一種超高壓提取北蟲草大米培養(yǎng)基中蟲草素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種超高壓提取北蟲草大米培養(yǎng)基中蟲草素的方法，屬于天然產(chǎn)物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的工藝流程包括對北蟲草培養(yǎng)基進(jìn)行切片、熱風(fēng)干燥、粉碎、超高壓提取、離心、陶瓷膜除雜、濃縮、冷凍干燥，再采用高速逆流色譜純化蟲草素，最后通過高效液相色譜進(jìn)行檢測。采用本方法，北蟲草培養(yǎng)基中蟲草素的得率達(dá)到常規(guī)方法的1.2倍，純度可達(dá)90%以上。本發(fā)明采用超高壓提取蟲草素具有高效低耗、提取率高、雜質(zhì)含量低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，而且整個提取過程不會產(chǎn)生高溫，可有效保留蟲草素活性成分及結(jié)構(gòu)。本方法所制備的蟲草素安全無污染，具有很高的食（藥）用價(jià)值，為食用菌北蟲草副產(chǎn)物的綜合利用帶來了一定的市場應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】一種超高壓提取北蟲草大米培養(yǎng)基中蟲草素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體的涉及一種快速高效提取北蟲草大米培養(yǎng)基中蟲草素的方法，屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】。采用超高壓提取北蟲草培養(yǎng)基中蟲草素，并且利用陶瓷膜對提取液進(jìn)行初步除雜，最后采用高速逆流色譜制備高純度的蟲草素。

【背景技術(shù)】
[0002]北蟲草，作為一種藥(食)用菌，與冬蟲夏草具有相似的作用，已被我國人民認(rèn)可并廣泛接受。隨著市場需求的上升，人工栽培北蟲草的技術(shù)不斷成熟并廣泛應(yīng)用于市場，取得良好的市場效應(yīng)和經(jīng)濟(jì)效益的同時，隨之產(chǎn)生的問題是采收子實(shí)體后的殘留培養(yǎng)基被廢棄于環(huán)境中導(dǎo)致腐敗變酸發(fā)臭造成污染。經(jīng)研究表明北蟲草培養(yǎng)基中存在蟲草素，并高于子實(shí)體中的含量，它具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗真菌、抗衰老和治療白血病的作用，具有可觀的醫(yī)療和商用價(jià)值。近年來，國內(nèi)外研究人員對北蟲草副產(chǎn)物的綜合利用高度重視，不斷對有效成分進(jìn)行提取分離、開發(fā)并轉(zhuǎn)化為高附加值的功能新產(chǎn)品。
[0003]超高壓提取技術(shù)應(yīng)用于提取天然有效成分的研究已有報(bào)道，而超高壓提取北蟲草培養(yǎng)基中的蟲草素在國內(nèi)外中還未見報(bào)道。目前所涉及的蟲草素提取方法已有報(bào)道的如2010年第16期《安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)》張麗艷采用正交試驗(yàn)法研究了水浸提蟲草素的工藝，所得最適參數(shù)是40°C水浸提取4次，料液比1: 20，每次提取2h ；2006年第22期《食品安全與檢測》中陳尚衛(wèi)等比較了超聲波法和回流法提取蟲草素，認(rèn)為兩者結(jié)果相近，但超聲波法操作更簡便，回流法則需要較高的溫度，但蟲草素的熱穩(wěn)定性較差；2010年第31期《食品科學(xué)》王淘則采用微波-超聲波協(xié)同提取蟲草素，充分發(fā)揮了超聲波和微波兩種提取方法的優(yōu)點(diǎn)，所以提取效率比傳統(tǒng)的方法高得多，且提取時間較短。眾所周知，水浸提法和回流法耗時長，所需溫度較高，不利于蟲草素活性的保留，技術(shù)含量低，工藝繁瑣，提取不充分等。超聲提取的提取時間和能耗大大降低，但噪音大、對人體具有輻射、規(guī)?；a(chǎn)難以實(shí)現(xiàn)等。另外，結(jié)合現(xiàn)有發(fā)表的文獻(xiàn)資料和專利可知，目前采用的蟲草素富集純化技術(shù)可歸納為:離子交換樹脂法、硅膠柱層析、超臨界流體萃取技術(shù)等。2004年第四期《食用菌》期刊中車振明等經(jīng)過對蛹蟲草子實(shí)體及培養(yǎng)基的粉碎、石油醚脫脂、80°C—85°C水浴12 h、調(diào)節(jié)等電點(diǎn)沉淀、732-NH4離子交換樹脂的分離、濃縮、4°C下低溫結(jié)晶，得到一定純度的蟲草素晶體。中國專利(CN 101906127 A)“一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法”中使用大孔樹脂吸附及洗脫，同時純化蟲草素和多糖。中國專利(CN 1339440 A)“一種超臨界萃取蟲草脫氧核苷的生產(chǎn)方法”中以蛹蟲草人工培養(yǎng)后的發(fā)酵物為原料，采用超臨界技術(shù)萃取核苷類有效成分，并以乙醇等作為夾帶劑減壓分離獲得核苷多組份及單體。傳統(tǒng)的蟲草素純化方法自動化程度不高，操作繁瑣，重現(xiàn)性不穩(wěn)定，且易造成蟲草素的吸附損耗，不易回收。目前研究者在蟲草素純化方法上另辟蹊徑，中國專利(CN 102977172A)中指出蛹蟲草粗提液可經(jīng)反相ODS填料柱吸附后得粗蟲草素采用高效液相色譜進(jìn)行純化，另外中國專利《CN 102321135 A》發(fā)明一種利用高速逆流色譜分離純化蟲草屬真菌的提取物中蟲草素的方法。然而，因進(jìn)樣量受限，不適宜大規(guī)模制備蟲草素。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明旨在提供一種超高壓提取北蟲草大米培養(yǎng)基中蟲草素的方法，該方法在保持較高的蟲草素提取率的同時，保留其原有結(jié)構(gòu)和活性不變，顯著提高效率，有效降低能耗。通過優(yōu)化工藝過程，使用本方法可使蟲草素的提取率達(dá)到0.18%以上，比常規(guī)方法所得的提取率提高了 20%，而且通過高速逆流色譜分離后純度可達(dá)到90%以上。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明人通過大量試驗(yàn)研究和不懈探索，最終獲得了如下技術(shù)方案:
一種快速高效提取北蟲草大米培養(yǎng)基中蟲草素的方法，具體步驟如下:
(1)原料粉碎:將相同批次的北蟲草大米培養(yǎng)基收集切片，并于60°c熱風(fēng)干燥至含水率低于5%，使用超微粉碎進(jìn)行粉碎，粉碎后過20 g —180目篩；
(2)超高壓處理:稱量一定質(zhì)量粉碎后的培養(yǎng)基粉末于容器中，按照料液比1:40-70加入蒸餾水，攪拌均勻使其充分潤濕，放入真空封裝機(jī)中抽真空確保容器中無氣泡，再放入超高壓的處理室，在處理室中加入加載介質(zhì)自來水，用深度尺檢測液面高度合適為止，取走深度尺后將柱塞推至加壓位置，關(guān)上超高壓主機(jī)防護(hù)門，準(zhǔn)備開始加壓。超高壓處理?xiàng)l件為:壓力300-600MPa，處理時間9_15min，處理完畢得處理液；
(3)陶瓷膜除雜:將處理液先通過150KD陶瓷膜，流速16-30mL/min，壓力
0.20bar-l.0bar，溫度23°C -30°C，保留透過液，再通過15KD陶瓷膜進(jìn)行二次除雜，流速、壓力和溫度與第一次保持一致；
(4)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮:將除雜的蟲草素提取液倒入圓底燒瓶中，設(shè)定溫度60°C進(jìn)行旋蒸，濃縮至原來的百分之一體積；
(5)冷凍干燥:將濃縮液轉(zhuǎn)移至凍干盤中后放入凍干機(jī)中，設(shè)定溫度從_3°C開始每隔2h上調(diào)2°C，直至45°C，檢查樣品凍干完全后慢減壓至ATM后推開上蓋，快速取走樣品放置于防潮避光處；
(6)高速逆流色譜純化:按比例配置溶劑體系乙酸乙酯-正丁醇-0.5%氨水(2:3:5)倒入分液漏斗中，將其反復(fù)多次振蕩搖勻，靜置10分鐘左右，即出現(xiàn)明顯分層，后將兩相移入干凈干燥的兩試劑瓶中，放置超聲震動儀中超聲脫氣20min后放至室溫。設(shè)置主機(jī)溫度28°C,然后以流速30mL/min泵入上相，再停泵以主機(jī)轉(zhuǎn)速900r/min、流速3mL/min泵入下相，當(dāng)體系達(dá)到動力學(xué)平衡后開啟檢測器，基線穩(wěn)定后開始手動注入提前用各5mL體積上、下相溶解的蟲草素樣品，檢測波長254nm，同時進(jìn)行圖譜采集，根據(jù)譜圖峰形手動收集色譜組分；
(7)高效液相色譜定量分析:將收集好的組分分別過0.45 μ m濾膜后進(jìn)入1.5mL棕色進(jìn)樣瓶中，色譜條件為:色譜柱C18柱(250mm X 2.6mm, 5um);流動相為乙腈-水(5:95);體積流量lmL/min ;進(jìn)樣量10 μ L ;檢測波長260nm ;柱溫35°C。
[0006]本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn):
(I)本發(fā)明的主要優(yōu)勢是，超高壓處理可以維持在接近常溫下溶出有效成分，從而使有效活性成分得到保存。同時，由于高壓處理可以殺滅部分微生物，可使提取和滅菌同步進(jìn)行，另外，超高壓在卸壓時壓力傳遞能瞬間完成，容器內(nèi)任何方向和位置的壓力相等，作用在物料上的力是均勻一致的。
[0007]( 2 )本發(fā)明中北蟲草培養(yǎng)基不同的粉碎目數(shù)對超高壓設(shè)備提取蟲草素含量和得率的影響顯著，最終優(yōu)化的結(jié)果是粉碎過20目篩的培養(yǎng)基粉末經(jīng)過超高壓提取后含量和得率均最高，即在本發(fā)明中證實(shí)超高壓設(shè)備提取北蟲草培養(yǎng)基中蟲草素時并非是粉碎至越細(xì)越有利于蟲草素的溶出，相反，粉碎越細(xì)的物料在提取過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)更多，蟲草素的含量和得率反而下降。
[0008](3)陶瓷膜分離設(shè)備以“錯流過濾”這獨(dú)有的技術(shù)優(yōu)勢可有效去除樣品溶液中大量存在的可溶性蛋白、膠體、雜質(zhì)多糖、亞微米微粒等；且膜分離材料無毒、無污染，無需額外助劑，可實(shí)現(xiàn)安全清潔生產(chǎn)；分離精度高，通過透析循環(huán)，可提高蟲草素收率。
[0009]( 4 )高速逆流色譜無需固體作固定相，不存在固體對樣品組分的吸附、玷污、變性、失活、拖尾等現(xiàn)象，能實(shí)現(xiàn)很高的回收率，節(jié)省昂貴的材料消耗和溶劑消耗；溶劑極性可調(diào)，無需更換不同極性的色譜柱即可實(shí)現(xiàn)流動相從弱極性到強(qiáng)極性或相反的轉(zhuǎn)化；色譜柱無填料，柱內(nèi)空間全部是有效空間，容積大，樣品負(fù)載能力強(qiáng)，制備量大，重現(xiàn)性好，可以快速分離蟲草素，得到高純度蟲草素溶液。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]附圖1是蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0011]附圖2是蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖。
[0012]附圖3是超高壓提取后蟲草素粗品的高效液相色譜圖。
[0013]附圖4是超聲波提取后蟲草素粗品的高效液相色譜圖。
[0014]附圖5是超高壓提取液透過陶瓷膜后蟲草素的高效液相色譜圖。
[0015]附圖6是高速逆流色譜分離蟲草素圖譜。
[0016]附圖7是高速逆流色譜純化后蟲草素樣品的物質(zhì)的高效液相色譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0017]本發(fā)明的步驟是:對北蟲草培養(yǎng)基進(jìn)行粉碎，超高壓處理后，通過陶瓷膜分離初步除雜后，將澄清液液移置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，在冷凍干燥機(jī)中干燥后取樣進(jìn)入高速逆流色譜中進(jìn)行純化得到高純度蟲草液，最后用高效液相色譜進(jìn)行定量分析。
[0018]下面用具體實(shí)施例詳述本發(fā)明:
實(shí)施例一
取粉碎后過20目篩的北蟲草培養(yǎng)基粉末30.0g于可密封的塑料容器中，按料液比為I:70加入蒸餾水后，攪拌均勻使其充分潤濕，使用真空包裝機(jī)脫氣以確保容器中無氣泡，后放入超高壓處理裝置中，在處理室中加入加載介質(zhì)自來水，用深度尺檢測液面高度合適為止，取走深度尺后將柱塞推至加壓位置，關(guān)上超高壓主機(jī)防護(hù)門，準(zhǔn)備開始加壓。設(shè)置壓力400MPa，保壓時間15min，處理完畢卸壓后，取出容器，倒出提取液離心(4000r/min，1min),棄殘?jiān)贸邏禾崛∫骸?br> [0019]采用高效液相色譜法對超高壓提取清液中蟲草素的含量進(jìn)行了測定，色譜條件為:色譜柱C18柱(250mmX 2.6mm, 5um);流動相為乙腈-水(5:95);體積流量lmL/min ;進(jìn)樣量1uL ;檢測波長260nm ;柱溫35°C。其色譜圖參見圖1至圖3。
[0020]從色譜圖中我們可以看出，超高壓提取液中物質(zhì)很雜，特別是高效液相色譜圖前面部分有很多雜質(zhì)峰，但盡管如此，在14.610min仍有一很高的色譜峰，其保留時間與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖(圖2)相一致，這就是蟲草素，峰表顯示含量為44.86%，通過蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及峰面積歸一法計(jì)算其提取得率為1843.49ug/g，與常規(guī)方法超聲波提取蟲草素相比(見圖4)，其提取得率為1586.69ug/g，且耗時少，含量高。由于蟲草素粗提品含有較多的雜質(zhì)，直接用于高速逆流色譜進(jìn)行分離純化難度比較大，于是將超高壓提取液先通過150KD陶瓷膜，流速20mL/min，壓力0.40bar，溫度28°C，保留透過液，再通過15KD陶瓷膜進(jìn)行二次除雜，頻率、壓力和溫度與第一次保持一致。采用高效液相色譜法對陶瓷膜透過液中蟲草素的含量進(jìn)行了測定(見圖5)，圖譜顯示色譜圖前面的雜質(zhì)峰有減少，且含量提高到了49.56%。透過液再旋轉(zhuǎn)濃縮至原來體積的百分之一，使用凍干機(jī)干燥得超高壓提取蟲草素粗品 1.436g。
[0021]蟲草素粗提物樣品加入1mL上相和1mL下相使其溶解，按比例配置溶劑體系乙酸乙酯-正丁醇-水(2:3:5)倒入分液漏斗中，將其反復(fù)多次振蕩搖勻，靜置10分鐘左右，即出現(xiàn)明顯分層，后將兩相移入干凈干燥的兩試劑瓶中，放置超聲震動儀中超聲脫氣20min后放至室溫。設(shè)置主機(jī)溫度28°C，然后以流速30mL/min泵入上相，再停泵以主機(jī)轉(zhuǎn)速900r/min、流速3mL/min泵入下相，當(dāng)體系達(dá)到動力學(xué)平衡后開啟檢測器，基線穩(wěn)定后開始手動注入提前用各5mL體積上、下相溶解的蟲草素樣品，檢測波長254nm，同時進(jìn)行圖譜采集，根據(jù)圖譜峰形手動收集93.00Γ111.583min的流出組分共計(jì)約65mL，見圖6。然后用一次性注射器吸取各組分過0.45um濾膜至1.5mL進(jìn)樣瓶中，最后用高效液相色譜進(jìn)行定量分析，見圖7，經(jīng)測定確定峰C為蟲草素峰，在260nm波長下檢測峰純度為97.58%。
[0022]實(shí)施例二
與實(shí)施例一不同的是:使用的北蟲草培養(yǎng)基粉末粉碎過60目篩，最后測得其含量為41.09%，超高壓提取得率為1558.556ug/g，凍干后超高壓提取蟲草素粗品質(zhì)量為1.311g，干燥的蟲草素粗品經(jīng)過逆流色譜分離后純度為94.02%。
[0023]實(shí)施例三
與實(shí)施例一不同的是:使用的北蟲草培養(yǎng)基粉末粉碎過60目篩,壓力為600Mpa,最后測得超高壓提取液中蟲草素含量為40.57%，提取得率為1393.71ug/g，凍干后超高壓提取蟲草素粗品質(zhì)量為1.142g，干燥的蟲草素粗品經(jīng)過逆流色譜分離后純度為91.82%。
[0024]實(shí)施例四
與實(shí)施例一不同的是:使用的北蟲草培養(yǎng)基粉末粉碎過120目篩，最后測得超高壓提取液中蟲草素含量為37.44%，提取得率為1418.57ug/g,凍干后超高壓提取蟲草素粗品質(zhì)量為1.259g,干燥的蟲草素粗品經(jīng)過逆流色譜分離后純度為90.25%。
[0025]實(shí)施例五
與實(shí)施例一不同的是:使用的北蟲草培養(yǎng)基粉末粉碎過120目篩,在壓力600Mpa下提取9min，最后測得其含量為33.53%，超高壓提取得率為291.60ug/g，鑒于得率太低，最后沒有再經(jīng)過陶瓷膜除雜用高速逆流色譜分離的必要了。
【權(quán)利要求】
1.一種超高壓提取北蟲草大米培養(yǎng)基中蟲草素的方法，其特征在于具體步驟如下: (1)原料預(yù)處理:將相同批次北蟲草大米培養(yǎng)基收集后切片，并于60°c熱風(fēng)干燥至含水率低于5%，粉碎過20目篩-180目篩； (2 )超高壓處理:將過篩后的培養(yǎng)基粉配置一定的料液比，真空脫氣后放入超高壓設(shè)備進(jìn)行處理，壓力300-600MPa，處理后離心得提取液； (3)陶瓷膜分離:將提取液通過陶瓷膜除雜，得到透過液； (4)旋轉(zhuǎn)濃縮:透過液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對上述處理液在溫度60°C下進(jìn)行濃縮，濃縮至原來體積的百分之一，得到濃縮液； (5)冷凍干燥:將濃縮液放入凍干機(jī)中干燥，溫度從_3°C_45°C，每隔2h均勻上調(diào)，時間 24-26h ； (6)高速逆流色譜制備:取凍干樣品于逆流色譜中制備高純度蟲草素； (7)高效液相色譜測定:HPLC測定蟲草素含量，色譜條件:色譜柱C18柱，流動相是乙腈:水=5:95,流速1.011117111；[11,柱溫351€,進(jìn)樣量 10uL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超高壓提取北蟲草大米培養(yǎng)基中蟲草素的方法，其特征在于步驟(1)中北蟲草大米培養(yǎng)基粉碎后過20目篩。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超高壓提取北蟲草大米培養(yǎng)基中蟲草素的方法，其特征在于步驟(2)中超高壓處理?xiàng)l件為:溫度為常溫，處理時間9-15min，料液比(g/L)為1:40-70。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超高壓提取北蟲草大米培養(yǎng)基中蟲草素的方法，其特征在于步驟(3)中陶瓷膜分離條件為:將處理液先通過150KD陶瓷膜，流速16-30mL/min，壓力0.20bar-l.0bar，溫度23°C -30°C，保留透過液，再通過15KD陶瓷膜進(jìn)行二次除雜，流速、壓力和溫度與第一次保持一致。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超高壓提取北蟲草大米培養(yǎng)基中蟲草素的方法，其特征在于步驟(6)中高速逆流色譜條件為:溶劑系統(tǒng)V (乙酸乙酯):V (正丁醇):V (水)=1?2:3?4:5，主機(jī)轉(zhuǎn)速700-900r/min，流速2.5_4mL/min，分離溫度15_35°C，進(jìn)樣體積最大為 20mL。
【文檔編號】C07H1/06GK104447925SQ201410686548
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】程薇, 高虹, 陳麗冰, 吳光旭, 史德芳, 范秀芝, 郭鵬, 陳明利, 薛淑靜, 楊德, 喬宇, 汪蘭, 吳文錦, 李露 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所