專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種縮短北蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)周期的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：-本發(fā)明涉及快速培養(yǎng)北蟲(chóng)草子實(shí)體的方法，進(jìn)一歩將是提供一種可以縮短北蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)周期的培育方法，屬于生物菌類(lèi)培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：北蟲(chóng)草(Cordycepsmilitaris)是指真菌的菌絲通過(guò)各種方法侵染鱗翅目昆蟲(chóng)，以昆蟲(chóng)體內(nèi)的物質(zhì)行寄生生活，通過(guò)不斷的發(fā)育和分解后最終伸出昆蟲(chóng)體表，而形成的一種真菌與蟲(chóng)體外殼共存的生物體。其主要功效成份蟲(chóng)草素明顯高于冬蟲(chóng)夏草。隨著人們生活水平的提高及保健意識(shí)的增強(qiáng)，做為保健、藥品主要原料之一的蟲(chóng)草需求量R益增加，加之蟲(chóng)草的采集，嚴(yán)重破壞了野生植被。蟲(chóng)草屬?lài)?guó)家明令禁止野外采集并加以保護(hù)的野生物種資源。為了滿(mǎn)足市場(chǎng)的需求，人工培養(yǎng)北蟲(chóng)草已成為當(dāng)前的發(fā)展趨勢(shì)。而目前國(guó)家普遍采用cordycepsmiltitaris菌株為北蟲(chóng)草生產(chǎn)菌，該菌株在固體培養(yǎng)子實(shí)體的生長(zhǎng)過(guò)程中存在著生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，大約40d到50d左右，給生產(chǎn)管理及提高單位產(chǎn)量都帶來(lái)了一定的制約。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種可以縮短北蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)周期的培育方法,應(yīng)用納米技術(shù)使植物生長(zhǎng)素緩慢釋放，目的旨在快速高產(chǎn)培養(yǎng)固體北蟲(chóng)草子實(shí)體，在保證北蟲(chóng)草子實(shí)體的營(yíng)養(yǎng)成份不變的基礎(chǔ)上縮短生長(zhǎng)周期同時(shí)，將植物生長(zhǎng)素的噴灑次數(shù)降至最低，從而提高北蟲(chóng)草子實(shí)體的產(chǎn)量，減低勞動(dòng)。本發(fā)明的技術(shù)解決方案包括以下操作歩驟1.北蟲(chóng)草的培宵①馬鈴薯培養(yǎng)基②將北蟲(chóng)草菌株接種于PDA斜面，26'C恒溫箱中培養(yǎng)7天，向斜面試管中注入無(wú)菌生理鹽水，振蕩后用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾，制成濃度約為3*107個(gè)/11^的孢子懸液。③栽培培養(yǎng)基85份大米+15份蛹粉，含水量65%，分裝于玻璃瓶?jī)?nèi)，121°C35分鐘滅菌備用。④用滅過(guò)菌的槍頭將制好的孢子懸液加入米飯培養(yǎng)基，每罐頭瓶培養(yǎng)基加2mL孢子懸液(孢子濃度為3"(^個(gè)/mL)，后用滅過(guò)菌的竹筷將米飯攪拌均勻，用封口膜封好，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室培養(yǎng)。溫度控制在23t:左右，空氣相對(duì)濕度為60%左右，黑暗培養(yǎng)，菌絲封底后室內(nèi)增加散射光，培養(yǎng)料表面或四周有桔黃色色素形成，即進(jìn)入子實(shí)體管理時(shí)期。⑤菌絲轉(zhuǎn)色完成后，為刺激子實(shí)體原基形成，增加光照和溫差刺激，每天光照不少于10h，溫度19-25°C，相對(duì)濕度60-80%，每天通風(fēng)10min以補(bǔ)充新鮮空氣，蛹蟲(chóng)草子座長(zhǎng)出后，增加光照強(qiáng)度，在500-700lx的散射光照，溫度保持23'C左右，空氣濕度65%左右，每天通風(fēng)換氣3次，每次10min。2.羥基磷灰石納米粒子一植物生長(zhǎng)素制備及噴灑①溶液配置溶液A配制準(zhǔn)確稱(chēng)取無(wú)水乙酸鈣0.705g，加重蒸水定容至10ml，搖勻備用；溶液B配制準(zhǔn)確稱(chēng)取磷酸二氫銨1.381g,乙酸銨4.008g，加重蒸水45ml，用濃氨水調(diào)節(jié)pH值在7.6左右，補(bǔ)加重蒸水定容至50ml，搖勻備用；②羥基磷灰石納米粒子一植物生長(zhǎng)素制備步驟l準(zhǔn)確稱(chēng)取赤霉素lmg，溶液B溶解，緩慢攪拌；步驟2將溶液A逐漸滴加到溶液B中，保持反應(yīng)體系溫度在37±rC，pH值7.4±0.2之間，緩慢攪拌l小時(shí)；步驟3反應(yīng)液4。C下10000rpm/min離心15分鐘；步驟4離心后沉淀室溫下干燥48小時(shí)，4'C保存。③稱(chēng)取羥基磷灰石納米粒子一植物生長(zhǎng)素0.28，用水定容1000ml，備用。④在培養(yǎng)瓶培養(yǎng)大約7天左右，即己從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段向生殖生長(zhǎng)階段過(guò)渡時(shí)，將0.1%的植物生長(zhǎng)素噴灑在菌表面。由于羥基磷灰石納米粒子一植物生長(zhǎng)素具有緩慢釋放作用，因此在北蟲(chóng)草生活周期中只需要噴灑一次。⑤培養(yǎng)至26天左右，子實(shí)體可長(zhǎng)高到8-9cm左右，即可下架采摘。為表明本發(fā)明的積極效果，通過(guò)以下單因素實(shí)驗(yàn)(包括不同培養(yǎng)原料、培養(yǎng)基含水量、PH值和不同溫度、光照對(duì)子實(shí)體干重及質(zhì)量的影響)對(duì)北蟲(chóng)草固體培養(yǎng)條件進(jìn)行比較原料選擇不同的原料，復(fù)合原料均為9份大米+l份的其他原料(大米+蛹、大米、麥粒、玉米饈、大米+麥鼓、大米+豆粉)，每條件處理10瓶。計(jì)算平均產(chǎn)量，即子實(shí)體的干重(g/瓶)。蛹粉濃度優(yōu)化在原料優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察蛹粉不同濃度對(duì)栽培的影響，每條件處理10瓶。原料含水量選擇85份大米+15份蛹粉作為原料，每瓶固體原料40g，加不同體積的水設(shè)置不同含水量，每條件處理10瓶。pH值栽培原料為85份大米+15份蛹粉。用in/。NaOH和P/。HCl調(diào)節(jié)水的pH。使原料起始pH分別為3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，每條件處理10瓶。溫度將接種的栽培瓶分別在23'C,暗恒溫培養(yǎng)至瓶底轉(zhuǎn)色后，分別置不同溫度，室內(nèi)散射光培養(yǎng)出草，每條件處理10瓶。光照強(qiáng)度采用不同密度的遮陽(yáng)網(wǎng)設(shè)置不同強(qiáng)度的光照，將黑暗發(fā)菌至瓶底轉(zhuǎn)色的栽培瓶，置不同光照下培養(yǎng)出草，每條件處理10瓶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論1、不同栽培原料對(duì)蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響栽培原料對(duì)北蟲(chóng)草生長(zhǎng)影響很大，結(jié)果表明(表.l)，大米和大米復(fù)合原料所產(chǎn)了實(shí)體的綜合質(zhì)量明顯好于其他原料；從產(chǎn)量上看，單一原料以大米為最好，平均每瓶(40g原料)產(chǎn)干蟲(chóng)草3.84g;復(fù)合原料以大米+蛹粉產(chǎn)量最高，平均每瓶(40g原料)產(chǎn)干蟲(chóng)草《76g。表1栽培原料對(duì)北蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響海瓶子實(shí)體干重<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2、不同蛹粉濃度對(duì)北蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響由實(shí)驗(yàn)可知，添加蛹酚可有效增加北蟲(chóng)草子實(shí)體產(chǎn)量，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察不同蛹粉濃度對(duì)蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響(結(jié)果見(jiàn)表2)。結(jié)果表明，蛹粉的濃度在5%-15%時(shí)蟲(chóng)草栽培的子實(shí)體質(zhì)量好，產(chǎn)量均有明顯的提高，15%時(shí)產(chǎn)量最高，子實(shí)體干重為4.79g;濃度為25%時(shí)，表現(xiàn)出草遲緩，產(chǎn)量降低。表.2蛹粉不同濃度對(duì)北蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響/%_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>子實(shí)體評(píng)價(jià)+++++++++++子實(shí)體產(chǎn)量/g4.394.644.794.421.023、不同原料含水量對(duì)北蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響含水量對(duì)蟲(chóng)草子實(shí)體產(chǎn)量影響很大(表3)，以大米+蛹粉為原料栽培生產(chǎn)，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)知含水量在65%時(shí)有較高的子實(shí)體產(chǎn)量，質(zhì)量也好。表3原料含水量對(duì)北蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響含水量455055606570菌絲體發(fā)育周期/d333435353543子實(shí)體質(zhì)量評(píng)價(jià)++++++++++++++子實(shí)體產(chǎn)量/g4.074.334.394.694.853.194、不同pH值對(duì)蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響以85份大米+15份蛹粉為原料栽培生產(chǎn)，含水量定為65%，從表4.4數(shù)據(jù)可知，蟲(chóng)草對(duì)pH的適應(yīng)范圍較廣，在原料起始pH在3.5-8.5均可生長(zhǎng)出子實(shí)體，其最適宜pH為7.5。表4不同pH值對(duì)北蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響3.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.5子實(shí)體質(zhì)量評(píng)價(jià)+++++++++++++++++++++++++子實(shí)體產(chǎn)量/g0.851.483.254.024.444.564.794.754.923.761.745、不同溫度對(duì)北蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響應(yīng)用前面優(yōu)化出的最佳條件培養(yǎng)，考察不同溫度變化對(duì)北蟲(chóng)草子實(shí)體產(chǎn)量的影響。由表4.5知在溫度為13-27°〇范圍均可出草，23'C為蟲(chóng)草最適溫度，此時(shí)北蟲(chóng)草子實(shí)體干重為4.93g。表5溫度對(duì)北蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響溫度1315171921232527子實(shí)體質(zhì)量評(píng)價(jià)+++++++++++++++++++子實(shí)體產(chǎn)量/g1.952.863.424.224.734.933.841.426、不同光照強(qiáng)度對(duì)北蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響光照對(duì)北蟲(chóng)草了實(shí)體的生長(zhǎng)影響很大(表6)。黑暗處理不產(chǎn)生子實(shí)體；連續(xù)光照與問(wèn)隔光照均能產(chǎn)生子實(shí)體；在500-700lx的散射光照處理的子實(shí)體產(chǎn)量最高。表6光照對(duì)北蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>得到人工栽培北蟲(chóng)草菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件為原料為85份大米+15份蛹粉，原料的最適含水量為65%，子實(shí)體最適生長(zhǎng)溫度為23°C;最適pH為7.5，黑暗培養(yǎng)不利于子實(shí)體生長(zhǎng)，在500-7001x的散射光照時(shí)產(chǎn)量最高。7、噴灑赤霉素與不噴灑赤霉素北蟲(chóng)草固體培養(yǎng)子實(shí)體效果比較制備羥基磷灰石納米粒子一赤霉素，可使赤霉素包裹在羥基磷灰石納米粒子孔徑中，起到緩慢釋放的作用，從而在整個(gè)北蟲(chóng)草生長(zhǎng)周期中，僅需噴灑羥基磷灰石納米粒子一赤霉素一次。分別在培養(yǎng)瓶培養(yǎng)大約7天，將羥基磷灰石納米粒子—赤霉素噴灑在菌表面；繼續(xù)在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，直至子實(shí)體生長(zhǎng)己有2cm高左右時(shí)，在子實(shí)體表面噴灑一次。表7噴灑赤霉素對(duì)北蟲(chóng)草固體培養(yǎng)子實(shí)體有效成分的有效成分<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在北蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)過(guò)程中添加植物生長(zhǎng)素后，培養(yǎng)時(shí)間縮短14天左右。菌絲體在PH6.5—一7.5時(shí)生長(zhǎng)較快。產(chǎn)量可增加1/3左右(即原來(lái)可生產(chǎn)100公斤情況下，噴灑赤霉素好后生產(chǎn)130公本發(fā)明相對(duì)現(xiàn)有北蟲(chóng)草子實(shí)體的培養(yǎng)工藝優(yōu)點(diǎn)在于可促進(jìn)北蟲(chóng)草的生理代謝機(jī)能，加快生長(zhǎng)速度，縮短了北蟲(chóng)草培養(yǎng)周期，可由目前的常規(guī)培養(yǎng)周期50天左右縮短到26天左右，產(chǎn)量可提高30%，可進(jìn)一步滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)北蟲(chóng)草的需求。圖1為發(fā)明培養(yǎng)的北蟲(chóng)草子實(shí)體照片。圖2為常規(guī)方法培育的北蟲(chóng)草子實(shí)體照片。具體實(shí)施方式為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實(shí)施例。其作用被理解為是對(duì)本發(fā)明的闡釋而非對(duì)本發(fā)明的任何形式的限制。實(shí)施例1一、北蟲(chóng)草的培養(yǎng)①馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)配置②將北蟲(chóng)草菌株接種于PDA斜面，26'C恒溫箱中培養(yǎng)7天，向斜面試管中注入無(wú)菌生理鹽水，振蕩后用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾，制成濃度約為3"(^個(gè)/mL的孢子懸液。③栽培培養(yǎng)基85份大米+15份蛹粉，含水量65%，分裝于玻璃瓶?jī)?nèi)，121°C35分鐘滅菌備用。④用滅過(guò)菌的槍頭將制好的孢子懸液加入米飯培養(yǎng)基，每罐頭瓶培養(yǎng)基加2mL孢子懸液(孢子濃度為3"(^個(gè)/mL)，后用滅過(guò)菌的竹筷將米飯攪拌均勻，用封口膜封好，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室培養(yǎng)。溫度控制在23"C左右，空氣相對(duì)濕度為60%左右，黑暗培養(yǎng)，菌絲封底后室內(nèi)增加散射光，培養(yǎng)料表面或四周有桔黃色色素形成，即進(jìn)入子實(shí)體管理時(shí)期。⑤菌絲轉(zhuǎn)色完成后，為刺激子實(shí)體原基形成，增加光照和溫差刺激，每天光照不少于10h，溫度19-25'C，相對(duì)濕度60-80%，每天通風(fēng)10min以補(bǔ)充新鮮空氣，蛹蟲(chóng)草子座長(zhǎng)出后，增加光照強(qiáng)度，溫度保持20-23'C左右，空氣濕度60-85%左右，每天通風(fēng)換氣3次，每次10min。二、添加植物生長(zhǎng)素羥基磷灰石納米粒子一植物生長(zhǎng)素制備及噴灑①溶液配置溶液A配制準(zhǔn)確稱(chēng)取無(wú)水乙酸f丐O.705g，加重蒸水定容至10ml，搖勻備用；溶液B配制準(zhǔn)確稱(chēng)取磷酸二氫銨1.381g，乙酸銨4.008g，加重蒸水45ml，用濃氨水調(diào)節(jié)pH值在7.6左右，補(bǔ)加重蒸水定容至50ml，搖勻備用；②羥基磷灰石納米粒子一植物生長(zhǎng)素制備步驟l準(zhǔn)確稱(chēng)取赤霉素lrag，溶液B溶解，緩慢攪拌；步驟2將溶液A逐漸滴加到溶液B中，保持反應(yīng)體系溫度在37±rC，pH值7.4±0.2之間，緩慢攪拌l小時(shí)；步驟3反應(yīng)液4。C下10000rpm/min離心15分鐘；步驟4離心后沉淀室溫下干燥48小時(shí)，4'C保存。③稱(chēng)取羥基磷灰石納米粒子一植物生長(zhǎng)素0.2g，用水定容1000ml，備用。④在培養(yǎng)瓶培養(yǎng)大約7天左右，即已從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段向生殖生長(zhǎng)階段過(guò)渡時(shí)，將0.1%的植物生長(zhǎng)素噴灑在菌表面。由于羥基磷灰石納米粒子一植物生長(zhǎng)素具有緩慢釋放作用，因此在北蟲(chóng)草生活周期中只需要噴灑一次。⑤培養(yǎng)至26天左右，子實(shí)體可長(zhǎng)高到8-9cm左右，即可下架采摘。北蟲(chóng)草子實(shí)體產(chǎn)量:每40g固體培養(yǎng)基得北蟲(chóng)草子實(shí)體干重5.16±0.4g。參見(jiàn)圖1權(quán)利要求1、一種可以縮短北蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)周期的培育方法，具體操作步驟包括1)北蟲(chóng)草的培育①馬鈴薯培養(yǎng)基②將北蟲(chóng)草菌株接種于PDA斜面，26℃恒溫箱中培養(yǎng)7天，向斜面試管中注入無(wú)菌生理鹽水，振蕩后用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾，制成濃度約為3*107個(gè)/mL的孢子懸液；③栽培培養(yǎng)基85份大米+15份蛹粉，含水量65％，分裝于玻璃瓶?jī)?nèi)，121℃35分鐘滅菌備用；④用滅過(guò)菌的槍頭將制好的孢子懸液加入米飯培養(yǎng)基，每罐頭瓶培養(yǎng)基加2mL孢子懸液，孢子濃度為3*107個(gè)/mL，后用滅過(guò)菌的竹筷將米飯攪拌均勻，用封口膜封好，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室培養(yǎng)；溫度控制在23℃左右，空氣相對(duì)濕度為60％左右，黑暗培養(yǎng)，菌絲封底后室內(nèi)增加散射光，培養(yǎng)料表面或四周有桔黃色色素形成，即進(jìn)入子實(shí)體管理時(shí)期；⑤菌絲轉(zhuǎn)色完成后，為刺激子實(shí)體原基形成，增加光照和溫差刺激，每天光照不少于10h，溫度19-25℃，相對(duì)濕度60-80％，每天通風(fēng)10min以補(bǔ)充新鮮空氣，蛹蟲(chóng)草子座長(zhǎng)出后，增加光照強(qiáng)度，在500-700lx的散射光照，溫度保持23℃左右，空氣濕度65％左右，每天通風(fēng)換氣3次，每次10min；2)噴灑植物生長(zhǎng)素羥基磷灰石納米粒子-植物生長(zhǎng)素制備及噴灑①溶液配置溶液A配制準(zhǔn)確稱(chēng)取無(wú)水乙酸鈣0.705g，加重蒸水定容至10ml，搖勻備用；溶液B配制準(zhǔn)確稱(chēng)取磷酸二氫銨1.381g，乙酸銨4.008g，加重蒸水45ml，用濃氨水調(diào)節(jié)pH值在7.6左右，補(bǔ)加重蒸水定容至50ml，搖勻備用；②羥基磷灰石納米粒子-植物生長(zhǎng)素制備步驟1準(zhǔn)確稱(chēng)取赤霉素1mg，溶液B溶解，緩慢攪拌；步驟2將溶液A逐漸滴加到溶液B中，保持反應(yīng)體系溫度在37±1℃，pH值7.4±0.2之間，緩慢攪拌1小時(shí)；步驟3反應(yīng)液4℃下10000rpm/min離心15分鐘；步驟4離心后沉淀室溫下干燥48小時(shí)，4℃保存；③稱(chēng)取羥基磷灰石納米粒子-植物生長(zhǎng)素0.2g，用水定容1000ml，備用；④在培養(yǎng)瓶培養(yǎng)大約7天左右，即已從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段向生殖生長(zhǎng)階段過(guò)渡時(shí)，將0.1％的植物生長(zhǎng)素噴灑在菌表面；⑤培養(yǎng)至26天左右，子實(shí)體可長(zhǎng)高到8-9cm左右，即可下架采摘。全文摘要本發(fā)明提供一種可以縮短北蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)周期的培育方法，將北蟲(chóng)草菌株接種于PDA斜面，恒溫箱中培養(yǎng)制成孢子懸液；用滅過(guò)菌的槍頭將制好的孢子懸液加入米飯培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室培養(yǎng)；在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段向生殖生長(zhǎng)階段過(guò)渡時(shí)，將羥基磷灰石納米粒子—赤霉素噴灑在菌表面，應(yīng)用納米技術(shù)達(dá)到緩慢釋放赤霉素的目的，在整個(gè)北蟲(chóng)草生長(zhǎng)周期中，儀需噴灑一次；子實(shí)體生長(zhǎng)已有2cm高左右時(shí)，將羥基磷灰石納米粒子—赤霉素噴灑在子實(shí)體表面噴灑一次；培養(yǎng)至26天左右，子實(shí)體可長(zhǎng)高到8-9cm左右，即可下架采摘。本發(fā)明培育的北蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)周期縮短14天左右，產(chǎn)量可提高30％，可進(jìn)一步滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)北蟲(chóng)草的需求。文檔編號(hào)C12N1/14GK101215528SQ200810050239公開(kāi)日2008年7月9日申請(qǐng)日期2008年1月11日優(yōu)先權(quán)日2008年1月11日發(fā)明者孟繁宇申請(qǐng)人:孟繁宇