專利名稱：一種鯊魚軟骨血管生成抑制因子小分子多肽及其生產(chǎn)純化方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小分子肽領(lǐng)域，具體涉及一種鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽及其 生產(chǎn)純化方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鯊魚是極少患惡性腫瘤的海洋動物之一，其發(fā)病率為百萬分之一。美國科學(xué)家 Luer將高劑量的強(qiáng)致癌劑黃曲霉素Bl注射到鯊魚體內(nèi)，也不能誘發(fā)鯊魚患癌癥。給鯊魚接 種癌細(xì)胞也不能誘發(fā)癌癥。這提示鯊魚體內(nèi)具有獨特的抗腫瘤機(jī)制(賀麗虹1，黃建華2， 沈頌東等，海洋科學(xué)/2005年/第29卷/第11期63-66)。多年來，世界各國的研究人員多是對鯊魚軟骨組織進(jìn)行了研究，從中分離提取 了多種具有腫瘤抑制作用，尤其是抑制腫瘤新生血管生長的多種物質(zhì)，如Lee等(Lee A， Langer R. Shark cartilage contains inhibitors of tumor angiogenesis)首次從一條 姥鯊的鰭和脊椎軟骨中分離提取了一種強(qiáng)烈抑制實體瘤新生血管生成的活性蛋白質(zhì)。這類從鯊魚軟骨中提取的具有血管生成抑制活性的蛋白質(zhì)稱之為鯊魚血管生 成抑制因子(Shark Cartilage Angiogenesis Inhibiting Factor, SCAIF)。Sheu 等 (Sheu JR, FuCC, Tsai ML, et al. Effect of U-995, a patent shark cartilage-derived angiogenesis inhibitor, on anti-angiogenesis and antitumor activities[J]. Anticancer Res, 1998,18 (6A) 4435)從藍(lán)鯊軟骨中分離純化了由兩條多肽組成的新血管 生成抑制因子U-995，可顯著抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，并會引起新血管的中 斷和破裂，阻止破壞由腫瘤壞死因子TNF-α誘導(dǎo)的雞胚絨毛尿囊膜血管生成，防止由膠原 酶誘導(dǎo)的膠原溶解。目前，從各種鯊魚軟骨中分離提取的物質(zhì)純度不等，相對分子量大小不一，理化性 質(zhì)和生物學(xué)活性不盡相同的蛋白質(zhì)和多糖類物質(zhì)。更有人直接將鯊魚軟骨粉作為口服藥 物，如1997年，加拿大批準(zhǔn)鯊魚軟骨口服液AE2941/Neovastat進(jìn)入III期臨床試驗，它是 至今進(jìn)入III期臨床試驗為數(shù)不多的抗血管生成藥物之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中，從鯊魚組織中分離提取的物質(zhì)純度不等，分 子量較大不容易被細(xì)胞吸收的問題，提供一種便于吸收的鯊魚血管生成抑制因子小分子多 肽。本發(fā)明另一目的在于提供一種編碼上述小分子多肽的DNA序列。本發(fā)明另一目的在于提供一種含有編碼小分子多肽的DNA序列的重組表達(dá)載體。本發(fā)明另一目的在于提供一種表達(dá)上述小分子多肽的重組微生物。本發(fā)明另一目的在于提供上述小分子多肽的生產(chǎn)純化方法。本發(fā)明還有一個目的在于提供上述小分子多肽的應(yīng)用。
本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)本發(fā)明從鯊魚組織中克隆到一個183個氨基酸的蛋白基因，不同于目前發(fā)現(xiàn)的任 何一種鯊魚血管抑制因子。但因為分子量較小的小分子肽更容易被細(xì)胞吸收，因此克隆了 該蛋白的活性區(qū)域，大小為33個氨基酸的小分子肽，該小分子肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。編碼所述鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。小分子多肽多需要進(jìn)行融合表達(dá)，雖然有GST標(biāo)簽等表達(dá)體系，但是表達(dá)產(chǎn)物切 割時多會留有多余氨基酸，因為小分子肽的分子量相對較小，多余的氨基酸可能會影響小 分子肽的功能。因而本發(fā)明采用了 SUMO表達(dá)系統(tǒng)，SUMO蛋白酶對SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)表達(dá) 的重組蛋白進(jìn)行切割切除掉SUMO蛋白后，不會在小分子肽上有多余氨基酸殘留，因此是融 合表達(dá)小分子肽的最佳系統(tǒng)。因此本發(fā)明采用SUMO與鯊魚血管抑制因子活性段融合表達(dá)， 表達(dá)后利用SUMO蛋白酶切除SUMO蛋白，獲得非融合的小分子肽。本發(fā)明鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽的生產(chǎn)純化方法，包括如下步驟(1)分別以-SUMO和鯊魚血管抑制因子全長基因序列為模板，設(shè)計引物，引物序列 如SEQ ID N0:12 15所示；通過PCR擴(kuò)增，得到兩段基因序列，將兩段基因連接在一起，經(jīng) 酶切后與表達(dá)載體PET3C連接，得到重組表達(dá)載體；(2)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)，挑取單克隆接種到培 養(yǎng)基中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后做電泳，選取表達(dá)量高的作為發(fā)酵種子；(3)將表達(dá)量高的克隆接種到培養(yǎng)基中發(fā)酵，離心所得發(fā)酵菌體，收集細(xì)胞、破碎、 離心后得到上清，用Ni-NTA柱進(jìn)行純化，得到含有SUMO標(biāo)簽的鯊魚血管生成抑制因子小分 子多肽；(4)將表達(dá)量高的克隆接種到培養(yǎng)基中發(fā)酵，離心所得發(fā)酵菌體，收集細(xì)胞、破碎、 離心后得到上清，用Ni-NTA柱進(jìn)行純化，得到含有SUMO標(biāo)簽的鯊魚血管生成抑制因子小分 子多肽；在含有SUMO標(biāo)簽的鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽加入SUMO酶，SUMO酶與小 分子多肽的體積比為1 100，得到鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽。體外細(xì)胞學(xué)實驗證明本發(fā)明的鯊魚血管生成抑制因子小分子肽具有抑制血管內(nèi) 皮細(xì)胞和兩種腫瘤細(xì)胞生殖的作用，同時該小分子肽還可以抑制雞胚尿囊膜血管的生長。體內(nèi)實驗證明本發(fā)明的鯊魚血管生成抑制因子小分子肽可以抑制小鼠腫瘤的生 長。因此本發(fā)明的鯊魚血管生成抑制因子小分子肽可用于制備抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的 相關(guān)藥物，或者用于制備抗腫瘤藥物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果(1)本發(fā)明提供一種鯊魚血管生成抑制因子小分子肽，該小分子肽只含有33個氨 基酸，因此體積小，易于細(xì)胞吸收，有利于融合蛋白表達(dá)，而且利于人工合成，成本低；(2)本發(fā)明的鯊魚血管生成抑制因子小分子肽經(jīng)體外和在體實驗證明，具有抑制 血管內(nèi)皮細(xì)胞和兩種腫瘤細(xì)胞生殖的作用，還可以抑制雞胚尿囊膜血管的生長，以及抑制 小鼠腫瘤的生長，因此可制備成相關(guān)藥物，具有廣闊的藥用價值；(3)本發(fā)明采用將待表達(dá)基因與SUMO基因相結(jié)合，從而獲得可溶性蛋白的高效表達(dá)，而且SUMO片斷連接了 6個His，也便于純化，純化后的蛋白通過SUMO酶的酶切，可以獲 得目的蛋白。


圖1為鯊魚血管生成抑制因子全長cDNA全序列的PCR電泳圖；其中，1為PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物，M為DNA Marker ；通過PCR獲得了鯊魚血管生成抑制因子SAIFcDNA，為692bp。圖2為利用PCR獲得融合蛋白SUM0-SAIF基因；其中，M為DNAMarker ；1為融合蛋 白基因，經(jīng)PCR，獲得了一條約430bp的條帶，與融合蛋白SUM0-SAIF基因的大小相符。圖3為重組質(zhì)粒pET3C/SUM0-aSAIF酶切鑒定電泳圖；其中，1，2為DNAMarker ；3， 4，5分別為挑選克隆。經(jīng)BamH I.Nde I雙酶切后，三個克隆中有兩個獲得了 430bp大小的 條帶，證明其為陽性克隆。圖4融合蛋白表達(dá)SDS-PAGE電泳圖；其中1和2為誘導(dǎo)組，3為對照組，未誘導(dǎo)，4 為上清，即菌體破碎離心后上清；5為沉淀，即菌體破碎離心后沉淀；電泳顯示，與為誘導(dǎo)組 相比，工程菌經(jīng)誘導(dǎo)后在20kDa處有一條明顯的蛋白條帶，說明，重組融合蛋白獲得表達(dá)。 經(jīng)破碎離心后，在上清中有同樣大小的條帶，而沉淀中則含量極小，說明該融合蛋白是以可 溶性蛋白的形式存在的。圖5為含有SUMO標(biāo)簽的重組融合蛋白的純化電泳圖；其中，M為蛋白Marker ；1 為純化后的融合蛋白；融合蛋白經(jīng)M柱親和層析后，收集洗脫峰進(jìn)行電泳，獲得純度大于 90%的融合蛋白。圖6為SUMO蛋白酶酶切含有SUMO標(biāo)簽的重組融合蛋白的電泳圖；其中，1為SUMO 酶切后的蛋白；M為蛋白Marker ；約20kDa大小的融合蛋白經(jīng)SUMO酶切后獲得了 16kDa大 小的SUMO蛋白和4kDa大小的非融合鯊魚血管抑制因子小分子肽；圖7為非融合蛋白純化電泳圖；其中，1為非融合蛋白；M為蛋白質(zhì)Marker ；酶切液 經(jīng)過M柱二次純化，帶有His標(biāo)簽的SUMO蛋白與M柱結(jié)合，而小分子肽則隨透過峰流出， 收集透過峰進(jìn)行電泳，顯示獲得純度約90%的非融合小分子肽aSAIF ；圖8為本發(fā)明小分子肽抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生成結(jié)果圖；分設(shè)對照組(1 3)和用藥組(4 6)，每組各3個平行樣；與對照組相比較，給藥組的雞胚尿囊膜的血管密 度明顯降低。圖9為本發(fā)明小分子肽抑制腫瘤體積生長結(jié)果曲線圖；1)陰性對照組(生理鹽水 組)8只，給0.9%的Nacl溶液，每只每天加0. Iml ；2)陽性對照組(環(huán)磷酰胺)8只，按 文獻(xiàn)給藥濃度為20mg/kg，每只每天加0. Iml0 3)給藥組8只，按文獻(xiàn)給藥濃度為5mg/kg， 每只每天加0. Iml ；結(jié)果顯示，用藥組的腫瘤體積明顯低于對照組，其結(jié)果與陽性對照組沒 有明顯差異；圖10為本發(fā)明小分子肽抑制腫瘤重量增加結(jié)果曲線圖；1)陰性對照組(生理鹽 水組)8只，給0.9%的Nacl溶液，每只每天加0. Iml ；2)陽性對照組(環(huán)磷酰胺)8只，按 文獻(xiàn)給藥濃度為20mg/kg，每只每天加0. Iml ；3)給藥組8只，按文獻(xiàn)給藥濃度為5mg/kg， 每只每天加0. Iml ；結(jié)果顯示，用藥組的腫瘤重量明顯低于對照組，其結(jié)果與陽性對照組沒 有明顯差異。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實施例并不對本發(fā)明做任 何限定。本發(fā)明首先通過基因克隆技術(shù)，從條紋斑竹鯊軟骨組織中制備得到鯊魚血管生成 抑制因子的全長cDNA序列，及其編碼氨基酸序列，然后通過對該氨基酸進(jìn)行分析，并結(jié)合 文獻(xiàn)檢索，從而確定氨基酸上第91 123區(qū)域的33個氨基酸所構(gòu)成的小分子多肽，可能為 蛋白的活性區(qū)域。接著本發(fā)明將該33個氨基酸組成的小分子肽進(jìn)行融合蛋白表達(dá)，并對表 達(dá)蛋白進(jìn)行活性鑒定，最后證實該小分子肽確實具有很好的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞 生殖的作用，具體試驗過程如各實施例所示。實施例1鯊魚血管生成抑制因子小分子肽的獲得
1. 1總RNA提取和cDNA第一鏈的合成從條紋斑竹鯊軟骨組織中提取總RNA 提取與純化按照Promega公司的SVTotal RNA Isolation System試劑盒的說明書操作進(jìn)行。cDNA第一鏈的合成使用TaKaRa RNA LA PCR TM Kit (AMV)試劑盒，以上述條紋 斑竹鯊軟骨組織總RNA為模板，oligo(dT)18為反轉(zhuǎn)錄引物，操作按試劑盒推薦方法進(jìn) 行。-20°C保存?zhèn)溆谩?. 1. 1.引物設(shè)計根據(jù)現(xiàn)有已知的SCAIF序列，通過分析判斷SCAIF序列的保守區(qū)域，設(shè)計引物，序 列如SEQ ID NO :4 9所示。LL2PCR 擴(kuò)增PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 3min，94°C 60s，40°C 60s，72°C 60s，共 30 個 循環(huán)，最后72°C延伸5min。PCR擴(kuò)增體系為PCR Buffer4dNTP2rTaq 酶0.2質(zhì)粒2F2R2ddH207.8_20 μ 1PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，PCR擴(kuò)增得到大約700bp的產(chǎn)物(箭 頭所指位置)。將PCR產(chǎn)物采用常規(guī)的切膠回收、純化、T載體連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞、檢測陽性克 隆等本領(lǐng)域技術(shù)人員的常用技術(shù)，將所得陽性克隆送交測序。測序結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增得到一條長692bp的序列，通過對該序列進(jìn)行分析以及 生物學(xué)親緣鑒定，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與現(xiàn)有的SCAIF序列具有很高的同源性，其中與狗鯊 中克隆到的基因有85. 2%的同源性，與人和斑馬魚的相關(guān)基因的同源性分別為68. 9%和62. 3%。該基因序列不同于任何一種已知的SCAIF序列，由此證明本實施例得到一條新的 鯊魚血管生成抑制因子的全長序列，長度為692bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0:10所示。對上述SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明該序列編碼183個氨基 酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0:11所示。1. 2小分子肽的基因獲得對SEQ ID NO :11所示氨基酸序列進(jìn)行分析，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)檢索，確定該氨基酸 序列上第91 123區(qū)域的33個氨基酸所構(gòu)成的小分子肽為蛋白的活性區(qū)域，編碼該小分 子肽的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，該小分子肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。實施例2融合表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)和純化1.含有SUMO標(biāo)簽的融合表達(dá)載體的構(gòu)建本實施例構(gòu)建含有SUMO基因以及SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的融合表達(dá)載體， 具體操作如下所示以pET3C-SUM0以及實例1所獲得的鯊魚血管抑制因子全長基因SEQ ID NO 10為 模板，采用引物Fl、Rl、F2、R2，通過PCR擴(kuò)增得到432bp的目的片段。引物Fl，其核苷酸序列如SEQ ID NO 12所示；引物Rl，其核苷酸序列如SEQ ID NO 13所示；引物F2，其核苷酸序列如SEQ ID NO 14所示；引物R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO 15所示；PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 3min，94°C 60s，40°C 60s，72°C 60s，共 30 個循 環(huán)，最后72°C延伸5min。PCR擴(kuò)增體系為
PCR Buffer4
dNTP2
rTaq 酶0. 2
質(zhì)粒2
Fw2
Rv2
ddH207. 8
20 μ 1
以F1、R1和F2、R2為引物，以SUMO基因和鯊魚血管抑制因子全長基因為模板分別
進(jìn)行PCR，然后再以Fl和R2為引物進(jìn)行第三次PCR，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，從圖中可以 看出，PCR擴(kuò)增得到大約432bp的產(chǎn)物(箭頭所指位置)。將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和大腸桿菌表達(dá)載體PET3C分別進(jìn)行BamH I.Nde I酶切后 連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，涂布平板后，挑取陽性克隆，進(jìn)行酶切鑒定，酶切鑒 定結(jié)果圖3所示，從圖中可以看出，在挑取的三個克隆中，其中兩個(3和5)經(jīng)雙酶切后有 一個大約430bp的條帶，證明是陽性克隆。將酶切鑒定的陽性克隆送交測 序，測序結(jié)果證實本實施例已經(jīng)成功構(gòu)建融合表達(dá) 載體 pET3C/SUM0-aSCAIF。
2.含有SUMO標(biāo)簽的工程菌的構(gòu)建與表達(dá)將上述構(gòu)建成功的融合表達(dá)載體pET3C/SUM0_aSCAIF轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 BL21 (DE3)，涂布LB (Amp+)平板，挑取單克隆接種到LB培養(yǎng)基中，當(dāng)OD = 0. 6時，加入IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)3h后收取菌體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看到經(jīng)誘導(dǎo)后，在20kDa處有一條明顯 條帶，由此說明本實施例成功獲得含有SUMO的重組融合蛋白。挑取表達(dá)量高的克隆作為菌種在搖瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，同樣條件下誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)3h 后離心收取菌體，經(jīng)超聲波破碎，離心后分別制備上清和沉淀的樣品，進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE 電泳，電泳鑒定發(fā)現(xiàn)該含有SUMO標(biāo)簽的融合蛋白存在于破碎上清中，因此該融合蛋白是以 可溶性形式表達(dá)的。3.含有SUMO標(biāo)簽的重組融合蛋白的發(fā)酵在22L發(fā)酵罐中加入IOL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含蛋白胨2%，酵母粉2%，糖蜜0.5% 及磷酸緩沖液(Na2HPO4 0.2%,NaH2PO4 0. 1%,ρΗ7. 0) ；37°C培養(yǎng)，接種量10%;溶氧控制在 發(fā)酵前期低速，中期高速，后期低速；連續(xù)流加葡萄糖250g，同時通過流加NaOH或HCl，控制 PH變化；IPTG在發(fā)酵進(jìn)行到3hr時加入，同時溫度設(shè)置在32°C，誘導(dǎo)5hr后放罐。獲得菌 體 32g/L。4. SUMO標(biāo)簽的去除及純化將上述所得發(fā)酵菌體進(jìn)行離心處理，收集細(xì)胞，按照1 8的比例將細(xì)胞重懸在破 碎緩沖液中(50mM Tris+300mM NaCl PH 7. 5)，超聲波破碎細(xì)胞后離心，取上清，因該融合 蛋白含有一個His純化標(biāo)簽，因此使用Ni-NTA柱進(jìn)行純化，純化的具體操作參照Ni-NTA柱 說明書即可。首先用緩沖液A(20mM磷酸緩沖液+500mM Nacl+30mM咪唑PH7. 5)平衡Ni-NTA柱， 然后加入樣品，再用緩沖液B (20mM磷酸緩沖液+500mM Nacl+30mM咪唑PH7. 5)進(jìn)行清洗， 之后用緩沖液C(20mM磷酸緩沖液+500mMNaCl+500mM咪唑PH7. 5)洗脫，分步收取洗脫液， 進(jìn)行電泳，從圖5可以看出，經(jīng)Ni柱一步純化后，可以得到純度約90%的含有SUMO標(biāo)簽的
重組融合蛋白。將純化后的含有SUMO標(biāo)簽的重組融合蛋白，按照SUMO酶重組融合蛋白= 1 100的比例混合(ν/ν)，37°C恒溫酶切12h后，電泳結(jié)果如圖6所示，從圖中可以看出， 分子量為20kDa的重組融合蛋白被酶切為16kDa的SUMO蛋白條帶以及4kDa的目的蛋白條 帶(本發(fā)明的鯊魚血管生成抑制因子小分子肽其分子量約4kDa左右)，經(jīng)過二次Ni柱純 化，，連有His的SUMO蛋白可以和柱結(jié)合，而非融合的aSCAIF隨著透過峰流出，從而和SUMO 蛋白分離。電泳圖中可以看到透過峰中有分子量大小約為4kDa的蛋白條帶，純度可達(dá)90% 以上。收集透過峰，做蛋白電泳顯示可以獲得大約90%純度的4kDa非融合的小分子肽(見 圖7)。由此說明本實施例成功獲得融合表達(dá)的鯊魚血管生成抑制因子小分子肽。實施例3鯊魚血管生成抑制因子小分子肽活性檢測1.采用MTT實驗檢測實施例2制備所得鯊魚血管生成抑制因子小分子肽抑制血管 內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人前列腺癌細(xì)胞DU145的生長情況(抑制率=(實驗 組_對照組)/對照組)，MTT操作采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作，檢測結(jié)果如表1所示。
表1小分子肽抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率
抑制率(％)/濃度 (mg/mL)0. 050. 0250. 01250. 006HUVEC53. 20%28. 70%15. 90%9%MCF-734. 80%16. 80%8. 20%0. 80%DU14516. 50%12. 60%4. 90%2. 10%從表1可看出，本發(fā)明鯊魚血管生成抑制因子小分子肽能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人前列腺癌細(xì)胞DU145的生長，尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，在 濃度為0. 05ug/ul時，抑制率可以達(dá)到53. 20%.2.對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制買回孵化第6天的雞胚，放在實驗室的恒溫箱內(nèi)適應(yīng)ld，第二天，打開雞胚尿囊膜 一端，將濾膜剪成直徑Imm的正方形，并將實施例2制備所得鯊魚血管生成抑制因子小分 子肽0. 3ug/ul加在濾膜上，空白對照為生理鹽水，加樣量為20ul，等濾膜吸收了樣品后， 將其放在尿囊膜上，并用透明膠布封嚴(yán)，7d以后，打開透明膠布，用固定液(甲醇丙酮= 1 1，體積比)固定3min后，用剪刀剪下濾膜周圍的尿囊膜，平鋪于培養(yǎng)皿上，用相機(jī)拍 攝。實驗結(jié)果如圖8所示，從圖中可以看出，實驗組加入了鯊魚血管抑制因子小分子 肽的樣本中血管密度明顯低于對照組，說明鯊魚血管生成抑制因子小分子肽可以抑制雞 胚絨毛尿囊膜血管生成。3.對小鼠腫瘤的抑制作用小鼠乳墊接種鼠源乳腺癌4T1腫瘤細(xì)胞，設(shè)置三個組別1)陰性對照組(生理鹽水組)8只，給0. 9%的Nacl溶液，每只每天加0. 1ml。2)陽性對照組(環(huán)磷酰胺)8只，按文獻(xiàn)給藥濃度為20mg/kg，每只每天加0. 1ml。3)給藥組8只，給藥濃度為5mg/kg，每只每天加0. Iml0給藥組和對照組均每天腹腔注射0. ImL,每天給藥1次。觀察各組的腫瘤體積和重量變化情況，結(jié)果如圖9和圖10所示，從圖中的各曲線 對比可以看出，無論是瘤體積還是瘤重量，陰性對照組都明顯高于陽性對照組和實驗組。而 且實驗組的作用結(jié)果接近或好于陽性對照組。本發(fā)明鯊魚血管生成抑制因子小分子肽對小 鼠乳腺癌4T1腫瘤細(xì)胞的生長是有明顯的抑制作用的。
權(quán)利要求
一種鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽，含有33個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽的DNA序列，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO 2 所示。
3. 一種重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體含有權(quán)利要求2所述的DNA序列。
4. 一種重組微生物，其特征在于所述重組微生物是權(quán)利要求3所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備得到。
5.權(quán)利要求1所述鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽的生產(chǎn)純化方法，其特征在于包 括如下步驟(1)分別以-SUMO和鯊魚血管抑制因子全長基因序列為模板，設(shè)計引物，引物序列如 SEQ ID NO :12 15所示；通過PCR擴(kuò)增，得到兩段基因序列，將兩段基因連接在一起，經(jīng)酶 切后與表達(dá)載體PET3C連接，得到重組表達(dá)載體；(2)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，挑取單克隆接種到培養(yǎng)基 中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后做電泳，選取表達(dá)量高的作為發(fā)酵種子；(3)將表達(dá)量高的克隆接種到培養(yǎng)基中發(fā)酵，離心所得發(fā)酵菌體，收集細(xì)胞、破碎、離心 后得到上清，用Ni-NTA柱進(jìn)行純化，得到含有SUMO標(biāo)簽的鯊魚血管生成抑制因子小分子多 肽；(4)將表達(dá)量高的克隆接種到培養(yǎng)基中發(fā)酵，離心所得發(fā)酵菌體，收集細(xì)胞、破碎、離心 后得到上清，用Ni-NTA柱進(jìn)行純化，得到含有SUMO標(biāo)簽的鯊魚血管生成抑制因子小分子多 肽；在含有SUMO標(biāo)簽的鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽加入SUMO酶，SUMO酶與小分子 多肽的體積比為1 100，得到鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽。
6.權(quán)利要求1所述鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽在抑制血管和血管內(nèi)皮細(xì)胞的 生產(chǎn)或生長中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽在制備抑制血管生成或生長的 藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽在制備抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生成 或生長的藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽及其生產(chǎn)純化方法和應(yīng)用。本發(fā)明鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，編碼該小分子多肽的DNA序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明鯊魚血管生成抑制因子小分子多肽可以抑制血管和血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成或生長，還可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，可用于制備抑制血管生成或生長相關(guān)藥物，或用于制備抗腫瘤藥物。
文檔編號C07K14/475GK101899104SQ201010191509
公開日2010年12月1日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者梁旭方, 洪岸, 謝秋玲, 陳小佳 申請人:暨南大學(xué)