抗微生物肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及新的抗微生物肽，其具有至少8個連續(xù)的氨基酸，其中所述肽具有下式的序列：Ter1-X1-B1-X2-B2-X3-Z1-Z2-X4-Ter2。此外，所述肽也可具有經(jīng)修飾的末端。該肽有效用于治療或預(yù)防由微生物，如細(xì)菌和真菌引起的炎性和感染性疾病。
【專利說明】抗微生物肽
[0001]本發(fā)明涉及新的抗微生物肽及其在醫(yī)藥中的用途。
[0002]抗微生物肽，也簡稱為"AMP"，是先天免疫系統(tǒng)的一部分，并且對于防止微生物感染的上皮防御至關(guān)重要。
[0003]在健康人中，皮膚和黏膜形成防止微生物感染的物理屏障。該物理屏障在健康皮膚中由角質(zhì)層構(gòu)成，在粘膜中由粘液層構(gòu)成，其中脫屑和粘膜分泌導(dǎo)致表面不斷更新，并且同時(shí)導(dǎo)致附著在表面上的微生物的連續(xù)消除。該物理屏障與此外存在于皮膚中的脂質(zhì)相互協(xié)作，防止微生物滲透到活的表皮中。
[0004]但是，除該物理屏障而外，對于健康皮膚和粘膜的有效的感染防御而言還有其他的因素是必需的，尤其包括內(nèi)生性抗微生物肽。例如，溶菌酶是一種存在于鼻腔分泌物中的抗微生物肽，并且其尤其可以殺死革蘭氏陽性菌。此外，已知在腸粘膜中防御素為抗微生物肽，尤其是在腸上皮(Darmepitelien)暴露于非常大量的細(xì)菌的背景下它們的存在似乎是必要的。除了對于微生物而言難于透過的粘液層而外，在腸道的粘膜中發(fā)現(xiàn)帕內(nèi)特細(xì)胞，其分泌人防御素-5并且此外還保護(hù)干細(xì)胞，這對于腸粘膜的持續(xù)再生是重要的。
[0005]此外已知的AMP是作為牛皮癖素(Psoriasin)已知的肽，以及RNase_7,其是有效的人類內(nèi)生性廣譜抗生素。
[0006]除了已知的內(nèi)生性抗微生物肽而外，在現(xiàn)有技術(shù)中此外還已知大量抗生素，其中包括生物來源的物質(zhì)和合成制備的物質(zhì)，即，它們是-如在最初意義上的-天然形成的真菌或細(xì)菌的低分子量代謝產(chǎn)物或者化學(xué)合成藥物。
[0007]尤其是在對天然和合成抗生素的抗性的發(fā)展使得治療微生物感染性疾病日益困難的背景下，總是存在對新的以副作用少、易于制備和施用為特點(diǎn)的抗微生物活性物質(zhì)的需求。
[0008]在此背景下，本發(fā)明的目的是提供新的抗微生物物質(zhì)，其可以用于治療微生物感染性疾病。
[0009]根據(jù)本發(fā)明，所述目的通過具有抗微生物活性和具有C-端和N-端的肽得以實(shí)現(xiàn)，并且所述肽由至少8個和最多12個連續(xù)的氨基酸構(gòu)成，其中所述肽具有下式I的序列:
Ter1-X1-B1-X2-B2-X3-Z1-Z2-X4-Ter2,(式 I)
其中
Ter1是N-端氨基酸X1的游離N-端氨基基團(tuán)，或者是經(jīng)修飾的N-端氨基基團(tuán)；
X1、X2和X3各自相同或不同，并且彼此獨(dú)立地各自選自具有堿性側(cè)鏈的氨基酸，優(yōu)選選自下述之一:精氨酸、賴氨酸、6-羥基賴氨酸、高精氨酸、2，4-二氨基丁酸、[β]_高精氨酸、D-精氨酸、精氨醛、2-氨基-3-胍基丙酸、硝基精氨酸、N-甲基-精氨酸、[ε ]-Ν-甲基賴氨酸、別羥基賴氨酸、2，3- 二氨基丙酸、2，2’ - 二氨基庚二酸、鳥氨酸、對稱性二甲基精氨酸、不對稱性二甲基精氨酸，
B1和B2相同或不同，并且各自彼此獨(dú)立地各自選自具有脂族側(cè)鏈或堿性側(cè)鏈的氨基酸，并且優(yōu)選選自丙氨酸或甘氨酸，
Z1和Z2各自是半胱氨酸，或者是半胱氨酸和丙氨酸，和Ter2是C-端氨基酸X4的游離C-端羧基基團(tuán)，或者是經(jīng)修飾的C-端羧基基團(tuán)。
[0010]在此優(yōu)選的是該肽由8個氨基酸構(gòu)成，并且具有式I的序列。
[0011 ] Z1和Z2,如已提及的，在此各自是半胱氨酸，或者是半胱氨酸和丙氨酸，即當(dāng)Z1是半胱氨酸時(shí)，Z2是丙氨酸，而當(dāng)Z1是丙氨酸時(shí)，Z2是半胱氨酸。
[0012]在此，所述肽優(yōu)選合成制備、重組制備、通過酶切制得和/或分離。因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明的肽是相對短的肽，所以根據(jù)本發(fā)明的肽優(yōu)選是合成制備的；合成制備方法在現(xiàn)有技術(shù)中充分已知，并且尤其包括液相和固相化學(xué)合成方法。示例性可參閱綜述文章/權(quán)威著作 Kent, S., ,,Chemical Synthesis of Peptides and Proteins", Annual Review ofB1chemistry 57:957-989 (1988)。相關(guān)領(lǐng)域中，許多企業(yè)目前正從事商業(yè)制備合成肽。
[0013]除了式I的八個氨基酸而外，在本發(fā)明的肽中，在N-端和C-端還可具有另外的氨基酸，其沒有損害或僅略微損害本發(fā)明的肽的效果和穩(wěn)定性；本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本發(fā)明的肽的結(jié)構(gòu)清楚知曉，在C-端和N-端上還可附加何種氨基酸或氨基酸殘基，以能夠獲得與由8個氨基酸構(gòu)成的肽相同或者非常相似的抗微生物作用。
[0014]在發(fā)明人自己的實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)，根據(jù)本發(fā)明的肽對一系列的細(xì)菌菌株和真菌菌株非常有效。
[0015]在此，將術(shù)語“肽”理解為是指各自經(jīng)由肽鍵彼此連接的氨基酸的序列，其中所述氨基酸優(yōu)選選自二十種天然存在的氨基酸，并且其中所述氨基酸可以以L-構(gòu)型或D-構(gòu)型存在。替代該肽和由其作用方式和結(jié)構(gòu)出發(fā)也可制備肽模擬物，因此根據(jù)本發(fā)明其也包括在本發(fā)明中。肽模擬物在本文中定義為低分子量化學(xué)化合物，其主要結(jié)構(gòu)元件是按本發(fā)明的肽仿造的。根據(jù)本發(fā)明的肽在此可以例如，分離、合成或重組存在，或以合適的形式提供。
[0016]在這里，將術(shù)語“抗微生物”理解為能夠減少微生物的增殖能力或者感染性，或?qū)⑵錃⑺阑蚴蛊涫Щ畹男阅堋Ｔ诖藢ⅰ拔⑸铩崩斫鉃樾〉糜蔑@微鏡才能看見的生物體或單位，其大都不可為肉眼所見，并且其中在此尤其理解為細(xì)菌、病毒和真菌，它們在其他生物體，特別是人類或者其他哺乳動物中引發(fā)有害健康的過程(疾病)。
[0017]根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的肽在此選自SEQ ID N0.1-6或其衍生物中的一個，其中所述衍生物是通過至少一個氨基酸被所述氨基酸的衍生物取代而形成的。在此特別優(yōu)選下述肽:具有序列RGKAKCCK (SEQ ID N0.1)的肽，具有序列RGKAKCAK (SEQID N0.2)的肽和具有序列RGKAKACK (SEQ ID N0.3)的肽，更確切地說以未修飾的形式，即具有未經(jīng)修飾的端位或者以經(jīng)修飾的形式，即具有至少一個經(jīng)修飾的(C-或者N-)端或者以具有經(jīng)修飾的N-端和經(jīng)修飾的C-端的經(jīng)修飾的形式(參見SEQ ID N0.4、5和6)。
[0018]在此將術(shù)語“氨基酸的衍生物”理解為衍生自各氨基酸的所有氨基酸殘基，其例如通過官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)變化由各自的氨基酸得到。
[0019]在此將術(shù)語“經(jīng)修飾的N-端氨基基團(tuán)”和“經(jīng)修飾的C-端羧基基團(tuán)”理解為改變的氨基基團(tuán)或者羧基基團(tuán)。N-端修飾的實(shí)例為乙酰化、甲酰化或者脒基化的N-端。C-端修飾的實(shí)例為酰胺化的C-端。
[0020]在此特別優(yōu)選所述肽在各個情況下全部由D-氨基酸或L-氨基酸或者它們的混合物構(gòu)成。在此，“D-氨基酸”或者“L-氨基酸意味著待使用的天然氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸衍生物(如亞氨基酸)可以以L-或D-構(gòu)型存在。
[0021]根據(jù)另一實(shí)施方式，優(yōu)選在C-端和/或在N-端修飾所述肽，并且尤其通過乙?；?、酰胺化、甲酰化或脒基化來修飾。
[0022]本發(fā)明的肽的C-端和/或N-端的修飾具有使它們由此對肽酶和蛋白酶的降解更穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)；由此，根據(jù)本發(fā)明的肽具有在例如血清中增加的半衰期。N-端和C-端的修飾也允許所述肽偶聯(lián)到其他基團(tuán)，例如其他氨基酸序列或者其他生物分子上。
[0023]在根據(jù)本發(fā)明的肽的另一實(shí)施方案中，所述肽被還原或以氧化態(tài)存在。
[0024]根據(jù)本發(fā)明，所述肽用于治療和/或預(yù)防由微生物引發(fā)的炎性疾病或感染性疾病。
[0025]因此，根據(jù)本發(fā)明，所述應(yīng)用在由細(xì)菌、病毒或者真菌引發(fā)的炎性疾病和/或感染性疾病中進(jìn)行。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用尤其在由選自下述的微生物引發(fā)的炎性疾病或感染性疾病中進(jìn)行:雙歧桿菌屬種sp.)、乳桿菌屬種sp.)、大腸桿菌、鏈球菌屬種(Strep1cocciAs sp.)、葡萄球菌屬種sp.)、擬桿菌屬種iBacteroides sp.)、假絲酵母菌屬種sp.)、假單胞菌屬種sp.)、丙酸桿菌屬種iProp1nibakteriuni sp.)、密螺旋體屬種(Treponema sp.)、腸桿菌屬種iEnterobacter sp.)、沙門氏菌屬種sp.)、軍團(tuán)菌屬種o/7e77a sp.),其中不言而喻，此列舉并未窮盡，所述肽也對未列出于此的細(xì)菌菌株和/或真菌菌株有效，特別是對通常屬于奈瑟氏菌科、腸桿菌科的細(xì)菌有效。
[0027]特別優(yōu)選在慢性炎癥性腸疾病、口腔-咽腔的炎癥性疾病，例如齲齒和牙齦炎癥，肺病、泌尿生殖道疾病、胰腺疾病、女性生殖系統(tǒng)疾病、皮膚的疾病和/或損傷(皮膚病)中使用本發(fā)明的肽。
[0028]相應(yīng)地，本發(fā)明也涉及含有至少一種根據(jù)本發(fā)明的肽以及任選的藥學(xué)上可接受的載體和另外的在現(xiàn)有技術(shù)中常見的制劑物質(zhì)和助劑的藥物組合物，和涉及治療罹患由微生物引起的炎癥性感染性疾病的哺乳動物的方法，其中施用治療有效量的本發(fā)明的肽或者本發(fā)明的藥物組合物。在這里，“治療有效”或者“治療有效量”是指能夠減少或完全防止細(xì)菌和/或真菌增殖和菌落形成或者能夠?qū)崿F(xiàn)可測量的治療或預(yù)防成效的至少一種根據(jù)本發(fā)明的肽或者含至少一種根據(jù)本發(fā)明的肽的藥物組合物的量?；颊叩拇_切有效量取決于其大小和健康狀況、疾病的性質(zhì)和程度以及所述至少一種肽或者所述藥物組合物或者多個上述提及因素的組合。
[0029]本發(fā)明的制劑/藥物可在體外或者體內(nèi)使用。
[0030]本發(fā)明的藥物組合物可以適應(yīng)于所選擇的給藥途徑，即腸胃外、口服、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮等以多種形式向患者給藥。腸胃外給藥在此包括下述途徑的給藥:靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、間質(zhì)內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、滑膜內(nèi)、經(jīng)上皮，包括經(jīng)皮、通過吸入經(jīng)肺、眼、舌下和頰，局部包括眼、真皮、眼、直腸和通過吹入法經(jīng)鼻吸入。
[0031]所述給藥可以以溶液、酊劑、膏劑、粉劑、懸浮劑、乳劑、以及其他固體或者液體制劑的形式和作為片劑、膠囊劑、噴霧給藥。
[0032]可用本發(fā)明的肽或者含有本發(fā)明的肽的藥物治療的皮膚疾病包括例如痤瘡、皮炎、燒傷和其他由微生物引起的皮膚疾病，或在存在微生物感染危險(xiǎn)的皮膚損傷的情況中。
[0033]根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方案，所述藥物組合物通過或經(jīng)由皮膚給藥，這是非侵入性的患者友好的給藥，并且與口服給藥相比，具有不必注意消化系統(tǒng)中的介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)。通過皮膚的吸收，例如，在鼻、頰中，在舌下、在牙齦上或者在陰道內(nèi)是可行的?？梢杂靡阎募夹g(shù)來獲得合適的劑型；它們可以被加工成滴鼻劑、鼻噴霧劑、填充物(Einlagen)、薄膜劑、貼齊U、凝膠劑、栓劑、軟膏劑或者片劑。優(yōu)選地，用于經(jīng)皮膚吸收的賦形劑包含一種或多種附著在皮膚上并由此延長該劑型與吸收表面的接觸時(shí)間的組分，以由此提高通過吸收的攝取。因此，可將所述至少一種根據(jù)本發(fā)明的肽配制成例如有利于所述肽進(jìn)入皮膚中的脂質(zhì)體。
[0034]此外，根據(jù)本發(fā)明的肽可用于治療口腔-咽腔的疾病，并且可以在這樣的應(yīng)用中以牙膏、漱口水、凝膠劑的形式存在，和/或例如存在于牙線上。
[0035]所述藥物組合物，如前已述及的，除了所述至少一種根據(jù)本發(fā)明的肽而外還可包含兩種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽。此外，所述藥物組合物除了所述至少一種根據(jù)本發(fā)明的肽而外還可包含一種或多種其它活性物質(zhì)，例如現(xiàn)有技術(shù)中已知的抗生素(例如鏈霉素、青霉素、四環(huán)素)或者其他抗微生物活性化合物如殺真菌劑，例如咪康唑，或者用于治療通常伴隨感染出現(xiàn)的癥狀(例如發(fā)燒或皮疹)的其他物質(zhì)。
[0036]此外，所述藥物也可含有藥學(xué)上可接受的載體、粘合劑、賦形劑或助劑。藥物載體、賦形劑或者稀釋劑的選擇可以考慮預(yù)期的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)化的制藥實(shí)踐進(jìn)行。作為藥學(xué)上可接受的載體可以使用溶劑、增容劑或其它液體粘合劑如分散助劑或者混懸助劑，表面活性劑、等滲劑、增稠劑或者乳化劑、防腐劑、包衣劑(包封劑)、固體粘合劑或者潤滑劑，取決于對于各自的劑量而言何種是最適合的且同時(shí)與所述肽相容。該藥物組合物也還可以包含緩沖劑、稀釋劑和/或添加劑。合適的緩沖劑包括例如Tris-HCl、甘氨酸和磷酸鹽，而合適的稀釋劑包括例如NaCl-水溶液、乳糖或甘露醇。合適的添加劑包括例如清潔劑、溶劑、抗氧化劑和防腐劑和保護(hù)膠體，例如，同源白蛋白或者生物相容的水凝膠。關(guān)于這些附加內(nèi)容物的綜述可見于例如 A.Kibbe: “Handbook of Pharmaceutical Excipients",第 3 版，2000， American Pharmaceutical Associat1n and Pharmaceutical Press。
[0037]此外，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物還可以具有藥學(xué)上可接受的鹽，例如無機(jī)酸的鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽以及類似的；和有機(jī)酸的鹽,如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽以及類似的。
[0038]一般而言，治療有效日劑量為大概在0.01-50毫克/千克，優(yōu)選0.1-20毫克/公斤待治療的患者體重的范圍。也如上面已經(jīng)提到的，該藥物可以以片劑或膠囊劑的形式提供，其可以單獨(dú)地或者兩種或者多種在同一時(shí)間給藥。該藥物還可以以緩釋制劑的形式提供。
[0039]通常，醫(yī)生將根據(jù)患者的年齡、體重和一般健康狀況確定適合于某一患者的實(shí)際劑量。
[0040]根據(jù)應(yīng)用，該藥物可如下所述給藥:通過吸入，以栓劑或者子宮托的形式，局部給藥，作為溶液劑、洗劑、軟膏劑、乳膏劑或者粉劑，使用皮膚貼劑，以任選含芳香性物質(zhì)或著色劑的片劑或膠囊劑、酏劑，溶液劑或者混懸劑的形式口服。
[0041]除了用于治療感染的治療用途，所述至少一種根據(jù)本發(fā)明的肽還可以用于消毒劑或清潔劑中，其可用于表面或物體的消毒或清潔。另一應(yīng)用領(lǐng)域是包裝，在其中肽可粘合在包裝材料上或者引入其中，或者作為易被微生物降解的其他材料的防腐劑。
[0042]除了在人用藥品中的用途而外，根據(jù)本發(fā)明的肽也可以用于獸用藥品。
[0043]本發(fā)明還涉及經(jīng)分離的核酸分子，其序列編碼根據(jù)本發(fā)明的肽，并尤其編碼具有SEQ ID N0.1至6的肽，所述SEQ ID N0.1至6的肽代表根據(jù)本發(fā)明的抗微生物的，即抗細(xì)菌或抗真菌的肽，或者與控制其在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列呈操作性連接的編碼核酸。本發(fā)明的另一組成部分是轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化了上述核酸分子的宿主細(xì)胞。
[0044]另外的優(yōu)點(diǎn)由以下的說明和附圖體現(xiàn)。
[0045]應(yīng)當(dāng)理解的是，以上提及的和以下將要說明的特征不僅可在個給出的組合中使用，而且也可在其他的組合中使用或單獨(dú)使用，而未脫離本發(fā)明的范圍。
[0046]附圖中示出本發(fā)明的實(shí)施例，并且在下面的說明中進(jìn)行了詳細(xì)解釋。其中:
圖1示出了各種肽(七肽(a);八肽(b) (C))對細(xì)菌青春雙歧桿菌
adolescentis)或大腸桿菌的抗微生物活性的研究結(jié)果。字母以單字母代碼給出氨基酸。肽ac-RGKAKCCK-NH2 (c) (SEQ ID N0.4)具有乙酰化的氨基末端和酰胺化的羧基末端。抑制區(qū)的直徑代表抗微生物活性；在這里，在瓊脂板中僅含有載體液體(陰性對照)的一個空白沖孔的直徑為2.5毫米的直徑。該實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，并示出平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差；
圖2示出根據(jù)本發(fā)明的肽作為對抗不同病原體的抗生素的多種實(shí)施方式的檢驗(yàn):檢驗(yàn)了下列肽:改性八肽(SEQ ID N0.4)，野生型八肽(SEQ ID N0.1)，丙氨酸-突變的八肽(SEQ ID N0.7)和七肽(SEQ ID N0.8)(各50 μ g/ ml)分別在流式細(xì)胞術(shù)-抗微生物效果實(shí)驗(yàn)中對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和脆弱擬桿菌進(jìn)行測試。字母再次以單字母代碼表示各氨基酸。將實(shí)驗(yàn)一式兩份重復(fù)兩次，示出平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；
圖3示出由D-氨基酸構(gòu)成的根據(jù)本發(fā)明的八肽相較于由L-氨基酸構(gòu)成的八肽對大腸桿菌K12 (a)和青春雙歧桿菌(b)的檢驗(yàn)結(jié)果；
圖4示出在徑向擴(kuò)散試驗(yàn)中不同的根據(jù)本發(fā)明的八肽對抗病原性細(xì)菌和真菌的活性的進(jìn)一步檢驗(yàn)的結(jié)果；和
圖5示出八肽對腸細(xì)胞系CaCo-2的細(xì)胞毒性的檢驗(yàn)結(jié)果。
[0047]如前所述，幾乎所有的生物體均產(chǎn)生抗微生物肽(AMP)，并且抗微生物肽(AMP)是對抗微生物感染的第一屏障。許多AMP具有抗革蘭氏陽性細(xì)菌和抗革蘭氏陰性細(xì)菌、以及抗真菌和一些帶有外殼的病毒的抗微生物活性。人體產(chǎn)生不同類別的AMP，其中如前已述及的防御素既是其中之一。它們以其微小的尺寸(3-5 kDa)、凈陽離子電荷和6個保存的半胱氨酸殘基為特點(diǎn)，所述半胱氨酸殘基經(jīng)由三個二硫橋鍵彼此相連。根據(jù)這些橋鍵的連接將防御素劃分為α-和β-防御素。迄今為止，僅功能性研究了四種防御素(hBD-Ι至hBD-4)，尤其也作為有抗生素效果的候選。
[0048]但是，迄今，如前所述，具有3個天然二硫橋鍵的β -防御素的化學(xué)合成在其制備方法的成本和復(fù)雜性方面均是巨大的挑戰(zhàn)。
[0049]由本發(fā)明首次提供的肽是一種防御素hBD-Ι的C-端末端的八肽，其包含兩個游離的半胱氨酸，并且其以其抗微生物活性證實(shí)為相較于hBD-Ι出色的以及更短的得自hBD-1的C-末端的肽序列，如下文中提及的實(shí)驗(yàn)所示。
[0050]細(xì)菌-和真菌菌株
由Ardeypharm (德國)得到細(xì)菌菌株青春雙歧桿菌Ni3, 29c (臨床分離),短雙歧桿HBifidobacterium brevet PZ1343,長雙歧桿菌longum') DSM20219T(臨床分離)，嗜酸乳桿菌iLactobacillus acidophilus') PZl 138 (臨床分離)，發(fā)酵乳桿菌(.LactobaciIlus fermen turn) PZ1162 (臨床分離)和唾液鏈球菌嗜熱亞種(51 treptococcussalivarius spp.termophilus)DSM20617,并且由DSMZ (德國微生物和細(xì)胞生產(chǎn)收藏中心)購得普通擬桿菌(ifeciero1fes raJgaiiAsODSMHA?。從糞便中分離出白色念珠菌aj^ica/75.)菌株526,并由Eichert醫(yī)學(xué)院,檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所(G5ppingen,德國)提供?！懊绹湫团囵B(yǎng)物保藏中心(ATCC)的對照菌株大腸桿菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923和脆弱擬桿菌(Aaciero1fe1S fragilis) ATCC25285由Eichert醫(yī)學(xué)院，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所(G5ppingen,德國)提供。此外,測試菌株糞腸球菌faecalis) ATCC29212,白色念珠菌ATCFC為10231和銅綠假單胞菌iPsoudomorms aeruginosa) ATCC27853,它們在給出的ATCC編號下，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心得到。
[0051]Ii
人β_防御素得自肽研究所，Osaka,日本；化學(xué)合成羧基-末端的七肽和八肽以及還原的 hBD-1 (EMC Micro Collect1ns Tubingen,德國)。
[0052]杭微牛物實(shí)齡
如先前所述般進(jìn)行厭氧細(xì)菌的抗微生物徑向擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(參見SchrSder等人"Reduct1n of disulfide bonds unmasks potent antimicrobial activity of humanbeta-defensin 1〃，Nature, 469: 419-423 (2011))。簡言之，厭氧培養(yǎng)所述細(xì)菌(OxoidAnaeroGen ?，英國)，更確切地說在37°C下在哥倫比亞-瓊脂板上厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，隨后接種到液體TSB (“胰蛋白胨大豆肉湯”)培養(yǎng)基中，并再培養(yǎng)24小時(shí)。接著，洗滌該細(xì)菌培養(yǎng)物并稀釋到光密度(OD62tl ?) = 0.1，其中使用150 μ I用于效果測定。溫育在10毫升pH為7.4的1mM磷酸鈉中進(jìn)行，其具有0.3毫克/毫升的TSB粉末和具有O或2 mM 二硫蘇糖醇(DTT，Sigma Aldrich)的1% (w/v)低EEO-瓊脂糖(具有非常低的EEO-值的瓊脂糖)(Appl1-Chem),更確切地說在厭氧條件下,用I μ g合成的氧化hBD_l (肽研究所，日本)或者合成肽進(jìn)行超過3小時(shí)。在該板上提供覆蓋凝膠，所述覆蓋凝膠帶有6% (w/v) TSB-粉末、I %瓊脂糖和1mM磷酸鈉緩沖液(pH-值7.4或5.7)，其帶有或沒有DTT。在37°C下溫育48小時(shí)后，測量抑制區(qū)的直徑。該實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。
[0053]如前所述進(jìn)行用于測定細(xì)菌和真菌的膜去極化的流式細(xì)胞術(shù)抗微生物實(shí)驗(yàn)(參見 Nuding 等人的 “A flow cytometric assay to monitor antimicrob1l activity ofdefensines and cat1nic tissue extracts' Journal of Microb1logical Methods,65: 335-380 (2006))。簡言之，在1:6稀釋的Schaedler-培養(yǎng)基中于37°C用肽以50 μ I的最終體積溫育1.5X 16個細(xì)胞/ml。將所述防御素溶解于0.01%的乙酸中，并用給定的最終濃度加入到細(xì)菌_/真菌-懸液液中。用溶劑(0.01 %乙酸)溫育的細(xì)菌-或真菌-懸浮液在此充當(dāng)生活力對照。90分鐘后，用I毫克/毫升的膜電位敏感染料DiBAC4(3)([雙(1，3-二丁基巴比妥酸酯)三甲燒氧雜菁])(Invitrogen,美國)溫育該懸浮液10分鐘。將懸浮液離心，并將沉淀重新懸浮在300毫升的磷酸鹽緩沖鹽水中。借助FACSCalibur-流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson,美國)，使用 Cell Quest 軟件(Becton-Dickinson)測定懸浮液中偶極化的熒光細(xì)菌或者真菌的百分比。將該實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，并且各次一式兩份。
[0054]HPLC-分析
為用HPLC (“高效液相色譜法)分析，將所述八肽與0.1 % (v/ V)的三氟乙酸(TFA)混合并用 Agilentl200 系統(tǒng)(Agilent)和“Synergi reversed phase”(RP)柱(250 x 4, 6mm, 4 μ m, Phenomenex,德國)分析。在25°C和0.8毫升/分鐘下，梯度經(jīng)24分鐘從0%B 升至 12% B，(溶劑 A，水+0.18% (v/ V) TFA ;溶劑 B，乙腈+0.15% (v/ v) TFA)。
[0055]離子-抑制實(shí)齡
在室溫下，用4.5 mM NaCl,氯化鎂MgCl2,氯化鐵FeCl2,氯化鋅ZnCl2或者硫酸鋅ZnSO4溫育0.25 μ g/ml所述肽或防御素45 min。隨后,在徑向擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)中分析該混合物對青春雙歧桿菌和大腸桿菌的抗微生物活性。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。
[0056]結(jié)果
最近，Schr5der 等人("Reduct1n of disulfid bonds unmasks potent antimicrobialactivity of human beta-defensine 1"，Nature, 469: 419-423 (2011))發(fā)現(xiàn)，人 β -防御素I在還原條件下表現(xiàn)出提高的抗微生物活性。
[0057]當(dāng)前已進(jìn)一步研究了 hBD-Ι及其抗微生物活性。為此測試了三種人β -防御素hBD-l、2和3對人腸內(nèi)菌群的共生細(xì)菌的抗微生物活性，即在標(biāo)準(zhǔn)條件(pH 7.4)和微酸性條件(pH5.7)下，其中在這兩個條件下也測試還原條件，在所述還原條件中向生長培養(yǎng)基中添加2mM的化學(xué)還原劑二硫蘇糖醇(DTT)。在此表明(數(shù)據(jù)未顯示)，在大部分細(xì)菌的情況中，所述β_防御素的活性在標(biāo)準(zhǔn)條件下是最高的，例外的是hBD-Ι，其在此條件下在很大程度上無活性，并且通過還原激活。然而，在PH值5.7的情況中不能觀察到該活化。與此相反，已證實(shí)hBD-2不會受還原影響，相反pH-值的變化對其抗微生物活性具有非常負(fù)面的影響。
[0058]在大多數(shù)情況中，hBD-3相較于另外兩種防御素對測試的共生菌具有最強(qiáng)的活性。
[0059]總之，可以說周圍環(huán)境的因素，例如氧化還原電位和pH-值，可調(diào)制防御素對共生腸細(xì)菌的抗微生物活性。然而，這種調(diào)制對于各個防御素-細(xì)菌-關(guān)系而言是特異性的，并且與細(xì)菌的革蘭氏狀態(tài)或者菌屬均不相關(guān)。
[0060]用已經(jīng)表現(xiàn)出對青春雙歧桿菌的抗微生物活性的代表hBD-Ι的七個末端氨基酸的七肽進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，野生型的羧基末端的七肽具有對青春雙歧桿菌的最高活性，而具有相反的氨基酸序列的肽活性較低。通過用丙氨酸置換半胱氨酸殘基完全抑制活性。hBD-1的孤立的氨基端是無活性的。
[0061]在此，測試作為下一個的根據(jù)本發(fā)明的肽，包含hBD-Ι的羧基末端的八個末端氨基酸的八肽:其表現(xiàn)出比之前測試的七肽更強(qiáng)的抗微生物活性(參見圖1)。如果置換Cys6或Cys7，對青春雙歧桿菌的活性大大降低，即以相同的程度，而置換兩個半胱氨酸使活性完全停頓。與先前測試的七肽相反，八肽對大腸桿菌也具有抗微生物活性(參見圖lb)。令人驚訝地，在此通過丙氨酸置換Cys6或Cys7提高了抗微生物活性，而置換兩個半胱氨酸又幾乎使抗微生物活性完全消失。
[0062]為了優(yōu)化所述八肽和改善其對蛋白酶的穩(wěn)定性，在隨后的步驟中通過乙酰化穩(wěn)定所述八肽的氨基末端，并且用酰胺化穩(wěn)定羧基末端。相較于野生型肽，對大腸桿菌的活性沒有顯著區(qū)別，而對青春雙歧桿菌的活性則大大提高(參見圖lc)。
[0063]借助該新確定并提供的八肽可以提供簡單經(jīng)濟(jì)地制造的具有抗菌效果的肽，其可以用作治療藥劑。因此研究了經(jīng)修飾和未經(jīng)修飾的肽殺滅(機(jī)會)病原微生物的能力。為此進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，(參見圖2)，由其表明，野生型八肽以及丙氨酸-突變肽和野生型七肽的作用在大多數(shù)情況中僅在邊緣。與此相反，經(jīng)修飾的八肽具有出色的抗病原微生物金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的活性，但對大腸桿菌和脆弱類桿菌卻沒有。
[0064]由此表明，通過穩(wěn)定化端基不僅提高了對共生腸細(xì)菌青春雙歧桿菌的抗微生物活性，而且提高了對臨床相關(guān)的至少兩種病原微生物的抗微生物活性。
[0065]在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行反相HPLC分析，以研究測試的肽的疏水性(數(shù)據(jù)未示出)。所述經(jīng)修飾的八肽作為最后的物質(zhì)從柱中洗脫出來，這表明疏水性最大；在其之前洗脫出野生型肽、各丙氨酸-氨基酸-置換變體和雙丙氨酸-氨基酸置換變體(數(shù)據(jù)未示出)。
[0066]為了進(jìn)一步研究電荷和離子相互作用的作用，用一價(jià)和二價(jià)陽離子溫育經(jīng)氧化的和經(jīng)還原的hBD-Ι和野生型和經(jīng)修飾的八肽(數(shù)據(jù)未示出)。就大腸桿菌而言，整個防御素的活性通過用氯化鎂或氯化鐵預(yù)溫育完全關(guān)閉，而羧基末端肽的活性被大大抑制，但用這些金屬離子預(yù)溫育后尚能檢測到。與此相反，NaCl不影響對大腸桿菌的抗微生物活性。
[0067]在研究青春雙歧桿菌時(shí)再次證實(shí)，用氯化鈉預(yù)溫育對活性沒有強(qiáng)烈影響，而氯化鐵、氯化鋅和硫酸鋅卻完全關(guān)閉或大大降低活性。不同于大腸桿菌，用氯化鎂溫育不影響對雙歧桿菌的抗菌活性。
[0068]在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中研究由除甘氨酸以外的D-氨基酸構(gòu)成的具有序列RGKAKCCK(SEQ ID N0.1)的本發(fā)明的八肽-與由L-氨基酸構(gòu)成的具有序列RGKAKCCK(SEQ ID N0.1)的八肽，也就是說具有經(jīng)修飾的或未經(jīng)修飾的末端(圖3)相比較。由D-氨基酸構(gòu)成的具有經(jīng)修飾的末端的肽(N-端:乙酰化；C-端:酰胺化)對大腸桿菌K12表現(xiàn)出較弱的活性(參見圖3a)，而這種肽，以未經(jīng)修飾的形式和經(jīng)修飾的形式，對青春雙歧桿菌表現(xiàn)出相較于由L-氨基酸構(gòu)成的肽升高的活性(參見圖3b)。
[0069]因此這些數(shù)據(jù)總體上也表明，在肽和陽離子之間的相互作用不僅基于正電荷，而且更確切地說特定的離子能影響對某些細(xì)菌的活性。
[0070]本發(fā)明的八肽抗病原細(xì)菌和真菌的活性也在另外的徑向擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)中得以證實(shí):測試了對菌株大腸桿菌25922、金黃色葡萄球菌25923、糞腸球菌29212、白色念珠菌10231和銅綠假單胞菌27853的活性(參見圖4)，其中一方面使用由L-氨基酸構(gòu)成的(參見圖4;圖中左側(cè)的五個條柱)或由除甘氨酸以外的D-氨基酸構(gòu)成的(參見圖4，圖中右側(cè)的五個條柱)具有序列RGKAKCCK (SEQ ID N0.1)的本發(fā)明的八肽，也就是說各自一次具有經(jīng)修飾的和一次具有未經(jīng)修飾的末端(N-端:乙?；?；C-端:酰胺化)。在此，除了出色的對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的活性而外，尤其也顯示出測試的八肽的所有變體對白色念珠菌的出色活性。
[0071]該進(jìn)一步的階1'-((3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎗溴化物；噻唑藍(lán))實(shí)驗(yàn)中還研究了末端穩(wěn)定化的八肽的細(xì)胞毒性，更確切地說隨增加的各八肽(SEQ IDn0.1 ;L-或D-氨基酸(除甘氨酸外)，具有經(jīng)修飾的末端:N-端:乙?；?，和C-端:酰胺化)的濃度，相較于增加的0.01%醋酸的濃度對人細(xì)胞系CaCo-2 (ATCC HTB-37)的細(xì)胞毒性。對此的結(jié)果示于圖5中，由其表明，穩(wěn)定化的八肽不具有超過溶劑0.01%醋酸的細(xì)胞毒性。因此，本發(fā)明的八肽也適合用于治療應(yīng)用中。
[0072]但是，上述結(jié)果和數(shù)據(jù)清楚表明，在此首次提供的八肽，即以野生型-形式，與氨基酸置換，和/或以穩(wěn)定化的形式，是出色的具有抗菌效果的藥劑。這些結(jié)果是令人驚訝的，并且基于迄今可用的現(xiàn)有技術(shù)是不可預(yù)期的。
【權(quán)利要求】
1.肽或其衍生物，其具有抗微生物活性，并且具有C-端和N-端，并且其由至少8個和最多12個連續(xù)的氨基酸構(gòu)成，其中所述肽具有下式I的序列:
Ter1-X1-B1-X2-B2-X3-Z1-Z2-X4-Ter2, (式 I) 其中 Ter1是N-端氨基酸X1的游離N-端氨基基團(tuán)，或者是經(jīng)修飾的N-端氨基基團(tuán)； X1^ X2和X3各自相同或不同并且彼此獨(dú)立地各自選自具有堿性側(cè)鏈的氨基酸，優(yōu)選選自下述之一:精氨酸、賴氨酸、6-羥基賴氨酸、高精氨酸、2，4-二氨基丁酸、[β]_高精氨酸、D-精氨酸、精氨醛、2-氨基-3-胍基丙酸、硝基精氨酸、N-甲基-精氨酸、[ε ]-Ν-甲基賴氨酸、別羥基賴氨酸、2，3- 二氨基丙酸、2，2’ - 二氨基庚二酸、鳥氨酸、對稱性二甲基精氨酸、不對稱性二甲基精氨酸， B1和B2相同或不同，并且各為具有脂族側(cè)鏈或堿性側(cè)鏈的氨基酸，并且優(yōu)選選自丙氨酸或甘氨酸， Z1和Z2各自是半胱氨酸，或者是半胱氨酸和丙氨酸，和 Ter2是C-端氨基酸X4的游離C-端羧基基團(tuán)，或者是經(jīng)修飾的C-端羧基基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其特征在于，所述肽由8個連續(xù)的氨基酸構(gòu)成，并且所述肽具有式I的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽或其衍生物，其特征在于，所述肽選自SEQID N0.1_6或其衍生物之一，其中所述衍生物是通過至少一個氨基酸被所述氨基酸的衍生物取代形成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的肽，其特征在于，其由D-或L-氨基酸或者它們的混合物構(gòu)成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的肽，其特征在于，所述肽在C-端和/或N-端被乙酰化、酰胺化、甲酰化、磷酸化修飾。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的肽作為抗生素和/或在消毒劑或清潔劑中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其用于治療和/或預(yù)防由微生物引發(fā)的炎性疾病或感染性疾病。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其特征在于，所述炎性疾病或感染性疾病由微生物引起，所述微生物是細(xì)菌、病毒或者酵母菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的用途，其特征在于，所述炎性疾病或感染性疾病由微生物引起，所述微生物選自雙歧桿菌屬種{Bifidobacterium sp.)、乳桿菌屬種{Lactobacillus sp.)、大腸桿菌、鏈球菌屬種{Streptococcus sp.)、葡萄球菌屬種{Staphylococcus sp.)、擬桿菌屬種 Cfeciero1fe11S sp.)、假絲酵母菌屬種sp.)、假單胞菌屬種sp.)、丙酸桿菌屬種(/￥0/72'ieriw? sp.)、密螺旋體屬ft (Treponema sp.)。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)的用途，其特征在于，所述炎性疾病或感染性疾病選自慢性炎性腸道疾病、口腔/咽腔的炎性疾病、肺病、泌尿生殖道的疾病、胰腺疾病、女性生殖系統(tǒng)的疾病、皮膚的疾病或損傷或燒傷。
11.藥物組合物，其包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的肽和藥學(xué)上可接受的載體。
12.多核苷酸,其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的肽。
【文檔編號】C07K14/47GK104245721SQ201380012350
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月7日
【發(fā)明者】韋坎普 J., 施勒德 B., 施坦格 E. 申請人:羅伯特·博世醫(yī)學(xué)研究有限責(zé)任公司