 Fab'、 Fab、雙抗體、線性抗體或抗體的F(ab')2 抗原結(jié)合片段。
31. —種與權(quán)利要求1-14或17-19中任一項(xiàng)的抗體結(jié)合的分離 的多肽或其任何片段，所述多肽由選自SEQ ID NO: 33的氨基酸 315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸 序列組成。
32. —種與權(quán)利要求1-14或17-19中任一項(xiàng)的抗體結(jié)合的分離 的多肽或其任何片段，所述多肽主要由選自SEQIDNO:33的氨基酸 315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸 序列組成。
33. —種與權(quán)利要求1-14或17-19中任一項(xiàng)的抗體結(jié)合的分離 的多肽或其任何片段，所述多肽包含選自SEQ ID NO: 33的氨基酸 315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸 序列，其中所述多肽不包括那些來(lái)自CD148但不是選自SEQIDNO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725 的氨基酸。
34. —種免疫測(cè)定方法，所述方法包括下述步驟(a)使試驗(yàn)樣 品與單克隆抗體或其抗原結(jié)合區(qū)接觸，所述單克隆抗體或其抗原結(jié) 合區(qū)在其與人CD148結(jié)合時(shí)能夠被與人CD148表位特異性結(jié)合的單 克隆抗體或其抗原結(jié)合區(qū)竟?fàn)幮砸种?，所述人CD148表位定義為一 個(gè)或多個(gè)選自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、200-536、 533-725和200-725的多肽序列；和(b)測(cè)定所述試驗(yàn)樣品中 人CD148的存在。
35. 權(quán)利要求34的免疫測(cè)定，其中所述抗體或其抗原結(jié)合區(qū)激 活CD148誘導(dǎo)的對(duì)血管生成的抑制。
36. —種與人CD148表位特異性結(jié)合的化合物的鑒定方法，所 述人CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQ ID NO: 33的氨基酸 315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序 列；所述方法包括使試驗(yàn)化合物與人CD148表位接觸足夠時(shí)間以 形成復(fù)合物，所述人CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725 的多肽序列；然后通過(guò)檢測(cè)復(fù)合物中的所述CD148表位或所述化合 物，來(lái)檢測(cè)所述復(fù)合物的形成，因此，如果檢出復(fù)合物的話，就鑒 定出與所述CD148表位結(jié)合的化合物。
37. —種與人CD148表位特異性結(jié)合的化合物的鑒定方法，所 述人CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQ ID NO: 33的氨基酸 315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序 列；所述方法包括提供限定CD148表位三維結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)，所 述CD148表位定義為一個(gè)或多個(gè)選自SEQ ID NO: 33的氨基酸31S 329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列；然后 根據(jù)所述原子坐標(biāo)來(lái)設(shè)計(jì)或選擇能夠結(jié)合所述CD148表位的化合 物。
全文摘要
描述了抗CD148抗體及其抗原結(jié)合區(qū)，以及包含這樣的抗體和抗原結(jié)合區(qū)的藥物組合物。也描述了使用這樣的抗體和抗原結(jié)合區(qū)結(jié)合CD148表位并激活CD148功能例如抑制血管生成的方法。還描述了可用于激活CD148功能和抗血管生成活性的表位以及能與之結(jié)合的化合物的鑒定方法。
文檔編號(hào)C07K16/00GK101124246SQ200580020383
公開(kāi)日2008年2月13日 申請(qǐng)日期2005年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月23日
發(fā)明者J·F·斯馬瑟斯, R·卡里夫, W·C·范斯洛夫三世 申請(qǐng)人:安姆根有限公司