專(zhuān)利名稱(chēng)：抗菌活性物質(zhì)dm0507及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的抗菌活性物質(zhì)，更具體地是涉及抗菌活性物質(zhì)DM0507及其應(yīng)用，其中抗菌活性物質(zhì)DM0507對(duì)很多菌種具有抗菌活性。
背景技術(shù)：
眾所周知，微生物產(chǎn)生具有抗細(xì)菌、抗真菌和抗病毒等作用的抗菌活性物質(zhì)。至今為止，青霉屬細(xì)菌產(chǎn)生的青霉素、頭孢霉屬產(chǎn)生的頭孢菌素、鏈霉菌屬產(chǎn)生的鏈霉素、四環(huán)素及紅霉素等作為抗菌活性物質(zhì)已經(jīng)得到了廣泛的利用。
此外，已知這些抗菌活性物質(zhì)經(jīng)長(zhǎng)年使用，其結(jié)果產(chǎn)生了對(duì)這些抗菌活性物質(zhì)有耐受性的菌(抗性菌)，因而人類(lèi)要尋求更加強(qiáng)有力的新型抗菌活性物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的課題因此，本發(fā)明的目的在于提供一種新型的更加強(qiáng)有力的抗菌活性物質(zhì)，該抗菌活性物質(zhì)來(lái)源于天然物質(zhì)，是一種廣譜抗菌物質(zhì)。
解決方案本發(fā)明人為了解決上述課題，經(jīng)過(guò)堅(jiān)持不懈的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從特殊的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液中能夠得到對(duì)很多菌種具有抗菌活性的物質(zhì)，從而完成了本發(fā)明。同時(shí)，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)所述具有抗菌活性的物質(zhì)即使添加在各種現(xiàn)有的產(chǎn)品中，其也能發(fā)揮抗菌活性的效果，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供一種抗菌活性物質(zhì)DM0507，其特征在于，通過(guò)包含以下步驟(a)～(d)的制造方法獲得(a)培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；(b)從所得的培養(yǎng)物回收上清；
(c)把上清的pH調(diào)整到3或3以下，回收所產(chǎn)生的沉淀物；(d)用乙醇從沉淀物中進(jìn)行提取的步驟。
同時(shí)，本發(fā)明提供一種抗菌劑，該抗菌劑以上述抗菌活性物質(zhì)DM0507作為有效成分。
并且，本發(fā)明提供一種飲料食品，該飲料食品含有上述抗菌活性物質(zhì)DM0507。
此外，本發(fā)明提供一種抗菌活性物質(zhì)DM0507的制造方法，其特征是包括下述步驟(a)～(d)(a)培養(yǎng)枯草芽孢桿菌；(b)從所得的培養(yǎng)物回收上清；(c)把上清的pH調(diào)整到3或3以下，回收所產(chǎn)生的沉淀物；(d)用乙醇從沉淀物中進(jìn)行提取的步驟。
發(fā)明效果本發(fā)明的抗菌活性物質(zhì)DM0507是一種對(duì)很多菌種具有抗菌活性的抗菌活性物質(zhì)。
因此，使用本發(fā)明的抗菌活性物質(zhì)DM0507，可得到各種具有優(yōu)異的抗菌活性的抗菌劑和飲料食品等。
最佳實(shí)施形式本發(fā)明抗菌活性物質(zhì)DM0507(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“DM0507”)，可以通過(guò)包含以下所述步驟的制造方法得到。
(a)培養(yǎng)枯草芽孢桿菌；(b)對(duì)所得培養(yǎng)物進(jìn)行離心后回收上清；(c)把上清的pH調(diào)整到3或3以下，回收所產(chǎn)生的沉淀物；(d)用乙醇從沉淀物中進(jìn)行提取的步驟。
在上述制造方法的步驟(a)中，作為培養(yǎng)中所使用的枯草芽孢桿菌，只要是生產(chǎn)DM0507的枯草芽孢桿菌，并沒(méi)有特別的限制。作為優(yōu)選的枯草芽孢桿菌，例如可以列舉枯草芽孢桿菌DB9011菌株(FERMBP-3418)和枯草芽孢桿菌MBI600菌株(beckerunderwood Inc.SUBTILEX(商品名))等，其中特別優(yōu)選枯草芽孢桿菌DB9011菌株。
因?yàn)樯鲜隹莶菅挎邨U菌的培養(yǎng)能根據(jù)常規(guī)的方法進(jìn)行，所以培養(yǎng)條件并沒(méi)有特別的限定。例如可以采用以下條件進(jìn)行培養(yǎng)，即可以采用水解酪蛋白胨肉湯(DIFCO制造)，在30℃～40℃的溫度優(yōu)選35℃下振動(dòng)培養(yǎng)24～48小時(shí)，優(yōu)選振蕩培養(yǎng)36小時(shí)。
下一步，從在上述步驟(a)中得到的培養(yǎng)物中回收上清(步驟(b))。在該步驟(b)中，可以采用離心分離的方法回收上清。具體的離心分離條件并無(wú)特別限定。例如可以采用10,000rpm～40,000rpm，優(yōu)選20,000rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行20分鐘～1小時(shí)，優(yōu)選1小時(shí)的離心分離。
將在上述步驟(b)中回收的上清，將其pH調(diào)整到3或3以下，優(yōu)選調(diào)整到3.0，并回收產(chǎn)生的沉淀物(步驟(c))。在這個(gè)步驟(c)中，pH的調(diào)整可用硫酸和鹽酸等的酸進(jìn)行。此外，在調(diào)整pH之后，理想的是在4～10℃，優(yōu)選4～5℃下放置8～24小時(shí)，優(yōu)選放置12～18小時(shí)。并且，通過(guò)調(diào)整pH而產(chǎn)生的沉淀物的回收，可通過(guò)離心分離、超濾、凍結(jié)干燥、透析等方法回收，優(yōu)選進(jìn)行離心分離。具體的離心分離的條件沒(méi)有特別限定，例如可以采用10,000rpm～40,000rpm，優(yōu)選20,000rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行20分鐘～1小時(shí)，優(yōu)選1小時(shí)的離心分離。
最后，使用乙醇對(duì)在上述步驟(c)中回收的沉淀物進(jìn)行提取(步驟(d))。通過(guò)這個(gè)步驟(d)能夠得到本發(fā)明的DM0507。由沉淀物提取DM0507的方法有多種，例如可以列舉在沉淀物中添加乙醇，在使沉淀物處于懸浮的狀態(tài)下靜置15分鐘～1小時(shí)左右，以將DM0507提取到乙醇中等方法。
如此得到的本發(fā)明的DM0507，是一種廣譜抗菌活性物質(zhì)，對(duì)如下(A)～(D)組微生物具有抗菌活性。
(A)組(需氧性和兼性厭氧微生物)豬鏈球菌(Streptococcus suis)肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC6633蠟狀芽孢桿菌狀變種(Bacillus cereus var.mycoides)ATCC11778化膿隱秘桿菌(Arcanobacterium pyogenes)殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmoaicida)嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)
伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)JCM2434胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)2型副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)多殺性巴斯德菌(Pasteurella multocida)D型溶血巴斯德菌(Pasteurella haemolytica)鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella Typhimurium)豬霍亂沙門(mén)氏菌(Salmonella Choleraesuis)肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)ATCC10031瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjunii)不動(dòng)桿菌屬某種(Acinetobacter sp.)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)血清型1的嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila serotype 1)雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum)雞滑膜支原體(Mycoplasma synoviae)(B)組(微需氧性微生物)空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)幽門(mén)螺旋桿菌(Helicobacter pylori)ATCC43526(C)組(專(zhuān)性厭氧微生物)產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringenes)艱難梭菌(Clostridium difficile)瘡皰丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)JCM6425脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)JCM8525牙齦炎病原菌(Tannerella forsythensis)JCM10827嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)JCM1132雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)JCM1255普氏厭氧球菌(Anaerococcus prevotii)JCM6508具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)(D)組(真菌)尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)。
在這些微生物中，本發(fā)明的DM0507尤其對(duì)血清型1的嗜肺軍團(tuán)菌、牙齦卟啉單胞菌(プロフィロモナス·ジンジバ一リスPorphyromonas gingivalis)、瘡皰丙酸桿菌具有很高的抗菌活性；其次對(duì)艱難梭菌、空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌具有很高的抗菌活性；再其次對(duì)殺鮭氣單胞菌、雞毒支原體、雞滑膜支原體具有很高的抗菌活性。
本發(fā)明的DM0507，對(duì)如上所述的很多種微生物具有抗菌活性，所以可用于以其作為有效成分的抗菌劑和含有本發(fā)明的DM0507的抗菌用品、飲料和食品等。
為了制造以本發(fā)明的DM0507作為有效成分的抗菌劑，可以通過(guò)常規(guī)的制造方法將DM0507與已知的醫(yī)藥學(xué)上容許的適當(dāng)醫(yī)藥載體組合形成制劑。關(guān)于在這種抗菌劑中的DM0507的含量，只要能讓抗菌活性有效發(fā)揮，其含量并沒(méi)有特殊的限制，例如可以測(cè)試DM0507相對(duì)于瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter junii)的MIC(最小抑菌濃度)，并使DM0507在制品中的含量達(dá)到或超過(guò)MIC值，優(yōu)選使DM0507在制品中的含量為MIC值的2～10倍。以下表示采用微量液體稀釋法測(cè)試相對(duì)于瓊氏不動(dòng)桿菌的MIC的測(cè)試法。
<采用微量液體稀釋法測(cè)試相對(duì)于瓊氏不動(dòng)桿菌的MIC的測(cè)試法>
對(duì)每一個(gè)試樣進(jìn)行2個(gè)系列的測(cè)試，DM0507濃度梯度是從10倍稀釋開(kāi)始，之后按2倍稀釋的方式一直稀釋到10240倍。首先，分別把2價(jià)離子調(diào)整水解酪蛋白胨肉湯(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“CAMHB”)注入96孔的平底微型板，每孔注入100μl。在最初加入DM0507的孔中注入180μl的CAMHB。下一步，在最初的孔中加入20μl的DM0507，以進(jìn)行稀釋10倍，之后每次取100μl以稀釋2倍的方式一直稀釋到10240倍。瓊氏不動(dòng)桿菌在前一天分離培養(yǎng)，預(yù)先進(jìn)行18～24小時(shí)的MHA培養(yǎng)。用生理鹽水把瓊脂培養(yǎng)基的新鮮培養(yǎng)菌調(diào)整為0.5麥?zhǔn)?McFarland)濃度之后，稀釋10倍，調(diào)為107cfu/ml.將調(diào)整過(guò)的菌液分別接種到各孔中，每孔5μl。最終的接種濃度為5×105cfu/ml(5×104cfu/100μl)。作為對(duì)照，制成只有CAMHB和菌液的孔以及只有CAMHB的孔。在35℃下將微型板培養(yǎng)18小時(shí)，之后將用肉眼確認(rèn)生長(zhǎng)被完全抑制的最少稀釋倍數(shù)作為MIC值。
另外，使本發(fā)明的DM0507可以直接或者以采用上述方法制成的抗菌劑的形式包含于或浸漬于如下所示的現(xiàn)有產(chǎn)品中，形成如下所述的抗菌制品。
<非醫(yī)藥品、試劑、漱口劑等>
外用藥、牙膏(牙膏、牙膏粉、牙膏水)、齒間牙刷、漱口劑、口腔炎等的消毒藥、假牙用品(清洗、粘附、滅菌、消毒、消臭)、沐浴用劑、藥用肥皂、口唇保護(hù)劑、指甲保護(hù)劑、皮膚消毒劑、雞眼和老繭用劑、傷口消毒劑、糜爛和痱子防止劑、龜裂凍瘡用劑、皮膚粗糙及皸裂用劑、頭皮·頭皮用劑、頭皮屑和搔癢防止劑、腋用劑。
<日用品、盥洗室用品、纖維及皮革商品等>
浸漬在尿布、廚房用品、盥洗室用品、肥皂、碳素纖維、布、皮等中而制成的制品<清潔劑等>
衛(wèi)生棉類(lèi)(包括紙制品)、洗發(fā)香波、護(hù)發(fā)素、生理衛(wèi)生用品、隱形眼鏡清潔劑<化妝品等>
化妝水、乳液、洗面奶、護(hù)膚劑、面膜、雪花膏、護(hù)手霜、化妝油、剃須劑、防曬劑<消毒劑、滅菌劑等>
循環(huán)式大眾浴池·溫泉滅菌劑、游泳池滅菌劑、冷卻(冷卻水)劑、空調(diào)等的過(guò)濾器用劑。
<建材、涂料等>
木材、紙張、油性漆、水性漆、布、粘合劑、草席、涂裝保護(hù)劑<食品添加劑等>
保鮮劑(含飲料)用于這些抗菌產(chǎn)品時(shí)，優(yōu)選用于化妝水和牙膏。在生產(chǎn)這類(lèi)抗菌用品時(shí)，除了將本發(fā)明的DM0507以有效量添加到產(chǎn)品原材料中以外，其他按照通常的生產(chǎn)方法進(jìn)行生產(chǎn)即可。
而且，本發(fā)明的DM0507還可以添加到口香糖、糖果、小甜餅、零食等點(diǎn)心、輔助食品、清涼飲料等飲料和食品中。對(duì)于這些飲食品來(lái)說(shuō)，優(yōu)選用于口香糖和糖果。使通常的這類(lèi)飲料和食品含有本發(fā)明的DM0507，能夠生產(chǎn)保健食品，并且通過(guò)人們?nèi)粘５臄z取就可以起到清除牙周病菌和幽門(mén)螺旋桿菌等病菌的作用，或起到防止這些菌長(zhǎng)期存在的預(yù)防作用。關(guān)于這類(lèi)飲料和食品的生產(chǎn)方法，除了將本發(fā)明的DM0507以有效量添加到飲料和食品的原材料等中以外，其他按照通常的生產(chǎn)方法進(jìn)行生產(chǎn)即可。
實(shí)施例下面根據(jù)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的任何限制。
參考例1抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選以抑制牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)JCM8525的繁殖的活性作為指標(biāo)，對(duì)下述的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)上清的抗菌活性進(jìn)行了檢測(cè)。
<被測(cè)試菌株>
·DB9011菌株(于1991年5月21日寄存在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物寄存中心(郵政編碼305-8566日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)，保藏號(hào)為FERM BP-3418。)·ATCC6633菌株·BN1001菌株(明治制果株式會(huì)社制B-NClean(商品名))·Kubota株(株式會(huì)社Asahi biotech公司產(chǎn)品BSK菌)·OUV23481菌株(Mizkan株式會(huì)社制金のっぶほね元?dú)?商品名))·MBI600菌株(beckerunderwood Inc.制SUBTILEX(商品名))首先在水解酪蛋白胨S瓊脂培養(yǎng)基(榮研化學(xué)株式會(huì)社制)中培養(yǎng)各種枯草芽孢桿菌，連續(xù)培養(yǎng)三代。下一步，在10ml滅菌過(guò)的水解酪蛋白胨肉湯(DIFCO制)中分別接種各1個(gè)白金環(huán)的菌株，在35℃下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。
把振蕩培養(yǎng)后的各培養(yǎng)液分別注入1.5ml的微管中，以15,000rpm的轉(zhuǎn)速離心分離10分鐘。下一步，回收離心過(guò)的上清，用0.45μm的過(guò)濾器過(guò)濾。將這種過(guò)濾后的培養(yǎng)上清滲入直徑6.5mm的紙盤(pán)(DIFCO公司制)。另一方面，將作為抗菌活性指標(biāo)使用的牙齦卟啉單胞菌預(yù)先用GAM肉湯培養(yǎng)基(日水制藥株式會(huì)社制)進(jìn)行厭氣培養(yǎng)。之后，在高壓蒸氣滅菌后將GAM瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥株式會(huì)社制)在50℃保溫，將預(yù)先厭氣培養(yǎng)好的牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng)液與其混合后，注入培養(yǎng)皿以固化。把滲入了各種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)濾液的紙盤(pán)置于該培養(yǎng)皿的中央，在35℃的溫度下進(jìn)行48小時(shí)的厭氣培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時(shí)后，測(cè)試各種枯草芽孢桿菌的對(duì)牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑。其結(jié)果如表1所示。


從表1可知，DB9011菌株和MBI600菌株的培養(yǎng)上清相對(duì)于牙齦卟啉單胞菌具有很高的抗菌活性。
實(shí)施例1抗菌活性物質(zhì)DM0507的生產(chǎn)(1)DB9011菌株的培養(yǎng)將在斜面培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并在冰箱中保存著的DB9011菌株在水解酪蛋白胨S瓊脂培養(yǎng)基(榮研化學(xué)株式會(huì)社制)中傳代繁殖，并在35℃下培養(yǎng)24小時(shí)后形成菌落。下一步，將1個(gè)上述菌落接種在10ml水解酪蛋白胨肉湯(DIFCO制)中，在35℃的溫度下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。最后，將上述培養(yǎng)液1ml接種到預(yù)先高壓蒸氣滅菌過(guò)的3L的水解酪蛋白胨肉湯中，在溫度35℃、時(shí)間30小時(shí)和轉(zhuǎn)速200rpm的條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)得到培養(yǎng)液。
(2)抗菌活性物質(zhì)DM0507的提取將3L在上述(1)中調(diào)制所得的培養(yǎng)液維持在4℃，并在這一狀態(tài)下以20,000rpm的轉(zhuǎn)速離心分離30分鐘，并回收離心分離后的上清。下一步，在離心分離后的上清中添加10N的鹽酸將pH調(diào)節(jié)至3后，在冰箱里靜置了一夜。將靜置后的上清維持在4℃，并在這一狀態(tài)下以20,000rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行30分鐘的離心分離，拋棄上清，回收沉淀物。在該沉淀物中施加99.5質(zhì)量％的乙醇10ml使之懸浮，靜置15分鐘左右后提取抗菌活性物質(zhì)DM0507。將該抗菌活性物質(zhì)DM0507維持在4℃，并在這一狀態(tài)下進(jìn)一步以20,000rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行30分鐘的離心分離，之后在上清中添加1N的氫氧化鈉，將pH調(diào)節(jié)至7.0后，用0.45μm的過(guò)濾器過(guò)濾，然后在-80℃的溫度下冷凍保存。
(3)抗菌活性物質(zhì)DM0507的物性測(cè)試<IR測(cè)試>
用以下的條件對(duì)DM0507實(shí)施IR測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3060.48、2958.27、2927.41、2871.49、2856.06、1737.55、1650.77、1573.63、1558.20、1469.49、1403.92、1274.72(單位均為cm-1)等中出現(xiàn)峰值(圖1)。
(測(cè)試條件)測(cè)試裝置HORIBA FT-710(堀場(chǎng)製作所製)測(cè)試方法KBr法測(cè)試溫度室溫<NMR測(cè)試>
用以下條件對(duì)DM0507實(shí)施了NMR測(cè)試。其測(cè)試結(jié)果如圖2所示。
(測(cè)試條件)測(cè)試裝置Unity INOVA600(Varian制)測(cè)試頻率599.898MHz測(cè)試溶劑重DMSO測(cè)試溫度30℃實(shí)施例2抗菌活性的測(cè)試使用在實(shí)施例1中得到的抗菌活性物質(zhì)DM0507，測(cè)試其針對(duì)以下被測(cè)試菌株的抗菌活性。
<被測(cè)試菌株>
·金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MSSA·金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MRSA·豬葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)·黃色微球菌(Micrococcus luteus)ATCC9341·變異鏈球菌(Streptococcus mutans)JCM5705·豬鏈球菌(Streptococcus suis)·肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)·化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)·鶉雞腸球菌(Enterococcus gallinarum)
·枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)DB9011·枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC6633·蠟狀芽孢桿菌蕈狀變種(Bacillus cereus var.mycoides)ATCC11778·化膿隱秘桿菌(Arcanobacterium pyogenes)·副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ATCC17802·殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)·嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)·伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)JCM2434·胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)2型·副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)·多殺性巴斯德菌(Pasteurella multocida)D型·溶血巴斯德菌(Pasteurella haemolytica)·巴斯德菌屬家禽病原菌(Pasteurella trehalosi)·埃希氏大腸菌(Escherichia coli)·鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella Typhimurium)·豬霍亂沙門(mén)氏菌(Salmonella Choleraesuis)·肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC10031·綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)·綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)質(zhì)子泵高表達(dá)菌株·綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)質(zhì)子泵缺失菌株·瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter junii)·不動(dòng)桿菌屬某種(Acinetobacter sp.)·嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)·血清型1的嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophilaserotype 1)·雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum)·雞滑膜支原體(Mycoplasma synoviae)·空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)·大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)·幽門(mén)螺旋桿菌(Helicobacter pylori)ATCC43526·產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)
·艱難梭菌(Clostridium difficile)·瘡皰丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)JCM6425·脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)·牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingvalis)JCM8525·牙齦炎病原菌(Tannerella forsythensis)JCM10827·嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)JCM1132·雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)JCM1255·白假絲酵母菌(Candida albicans)·隱球菌屬某種(Cryptococcus sp.)·黑曲霉(Aspergillus niger)·尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)(1)檢驗(yàn)被測(cè)試菌株以適合的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件(表2)進(jìn)行三代傳代培養(yǎng)，并以下述(2)混合稀釋或(3)劃線涂抹中的任意一種方法接種到培養(yǎng)基中。下一步，將實(shí)施例1中制備的抗菌活性物質(zhì)0507滲入到直徑8mm的薄紙盤(pán)(Advantech公司制)中，每個(gè)滲入20μl，在錯(cuò)開(kāi)培養(yǎng)皿蓋的狀態(tài)下在冰箱內(nèi)靜置30分鐘，使乙醇揮發(fā)。作為對(duì)照，對(duì)只有乙醇的紙盤(pán)也進(jìn)行了同樣的操作。把DM0507的紙盤(pán)及作為對(duì)照用的紙盤(pán)各1個(gè)放在接種了被測(cè)試菌株的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，測(cè)試紙盤(pán)周?chē)囊志Υ笮　?br> (2)混合稀釋用1ml的滅菌生理鹽水把傳代繁殖三代培養(yǎng)后的菌株調(diào)整為2麥?zhǔn)蠞舛?6.0×108/ml)之后，再稀釋10倍。然后，將該菌液以0.1質(zhì)量％的比例添加到預(yù)先高壓蒸氣滅菌后保持在50℃的瓊脂培養(yǎng)基中混合。并且，在預(yù)先注入了10ml瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中再覆上10ml加有菌液的培養(yǎng)基。此時(shí)的菌數(shù)是1.0×104/cm2。
(3)劃線涂抹用1ml滅菌生理鹽水把傳代繁殖三代培養(yǎng)后的菌株調(diào)整為0.5麥?zhǔn)蠞舛?1.5×108/ml)之后，在其中浸漬滅菌木桿棉棒(榮研器材株式會(huì)社產(chǎn)品)后，從3個(gè)方向?qū)Ω鱾€(gè)培養(yǎng)基劃線。




※1瓊脂培養(yǎng)基MHA水解酪蛋白胨S瓊脂培養(yǎng)基(榮研化學(xué)株式會(huì)社制)GAMGAM瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥株式會(huì)社制)
澤田澤田培養(yǎng)基(自己調(diào)制)B-CYEαB-CYE α瓊脂培養(yǎng)基(榮研化學(xué)株式會(huì)社制)FrayFray瓊脂培養(yǎng)基(自己調(diào)制)PDA馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(榮研化學(xué)株式會(huì)社制)※2雞毒支原體(M.gallisepticum)、雞滑膜支原體(M.synoviae)的劃線涂抹雞毒支原體以及雞滑膜支原體使用Fray肉汁(自己調(diào)制)、根據(jù)其變黃來(lái)確認(rèn)繁殖，并在35℃的溫度下傳代繁殖三代。在變黃的第三代肉汁中浸漬滅菌木軸棉棒，從三個(gè)方向在Fray瓊脂培養(yǎng)基上劃線。
※3牙齦炎病原菌(T.Forsythensis)JCM 10827的劃線涂抹由于牙齦炎病原菌發(fā)育需要N-乙酰胞壁酸，所以將1.5％N-乙酰胞壁酸盤(pán)放置在培養(yǎng)基的中央進(jìn)行培養(yǎng).將15mg的N-乙酰胞壁酸溶解在1ml的純化水中，用0.45μm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，然后滲入到直徑8mm的紙盤(pán)中，每個(gè)滲入20μl，并在室溫下進(jìn)行干燥。把所得物作為1.5％N-乙酰胞壁酸盤(pán)使用。
※4黑曲霉、尖孢鐮刀菌(F.Oxysporum)的劃線涂抹A.niger以及尖孢鐮刀菌使用PDA的斜面培養(yǎng)基，在25℃下培養(yǎng)7天。在真菌已在其上發(fā)育的斜面培養(yǎng)基中添加2ml加入了0.1％Tween80的生理鹽水，輕輕混合制成孢子液。將孢子液放入血球計(jì)算盤(pán)中測(cè)試孢子數(shù)，然后用加入了0.1％Tween80的生理鹽水調(diào)節(jié)到1×106/ml。在孢子液中浸漬經(jīng)過(guò)滅菌的木桿棉棒從三個(gè)方向在PDA平板培養(yǎng)基上劃線。
從上述結(jié)果可知，本發(fā)明的DM0507具有非常寬的抗菌譜，并且針對(duì)不同的菌種其抗菌活性的強(qiáng)度也有所不同。
實(shí)施例3制造收斂性化妝水按照以下的配方，采用常規(guī)的制造方法混合各種成分，以制造收斂性化妝水。
(配方) (配合量質(zhì)量％)甘油3.0山梨糖醇2.0
親水性表面活性劑1.0乙醇14.0檸檬酸和磷酸鹽緩沖劑0.1對(duì)酚磺酸鋅 0.2DM0507*1.0香料適量防腐劑 適量純化水 78.7*表示實(shí)施例1的產(chǎn)物實(shí)施例4制造乳液按照以下的配方，采用常規(guī)的制造方法混合各種成分，以制造乳液。
(配方) (配合量質(zhì)量％)蜜蠟 0.5凡士林2.0三十碳烷 5.0親油性乳化劑 0.8親水性乳化劑 1.2香料 0.5防腐劑適量防氧化劑 適量丙二醇5.0乙醇 4.01％增粘劑水溶液 20.0氫氧化鉀 0.1DM0507*1.0純化水59.9*表示實(shí)施例1的產(chǎn)物實(shí)施例5制造藥用牙膏按照以下的配方，采用常規(guī)的制造方法混合各種成分，以制造藥用牙膏。
(配方) (配合量質(zhì)量％)氯化十六烷基吡啶 0.01氯化鈉 10.0磷酸氫鈣 20.0黃蓍 2.0檸檬酸鈉 適量檸檬酸 適量對(duì)羥基苯甲酸酯 0.5純化水 其余部分香料 微量法定色素 微量DM0507*1.0*表示實(shí)施例1的產(chǎn)物實(shí)施例6制造藥用肥皂按照以下的配方，采用常規(guī)的制造方法混合各種成分，以制造藥用肥皂。
(配方) (配合量質(zhì)量％)2，4，4’-三氯-2’-羥基二苯醚 0.3聚氧乙烯 適量月桂基醚磷酸酯 2.0混合植物提取液 2.0肥皂用原料 35.0檸檬酸 適量對(duì)羥基苯甲酸酯 0.5
純化水 其余部分香料微量法定色素微量DM0507*1.0*表示實(shí)施例1的產(chǎn)物實(shí)施例7制造美容液按照以下的配方，采用常規(guī)的制造方法混合各種成分，以制造美容液。
(配方)(配合量質(zhì)量％)甘油 5.0BG10.0透明質(zhì)酸 0.01膠原蛋白 0.8氨基酸0.5植物提取液0.5卡波姆0.2對(duì)羥基苯甲酸酯0.2純化水其余部分DM0507*1.0*表示實(shí)施例1的產(chǎn)物實(shí)施例8制造雪花膏按照以下的配方，采用常規(guī)的制造方法混合各種成分，以制造雪花膏。
(配方)(配合量質(zhì)量％)甘油 6.0BG7.0
透明質(zhì)酸 0.01植物提取液 0.5角鯊?fù)? 10.0硬脂酸 2.0三十二烷醇 5.0對(duì)羥基苯甲酸酯 0.2純化水 其余部分DM0507*1.0*表示實(shí)施例1的產(chǎn)物實(shí)施例9制造洗面奶按照以下的配方，采用常規(guī)的制造方法混合各種成分，以制造洗面奶。
(配方) (配合量質(zhì)量％)甘油3.0BG 3.0硬脂酸 5.2礦物油 15.0碳酸二烷基酯10.0椰油基乙基?；撬?.5十八烷醇1.5對(duì)羥基苯甲酸酯 0.2純化水 其余部分DM0507*1.0*表示實(shí)施例1的產(chǎn)物實(shí)施例10制造沐浴用劑按照以下的配方，采用常規(guī)的制造方法混合各種成分，以制造沐浴劑。
(配方) (配合量質(zhì)量％)碳酸氫鈉50.0干燥硫化鈉 30.0氯化鈦 1.2法定色素微量香料微量聚乙二醇其余部分DM0507*0.001*表示實(shí)施例1的產(chǎn)物在產(chǎn)業(yè)方面的應(yīng)用本發(fā)明的DMK0507對(duì)很多菌種具有抗菌活性，所以可以應(yīng)用在具有優(yōu)異抗菌活性的抗菌劑、抗菌產(chǎn)品、飲料和食品等中。


圖一為DM0507的IR譜圖。
圖二DM0507的NMR譜圖。
權(quán)利要求
1.一種抗菌活性物質(zhì)DM0507，其特征在于，由包含以下步驟(a)～(d)的制造方法獲得(a)培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；(b)從所得的培養(yǎng)物回收上清；(c)把上清的pH調(diào)整到3或3以下，回收所產(chǎn)生的沉淀物；(d)用乙醇對(duì)沉淀物進(jìn)行提取的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌活性物質(zhì)DM0507，其特征在于，對(duì)以下(A)～(D)組微生物具有抗菌活性(A)組(需氧性和兼性厭氧微生物)豬鏈球菌(Streptococcus suis)肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC6633蠟狀芽孢桿菌蕈狀變種(Bacillus cereus var.mycoides)ATCC11778化膿隱秘桿菌(Arcanobacterium pyogenes)殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)JCM2434胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)2型副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)多殺性巴斯德菌(Pasteurella multocida)D型溶血巴斯德菌(Pasteurella haemolytica)鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella Typhimurium)豬霍亂沙門(mén)氏菌(Salmonella Choleraesuis)肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC10031瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter junii)不動(dòng)桿菌屬某種(Acinetobacter sp.)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)血清型1的嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila serotype 1)雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum)雞滑膜支原體(Mycoplasma synoviae)(B)組(微需氧性微生物)空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)幽門(mén)螺旋桿菌(Helicobacter pylori)ATCC43526(C)組(專(zhuān)性厭氧微生物)產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringenes)艱難梭菌(Clostridium diffcile)瘡皰丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)JCM6425脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)JCM8525牙齦炎病原菌(Tannerella forsythensis)JCM10827嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)JCM1132雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)JCM1255普氏厭氧球菌(Anaerococcus prevotii)JCM6508具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)(D)組(真菌)尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗菌活性物質(zhì)DM0507，其特征在于，枯草芽孢桿菌為保藏號(hào)為FERM BP-3418的枯草芽孢桿菌DB9011。
4.一種抗菌劑，其特征在于，以權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的抗菌活性物質(zhì)DM0507作為有效成分。
5.一種飲料食品，其特征在于，含有權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的抗菌活性物質(zhì)DM0507。
6.一種抗菌活性物質(zhì)DM0507的制造方法，其特征在于包含以下步驟(a)～(d)(a)培養(yǎng)枯草芽孢桿菌；(b)從所得的培養(yǎng)物回收上清；(c)把上清的pH調(diào)整到3或3以下，回收所產(chǎn)生的沉淀物；(d)用乙醇從沉淀物中進(jìn)行提取的步驟。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種新型的更加強(qiáng)有力的抗菌活性物質(zhì)，該抗菌活性物質(zhì)來(lái)源于天然物質(zhì)，為廣譜抗菌物質(zhì)，具體提供一種抗菌活性物質(zhì)DM0507，其由包含以下步驟的制造方法獲得(a)培養(yǎng)枯草芽孢桿菌；(b)從所得的培養(yǎng)物回收上清；(c)把上清的pH調(diào)整到3或3以下，回收所產(chǎn)生的沉淀物；(d)用乙醇從沉淀物中進(jìn)行萃取。
文檔編號(hào)C07G11/00GK101084318SQ200580019860
公開(kāi)日2007年12月5日 申請(qǐng)日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月4日
發(fā)明者山下直美, 飯塚武, 中江太治, 佐竹幸子 申請(qǐng)人:株式會(huì)社Ahc, Aim資產(chǎn)管理株式會(huì)社