非天然共有白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了可用于控制治療劑分子對(duì)于患者的半衰期的非天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、編碼其的多核苷酸以及制備和使用這些結(jié)構(gòu)域和多核苷酸的方法。
【專利說(shuō)明】非天然共有白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域及其制備和使用方法。更具體地講，本發(fā)明涉及非 天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域共有序列及其如本文所述的變體。

【背景技術(shù)】
[0002] 經(jīng)由腎清除的生物治療劑分子快速消除導(dǎo)致有限的臨床效果或更頻繁地對(duì)患者 給藥。腎小球過(guò)濾所導(dǎo)致的腎清除與較小的生物治療劑最為相關(guān)，因?yàn)閷?duì)于分子量大于 50, 000道爾頓的分子而言腎過(guò)濾速率大大降低（Kontermann，Curr Opin Biotechnol 22 : 868-76,2011)。若干種已獲批的生物治療藥物包含本身會(huì)降至過(guò)濾極限以下并因此被快速 清除的活性部分。為了克服此限制，已引入多種技術(shù)來(lái)有效增加治療劑分子的大小以減少 腎過(guò)濾和所產(chǎn)生的半衰期。
[0003] 治療劑聚乙二醇化（PEG)是增加蛋白的流體動(dòng)力學(xué)半徑和減少腎小球過(guò)濾的有 效方法。一條或若干條PEG鏈可偶聯(lián)至蛋白，最常見的方式是通過(guò)與蛋白表面上的游離 硫醇或胺基團(tuán)共軛。腺苷脫氨酶、L-天冬酰胺酶、干擾素 a _2b、G-CSF、人類生長(zhǎng)激素、 促紅細(xì)胞生成素、尿酸酶和抗-TNFa抗體片段的聚乙二醇化型式已被批準(zhǔn)用于人類治療 (Kontermann，Curr Opin Biotechnol，22 :868_76,2011)。聚乙二醇化的缺陷包括生成異質(zhì) 產(chǎn)物并且難以控制連接到某些蛋白的PEG分子的數(shù)量。聚乙二醇化對(duì)治療性蛋白的制備引 入附加的共軛步驟以及純化步驟，從而導(dǎo)致產(chǎn)率下降以及產(chǎn)品成本增加。聚乙二醇化還可 導(dǎo)致動(dòng)物和患者的腎小管空泡，因?yàn)镻EG鏈在腎臟中是不可降解的（Gaberc-Porekar等人， Curr Opin Drug Discov Devel 11 :242_250,2008)。
[0004] 將治療劑與抗體Fc區(qū)偶聯(lián)以生成Fc-融合蛋白可用于增加治療劑分子的血清半 衰期。免疫球蛋白由于其較大的尺寸和透過(guò)FcRn的再循環(huán)可在人體內(nèi)表現(xiàn)出大約數(shù)周的 長(zhǎng)半衰期（Kuo 等人，J Clin Immunol 30 :777-789,2010)。TNF 受體 2、LFA-3、CTLA-4、 IL-IR和TPO-擬肽分子均為獲批的制備為Fc-融合物的治療劑（Kontermann，Curr Opin Bi〇techn〇l，22 :868-76,2011)。由于若干原因，F(xiàn)e-融合蛋白并非對(duì)所有治療劑類別均是 理想的。Fc區(qū)的同型二聚體性質(zhì)導(dǎo)致產(chǎn)生二聚體治療性蛋白，這可能由于受體聚簇而導(dǎo)致 細(xì)胞活化。Fc-融合物還可在比原核系統(tǒng)更昂貴的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中制成。
[0005] 除了 Fc之外，白蛋白由于FcRn再循環(huán)而表現(xiàn)出體內(nèi)長(zhǎng)半衰期。在約40g/L的濃 度下，人血清白蛋白（HSA)是存在于血液中的最豐富的蛋白。FcRn再循環(huán)導(dǎo)致人體內(nèi)約 19天的長(zhǎng)半衰期。另外，生物學(xué)分布研究表明白蛋白可在體內(nèi)分布至對(duì)于靶標(biāo)疾?。ㄖT如 發(fā)炎關(guān)節(jié)或腫瘤）而言重要的區(qū)域（Wunder等人，J Immunol 170:4793-4801,2003)。因 此，多種蛋白的血清半衰期已通過(guò)將其制備為對(duì)HSA的C-端或N-端融合物而增加。成功 的融合物包括干擾素 α (Flisiak and Flisiak，Expert Opin Biol Ther 10 :1509-1515， 2010)、人類生長(zhǎng)激素 （Osborn 等人，Eur J Pharmacol 456 :149_158, 2002)、腫瘤壞死因子 (Muller 等人，Biochem Biophys Res Commun396:793-799,2010)、凝結(jié)因子 IX(Metzner 等 人，Thromb Haemost 102 :634_644,2009)、凝結(jié)因子 VIIa(Schulte，Thromb Res 122Suppl 4 :S14-19, 2008)、胰島素 （Duttaroy 等人，Diabetes 54 :251-258, 2005)、尿激酶（Breton 等人，Eur J Biochem 231 :563_569，1995)、水輕素 （Sheffield 等人，Blood Coagul Fibrinolysis 12 :433-443,2001)和雙特異性抗體片段（Muller 等人，J Biol Chem 282 : 12650-12660,2007)。HSA融合蛋白可具有長(zhǎng)血清半衰期，然而這些融合蛋白的較大規(guī)模的 制備主要限于酵母表達(dá)系統(tǒng)。另外，HSA的大尺寸可由于空間位阻而導(dǎo)致治療劑的活性損 失。
[0006] 治療劑蛋白也可制備為與肽的融合蛋白或與血流中的血清白蛋白結(jié)合的蛋白，從 而增加其半衰期。此類白蛋白結(jié)合肽包括半胱氨酸限制性肽或白蛋白的抗體片段。Fab抗 體片段表達(dá)為與半胱氨酸限制性肽的融合物，其顯著增加了 Fab的血清半衰期（Dennis等 人，J Biol Chem，277:35035-35043,2002;US2004/0253247A1)。與靶標(biāo)同一抗原的 Fab 和 mAb分子相比，半胱氨酸限制性肽與抗體片段偶聯(lián)導(dǎo)致更佳的峰值腫瘤積聚和更均勻的腫 瘤分布（Dennis 等人，Cancer Res 67 :254-261，2007;US2005/0287153Al)。另外，已將特 異性結(jié)合白蛋白的多個(gè)抗體片段偶聯(lián)至治療部分以增加治療劑的半衰期。結(jié)合HSA的駱 馬它科動(dòng)物Vhh抗體片段（Nanobodies?)與結(jié)合TNF-α的另一 Nanobody? (Coppieters 等人，Arthritis Rheum 54 :1856-1866, 2006)或抗-EGFR Nai.i〇b〇diesii: (Tijink 等人， Mol Cancer Ther 7:2288-2297,2008)融合。已生成結(jié)合白蛋白的抗-白蛋白結(jié)構(gòu)域抗 體（dAbs)，并且已與例如白介素-1受體（Holt等人，Protein Eng Des Sel 21 :283-288, 2008)和干擾素 a 2b (Walker 等人，Protein Eng Des Sel，23 :271-278,2010)融合以改善 其半衰期。
[0007] 已知來(lái)自細(xì)菌的多種天然存在的蛋白結(jié)構(gòu)域可與白蛋白相互作用，據(jù)推測(cè)有助于 此類細(xì)菌在整個(gè)宿主生物體中分布。存在大小為約6kDa的3-螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域，其使 用3-螺旋束的一個(gè)面與血清白蛋白相互作用（Cramer等人，F(xiàn)EBS Lett 581:3178-3182， 2007 ;Lejon 等人，Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 64:64-69， 2008) Johansson 等人，F(xiàn)EBS Lett，374 :257-261,1995 Johansson 等人，J Mol Biol 266: 859-865,1997 Johansson 等人，J Biol Chem，277 :8114-8120, 2002)。來(lái)源于鏈球菌蛋 白G的一種此類白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Jonsson等人，Protein Eng Des Sel, 21 :515-527, 2008)已被廣泛用于延長(zhǎng)蛋白的血清半衰期。與此結(jié)構(gòu)域的融合已被證實(shí)用于增加以下各 項(xiàng)的半衰期：1型可溶性補(bǔ)體受體（Makrides等人，J Pharmacol Exp Ther 277 :534_542， 1996)、雙特異性抗體（Stork 等人，Protein Eng Des Sel，20:569-576,2007)、CD4(Nygren 等人，Vaccines 91 :363-368,1991 ;US 6267,964B1)，PH55/RESA (Stahl 等人，J Immunol Methods 124 :43-52,1989)、G-CSF(Frejd，F(xiàn). PEGS Europe，October 5, 2010)和結(jié)合多個(gè)靶 的抗體分子（Andersen 等人，J Biol Chem，286 :5234_5241，2011) (Frejd，F(xiàn).PEGS Europe， 2010年10月5日）。然而，針對(duì)結(jié)構(gòu)域的抗體制備已在患者中有所報(bào)道，因此使用分子進(jìn) 行治療劑應(yīng)用可為具有挑戰(zhàn)性的（Goetsch等人，Clin Diagn Lab Immunol 10:125-132， 2003 ;Libon 等人，Vaccine，17 :406-414,1999)。
[0008] 結(jié)合白蛋白的多種蛋白結(jié)構(gòu)域或肽能夠延長(zhǎng)血清半衰期并且產(chǎn)生更有益的治療 劑蛋白生物學(xué)分布模式。為了將這些白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域用于治療應(yīng)用中，需要滿足多個(gè)生 物物理要求，例如在宿主中的高表達(dá)水平、溶解度和穩(wěn)定性以及最低免疫原性。白蛋白結(jié)合 部分應(yīng)以對(duì)血清半衰期和生物學(xué)分布與結(jié)合或不結(jié)合白蛋白時(shí)的治療部分的活性進(jìn)行有 效平衡的親和力結(jié)合血清白蛋白。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的一個(gè)方面為一種蛋白，其包含具有SEQ ID NO :21的氨基酸序列的分離的 非天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種分離的非天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 其包含與 SEQ ID N0:21 至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或100相問(wèn)的氣基酸序列。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種分離的非天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含在1、2、3、4、 5和/或6個(gè)殘基處具有取代的SEQ ID NO :21的氨基酸序列，優(yōu)選地，其中1、2、3、4、5和/ 或6個(gè)殘基處的取代可發(fā)生在SEQ ID NO :21的氨基酸位置Y21、Y22, L25、K30, T31、E33、 G34、A37、L38、E41、I42 和 / 或 A45 處或在 SEQ ID N0:21 的氨基酸位置 Y21、Y22、K30、T31、 Α37和/或Ε41處。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種分離的非天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含氨基酸序 列：Lkeakekaieelkkagitsdx1X2Fdlinkax3X 4Vegvnx5Lkdx6Ilka(seq id no :22);其中 X1'χ2、 χ3、χ4、\和X 6可為任意氨基酸或某些氨基酸的子集。
[0012] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述分離的非天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含在其N-端的5 個(gè)氨基酸的延長(zhǎng)。
[0013] 本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種制備本發(fā)明的非天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法，所述 方法包括：提供編碼所述非天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸；在宿主中或體外表達(dá)所述 多核苷酸；以及回收所述非天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種編碼本發(fā) 明的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分離的多核苷酸。本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種包含SEQ ID NO: 35的多核苷酸的分離的多核苷酸。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的分離的載體以及一 種包含本發(fā)明的分離的載體的宿主細(xì)胞。
[0015] 本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種融合蛋白，其包含本發(fā)明的白蛋白結(jié)合蛋白和生物活 性劑。
[0016] 本發(fā)明的另一個(gè)方面為一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的融合蛋白和至少一種藥 學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1示出經(jīng)純化的ABDCon的SDS-PAGE分析。樣品如下：泳道I) SeeBlue+2標(biāo)記 物、2)總細(xì)胞裂解液、3)可溶性細(xì)胞裂解液、4)柱流通液、5-12)洗脫級(jí)分。標(biāo)記物帶中一 些的分子量在左邊不出。
[0018] 圖2示出經(jīng)純化的ABDCon樣品的電噴霧電離質(zhì)譜。
[0019] 圖3示出如在PBS中運(yùn)行的經(jīng)純化的ABDcon的尺寸排阻色譜法分析。
[0020] 圖4示出如通過(guò)在PBS中的DSC所測(cè)量的熔融溫度A)和ABDCon解折疊的可逆 性B)。第一次掃描的扣除數(shù)據(jù)的歸一化基線在A中示出。在第一次掃描后，使樣品冷卻至 20°C并且重復(fù)掃描以測(cè)定折疊可逆性。第一次掃描和第二次掃描的原始數(shù)據(jù)跡線在B部分 中疊加。
[0021] 圖5示出當(dāng)以2mg/kg靜脈內(nèi)給藥時(shí)小鼠體內(nèi)Tencon25-ABDCon融合蛋白的藥代 動(dòng)力學(xué)。
[0022] 圖6示出當(dāng)以2mg/kg靜脈內(nèi)給藥時(shí)小鼠體內(nèi)與ABDCon (SEQ ID NO :21)、 ABDCon3(SEQ ID N0:26)、ABDcon5(SEQ ID N0:28)、ABDCon7(SEQ ID N0:30)和 ABDCon9(SEQIDN0:32)融合的Tencon25(SEQIDN0:39的殘基l-90)分子的藥代動(dòng)力學(xué)。
[0023] 圖7示出當(dāng)在PBS中在37°C下孵育0或28天時(shí)的A)某些FN3結(jié)構(gòu)域ABDCon (SEQ ID NO :1)融合蛋白和B)在ABDCon處具有延伸的N-端螺旋的FN3結(jié)構(gòu)域-ABDConl2 (SEQ ID NO :46)融合蛋白的穩(wěn)定性。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域"或"結(jié)構(gòu)域"是指在體內(nèi)或體外結(jié)合白蛋 白的多肽。白蛋白可來(lái)源于任何動(dòng)物物種，例如人、猴類或嚙齒動(dòng)物。
[0025] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"Kd "是指白蛋白與白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的解離常數(shù)。
[0026] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"K。/是指白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域與白蛋白締合形成白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu) 域/白蛋白復(fù)合物的結(jié)合速率常數(shù)。
[0027] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"K#"是指白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域與白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域/白蛋白復(fù) 合物解離的解離速率常數(shù)。
[0028] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"非天然"是指合成的（即，具有不存在于原生多肽中的氨基酸 序列）的結(jié)構(gòu)域。
[0029] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"取代的"或"取代"是指在多肽或多核苷酸序列中改變、缺失或 插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸，或一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸的改變、缺失或插入，以生 成所述序列的變體。
[0030] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"變體"是指不同于參考多肽或參考多核苷酸一處或多處修飾， 例如取代、插入或缺失的多肽或多核苷酸。
[0031] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"生物活性劑"是指當(dāng)施用給動(dòng)物患者時(shí)向所述患者提供有益效 果的蛋白、抗體、肽、核苷酸、小分子藥物，等等。通過(guò)合成制得的、天然源的或重組產(chǎn)生的部 分也包括在該術(shù)語(yǔ)中。生物活性劑可為生物活性劑的類似物、衍生物、激動(dòng)劑、拮抗劑、對(duì)映 體或配藥學(xué)上可接收的鹽。
[0032] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定性"是指在生理?xiàng)l件下分子保持折疊狀態(tài)使得其保持其正 常功能活性中的至少一種例如半衰期的能力。
[0033] 術(shù)語(yǔ)"載體"是指能夠在生物系統(tǒng)內(nèi)復(fù)制或可以在此類系統(tǒng)間移動(dòng)的多核苷酸。載 體多核苷酸通常含有諸如復(fù)制起點(diǎn)、聚腺苷酸化信號(hào)或選擇標(biāo)記的元件，其功能是促進(jìn)這 些多核苷酸在生物系統(tǒng)中的復(fù)制或保持。此類生物系統(tǒng)的例子可包括細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、動(dòng) 物、植物和用能夠復(fù)制載體的生物組分再造的生物系統(tǒng)。包含載體的多核苷酸可以是DNA 或RNA分子或這些分子的雜合分子。
[0034] 術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"是指可用于在生物系統(tǒng)或再造生物系統(tǒng)中指導(dǎo)由存在于表達(dá)載 體中的多核苷酸序列所編碼的多肽的翻譯的載體。
[0035] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"操作性連接的"是指使得元件以其預(yù)期方式起作用的元件布 置。
[0036] 氨基酸在本文中采用它們的標(biāo)準(zhǔn)三字母或單字母代碼提及：
[0037] 白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域鉬合物
[0038] 本發(fā)明提供一種合成白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ABDCon) (SEQ ID NO :21)及其變體。 ABDCon可操作性連接至生物活性劑以增強(qiáng)治療劑的血清半衰期和生物學(xué)分布。ABDCon及 其變體可在大腸桿菌（E. coli)中以高水平表達(dá)，為可溶性的并且具有高熱穩(wěn)定性。本發(fā)明 提供編碼ABDCon及其變體的多核苷酸或其互補(bǔ)核酸、載體、宿主細(xì)胞以及制備和使用它們 的方法。
[0039] 本發(fā)明還提供合成白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ABDCon)，其在N-端具有5個(gè)氨基酸延長(zhǎng)的 延長(zhǎng)。所述延長(zhǎng)改善ABDCon的穩(wěn)定性。
[0040] ABDCon結(jié)合結(jié)構(gòu)域如下設(shè)計(jì)：使用來(lái)自鏈球菌屬G148蛋白G(SEQID NO :1)的 ABD作為模板對(duì)保藏在無(wú)冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的某些3-螺旋束白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ABD) 序列的共有氨基酸序列進(jìn)行計(jì)算，并選擇每個(gè)序列位置處的最常見氨基酸（表6)。當(dāng)用 本文指定的條件進(jìn)行測(cè)試時(shí)，ABDCon對(duì)人白蛋白具有高親和力，其中K d為75pM，1(。"為 3. 02X 1(T51/S，因此可操作性連接至ABDCon的生物活性劑一旦施用給動(dòng)物患者就可主要 地結(jié)合白蛋白。在人類患者中，過(guò)弱結(jié)合血清白蛋白的分子將由于腎過(guò)濾而具有短血清半 衰期（Hopp，Protein Eng Des Sel, 23 :827-834, 2010)，而過(guò)緊密地結(jié)合血清白蛋白的分子 將無(wú)法從優(yōu)選作用位點(diǎn)處的白蛋白中釋放，因此在一些情況下可降低對(duì)所需靶的活性調(diào)節(jié) 能力并且提供治療有益效果。因此本發(fā)明的一個(gè)方面是具有并且能夠生成對(duì)白蛋白具有親 和力譜的ABDCon變體和結(jié)合結(jié)構(gòu)域并因此提供對(duì)可操作性地連接至ABDCon變體和結(jié)合結(jié) 構(gòu)域的生物活性劑的半衰期進(jìn)行調(diào)節(jié)的能力。
[0041] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例為一種分離的非天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含與SEQ ID N0:21(ABDCon) :LKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA 至少 85 %、86 %、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%相同的 氨基酸序列。
[0042] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例為一種分離的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含在1、2、3、4、5和 /或6個(gè)殘基處具有取代的SEQ ID NO :21的氨基酸序列。
[0043] ABDCon變體可如下設(shè)計(jì)：檢驗(yàn)與白蛋白復(fù)合的示例性3-螺旋束白蛋白結(jié)合蛋白 的晶體結(jié)構(gòu)并且假設(shè)ABDCon可以類似于示例性蛋白的方式結(jié)合白蛋白?？刹捎玫氖纠?晶體結(jié)構(gòu)為與人白蛋白復(fù)合的厭氧細(xì)菌大芬戈?duì)柕戮‵inegoldia magna)(原先稱為大 消化鏈球菌（Peptostreptococcus magnus))的蛋白PAB的GA模塊（蛋白G-相關(guān)白蛋 白-結(jié)合模塊）的結(jié)構(gòu)（蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB)代碼lTF0(Leion等人，JBiol Chem 279 : 42924-42928,2004)。
[0044] 具有對(duì)白蛋白的降低的親和力的ABDCon變體可通過(guò)各種策略進(jìn)行設(shè)計(jì)，諸如通 過(guò)破壞預(yù)計(jì)的疏水性接觸；破壞芳族殘基之間的預(yù)計(jì)的Pi-堆疊；通過(guò)用較大的氨基酸取 代來(lái)引入空間位阻；通過(guò)去除帶電荷的殘基來(lái)破壞鹽橋；以及破壞預(yù)計(jì)在ABDCon與白蛋白 之間進(jìn)行的氫鍵合。對(duì)引入的改變進(jìn)行設(shè)計(jì)以降低結(jié)合親和力，而不以消除結(jié)合的方式改 變結(jié)合表面。例如，殘基Y21可取代帶電荷的氨基酸（Ly S、Arg、Asp、Glu)或較小的氨基酸 (Ala、Gly)以減小此殘基與白蛋白殘基V325和F326之間的疏水性相互作用。此外，ABDCon 的Y21與白蛋白殘基N318和D324的主鏈形成氫鍵，使得微小的變化（諸如Phe的突變） 可略微減弱相互作用。預(yù)計(jì)ABDCon的殘基Y22與白蛋白殘基F309和F326形成疏水的以 及pi-堆疊的相互作用。因此，Y22取代較小的中性氨基酸Ala、Ser、Val或帶電荷的氨基 酸Lys、Arg、Asp或Glu可降低疏水性接觸并且降低ABDCon變體對(duì)白蛋白的親和力。預(yù)計(jì) ABDCon中的殘基K30與白蛋白殘基E227形成鹽橋，因此K30可取代Asp或Glu以引入排斥 電荷并且可能降低對(duì)白蛋白的ABDCon親和力。任何不帶電荷的氨基酸的突變還可通過(guò)消 除鹽橋降低親和力。預(yù)計(jì)ABDCon殘基T31與白蛋白殘基N267形成分子間氫鍵并且對(duì)Ala 或Gly的取代可用于破壞分子間氫鍵而不引入可顯著使相互作用不穩(wěn)定的大的空間位阻。 ABDCon殘基A37可取代Val、Tyr或其它較大的氨基酸以引入空間位阻。殘基E41可取代 Gln或Asn以去除電荷。帶正電荷的殘基諸如Lys或Arg的引入可預(yù)期進(jìn)一步降低結(jié)合親 和力。預(yù)計(jì)ABDCon殘基L25、E33、G34、L38、142和A45形成與白蛋白的直接接觸，并且這 些殘基處的取代很有可能調(diào)節(jié)對(duì)白蛋白的ABDCon親和力。殘基位置是指SEQ ID NO :21的 ABDCon和SEQ ID NO :36的人白蛋白。
[0045] 或者，可使用氨基酸的無(wú)規(guī)混合物，利用例如NNK密碼子進(jìn)行識(shí)別位置處的取代， 并且使用標(biāo)準(zhǔn)方法和本文所述的方法來(lái)測(cè)量所得變體與白蛋白的結(jié)合。
[0046] 示例性 ABDCon 變體為在選自 SEQ ID NO :21 的 Y21、Y22、L25、K30、T31、E33、G34、 A37、L38、E41、142和A45的至少一種殘基中具有取代的變體。
[0047] 示例性ABDCon變體為在選自SEQIDN0:21的Y21、Y22、K30、T31、A37和E41的 至少一種殘基中具有取代的變體。
[0048] 示例性 ABDCon 變體包含氨基酸序列 Lkeakekaieelkkagitsdx1X2Fdlinkax3X 4Vegvn X5LKDX6ILKA(SEQ ID N0:22;其中父1、父2、父3、父4、父 5和父6可為任意氨基酸。
[0049] 在其它實(shí)施例中，示例性ABDCon變體包含氨基酸序列Lkeakekaieelkkagitsdx1X2 FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA(SEQ ID N0:23)，其中
[0050] DX1S賴氨酸（K)、精氨酸（R)、天冬氨酸（D)、谷氨酸（E)、丙氨酸（A)、甘氨酸（G)、 苯丙氨酸（F)或酪氨酸（Y);
[0051] ii)X2S丙氨酸（A)、絲氨酸（S)、纈氨酸（V)、賴氨酸（K)、精氨酸（R)、天冬氨酸 (D)、谷氨酸（E)或酪氨酸（Y);
[0052] iii)X3為天冬氨酸（D)、谷氨酸（E)或賴氨酸（K);
[0053] iv) X4為丙氨酸（A)、甘氨酸（G)或蘇氨酸（T);
[0054] v)X5S纈氨酸（V)、酪氨酸（Y)或丙氨酸（A);并且
[0055] vi) X6為谷氨酰胺（Q)、天冬酰胺（N)、賴氨酸（K)、精氨酸（R)或谷氨酸（E)。
[0056] 在其它實(shí)施例中，示例性ABDCon變體包含氨基酸序列Lkeakekaieelkkagitsdx1X2 FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA(SEQ ID N0:24)，其中
[0057] DX1S賴氨酸（K)、丙氨酸（A)或酪氨酸（Y);
[0058] ii)X2S丙氨酸（A)、絲氨酸（S)、纈氨酸（V)或酪氨酸（Y);
[0059] iii)X3為天冬氨酸（D)或賴氨酸（K);
[0060] iv) X4為丙氨酸（A)或蘇氨酸（T);
[0061] v)X5S纈氨酸（V)、酪氨酸（Y)或丙氨酸（A);并且
[0062] vi) X6為谷氨酰胺（Q)或谷氨酸（E)。
[0063] 另外的示例性ABDCon變體包含SEQ ID NO :25-34中示出的氨基酸序列。使用熟知 的方法，例如在采用等離振子共振的體外測(cè)定（BIAcore，GE-Healthcare Uppsala, Sweden) 中測(cè)試ABDCon變體的白蛋白結(jié)合。如果在不同的條件（例如，同滲容摩、pH)下測(cè)量，特 定ABDCon變體/白蛋白抗原相互作用的測(cè)量的親和力可變化。因此，親和力和其它結(jié)合 參數(shù)（例如，K D、Km、Ktjff)的測(cè)量?jī)?yōu)選地用ABDCon變體和白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及標(biāo)準(zhǔn)緩沖 液，諸如本文所述的緩沖液進(jìn)行。ABDCon變體對(duì)白蛋白的親和力可在至少約IX 1(Γ5Μ、至 少約I X 1(Γ6Μ、至少約I X 1(Γ7Μ、至少約I X 1(Γ8Μ、至少約I X 1(Γ9Μ、至少約I X KTwIVU至少約 IX 1(ΓηΜ、至少約IX KT12M或至少約IX KT13M的范圍內(nèi)。例如，在ABDCon (SEQ ID NO :21) 的Y22處的各種取代將變體對(duì)白蛋白的親和力降低約300-1，000倍，這取決于取代（表4)。 在定義位置或位置組合處具有取代的另外的變體可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員設(shè)計(jì)和生成并且 使用常規(guī)方法測(cè)試所需的白蛋白結(jié)合親和力。
[0064] 可通過(guò)向ABDCon或ABDCon變體的N-端添加5個(gè)氨基酸延長(zhǎng)來(lái)對(duì)ABDCon及其變 體進(jìn)行進(jìn)一步修飾。所述5個(gè)氨基酸延長(zhǎng)可由氨基酸序列TIDEWL (SEQ ID NO :43)或SEQ ID NO :42或45-55中示出的任意氨基酸序列組成。將N-端5個(gè)氨基酸延長(zhǎng)并入ABDCon及 其變體中可提高分子的穩(wěn)定性。所述N-端5個(gè)氨基酸延長(zhǎng)可在結(jié)構(gòu)上排序作為ABDCon和 變體的第一 α螺旋的一部分。因此穩(wěn)定螺旋的整體結(jié)構(gòu)可改善N-端延伸分子的穩(wěn)定性。 N-端ABDCon變體可使用標(biāo)準(zhǔn)方法制備，其穩(wěn)定性例如熱穩(wěn)定性如本文所述進(jìn)行評(píng)估。任何 白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ABD)均可通過(guò)添加5個(gè)N-端氨基酸進(jìn)行修飾以使ABD結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并改 善所得分子的穩(wěn)定性，諸如熱穩(wěn)定性。
[0065] ABDCon及其變體可進(jìn)一步在不影響與白蛋白結(jié)合的殘基處進(jìn)行修飾以例如改善 穩(wěn)定性、降低免疫原性、改善溶解度或任何其它合適的特性。在實(shí)現(xiàn)這一目的的一種方式 中，可通過(guò)使用親本和工程改造序列的三維模型分析親本序列和各種概念上的工程改造產(chǎn) 物的過(guò)程任選地制備ABDCon及其變體。三維模型是本領(lǐng)域技術(shù)人員可公共獲得的和熟悉 的。計(jì)算機(jī)程序可供圖解和展示選定的候選序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)并可測(cè)量可能的免疫 原性（例如，Immunofilter程序（Xencor，Inc.，Monrovia, CA))。對(duì)這些顯示的檢測(cè)允許 分析對(duì)候選序列的功能起作用的殘基的可能作用，例如，影響ABDCon結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性的殘 基。按此方式，可由親本和參考序列選擇并組合殘基以實(shí)現(xiàn)期望的特性，諸如獲得改善的穩(wěn) 定性。另選地，或除了以上過(guò)程，可如本領(lǐng)域所已知使用其它合適的工程改造方法。
[0066] 本發(fā)明的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所需物理特性包括高熱穩(wěn)定性以及熱折疊和解折 疊的可逆性。多種方法已應(yīng)用于增加蛋白質(zhì)和酶的表觀熱穩(wěn)定性，包括基于與高度相似的 熱穩(wěn)定序列比較的合理設(shè)計(jì)、穩(wěn)定二硫橋的設(shè)計(jì)、增加 α -螺旋傾向的突變、對(duì)鹽橋進(jìn)行工 程改造、蛋白質(zhì)表面電荷的改變、定向進(jìn)化和共有序列的構(gòu)成（Lehmann和Wyss，Curr Opin Biotechnol，12 :371-375,2001)。高度的熱穩(wěn)定性可增加所表達(dá)蛋白的產(chǎn)量、改善溶解度或 活性、降低免疫原性并且使生產(chǎn)中對(duì)冷鏈的需要最小化。
[0067] 可通過(guò)進(jìn)行取代并測(cè)定白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所需特性來(lái)確定可被取代以改善本 發(fā)明的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何特性的殘基。例如，可采用丙氨酸掃描來(lái)識(shí)別可影響白蛋 白結(jié)合結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定性的ABDCon及其變體中的位置。
[0068] 根據(jù)穩(wěn)定性的喪失，即，蛋白的"變性（denaturing/denaturation) "意指其中賦予 蛋白的功能特性的三維構(gòu)象的一些或全部已伴隨活性和/或溶解性的喪失而喪失的過(guò)程。 在變性過(guò)程中被破壞的力包括分子內(nèi)鍵，例如，靜電力、疏水力、范德華力、氫鍵和二硫鍵。 蛋白變性可由施加于蛋白或包含蛋白的溶液的力以及由化學(xué)變性劑引起，所述力諸如機(jī)械 力（例如壓力或剪切力），熱、滲透應(yīng)力、pH的變化、電場(chǎng)或磁場(chǎng)、電離輻射、紫外線輻射和脫 水。
[0069] 蛋白穩(wěn)定性和蛋白易變性的測(cè)量可視為蛋白完整性的相同或不同方面。蛋白對(duì)由 熱、由紫外線或電離輻射、環(huán)境同滲容摩和pH(如果在液體溶液中）的變化、由小孔徑過(guò)濾 施加的機(jī)械剪切力、紫外線輻射、電離輻射（諸如由Y輻射）、化學(xué)或熱脫水或任何其它可 造成蛋白結(jié)構(gòu)破壞的作用或力引起的變性敏感或"易變"?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定分子的穩(wěn)定 性。例如，可通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量熱熔融（T m)溫度，即一半的分子變?yōu)榻庹郫B的以攝氏 度（°C)表示的溫度來(lái)測(cè)定分子的穩(wěn)定性。通常，Tm越高，分子越穩(wěn)定。除了熱之外，化學(xué) 環(huán)境也改變蛋白的穩(wěn)定性以保持特定的三維結(jié)構(gòu)。
[0070] 可通過(guò)多種方法同樣地測(cè)量化學(xué)變性?；瘜W(xué)變性劑包括鹽酸胍、硫氰酸胍、脲、丙 酮、有機(jī)溶劑（DMF、苯、乙腈）、鹽（硫酸銨、溴化鋰、氯化鋰、溴化鈉、氯化鈣、氯化鈉）；還原 劑（例如二硫蘇糖醇、β -巰基乙醇、二硝基硫苯和氫化物，諸如硼氫化鈉）、非離子和離子 型去污劑、酸（例如鹽酸（HC1)、乙酸（CH3C00H)、鹵代乙酸）、疏水分子（例如，磷脂）和靶 向變性劑。變性程度的定量可依賴于功能特性的喪失，諸如結(jié)合靶分子的能力，或通過(guò)物理 化學(xué)特性定量，諸如聚集的趨勢(shì)、先前溶劑不可及殘基的暴露或二硫鍵的破壞或形成。
[0071] ABDCon結(jié)合結(jié)構(gòu)域及其變體可操作性地連接至生物活性劑。示例性生物活性 劑為可使用熟知的連接子可操作性地連接至ABDCon及其變體的肽和蛋白，所述連接子為 例如包含聚-甘氨酸、甘氨酸和絲氨酸（Gly-Ser連接子）或丙氨酸和脯氨酸的連接子。 使用天然存在的以及人工肽連接子在文獻(xiàn)中是熟知的（Hallewell等人，J Biol Chem， 264 :5260-5268,1989 ;Alfthan 等人，Protein Eng 8 :725-731,1995 ;Robinson&Sauer, Biochemistry, 35 :109-116,1996 ;美國(guó)專利 5, 856, 456)。生物活性劑可從ABDCon 或變體的 C-端或N-端與其連接。多特異性生物活性劑還可連接至ABDCon。在這些情況中，ABDCon 可連接至分子的N-端或C-端。ABDCon還可位于此類多特異性劑的內(nèi)部，使得其連接至一 種劑的C-端以及另一種劑的N-端。使用本領(lǐng)域熟知的化學(xué)交聯(lián)，例如使用腙或縮氨基脲 鍵，也可以使生物活性劑與本發(fā)明的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)。示例性生物活性劑為特異性 結(jié)合靶抗原的蛋白，諸如從III型纖連蛋白（FN3)重復(fù)蛋白文庫(kù)（諸如W02011/137319A2 和TO2010/093627A2中所述的基于Tencon25的文庫(kù)）中識(shí)別的蛋白。
[0072] 另外的部分可結(jié)合到本發(fā)明的ABDCon或其變體，諸如用于期望特性的毒素綴合 物；聚乙二醇（PEG)分子，諸如PEG5000或PEG20, 000 ;不同鏈長(zhǎng)的脂肪酸和脂肪酸酯，例 如，月桂酸酯、肉豆蘧酸酯，硬脂酸酯、花生酸酯、二十二烷酸酯、油酸酯、花生四烯酸、辛二 酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等、聚賴氨酸、辛烷、糖類（葡聚糖、纖維素、寡 糖或多糖）。這些部分可與ABDCon編碼序列直接融合并且可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的克隆和表達(dá)技術(shù)生 成。另選地，熟知的化學(xué)偶聯(lián)方法可用于將這些部分連接至本發(fā)明的重組制備的ABDCon。
[0073] 可使用熟知的藥代動(dòng)力學(xué)特性以體內(nèi)模型評(píng)估ABDCon及其變體以及生物活性劑 與ABDCon的融合蛋白的半衰期。示例性ABDCon及其變體以約介于IpM-I μ M之間、介于 75ρΜ-860ηΜ之間、介于100ρΜ-500ηΜ之間或介于InM-IOOnM之間的KD結(jié)合白蛋白。
[0074] ABDCon及其奪體的牛成和制各
[0075] 本發(fā)明的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的生成通常使用標(biāo)準(zhǔn)方法在核酸水平上實(shí)現(xiàn)。使用標(biāo) 準(zhǔn)PCR克隆方法，或根據(jù)美國(guó)專利No. 6, 521，427和美國(guó)專利No. 6, 670, 127中描述的方法 的化學(xué)基因合成，或使用 Kunkel 誘變（Kunkel 等人，Methods Enzymol，154 :367_382,1987) 來(lái)合成在一個(gè)或多個(gè)特異性殘基處具有取代的密碼子的ABDCon變體。如果要對(duì)任意殘基 位置使用隨機(jī)化密碼子，則可使用熟知的方法例如匹配設(shè)計(jì)多樣性的簡(jiǎn)并寡核苷酸，或例 如使用NNK密碼子（其編碼所有20種天然存在的氨基酸）來(lái)實(shí)現(xiàn)隨機(jī)化。在其它多樣化方 案中，DVK 密碼子可用于編碼氨基酸 Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、 Gly和Cys。另選地，NNS密碼子可用于產(chǎn)生所有20種氨基酸殘基并同時(shí)降低終止密碼子 的頻率。密碼子命名根據(jù)熟知的IUB密碼。
[0076] 用某些位置處所選的核苷酸"簡(jiǎn)并性"合成寡核苷酸是本領(lǐng)域熟知的，例如TRM 方法（Knappek 等人，J Mol Biol，296 :57-86,1999 ;Garrard&Henner，Gene，128 :103-109， 1993)?？墒褂每缮藤?gòu)獲得的核苷酸或核苷試劑和設(shè)備來(lái)合成具有某些密碼子組的核苷酸 的此類組。
[0077] 標(biāo)準(zhǔn)的克隆和表達(dá)技術(shù)用于將ABDCon或其變體克隆進(jìn)載體或合成ABDCon的雙 鏈cDNA以在體外表達(dá)或翻譯蛋白。可使用熟知的方法使生物活性劑可操作性地連接至 ABDCon或其變體。
[0078] 核酸分子和裁體
[0079] 本發(fā)明將編碼本發(fā)明的ABDCon或其變體的核酸提供為分離的多核苷酸或表達(dá)載 體的部分或線性DNA序列的部分，包括用于體外轉(zhuǎn)錄/翻譯的線性DNA序列，與原核、真核 或絲狀噬菌體表達(dá)、組合物的分泌和/或展示相容的載體。某些示例性多核苷酸在本文 中公開，然而，考慮到遺傳密碼的簡(jiǎn)并性和給定表達(dá)系統(tǒng)中的密碼子偏好，編碼本發(fā)明的 ABDCon或其變體的其它多核苷酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0080] 本發(fā)明的多核苷酸可以通過(guò)化學(xué)合成（諸如在自動(dòng)化多核苷酸合成儀上的固相 多核苷酸合成）來(lái)生產(chǎn)，并裝配成完整的單鏈或雙鏈分子。另選地，本發(fā)明的多核苷酸可以 通過(guò)其它技術(shù)來(lái)生產(chǎn)，諸如PCR之后進(jìn)行常規(guī)克隆。制備或獲得具有給定的已知序列的多 核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
[0081] 本發(fā)明的多核苷酸可包含至少一個(gè)非編碼序列，諸如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列、內(nèi)含 子、聚腺苷酸化信號(hào)等。多核苷酸序列還可包含編碼另外的氨基酸的另外序列，其編碼例如 標(biāo)記物或標(biāo)簽序列，諸如六-組氨酸或HA標(biāo)簽以促進(jìn)蛋白質(zhì)的純化或檢測(cè)；信號(hào)序列；融 合蛋白配偶體諸如編碼生物活性劑的cDNA，等等。
[0082] 示例性多核苷酸包含編碼ABDCon的序列、針對(duì)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、啟動(dòng)子序 列、終止子序列、抗生素抗性基因和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)（ori)。編碼本發(fā)明的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域 的示例性多核苷酸在SEQ ID NO :35中示出。
[0083] 本發(fā)明的另一實(shí)施例是包含至少一種本發(fā)明的多核苷酸的載體。此類載體可以是 質(zhì)粒載體、病毒載體、桿狀病毒表達(dá)載體、基于轉(zhuǎn)座子的載體或任何其它適用于通過(guò)任何手 段將本發(fā)明的多核苷酸引入給定生物體或遺傳背景的載體。此類載體可以是包含可控制、 調(diào)節(jié)、引起或允許由這種載體編碼的多肽的表達(dá)的核酸序列元件的表達(dá)載體。此類元件可 包含轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子結(jié)合位點(diǎn)、RNA聚合酶起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及有利于被編碼多肽在 給定表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)的其它位點(diǎn)。此類表達(dá)系統(tǒng)可以是本領(lǐng)域熟知的基于細(xì)胞的系統(tǒng)或 無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)。
[0084] 宿豐細(xì)朐詵擇或宿豐細(xì)朐工稈改誥
[0085] 本發(fā)明的ABDCon及其變體可任選地通過(guò)細(xì)胞系、混合的細(xì)胞系、無(wú)限增殖化細(xì)胞 或無(wú)限增殖化細(xì)胞的克隆群體來(lái)生產(chǎn)，這是本領(lǐng)域熟知的。參見例如，Ausubel等人編輯， Current Protocols in Molecular BiologyjJohn ffiley&Sons, Inc. , NY, NY(1987-2001)； Sambrook 等人，Molecular Cloning ：A Laboratory Manual,2ndEdition, Cold Spring Harbor, NY(1989) ；Harlow 和 Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY(1989) ;Colligan 等人編輯，Current Protocols in Immunology, John Wiley &Sons, Inc. , NY(1994-2001) ;Colligan 等人，Current Protocols in Protein Science, John Wiley&Sons，NY，NY，（1997-2001)。
[0086] 選擇用于表達(dá)的宿主細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物起源的或可選自C0S-1、C0S-7、HEK293、 BHK21、CH0、BSC-1，!fep G2、653、SP2/0、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆蟲或植物細(xì)胞，或它 們的任何衍生物、無(wú)限增殖化細(xì)胞或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。另選地，宿主細(xì)胞可選自不能夠使多肽 糖基化的物種或生物體，例如原核細(xì)胞或生物體，諸如BL21、BL21 (DE3)、BL21-G0LD(DE3)、 XLl-Blue、JM109、HMS174、HMS174(DE3)以及任何天然或工程改造的大腸桿菌屬（E. coli spp)、克雷伯氏菌屬（Klebsiella spp.)或假單胞菌屬（Pseudomonas spp)菌株。
[0087] 本發(fā)明的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的用涂
[0088] 本發(fā)明的非天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域ABDCon及其變體的組合物可用于通過(guò)可操作 性地連接ABDCon和生物活性劑來(lái)調(diào)節(jié)所述生物活性劑在動(dòng)物組織內(nèi)的半衰期和/或生物 學(xué)分布，并且其中給動(dòng)物施用所述組合物所導(dǎo)致的生物活性劑半衰期和/或生物學(xué)分布與 單獨(dú)施用活性劑時(shí)所獲得的組織分布不同。
[0089] 何含ABDCon或其奪體的藥物纟目合物
[0090] 可操作性地連接至生物活性劑的結(jié)合白蛋白的ABDCon或其變體可使用本領(lǐng)域熟 知的用于捕獲、固定、分配或沉淀的分離工序分離，并將其純化至商業(yè)適用所必需的程度。
[0091] 對(duì)于治療劑的用途，可將生物活性分子-ABDCon融合蛋白制備為藥物組合物，所 述藥物組合物包含有效量的生物活性劑-ABDCon融合蛋白作為藥學(xué)上可接受的載體中的 活性成分。術(shù)語(yǔ)"載體"是指活性化合物與其一起施用的稀釋劑、輔助劑、賦形劑或媒介物。 此類媒介物可以是液體，諸如水和油，包括那些來(lái)源于石油、動(dòng)物、植物的油或合成的油，諸 如花生油、大豆油、礦物油和芝麻油等。例如，可使用0.4%鹽水溶液和0.3%甘氨酸。這些 溶液是無(wú)菌的，并且通常不含顆粒物。它們可通過(guò)常規(guī)的已知的滅菌技術(shù)（例如過(guò)濾）進(jìn) 行滅菌。所述組合物可根據(jù)需要包含配藥學(xué)上可接受的輔助性物質(zhì)，以接近生理?xiàng)l件，諸 如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、潤(rùn)滑劑和著色劑等。在此類藥物制劑中生物活性 劑-ABDCon融合蛋白的濃度可廣泛改變，按重量計(jì)，即從小于約0. 5%，通常為或至少約1 % 至多達(dá)15或20%，且將根據(jù)所選擇的具體施用方式，主要基于所需劑量、流體體積、粘度等 進(jìn)行選擇。合適的媒介物和制劑描述于例如Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 21 版，Troy, D. B.編輯，Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA2006,第 5 部分，Pharmaceutical Manufacturing 第 691-1092 頁(yè)，特別參見第 958-989 頁(yè)。
[0092] 生物活性劑-ABDCon融合蛋白的治療用途的施用方式可以是將藥劑遞送至宿主 的任何合適的途徑，諸如非腸道施用，例如，真皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下、肺部；經(jīng) 粘膜（口腔、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸）；使用片劑、膠囊、溶液、懸浮劑、粉末、凝膠、顆粒形式的制 齊IJ ;以及包含在注射器、植入裝置、滲透泵、盒、微型泵中；或技術(shù)人員所理解的本領(lǐng)域熟知 的其它方式?？赏ㄟ^(guò)例如以下方式實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性施用：胃腸外、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟 骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、頸管內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心臟內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心 包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮 內(nèi)、血管內(nèi)、膀胱內(nèi)、病灶內(nèi)、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內(nèi)或經(jīng)皮遞送。
[0093] 雖然以一般的術(shù)語(yǔ)描述了本發(fā)明，但是本發(fā)明的實(shí)施例還將在以下的實(shí)例中公 開，所述實(shí)例不應(yīng)理解為對(duì)本權(quán)利要求所保護(hù)的范圍的限制。
[0094] 實(shí)例L非天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的牛成
[0095] 非天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域共有序歹Il (ABDCon)的設(shè)計(jì)
[0096] 通過(guò)對(duì)保藏在無(wú)冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的3-螺旋束ABD序列的共有氨基酸序列 進(jìn)行計(jì)算來(lái)設(shè)計(jì)非天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ABD)。為了測(cè)定共有序列，將來(lái)自鏈球菌屬 (Streptococcus sp)G148蛋白G(SEQID NO :1)的ABD用作針對(duì)無(wú)冗余NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù) 進(jìn)行 BLAST 檢索的模板序列（http :_//blast_ncbi_nlm_nih_gov/Blast_cgi)。所有默認(rèn)設(shè) 置均用于BLAST檢索；預(yù)期閾值=10 ;字長(zhǎng)=3 ;矩陣=BL0SUM62 ;空位權(quán)重=存在11，延 長(zhǎng)1 ;組合調(diào)整=有條件的組合評(píng)分矩陣調(diào)整。從此檢索中，選擇20個(gè)密切相關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu) 域，在表1中列出（SEQ ID NO :1-20)以包含在多序列對(duì)比中，以便測(cè)定共有序列。僅選擇 無(wú)冗余序列。若干個(gè)蛋白登錄號(hào)在表1中多次列出，表明一些蛋白包含若干個(gè)密切相關(guān)的 ABD結(jié)構(gòu)域。SEQ ID NO :4為源于噬菌體展示和基因改組的非天然ABD。（He等人，Protein Sci，16 :1490-1494,2007)。
[0097] 表 L
[0098]

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的非天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含與SEQ ID NO: 21的氨基酸序列至少 85〇/〇、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的氨基 酸序列。
2. -種分離的非天然白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含在1、2、3、4、5或6個(gè)殘基處具有取代 的SEQ ID NO: 21的氨基酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中1、2、3、4、5或6個(gè)殘基處的 所述取代發(fā)生在 SEQ ID NO: 21 的氨基酸位置 Y21、Y22、L25、K30、T31、E33、G34、A37、L38、 E41、142和A45中的一處或多處。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中1、2、3、4、5或6個(gè)殘基處的 所述取代發(fā)生在SEQ ID NO: 21的氨基酸位置Y21、Y22、K30、T31、A37和E41中的一處或 多處。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，還包含在其N-端的5個(gè)氨基酸的 延長(zhǎng)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述5個(gè)氨基酸的延長(zhǎng)包含 選自SEQ ID NO: 42、43和45-55的氨基酸序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述5個(gè)氨基酸的延長(zhǎng)包含 SEQ ID NO: 43的氨基酸序列。
8. -種分離的非天然白蛋白結(jié)合，其包含選自SEQ ID NO: 21-34或44的氨基酸序列。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，還包含在其N-端的5個(gè)氨基酸的 延長(zhǎng)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述5個(gè)氨基酸的延長(zhǎng)包含 SEQ ID NO: 42、43或45-55的氨基酸序列。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述5個(gè)氨基酸的延長(zhǎng)包含 SEQ ID NO: 43的氨基酸序列。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域具 有結(jié)合人白蛋白的介于約50pM至1剛之間的解離常數(shù)（Kd)，所述解離常數(shù)是采用Prote化TM XPR-36蛋白相互作用陣列系統(tǒng)炬io-Rad)使用GLC傳感器芯片測(cè)量的，流速為100化/min， 使用PBST (PBS，0. 005%的Tween20)作為運(yùn)行緩沖液。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域具 有結(jié)合人白蛋白的在3. 6 X 1(T5至1. 1 X l(Ti的解離速率常數(shù)化off)，所述解離速率常數(shù)是 采用Prote化TM XPR-36蛋白相互作用陣列系統(tǒng)炬io-Rad)使用GLC傳感器芯片測(cè)量的，流 速為lOOML/min，使用PBST (PBS，0. 005%的Tween20)作為運(yùn)行緩沖液。
14. 一種制備權(quán)利要求1所述的分離的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括 a) 提供編碼所述分離的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核巧酸； b) 在宿主中或體外表達(dá)所述多核巧酸；W及 C)回收所述分離的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
15. -種分離的多核巧酸，其編碼權(quán)利要求1所述的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
16. -種分離的多核巧酸，其包含編碼選自SEQ ID NO: 21-34或44的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu) 域的多核巧酸。
17. -種分離的多核巧酸，其包含SEQ ID NO: 35的多核巧酸。
18. -種分離的載體，其包含權(quán)利要求15、16或17所述的分離的多核巧酸。
19. 一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求18所述的分離的載體。
20. -種融合蛋白，其包含權(quán)利要求1、5或8中任一項(xiàng)所述的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和生物 活性劑。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的融合蛋白，其中所述生物活性劑為特異性結(jié)合祀分子的蛋 白質(zhì)支架。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的融合蛋白，其中所述蛋白質(zhì)支架基于包含SEQ ID NO: 39 的氨基酸殘基1-90或其變體的Tencon25。
23. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的融合蛋白，其中所述白蛋白結(jié)合蛋白和所述生物活性劑使 用連接子操作性連接。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的融合蛋白，其中所述連接子包含Gly-Ser連接子。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的融合蛋白，其中所述連接子包含SEQ ID NO: 40的氨基酸 序列。
26. -種藥物組合物，其包含權(quán)利要求20所述的融合蛋白和至少一種藥學(xué)上可接受的 載體或稀釋劑。
27. 本文描述的任何發(fā)明。
【文檔編號(hào)】C07K14/00GK104470944SQ201380039335
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月25日
【發(fā)明者】賈科布斯 S. 申請(qǐng)人:詹森生物科技公司