富勒烯單加成線肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種富勒烯單加成線肽及其制備方法和其在清除自由基方面的應(yīng)用，N-取代富勒烯單加成吡咯烷與只有一個活性羧基的酸性氨基酸在DCC、HOBT、DMAP的存在下，用液相合成法進行縮合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，硅膠柱層析分離純化，產(chǎn)物經(jīng)脫保得到僅含氨基保護基富勒烯單加成氨基酸，僅含氨基保護基富勒烯單加成氨基酸的活性羧基與樹脂-多肽上的活性氨基用固相合成法進行縮合反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)脫保，裂解得到富勒烯單加成多肽，大大提高肽的穩(wěn)定性及富勒烯的水溶性，還可以用來連接不同的多肽（如抗體或表面受體），隨著功能肽的變換而獲得不同的生物學(xué)活性，具有良好的抗癌活性和清除自由基的能力。
【專利說明】富勒烯單加成線肽及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種富勒烯單加成線肽及其制備方法，該化合物 大大的提高了富勒烯在極性溶液中的溶解度，提高了生物學(xué)利用度及其對細胞的靶向性問 題。

【背景技術(shù)】
[0002] 富勒烯C6tl因具有特殊的物理、化學(xué)性質(zhì)顯示了較獨特的生物學(xué)活性，可歸納為光 敏性作用與非光敏性作用。前者與富勒烯球籠受光誘導(dǎo)在氧存在時產(chǎn)生單線態(tài)氧等自由基 有關(guān)，包括光激發(fā)的DNA斷裂、細胞膜損傷和細胞毒性等。不斷增加的研究資料顯示富勒烯 衍生物在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有相當廣泛的應(yīng)用前景，如作為光動力學(xué)治療中的光敏劑、抗衰 老藥物、反義核酸藥物和藥物載體，其光敏作用的研究與應(yīng)用逐漸成為富勒烯研究的前沿 和熱門方向。越來越多的研究表明富勒烯量子產(chǎn)額高，比目前臨床應(yīng)用的光敏劑效果好得 多，且對正常皮膚、小鼠體重及血液中一些酶含量基本上沒有影響，為富勒烯作為腫瘤動力 學(xué)治療中的光敏劑提供了理論依據(jù)；但也有不同的研究結(jié)論，還需要進一步深入系統(tǒng)地研 究來證實。
[0003] 不同的多肽具有不同的生物功能和用途，常用的功能肽有R⑶肽、PHLATLF肽 和TISWPPR肽等，短肽PHLATLF對卵巢癌A2780細胞具有生長抑制作用，TISWPPR這個七 肽（TR-7)對大腸癌有特異性親和作用，主要是對腫瘤干細胞的特異性標記分子CD133有 特異性的高親和作用，對腫瘤細胞的增殖能力及粘附能力沒有顯著影響，對腫瘤細胞的 遷移運動能力有顯著的抑制作用。其中RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (Arg-Gl y-Asp)3個氨基酸的小分子多肽，可以與在某些腫瘤細胞高表達的整合素α ν β 3分 子發(fā)生特異性結(jié)合，α ν β 3在正常組織系統(tǒng)極少表達甚至不表達，也使其成為腫瘤靶向治療 理想的靶點。配體RGD與ανβ 3受體結(jié)合的特異性強，親和力高，是有效的藥物載體。
[0004] 基于以上系列研究基礎(chǔ)，我們擬設(shè)計合成一種新型的富勒烯衍生物的納米光敏 齊U。為富勒烯修飾的RGD肽：FP (RGD)，這樣一方面可以增加肽的穩(wěn)定性及富勒烯的水溶 性，充分發(fā)揮RGD肽的生物活性，從而獲得腫瘤靶向的光敏劑；另一方面，建立的實驗方法 還可以用來連接不同的多肽(如抗體或表面受體)，隨著功能肽的變換而獲得不同的生物學(xué) 活性。富勒烯光動力學(xué)研究有不少報道，但合成的化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很少有在生物學(xué)方面進 一步系統(tǒng)的研究，對于這種富勒烯衍生物的納米顆粒的光敏性等抗腫瘤活性研究更是未見 報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是體供一種富勒烯單加成線肽的制備方法，大大提高了富勒烯在極 性溶液中的溶解度，且具有良好的抗癌活性和清除自由基的能力。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種富勒烯單加成線肽，結(jié)構(gòu)式如 下：

【權(quán)利要求】
1. 一種富勒烯單加成線肽，其特征在于結(jié)構(gòu)式如下：
其中L為RGD肽、TISWPPR肽和PHLATLF肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富勒烯單加成線肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) N-取代富勒烯單加成吡咯烷與只有一個活性羧基的酸性氨基酸在DCC、HOBT、DMAP 的存在下，在氮氣保護下，用液相合成法進行縮合反應(yīng)，室溫避光攪拌反應(yīng)24~72小時，反 應(yīng)結(jié)束后，硅膠柱層析分離純化得到氨基和羧基均被保護的富勒烯單加成氨基酸； (2) 將氨基和羧基均被保護的富勒烯單加成氨基酸加入TFA/DCM的混合溶液中，室溫 攪拌反應(yīng)〇. 5~12h，經(jīng)脫保脫除羧基保護基得到僅含氨基保護基的富勒烯單加成氨基酸； (3) 將僅含氨基保護基富勒烯單加成氨基酸溶于DMF/DCM混合溶劑中，然后加入樹 脂-線肽、HBTU、HOBT和DIEA，在室溫下用固相合成法進行縮合反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)脫保、裂解得到 富勒烯單加成線肽； 以上各個步驟均在無水無氧的條件下進行； 所述步驟（1)中的只有一個活性羧基的酸性氨基酸為天冬氨酸或谷氨酸； 所述步驟（3)中的樹脂-線肽為樹脂-RGD肽、樹脂-TISWPPR肽或樹脂-PHLATLF肽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富勒烯單加成線肽的制備方法，其特征在于：所述步驟（1)中 N-取代富勒烯單加成吡咯烷、只有一個活性羧基的酸性氨基酸、DCC、HOBT和DMAP的物質(zhì)的 量之比為 〇? 05-0. 2:2:2:2:0. 2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富勒烯單加成線肽的制備方法，其特征在于：所述步驟（2)中 TFA/DCM的混合溶液中TFA和DCM的體積比為0. 2-9:1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富勒烯單加成線肽的制備方法，其特征在于：所述步驟（3)中 僅含氨基保護基的富勒烯單加成氨基酸、樹脂-線肽、HBTU、HOBT和DIEA的物質(zhì)的量之比 為 2:1-6:2:2:4。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富勒烯單加成線肽的制備方法，其特征在于：所述步驟（3)中 DMF/DCM混合溶劑中DMF和DCM的體積比為1:1。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富勒烯單加成線肽的制備方法，其特征在于：所述步驟（3)在 室溫下用固相合成法進行縮合反應(yīng)是在140r/min的條件下振蕩8-24h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富勒烯單加成線肽的制備方法，其特征在于：所述步驟（3)中 脫保所用試劑為哌啶/DMF的混合溶液，其中哌啶和DMF的體積比為1:4,在室溫、140r/min 的條件下振蕩15~30min。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富勒烯單加成線肽的制備方法，其特征在于：所述步驟（3)中 裂解所用試劑為TFA/TIS/H20的混合溶液，其中TFA、TIS和H20的體積比為95:2:3,在室 溫、140r/min的條件下振蕩2-4h。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富勒烯單加成線肽得到的納米體系及其在清除自由基方面 的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K7/06GK104478994SQ201410839223
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月30日
【發(fā)明者】張靜, 張曉磊, 何婷 申請人:鄭州大學(xué)