本發(fā)明屬于納米材料制備和生物醫(yī)學領域，具體涉及一種碘代氟硼二吡咯高負載率納米棒的制備及應用。

背景技術：

α-乳白蛋白（簡稱α-la）是由123個氨基酸組成的，是一種結構緊實的球蛋白，在其二級結構中大約有26%為α-螺旋，14%為β-折疊，其它60%為無序結構。通過酶解后的乳白蛋白，會存在顯著的兩親性肽鏈，由此可知酶解后的兩親性肽鏈可以作為兩親性單體聚集形成膠束。另一方面，α-乳白蛋白有四個二硫鍵，通過打破二硫鍵能夠得到游離的巰基，進而在多肽分子間交錯形成新的二硫鍵，可以提高膠束作為藥物載體的穩(wěn)定性。

新型光敏劑碘代氟硼二吡咯因為具有高消光系數(shù)，高單線態(tài)氧產生率、高穩(wěn)定性等優(yōu)點被廣泛關注，被視作一種理想的光動力治療劑。但碘代氟硼二吡咯分子疏水性的特性阻礙了其在生物醫(yī)學上的進一步應用。因此，本發(fā)明試圖利用la肽鏈的兩親性和能形成膠束的特性，對疏水性的光敏劑bodipy-2i進行組裝轉相，發(fā)展一種具有高負載率且光動力治療效果顯著的bodipy-2i-la納米棒。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種碘代氟硼二吡咯高負載率納米棒的制備及應用。本發(fā)明所制得bodipy-2i-la納米棒可以實現(xiàn)對疏水性光敏劑bodipy-2i的高負載，在光照作用下產生高的單線態(tài)氧產生率，并在腫瘤部位受ph及gsh雙重響應藥物釋放特性等優(yōu)點，可作為一種優(yōu)良的光動力治療劑。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種碘代氟硼二吡咯高負載率納米棒的制備方法：首先由α-乳白蛋白（α-la）經酶水解成兩親性的肽鏈，然后加入dtt將肽鏈上的二硫鍵切斷形成裸露的巰基，疏水性的光敏劑bodipy-2i通過疏水作用力和兩親性乳白蛋白肽鏈的疏水端自組裝，形成bodipy-2i-la納米棒，然后通入氧氣氧化，使巰基重新錯位交聯(lián)，使納米棒更加穩(wěn)定。

更具體的，所述的制備方法包括如下步驟：

（1）α-la兩親性肽鏈的合成：

將一定量的乳白蛋白溶解在pbs溶液中，加入蛋白水解酶，在室溫條件下反應并對所得產物進行離心、過濾后，獲得酶解后的乳白蛋白兩親性肽鏈材料；再經二硫蘇糖醇處理將肽鏈上的二硫鍵切斷形成裸露的巰基，制得反應液；

（2）bodipy-2i-la納米棒的合成：

將bodipy-2i分子分散在四氫呋喃溶液中，加入步驟（1）制得的反應液中，攪拌，靜置一定時間后，產物經離心、洗滌處理，獲得bodipy-2i-la納米棒；

（3）將bodipy-2i-la納米棒重新分散于去離子水中，然后往溶液中通氧氣，使二硫鍵重新交聯(lián)，得到更穩(wěn)定的交聯(lián)化的bodipy-2i-la納米棒。

步驟（1）中α-乳白蛋白與酶的反應質量比是25:1。

步驟（2）中bodipy-2i與α-la的質量比是0.04:1～1:1，最優(yōu)選比例是0.2:1。

步驟（2）中反應液與thf的體積比為10:1～5:1，最優(yōu)選比例是10:1。

步驟（2）中bodipy-2i與la攪拌時間是10min，攪拌速度是1000rpm，然后靜置反應12h。

步驟（3）中通氧氣氧化時間是30min。

一種如上所述的制備方法制得的碘代氟硼二吡咯高負載率納米棒，其直徑為50±5nm，表面帶負電，極易分散于水溶液中；bodipy-2i在納米棒中的負載率隨bodipy-2i與la的反應質量比不同而變化，其中，bodipy-2i在納米棒中的最高負載率可達到97%；與自由的bodipy-2i分子相比，bodipy-2i-la納米棒的單線態(tài)氧產生率更高。

一種如上所述的光敏劑碘代氟硼二吡咯高負載率納米棒的應用：在ph≤6、gsh濃度為10mm的雙重刺激下，bodipy-2i-la納米棒解離釋放出bodipy-2i，并在一定的光照作用下產生單線態(tài)氧，實現(xiàn)光動力治療應用。

與其他光動力診療劑體系相比，本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：

（1）本發(fā)明的bodipy-2i-la納米棒制備方法簡單，條件溫和可控；對光敏劑bodipy-2i的負載率可高達97%，可有效降低治療過程中藥物載體的使用劑量，達到減少副作用的目的；

（2）本發(fā)明的bodipy-2i-la納米棒具有針對低ph和高gsh雙重刺激響應特性；在光照下，與自由的bodipy-2i分子相比，可產生較高濃度的單線態(tài)氧，從而可以高效的抑制癌細胞；

（3）本發(fā)明所述的bodipy-2i-la納米棒生物相容性好，易于在腫瘤環(huán)境內解離，是可降解型藥物載體。

附圖說明

圖1為bodipy-2i-la納米棒的tem表征圖；

圖2為實施例1制備的bodipy-2i-la納米棒分別在pbs和培養(yǎng)基中的粒徑變化圖；橫坐標為時間，縱坐標為粒徑尺寸；

圖3為按照bodipy-2i和la不同的質量比合成的bodipy-2i-la納米棒在體外的單線態(tài)氧產生率變化圖；橫坐標為時間，縱坐標為單線態(tài)氧產生率（用i/i0來評估，i為初始單線態(tài)氧捕獲劑dpbf在410nm處紫外吸收值，i0為不同時間點單線態(tài)氧捕獲劑dpbf在410nm處紫外吸收值）；

圖4為bodipy-2i和la按照0.2:1的質量比合成的bodipy-2i-la納米棒以及不同對照組的體外單線態(tài)氧產生率變化圖；橫坐標為時間，縱坐標為單線態(tài)氧產生率（用i/i0來評估，i為初始單線態(tài)氧捕獲劑dpbf在410nm處紫外吸收值，i0為不同時間點單線態(tài)氧捕獲劑dpbf在410nm處紫外吸收值）；

圖5為實施例1制備的bodipy-2i-la納米棒在不同條件下對bodipy-2i的釋放圖；橫坐標為釋放時間，縱坐標為釋放百分率；

圖6為考察不同濃度的bodipy-2i-la納米棒的生物相親性；橫坐標為bodipy-2i-la濃度，縱坐標為細胞存活率；

圖7為考察不同組納米棒在未經光照及光照后的細胞抑制圖；橫坐標為不同樣品組，縱坐標為細胞存活率。

具體實施方式

下面以具體實施示例對本發(fā)明的技術方案做進一步說明，但是不能以此限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

一種制備具有高負載率新型光敏劑的納米棒的方法，具體步驟為：

1）α-乳白蛋白兩親性多肽鏈的合成：

取6mgα-乳白蛋白溶解于200μl，ph=7.5，75mmtris-hcl緩沖液中，再加入12μl，0.3u/ml蛋白水解酶，用1ml注射器吸取溶液，于0.22μm聚醚砜針頭式過濾器過濾溶液一次，于50℃水浴中加熱20min，離心后取上清液，冷凍干燥，所得產物重新分散在ph=7.5，75mmtris-hcl緩沖液中，從而得到兩親性的多肽鏈溶液；

2）dtt處理：

取52μl、1mg/ml二硫蘇糖醇（dtt），將其加入步驟1）所得α-乳白蛋白的兩親性多肽鏈溶液中，1000rpm攪拌10min，使肽鏈上的二硫鍵切斷形成裸露的巰基，從而獲得處理液；

3）bodipy-2i-la納米棒的自組裝：

將bodipy-2i分散于5mlthf中，加入步驟2）制得的0.5mg/mlα-乳白蛋白兩親性多肽鏈中，其中bodipy-2i與la的質量比是0.2:1，室溫攪拌10min，靜置12h，離心處理后，將沉淀重新分散于去離子水中，通氧氣處理30min，得到bodipy-2i-la納米棒溶液。

實施例2

一種制備具有高負載率新型光敏劑的納米棒的方法，具體步驟為：

1）α-乳白蛋白兩親性多肽鏈的合成：

取6mgα-乳白蛋白溶解于200μl，ph=7.5，75mmtris-hcl緩沖液中，再加入12μl，0.3u/ml蛋白水解酶，用1ml注射器吸取溶液，于0.22μm聚醚砜針頭式過濾器過濾溶液一次，于50℃水浴中加熱20min，離心后取上清液，冷凍干燥，所得產物重新分散在ph=7.5，75mmtris-hcl緩沖液中，從而得到兩親性的多肽鏈溶液；

2）dtt處理：

取52μl、1mg/ml二硫蘇糖醇（dtt），將其加入步驟1）所得α-乳白蛋白的兩親性多肽鏈溶液中，1000rpm攪拌10min，使肽鏈上的二硫鍵切斷形成裸露的巰基，從而獲得處理液；

3）bodipy-2i-la納米棒的自組裝：

將bodipy-2i分散于5mlthf中，加入步驟2）制得的0.5mg/mlα-乳白蛋白兩親性多肽鏈中，其中bodipy-2i與la的質量比從0.04:1、0.1:1、0.6:1和1:1混合，室溫攪拌10min，靜置12h，離心處理后，將沉淀重新分散于去離子水中，通氧氣處理30min，得到bodipy-2i-la納米棒溶液。

實施例3

bodipy-2i-la-rgd納米棒的合成：

將實施例1制備的bodipy-2i-la納米棒溶液加入rgd分子，bodipy-2i-la納米棒和rgd的質量比為2:1，反應12h后，離心得到bodipy-2i-la-rgd納米棒。

性能檢測：

1、將實施例1的溶液滴在銅網上，晾干后進行tem表征，結果如圖1所示。從圖1可看出，bodipy-2i-la復合顆粒的形貌為單分散的納米棒狀，直徑為50±5nm，納米棒長短不一。

2、分別取bodipy-2i-la納米棒加入至pbs（ph=7.4）緩沖溶液和培養(yǎng)液中，配制濃度為1mg/ml，混勻，分別于不同時間取樣測粒徑變化，結果如圖2所示。zeta粒度分析儀數(shù)據(jù)表明：在pbs緩沖液和細胞培養(yǎng)液中，在9天內，bodipy-2i-la納米棒的粒徑都在80nm左右，由此可知bodipy-2i-la納米棒在一定時間內，不會溶脹及解離，熱穩(wěn)定性良好；另一方面，由于la肽鏈還起到分散劑作用，因此由zeta粒度分析儀得到的光動力學粒徑尺寸會比tem數(shù)據(jù)偏大。

3、將bodipy-2i和la按不同的質量比從0.04:1、0.1:1、0.2:1、0.6:1、1:1合成bodipy-2i-la納米棒，通過熒光數(shù)據(jù)分析得bodipy-2i在納米棒中的負載率分別為64%、77%、83%、96%、97%。考察負載率不同時，納米棒在光照下單線態(tài)氧變化情況。取不同質量比合成的納米棒（所含bodipy-2i的濃度均為5μm）與100μmdpbf均勻混合，加水至總體積為1ml，用波長為518nm，功率為80mw/cm²的燈照射，在不同的時間點測單線態(tài)氧捕獲劑dpbf在410nm處紫外吸收值。測試結果如圖3所示，當納米棒中bodipy-2i濃度相同時（均為5μm），不同負載率的bodipy-2i-la納米棒單線態(tài)氧產生率幾乎相同，沒有太大差別，這進一步說明bodipy-2i在la形成的膠束棒中是以自由分散的單分子形式存在，而不是聚集狀態(tài)，因而高負載率不影響單線態(tài)氧的產生。同時也說明可以通過提高bodipy-2i的負載率，減少bodipy-2i-la納米棒載體的使用劑量，達到降低副作用的目的。

4、取0.014mg/ml納米棒（所含bodipy-2i濃度為5μm）與100μmdpbf均勻混合，加水至總體積為1ml。用波長為518nm，功率為80mw/cm²的燈照射，在不同的時間點測單線態(tài)氧捕獲劑dpbf在410nm處紫外吸收值；對照組為dpbf及單獨bodipy-2i+dpbf，用同樣實驗條件照射，測試結果如圖4所示。i/i0的值越小，表明單線態(tài)氧產生率越高。由圖可知bodipy-2i-la納米棒比自由的bodipy-2i分子單線態(tài)氧產生率顯著提高，這主要是因為bodipy-2i分子是疏水性，在水溶液中易因為π-π堆積作用聚集成二聚體或低聚體，從而影響單線態(tài)氧產生；而bodipy-2i分子在納米棒中是單分散而不是聚集狀態(tài)存在，且bodipy-2i-la納米棒在水中分散性很好，在光照作用下緩慢的釋放bodipy-2i，從而有比較高的單線態(tài)氧產生。

5、將實施例1制得的bodipy-2i-la納米棒分散到不同條件下（ph=7.4，ph=7.4+10mmgsh，ph=5.0，ph=5.0+10mmgsh）的溶液中，置于37℃下避光保存，于不同的時間點取樣離心。利用紫外分光光度計測528nm處紫外吸收值，并根據(jù)bodipy-2i標準曲線計算分析不同條件下的釋放情況。如圖5所示，在ph=7.4緩沖液中，bodipy-2i的釋放百分比僅為18%，說明經過通氧交聯(lián)后的bodipy-2i-la納米棒很穩(wěn)定；而在ph=7.4+10mmgsh條件下，bodipy-2i的釋放量達到71.5%，說明高gsh可以有效解離bodipy-2i-la納米棒結構，從而釋放出bodipy-2i。另一方面，在ph=5.0緩沖液中，bodipy-2i的釋放百分比為60%，說明酸性也可以誘導bodipy-2i-la納米棒結構發(fā)生解離；而在ph=5.0+10mmgsh條件下，bodipy-2i的釋放百分比增加到88%，說明經低ph及高gsh的雙重刺激，bodipy-2i-la納米棒結構迅速發(fā)生解離，從而釋放出更多的bodipy-2i。

6、用hela細胞作為目標細胞考察bodipy-2i-la納米棒的生物相親性實驗：取已消化成單分散的hela細胞懸濁液用培養(yǎng)液稀釋，以100μl/孔的密度接種到96孔板，每孔的細胞個數(shù)控制約為10⁵個。將96孔板置于37℃，5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，移去培養(yǎng)液，加入含有不同濃度bodipy-2i-la納米棒培養(yǎng)液，每組設置4個重復孔。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，移去培養(yǎng)液，用pbs緩沖液（ph=7.4）清洗兩次，加入100μl培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20h后，每孔分別加入10μl濃度為5mg/ml的mtt，繼續(xù)孵育4h，小心移去培養(yǎng)液，加入150μldmso，37^oc培養(yǎng)15min，震蕩均勻后，在酶標儀上測490nm處的吸收值，計算細胞存活率。圖6顯示當bodipy-2i-la納米棒的濃度在12μg/ml以內，其生物相親性較好，達到80%以上，因此可以選擇bodipy-2i-la納米棒的濃度為1-12μg/ml，作光動力治療劑應用。

7、用hela細胞作為目標細胞考察bodipy-2i-la納米棒的光動力抑制效果。取已消化成單分散的hela細胞懸濁液用培養(yǎng)液稀釋，以100μl/孔的密度接種到96孔板，每孔的細胞個數(shù)控制約為10⁵個，每組設置4個復孔作為重復組。將96孔板置于37℃，5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，移去孔中培養(yǎng)液，分別加入1、control2、freebodipy-2i3、bodipy-2i-la4、bodipy-2i-la-rgd組，其中bodipy-2i的濃度均為1.0μg/ml，bodipy-2i-la納米棒的濃度均為6.0μg/ml，另外設如上四組加波長為528nm，80mw/cm²照射10min。培養(yǎng)4h后，移去培養(yǎng)液，用pbs緩沖液清洗兩次，加入100μl培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20h后，每孔分別加入10μl濃度為5mg/ml的mtt，繼續(xù)孵育4h，移去培養(yǎng)液，加入150μldmso，37℃培養(yǎng)15min，振蕩均勻后，在酶標儀上測490nm處的吸收值，計算細胞存活率。從圖7可以看出光照組比無光照組的細胞死亡率要高，bodipy-2i-la組經光照后對hela細胞的抑制率為70%，有靶分子修飾的bodipy-2i-la-rgd組對細胞的抑制率可達到85%，說明該體系可以有效的用于腫瘤細胞的光動力治療。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。