針對(duì)vegf的elisa的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及針對(duì)VEGF的ELISA?；颊哐骰蚱渌飳W(xué)樣品中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)活性可以充當(dāng)癌癥、糖尿病、心臟疾患、及其它病理的診斷和預(yù)后指標(biāo)。提供了針對(duì)作為抗原的VEGF的抗體-三明治式ELISA方法和試劑盒，用以檢測(cè)來自動(dòng)物模型和人患者的生物學(xué)樣品中的VEGF水平類型，并可以用作診斷/預(yù)后指標(biāo)。【專利說明】針對(duì)VEGF的ELISA[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年10月03日、中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枮?00780036803.0、發(fā)明名稱為“針對(duì)VEGF的ELISA”的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。[0002]相關(guān)申請(qǐng)[0003]本申請(qǐng)要求2006年10月4日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)流水號(hào)60/828，203的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，本文完整收入其說明書。發(fā)明領(lǐng)域[0004]本發(fā)明涉及用于檢測(cè)某些VEGF群體的免疫測(cè)定法，其可以用作癌癥、心血管、或其它病理患者的診斷和預(yù)后方法。[0005]發(fā)明背景[0006]目前完全確立了血管發(fā)生牽涉多種病癥的發(fā)病機(jī)理。這些包括實(shí)體瘤、眼內(nèi)新血管綜合征(諸如增殖性視網(wǎng)膜病或年齡相關(guān)黃斑變性(AMD))、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、及銀屑病(Folkman等,T.Biol.Chem.267:10931-10934(1992);Klagsbrun等,Annu.Rev.Physiol.53:217-239(1991);及GarnerA,Vasculardiseases.于:Pathobiologyofoculardisease.Adynamicapproach.GarnerA,KlintworthGK,編第2版(MarcelDekker,NY,1994)，頁(yè):1625-1710)。在實(shí)體瘤的情況中，新血管形成讓腫瘤細(xì)胞獲得了與正常細(xì)胞相比的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和增殖自治。因而，在腫瘤切片中的微血管密度與乳腺癌及數(shù)種其它腫瘤的患者存活之間觀察到了相關(guān)性(Weidner等，NEnglTMed324:1~6(1991);Horak等，Lancet340:1120-1124(1992);及Macchiarini等.Lancet340:145-146(1992))。[0007]對(duì)血管發(fā)生正調(diào)節(jié)物的尋找產(chǎn)生了許多候選物，包括例如aFGF、bFGF、TGF-α、TGF-β、HGF>TNF-α、血管生成素、IL-8等(Folkman等，見上文，及Klagsbrun等，見上文)。一些迄今鑒定的負(fù)調(diào)節(jié)物包括血小板反應(yīng)蛋白(Good等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA..87:6624-6628(1990))、促乳素的16kDaN端片段(Clapp等，Endocrinologvl33:1292-1299(1993))、血管他丁(O，Reilly等.Cell79:315-328(1994))、及內(nèi)皮他丁(O，Reilly等.Cell88:277-285(1996))。[0008]最近幾年完成的工作建立了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在調(diào)節(jié)正常及異常血管發(fā)生中的關(guān)鍵作用(Ferrara等，Endocr.Rev.18:4-25(1997))。甚至單個(gè)VEGF等位基因的遺失導(dǎo)致胚胎致死的發(fā)現(xiàn)指向此因子在血管系統(tǒng)的發(fā)育和分化中所發(fā)揮的不可代替的作用(Ferrara等,見上文)。[0009]此外，VEGF已顯示為與腫瘤和眼內(nèi)病癥有關(guān)的新血管形成的關(guān)鍵介導(dǎo)物(Ferrara等，見上文)。VEGFmRNA在多數(shù)所檢查的人腫瘤中過表達(dá)(Berkman等，TClinInvest91:153-159(1993);Brown等，HumanPathol.26:86-91(1995);Brown等，CancerRes.53:4727-4735(1993):Mattern等，Brit.T.Cancer73:931-934(1996);及Dvorak等，細(xì)T.Pathol.146:1029-1039(1995))。同樣，眼部液體中VEGF的濃度與糖尿病性視網(wǎng)膜病和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)I旲病患者中的活躍的血管增殖的存在聞度相關(guān)(Aiello等’N.Engl.T.Med.331:1480-1487(1994))0此外，研究證明了VEGF在急性黃斑變性(AMD)患者脈絡(luò)膜新血管膜中的定位(Lopez等，Invest.0phtalm0.Vis.Sc1.37:855-868(1996))。[0010]VEGF由組織產(chǎn)生且不必進(jìn)入循環(huán)而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，而是在局部充當(dāng)旁分泌調(diào)節(jié)物。Yang等，1.Pharm.Exp.Ther.284:103(1998)的最近研究發(fā)現(xiàn)從循環(huán)中清除rhVEGF165非常迅速，提示循環(huán)中的內(nèi)源VEGF最可能是VEGF不斷合成的結(jié)果。此外，數(shù)項(xiàng)研究嘗試了將循環(huán)VEGF的水平與腫瘤負(fù)荷相關(guān)聯(lián)，并提示了VEGF水平為潛在的預(yù)后標(biāo)志物(Ferrari和ScagliottiEur.1.Cancer32A:2368(1996);Gasparini等,1.Natl.CancerInst.89:139(1997);KohnCancer80:2219(1997);Baccala等,Urology51:327(1998);Fujisaki等.Am.T.Gastroenterol..93:249(1998))。顯然，準(zhǔn)確測(cè)量VEGF的能力對(duì)理解其在許多生物學(xué)過程(諸如維持血管開放、月經(jīng)周期、缺血、糖尿病、癌癥、目艮內(nèi)病癥等)中的潛在作用會(huì)是重要的。[0011]有文獻(xiàn)報(bào)道正常和病態(tài)患者中極其不同濃度的內(nèi)源VEGF，其范圍從不可檢測(cè)水平至高水平。測(cè)量?jī)?nèi)源VEGF水平的能力依賴于靈敏且特異性測(cè)定法的可獲得性。針對(duì)VEGF的基于比色法、化學(xué)發(fā)光、及熒光測(cè)定的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)已有報(bào)道。Houck等，見上文(1992);Yeo等,Clin.Chem.38:71(1992);Kondo等,Biochim.Biophys.Acta1221:211(1994);Baker等,Obstet.Gynecol.86:815(1995);Hanatani等,Biosc1.Biotechnol.Biochem.59:1958(1995);Leith和MichelsonCellProlif.28:415(1995);Shifren等,1.Clin.Endocrinol.Metab.81:3112(1996);Takano等,CancerRes.56:2185(1996):Toi等,Cancer77:1101(1996);Brekken等,CancerRes.58:1952(1998);Obermair等.Br.T.Cancer77:1870-1874(1998);ffebb等.Clin.Sc1.94:395-404(1998)。[0012]例如，Houck等，見上文(1992)描述了表現(xiàn)出具有ng/ml靈敏度的比色ELISA，其靈敏度可能不足以檢測(cè)內(nèi)源VEGF水平。Yeo等，見上文(1992)描述了二位點(diǎn)時(shí)間分辨免疫熒光測(cè)定法，然而，在正常血清中沒有檢出VEGF(Yeo等，CancerRes.53:2912(1993))。Baker等，見上文(1995)(其使用該免疫熒光測(cè)定法的改良型式)報(bào)道了來自孕婦的血漿中可檢測(cè)水平的VEGF，在先兆子癇的婦女中觀察到更高的水平。使用放射性免疫測(cè)定法的Anthony等，Ann.Clin.Biochem.34:276(1997)報(bào)道了孕婦中類似的數(shù)據(jù)。Hanatani等，見上文(1995)開發(fā)了能夠測(cè)量循環(huán)VEGF的化學(xué)發(fā)光ELISA，并報(bào)道了來自30名正常個(gè)體(男性和女性)的血漿中的VEGF水平，為8-36pg/ml。Brekken等，見上文(1998)描述了使用對(duì)單獨(dú)的VEGF或VEGF=Flk-1復(fù)合物具有結(jié)合偏愛的抗體進(jìn)行的ELISA測(cè)定法。[0013]用于VEGF檢測(cè)的ELISA試劑盒可購(gòu)自R&DSystems(Minneapolis,MN)。R&DVEGFELISA試劑盒已經(jīng)被用于三明治式測(cè)定法，其中使用單克隆抗體來捕捉靶物VEGF抗原，而使用多克隆抗體來檢測(cè)VEGF。Webb等，見上文(1998)。還可參見例如Obermair等，見上文(1998)。[0014]Keyt等，J.Biol?Chem.271:7788_7795(1996);Keyt等.T.Biol.Chem.271:5638(1996):及Shifren等，見上文(1996)還開發(fā)了基于雙重單克隆抗體對(duì)的比色ELISA。雖然該ELISA能夠在癌癥患者中檢出升高的VEGF水平，但其缺乏在正常個(gè)體中測(cè)量?jī)?nèi)源水平的VEGF所需的靈敏度。Rodriguez等，1.1mmunol.Methods219:45(1998)描述了在純粹的(neat)血漿或血清中產(chǎn)生10pg/mlVEGF的靈敏度的二位點(diǎn)熒光測(cè)定VEGFELISA0然而，該熒光測(cè)定法檢測(cè)VEGF的完全完整的165/165和165/110種類(據(jù)報(bào)道VEGF165/165可以被蛋白水解切割成三種其它形式:165/110異二聚體、110/110同二聚體、及55個(gè)氨基酸的C端片段(Keyt等，T.Biol.Chem.271:7788-7795(1996);Keck等，Arch.Biochem.Biophvs.344:103-113(1997))。[0015]如此，需要開發(fā)在動(dòng)物模型或患者的生物學(xué)樣品中檢測(cè)比現(xiàn)有ELISA更高的可測(cè)量水平的VEGFJP/或可以測(cè)量VEGF的不同同等型的診斷和預(yù)后測(cè)定法。[0016]發(fā)明概述[0017]開發(fā)了針對(duì)作為抗原的VEGF的抗體-三明治式ELISA方法，用以檢測(cè)生物學(xué)樣品中的VEGF形式。本文所提供VEGFELISA能夠檢測(cè)VEGF同等型和大于110的VEGF片段(“VEGF11Q+”)。還提供了其試劑盒。[0018]例如，用于在生物學(xué)樣品中檢測(cè)大于110個(gè)氨基酸的選擇性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)形式(VEGF11J的方法包括如下步驟:(a)使生物學(xué)樣品與固定化至固體支持物的捕捉試劑接觸并一起溫育，其中所述捕捉試劑是與針對(duì)人VEGF的抗體5C3識(shí)別相同表位的抗體，所述單克隆抗體特異性結(jié)合人VEGF中大于110的殘基；(b)將所述生物學(xué)樣品與所述固定化捕捉試劑分開；(c)使所述固定化捕捉試劑-靶物分子復(fù)合物與可檢測(cè)抗體接觸，所述可檢測(cè)抗體能結(jié)合VEGF的KDR和/或FLTl受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；并(d)使用針對(duì)所述可檢測(cè)抗體的檢測(cè)手段來測(cè)量所述捕捉試劑所結(jié)合的VEGFlltl+的水平。在某些實(shí)施方案中，所述可檢測(cè)抗體能結(jié)合VEGFl-110中的表位。在某些實(shí)施方案中，可以實(shí)施比較ELISA以檢測(cè)VEGF的不同類型。在某些實(shí)施方案中，所述生物學(xué)樣品(例如腫瘤樣品或腫瘤溶胞產(chǎn)物、血漿、血清、或尿等)是從人受試者中分離的。[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中，捕捉試劑是5C3單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，固定化的捕捉試劑包被在微量滴定板上。在某些實(shí)施方案中，可檢測(cè)抗體是單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，可檢測(cè)抗體是鼠單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，固定化的單克隆抗體是單抗5C3，且可檢測(cè)抗體是單抗A4.6.1。在某些實(shí)施方案中，可檢測(cè)抗體是可直接檢測(cè)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，可檢測(cè)抗體受比色試劑放大。在一個(gè)實(shí)施方案中，可檢測(cè)抗體是生物素化的，且檢測(cè)手段是親合素或鏈霉親合素-過氧化物酶和3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺。[0020]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，人受試者是血管、糖尿病、或癌癥患者，且測(cè)量步驟(d)還包括與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較以測(cè)定與正常個(gè)體相比的VEGF水平。[0021]還提供了試劑盒。例如，用于在生物學(xué)樣品中檢測(cè)大于110個(gè)氨基酸的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)形式(VEGFlltl+)的免疫測(cè)定試劑盒可以包含:(a)作為捕捉試劑的針對(duì)人VEGF的抗體，其中所述單克隆抗體能特異性結(jié)合人VEGF中大于110的殘基；和(b)作為檢測(cè)試劑的可檢測(cè)抗體，其能結(jié)合VEGF的KDR和/或FLTl受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述可檢測(cè)抗體能結(jié)合VEGF1-110中的表位。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含捕捉試劑的固體支持物。例如，所述捕捉試劑可以固定化在所述固體支持物(例如微量滴定板)上。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含可檢測(cè)抗體的檢測(cè)手段(例如比色手段、熒光測(cè)定手段等)。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含作為抗原標(biāo)準(zhǔn)品的純化的VEGF。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以提供一種或多種別的VEGFELISA，用于進(jìn)行與VEGF11(I+ELISA的比較研究。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包括捕捉試劑單克隆抗體(其是鼠單克隆抗體單抗5C3)，及可檢測(cè)抗體(其是單抗A4.6.1)。[0022]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗VEGF抗體5C3(其可由以ATCC號(hào)PTA-7737保藏的雜交瘤獲得或生成)。本發(fā)明還提供了不能結(jié)合VEGF1-110但能與雜交瘤細(xì)胞系PTA-7737所生成的單克隆抗體結(jié)合相同VEGFlltl+表位的抗體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體偶聯(lián)有可檢測(cè)的標(biāo)記物。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了以ATCC保藏號(hào)PTA-7737保藏的雜交瘤5C3.1.1。[0023]附圖簡(jiǎn)述[0024]圖1A、1B和IC顯示了通過不同VEGFELISA來檢測(cè)重組體VEGF165、VEGF121(1)(截短的,依照制造商R&DSystems可能從羧基末端缺失大約9個(gè)氨基酸)、VEGF121(2)(來自PcproTech),VEGFl10(通過纖溶酶消化VEGF而生成的N端片段)和VEGF8-109(具有VEGF165的氨基酸8-109的人工VEGF)分子。(1A).ELISAA，其使用3.5F8來包被，并使用生物素化的A4.6.1來檢測(cè)。(IB).ELISAB，其使用A4.6.1來包被，并使用生物素化的2E3來檢測(cè)。(1C).ELISAC，其使用5C3來包被，并使用生物素化的A4.6.1來檢測(cè)。[0025]圖2顯示了A673細(xì)胞所生成的VEGF的蛋白質(zhì)印跡，其使用3.5F8(左)或A4.6.1(右)來探查。樣品是使用A4.6.1親和柱從A673細(xì)胞的條件化培養(yǎng)基中純化的VEGF(第I道)及重組體VEGF蛋白VEGF165、VEGF121(依照制造商R&DSystems可能從羧基末端缺失大約9個(gè)氨基酸)和大腸桿菌所生成的VEGF8_1M(分別在第2、3、4道)。[0026]圖3顯示了VEGF165、VEGF121和VEGFlltl(通過纖溶酶消化VEGF而生成的N端片段)的示意圖，其顯示了用于三種VEGFELISA的抗體的提議結(jié)合位點(diǎn)。[0027]發(fā)明詳述[0028]定義[0029]在詳細(xì)描述本發(fā)明前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于具體的組合物或生物學(xué)系統(tǒng)，它們當(dāng)然可以有所變化。還應(yīng)當(dāng)理解本文所使用術(shù)語是僅僅為了描述具體實(shí)施方案的目的，并非意圖是限制性的。在用于本說明書及所附權(quán)利要求書時(shí)，單數(shù)形式“一個(gè)/種”、“該”和“所述”等包括復(fù)數(shù)所指物，除非另有明確規(guī)定。如此，例如，提到“一個(gè)/種分子”任選地包括兩個(gè)/種或更多個(gè)/種此類分子的組合，等等。[0030]術(shù)語“VEGF”在用于本文時(shí)指165個(gè)氨基酸的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，及相關(guān)的121個(gè)、145個(gè)、189個(gè)和206個(gè)氨基酸的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如Leung等，Science246:1306(1989).Houck等,Mol.Endocrin.5:1806(1991).及Neufeld等，見上文所述，及這些生長(zhǎng)因子的天然存在等位形式和加工形式。還可參見例如美國(guó)專利N0.6，057，428的圖1A及B?；钚訴EGF片段可以通過纖溶酶切割而從ECM結(jié)合的VEGF中釋放，生成前110個(gè)氨基酸(參見例如KeytBA等，Thecarboxyl-terminaldomain(111-165)ofvascularendothelialgrowthfactoriscriticalforitsmitogenicpotency.1BiolChem.271:7788-7795(1996))。“VEGF11(I+”在用于本文時(shí)指大于110個(gè)氨基酸的VEGF片段(自N端起)，但不包括前110個(gè)氨基酸或更小片段(例如VEGF8_1(I9)。[0031]術(shù)語“檢測(cè)”以最廣義使用來包括靶分子的定性和定量測(cè)量。一方面，使用本文所描述的檢測(cè)方法僅僅來鑒定生物學(xué)樣品中VEGFlltl+或VEGF的存在。另一方面，使用所述方法來測(cè)試樣品中VEGFlltl+或VEGF是否處于可檢測(cè)的水平。又一方面，可以使用所述方法來量化樣品中VEGFlltl+或VEGF的量并進(jìn)一步比較來自不同樣品的VEGFlltl+或VEGF水平。[0032]術(shù)語“生物學(xué)樣品”指來自任何動(dòng)物的身體樣品，但優(yōu)選來自哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選來自人。在某些實(shí)施方案中，此類生物學(xué)樣品來自血管、糖尿病、或癌癥患者。此類樣品包括生物學(xué)流體，諸如血清、血漿、玻璃體液、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊水、乳汁、全血、尿液、腦脊液、唾液、痰、淚液、汗液、粘液、腫瘤溶胞產(chǎn)物、及組織培養(yǎng)液、以及組織提取物(諸如勻漿組織、腫瘤組織、和細(xì)胞提取物)。在某些實(shí)施方案中，樣品是來自任何動(dòng)物的身體樣品，在一個(gè)實(shí)施方案中，其來自哺乳動(dòng)物，在一個(gè)實(shí)施方案中，其來自人受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，此類生物學(xué)樣品來自臨床患者。[0033]術(shù)語“可檢測(cè)抗體”指能夠直接經(jīng)由通過檢測(cè)手段放大的標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)的抗體，或是能夠間接經(jīng)由例如經(jīng)標(biāo)記的另一抗體進(jìn)行檢測(cè)的抗體。對(duì)于直接標(biāo)記，典型地將抗體偶聯(lián)可通過一些手段檢測(cè)的模塊。在一個(gè)實(shí)施方案中，可檢測(cè)抗體是生物素化的抗體。[0034]術(shù)語“檢測(cè)手段”指在本文的ELISA中用于檢測(cè)可檢測(cè)抗體的存在的模塊或技術(shù)，并包括放大固定化的標(biāo)記物(諸如捕捉到微量滴定板上的標(biāo)記物)的檢測(cè)試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測(cè)手段是比色檢測(cè)劑，諸如親合素或鏈霉親合素-HRP。[0035]術(shù)語“捕捉試劑”指能夠結(jié)合和捕獲樣品中的靶物分子，從而在合適條件下可將捕捉試劑-靶物抗體復(fù)合物與剩余樣品分開的試劑。典型地，捕捉試劑是固定化的或可固定化的。在三明治式免疫測(cè)定法中，捕捉試劑優(yōu)選是針對(duì)靶物抗原的抗體或不同抗體的混合物。[0036]本文中的術(shù)語“抗體”以最廣義使用，具體覆蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、從至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。[0037]“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2、及Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及從抗體片段形成的多特異性抗體。[0038]為了本文的目的，“完整抗體”是包含重鏈可變域和輕鏈可變域以及Fe區(qū)的抗體。[0039]“天然抗體”通常指由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈⑶構(gòu)成的約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端具有一個(gè)可變域(Vh)，接著是多個(gè)恒定域。每條輕鏈在一端具有一個(gè)可變域(')，而另一端是一個(gè)恒定域；輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域排列在一起，而輕鏈的可變域與重鏈的可變域排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變域之間形成界面。[0040]術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時(shí)指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單一抗原性位點(diǎn)。此外，與典型的包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。除它們的特異性外，單克隆抗體的優(yōu)勢(shì)在于它們是通過雜交瘤培養(yǎng)合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohler等，Nature256:495(1975)記載的雜交瘤方法來制備，[0041]或者可通過重組DNA方法來制備(參見例如美國(guó)專利N0.4，816，567)?！皢慰私悼贵w”還可使用例如Clackson等，Nature352:624-628(1991)和Marks等，.T.Mol.Biol.222:581-597(1991)中記載的技術(shù)從噬菌體抗體庫(kù)分離。[0042]本文的單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)(其中重鏈和/或輕鏈的一部分與自特定物種衍生的或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體中相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與自另一物種衍生的或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體中相應(yīng)序列相同或同源)以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)期望的生物學(xué)活性(美國(guó)專利N0.4，816，567;Morrison等.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.81:6851-6855(1984))。本文感興趣的嵌合抗體包括“靈長(zhǎng)類化的”(“primatized”)抗體，其包含自非人靈長(zhǎng)類衍生的可變域抗原結(jié)合序列(例如舊世界猴(OldWorldMonkey),諸如狒狒、稱猴或短尾猴(rhesusorcynomolgusmonkey))和人恒定區(qū)序列(美國(guó)專利N0.5，693，780)。[0043]非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式是包含自非人免疫球蛋白衍生的最低限度序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體高變區(qū)的殘基為具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長(zhǎng)類的高變區(qū)殘基所替換。在有些情況中，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中未找到的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步改善抗體性能。一般而言，人源化抗體會(huì)包含至少一個(gè)，通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的那些。任選地，人源化抗體還會(huì)包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的。更多細(xì)節(jié)參見Jones等.Nature321:522-525(1986);Riechmann等.Nature332:323-329(1988);及PrestaCurr.Pd.Struct.Biol.2:593-596(1992)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了人源化5C3抗體，并使用了本文所提供的方法。[0044]術(shù)語“可變的”指可變域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用于每種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區(qū)的三個(gè)區(qū)段?？勺冇蛑懈痈叨缺Ｊ氐牟糠址Q作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個(gè)FR，它們大多采取￠-折疊片構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成3-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見Kabat等，SeauencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991)。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)中抗體的參與。[0045]木瓜蛋白酶消化抗體生成兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段(稱為“Fab”片段，每個(gè)具有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn))，及剩余的“Fe”片段(其名稱反映了其易于結(jié)晶的能力)。胃蛋白酶處理產(chǎn)生了具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能夠交聯(lián)抗原的F(ab’)2片段。[0046]“Fv”是包含完整抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。此區(qū)由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，每個(gè)可變域的三個(gè)高變區(qū)相互作用而在Vh-Vl二聚體表面上確定了一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)高變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變域(或只包含對(duì)抗原特異性的三個(gè)高變區(qū)的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。[0047]Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHl)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab'-SH是本文中對(duì)其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶至少一個(gè)游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab')2抗體片段最初是作為在Fab'片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。[0048]根據(jù)其恒定域氨基酸序列，來自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)“輕鏈”可歸入兩種截然不同型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(dá)(λ)。[0049]根據(jù)其重鏈恒定域氨基酸序列，抗體可歸入不同的類。完整抗體有五種主要的類:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為“亞類”(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同類的抗體對(duì)應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作α、δ、ε、ν和μ。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。[0050]“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。優(yōu)選的是，F(xiàn)v多肽在Vh和\結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pliickthun,于ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag,NewYork,第269-315頁(yè)，1994。[0051]術(shù)語“高變區(qū)”在用于本文時(shí)指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“⑶R”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變域中的殘基24-34(LI)、50-56(L2)和89-97(L3)及重鏈可變域中的殘基31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等，SequencesofProteinsofTmmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,(1991))和/或那些來自“高變環(huán)”的殘基(例如輕鏈可變域中的殘基26-32(LI)、50-52(L2)和91-96(L3)及重鏈可變域中的殘基26-32(Hl),53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和Lesk,T.Mol.Biol.196:901-917(1987))?！翱蚣軈^(qū)”或“FR”殘基指可變域中除本文中所定義的高變區(qū)殘基外的那些殘基。[0052]為了治療/處理的目的，“哺乳動(dòng)物”指歸入哺乳類的任何動(dòng)物，包括人，家畜和牲畜，及動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)或?qū)櫸飫?dòng)物，諸如犬、馬、貓、綿羊、豬、牛等。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物指人。[0053]術(shù)語“癌癥”、“癌性”或“惡性的”指或描述哺乳動(dòng)物中特征通常為細(xì)胞生長(zhǎng)不受調(diào)控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌瘤(carcinoma)(包括腺癌)、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、黑素瘤、肉瘤、和白血病。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌(gastricorstomachcancer)(包括胃腸癌)、胃腸基質(zhì)癌(gastrointestinalstromalcancer)、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)(例如肝癌(hepaticcarcinoma)和肝瘤(hepatoma))、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidneyorrenalcancer)、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、基底細(xì)胞癌、睪丸癌、食管癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、軟組織肉瘤、卡波西(Kaposi)氏肉瘤、類癌癌(carcinoidcarcinoma)、間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤、及各種類型的頭頸癌，以及B細(xì)胞淋巴瘤(包括低級(jí)/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細(xì)胞性(SL)NHL、中級(jí)/濾泡性NHL、中級(jí)彌漫性NHL、高級(jí)成免疫細(xì)胞性NHL、高級(jí)成淋巴細(xì)胞性NHL、高級(jí)小無核裂細(xì)胞性NHL、貯積病(bulkydisease)NHL、套細(xì)胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤、和瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom)巨球蛋白血癥)、何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、毛細(xì)胞性白血病、慢性成髓細(xì)胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病癥(PTLD)、以及與瘢痣病(phakomatoses)、水腫(諸如與腦瘤有關(guān)的)和梅格斯氏(Meigs)綜合征有關(guān)的異常血管增殖。[0054]短語“血管的”和“心血管的”可互換使用，描述具有刺激血管發(fā)生和/或心血管形成指征/適應(yīng)癥的患者，和抑制血管發(fā)生和/或心血管形成指征/適應(yīng)癥的患者。此類病癥包括例如動(dòng)脈疾病，諸如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、炎性血管炎、雷諾(Reynaud)氏病和雷諾氏現(xiàn)象、動(dòng)脈瘤、及動(dòng)脈再狹窄；靜脈和淋巴病癥，諸如血栓性靜脈炎、淋巴管炎、及淋巴水腫；及其它血管病癥，諸如外周血管病癥、AMD、癌癥諸如血管腫瘤例如血管瘤(毛細(xì)管和洞穴狀的(cavernous))、血管球瘤、毛細(xì)管擴(kuò)張、桿菌性血管瘤病、血管內(nèi)皮瘤、血管肉瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、卡波西(Kaposi)氏肉瘤、淋巴管瘤、及淋巴管肉瘤、腫瘤血管發(fā)生、創(chuàng)傷(trauma)諸如傷口(wound)、燒傷、和其它受傷組織、植入物固定(implantfixation)、瘢痕形成、缺血再灌注損傷(ischemiareperfusioninjury)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腦血管疾病、腎臟疾病諸如急性腎衰竭、及骨質(zhì)疏松。這還會(huì)包括咽峽炎、心肌梗死諸如急性心肌梗死、心臟肥大、及心力衰竭諸如充血性心力衰竭(CHF)。[0055]術(shù)語“糖尿病”指牽涉不適當(dāng)生成或利用胰島素的進(jìn)行性糖代謝疾病，且其特征在于高血糖和糖尿。該術(shù)語包括糖尿病的所有形式，諸如I型和II型糖尿病和胰島素耐受性糖尿病(insulin-resistantdiabete),諸如Mendenhall氏綜合征、沃納(Werner)綜合征、矮怪病(leprechaunism)、脂肪萎縮糖尿病(lipoatrophicdiabete)、及其它脂肪萎縮。[0056]術(shù)語“親和純化的”指通過使某物質(zhì)流經(jīng)親和層析柱洗脫而將其純化。[0057]ELISA[0058]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是同源二聚體糖蛋白，并且在發(fā)育過程中和與腫瘤有關(guān)的病理性血管發(fā)生中是血管形成的關(guān)鍵血管發(fā)生因子。VEGF的表達(dá)應(yīng)答低氧、及潛在地其它因素(諸如生長(zhǎng)因子、激素和癌基因)而增強(qiáng)(參見例如FerraraN:Vascularendothelialgrowthfactor:Basicscienceandclinicalprogress.EndocrineReviews25:581-611(2004))0人VEGF基因具有8個(gè)由內(nèi)含子分隔開的外顯子?？勺僐NA剪接導(dǎo)致至少4種主要同等型的生成，其單體形式具有121、165、189和206個(gè)氨基酸(參見例如HouckKA等，Thevascularendothelialgrowthfactorfamily:1dentificationofafourthmolecularspeciesandcharacterizationofalternativesplicingofRNA.MolEndocrinol5:1806-1814(1991);及TischerE等，Thehumangeneforvascularendothelialgrowthfactor.Multipleproteinformsareencodedthroughalternativeexonsplicing..1BiolChem266:11947-11954(1991))o還報(bào)道了較低頻率的同等型，包括那些單體形式具有145個(gè)(參見例如PoltorakZ等，VEGF145，asecretedvascularendothelialgrowthfactorisoformthatbindstoextracellularmatrix.JBiolChem272:7151-7158(1997))和183個(gè)(參見例如JingjingL等，HumanMullercellsexpressVEGF183，anovelsplicedvariantofvascularendothelialgrowthfactor.1nvestOphthalmolVisSci40:752-759(1999))氨基酸的同等型。所有VEGF同等型結(jié)合兩種受體酪氨酸激酶，即VEGFR-1(參見例如DeVriesC等，Thefms-liketyrosinekinase,areceptorforvascularendothelialgrowthfactor.Science255:989-991(1992))和VEGFR_2(參見例如TermanBI等，Identificationofanewendothelialcellgrowthfactorreceptortyrosinekinase.0ncogene6:1677-1683(1991))。VEGF165還與神經(jīng)租蛋白相互作用(參見例如SokerS等，Neuropilin-1isexpressedbyendothelialandtumorcellsasanisoform-specificreceptorforvascularendothelialgrowthfactor.Cell92:735-745(1998))。VEGF189和VEGF206以高親和力結(jié)合肝素，并且大部分被隔絕在胞外基質(zhì)(ECM)中。VEGF165以中等親和力結(jié)合肝素，并且部分可溶而部分結(jié)合至細(xì)胞表面和ECM。VEGF121不結(jié)合肝素，并且是易溶的。通過逆轉(zhuǎn)錄-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌和卵巢癌腫瘤標(biāo)本和細(xì)胞系中VEGF121和VEGF165是最優(yōu)勢(shì)性表達(dá)的變體，而VEGF206表達(dá)未檢出。發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞系中VEGF183和VEG189表達(dá)是檢測(cè)不到的或處于低水平，而在一些腫瘤標(biāo)本中檢出(參見例如StimpflM等，VascularEndothelialgrowthfactorsplicevariantsandtheirprognosticvalueinbreastandovariancancer.ClinicalCancerResearch8:2253-2259(2002))。[0059]活性VEGF片段可以通過纖溶酶切割而從ECM結(jié)合的VEGF中釋放，生成前110個(gè)氨基酸(參見例如KeytBA等，Thecarboxyl-terminaldomain(111-165)ofvascularendothelialgrowthfactoriscriticalforitsmitogenicpotency.1BiolChem271:7788-7795(1996))。這可能是血管發(fā)生的生理性和病理性過程中局部調(diào)節(jié)VEGF生物利用度的機(jī)制。參見例如HouckKA等，Dualregulationofvascularendothelialgrowthfactorbioavailabilitybygeneticandproteolyticmechanisms.1BiolChem267:26031-26037(1992);KeytBA等，Thecarboxy-terminaldomain(111-165)ofvascularendothelialgrowthfactoriscriticalforitsmitogenicpotency.1BiolChem271:7788-7795(1996);及RothD等，Plasminmodulatesvascularendothelialgrowthfactor-A-mediatedangiogenesisduringwoundrepair.AmPathology168:670-684(10-12)(2006)。然而，生物學(xué)樣品中的VEGFlltl濃度尚未有報(bào)道?；钚訴EGF片段還可以通過基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)切割而從ECM結(jié)合的VEGF中釋放。這得到了來自卵巢癌患者的腹水中具有1-110以外的氨基酸的降解VEGF片段的發(fā)現(xiàn)所支持。纖溶酶和MMP3兩者在腹水中檢出。參見例如LeeS，ShahlaMJ等，ProcessingofVEGF-Abymatrixmetalloproteinasesregulatesbioavailabilityandvascularpatterningintumors.1CellBiology169:681-691(2005)?[0060]針對(duì)各種抗原的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)包括那些基于比色法、化學(xué)發(fā)光、及熒光測(cè)定法的ELISA。ELISA已經(jīng)成功應(yīng)用于在血漿和尿樣品中測(cè)定少量的藥物和其它抗原性成分，不牽涉提取步驟，并易于實(shí)施。本文所述測(cè)定法是利用抗體作為針對(duì)VEGF和VEGFlltl+的捕捉試劑和可檢測(cè)抗體的ELISA。在某些實(shí)施方案中，該ELISA是基于細(xì)胞的。在測(cè)定法的第一步中，使懷疑含有VEGF或含有VEGFlltl+的生物學(xué)樣品與捕捉(或包被)抗體接觸并一起溫育，使得捕捉抗體捕捉或結(jié)合至VEGF或VEGFlltl+,使得其可以在檢測(cè)步驟中被檢出。檢測(cè)步驟牽涉使用可檢測(cè)抗體，其在與任何所結(jié)合的VEGF或VEGFlltl+接觸時(shí)結(jié)合至感興趣的蛋白質(zhì)(如果存在的話)，并使用檢測(cè)手段來檢測(cè)抗體上的標(biāo)記物，由此檢出所存在的VEGF或VEGFlltl+的存在或量。這種ELISA可以與識(shí)別總VEGF(例如美國(guó)專利N0.6，855，508；那些本文所述的ELISA，及那些本領(lǐng)域已知的ELISA)或VEGF同等型的ELISA相比較以測(cè)定所存在的VEGF的類型。[0061]例如，在某些實(shí)施方案中，所述測(cè)定法利用如下步驟:[0062]第I步[0063]在本文測(cè)定法的第I步中，使生物學(xué)樣品與固定化的捕捉(或包被)試劑接觸并一起溫育，所述試劑是抗VEGF單克隆抗體。該抗體可以來自任何物種，但優(yōu)選的單克隆抗體是鼠或大鼠或小鼠單克隆抗體，更優(yōu)選鼠的，最優(yōu)選自本文所鑒定的雜交瘤衍生的單抗5C3。因此，在具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，固定化的單克隆抗體是鼠單克隆抗體，最優(yōu)選單抗5C3。如下實(shí)現(xiàn)常規(guī)固定化，即或是在測(cè)定規(guī)程之前使捕捉試劑不溶解，如通過吸附至不溶解于水的基質(zhì)或表面(美國(guó)專利N0.3，720，760)或非共價(jià)或共價(jià)偶聯(lián)(例如使用戊二醛或碳二亞胺交聯(lián)，無論是否用例如硝酸和美國(guó)專利N0.3，645，852或Rotmans等，J.1mmunol.Methods57:87-98(1983)所述還原劑在先活化支持物)實(shí)現(xiàn)；或是在測(cè)定規(guī)程之后使捕捉試劑不溶解，例如通過免疫沉淀實(shí)現(xiàn)。[0064]用于固定化的固相可以是基本上不溶于水的且可用于免疫測(cè)定法的任何惰性支持物或載體，包括例如表面、顆粒、多孔基質(zhì)等形式的支持物。常用的支持物的例子包括小薄片、Sephadex、聚氯乙烯、塑料珠、及由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等制造的測(cè)定板或試管(包括96孔微量滴定板)、以及微粒材料，諸如濾紙、瓊脂糖、交聯(lián)的右旋糖苷、及其它多糖?；蛘?，反應(yīng)性不溶于水的基質(zhì)(諸如溴化氰活化的碳水化合物和美國(guó)專利N0.3，969，287;3,691,016;4，195，128;4，247，642;4，229，537;及4，330，440所述反應(yīng)性基片)適合用于捕捉試劑固定化。在一個(gè)實(shí)施方案中，固定化的捕捉試劑包被在微量滴定板上，更具體地，使用的優(yōu)選固相是可以用于一次分析數(shù)個(gè)樣品的多孔微量滴定板，例如微測(cè)試96孔ELISA板，諸如以NuneMaxisorb或Immulon出售的。在某些實(shí)施方案中，平板是MICR0TEST?或MAXIS0RP?96孔ELISA板，諸如以NUNCMAXISORB?或IMMUL0N?出售的。[0065]用上文所限定的捕捉試劑包被固相，所述捕捉試劑可以根據(jù)需要通過非共價(jià)的或共價(jià)的相互作用或物理連接而連接。用于附著的技術(shù)包括美國(guó)專利N0.4，376，110及其引用的參考文獻(xiàn)所述的那些。若共價(jià)的，則將平板或其它固相與交聯(lián)劑連同捕捉試劑在本領(lǐng)域公知的條件下一起溫育，例如諸如在室溫達(dá)I小時(shí)。[0066]用于將捕捉試劑附著至固相基片的常用交聯(lián)劑包括例如1，1_二(重氮乙?；?-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基-琥珀酰亞胺酯(例如具有4-疊氮-水楊酸的酯)、同雙功能亞氨酸酯(包括二琥珀酰亞氨基酯，諸如3，3’-二硫代二-(琥珀酰亞氨基-丙酸酯))、及雙功能馬來酰亞胺(諸如二-N-馬來酰亞胺-1，8-辛烷)。衍生化試劑(諸如甲基-3-[(對(duì)疊氮苯基)-二硫代]丙亞氨酸酯(pro-pioim1-date))產(chǎn)生光可活化的(photoactivatable)中間體，其能夠在光存在時(shí)形成交聯(lián)。[0067]如果利用96孔平板，那么典型地將它們用捕捉試劑包被(典型地在緩沖液諸如0.05M碳酸鈉中稀釋，通過溫育至少約10小時(shí)，更優(yōu)選至少過夜，在約4-20°C、或約4-8°C的溫度，及在約8-12的pH、或約pH9-10、或約pH9.6實(shí)現(xiàn))。如果期望較短的包被時(shí)間，可以例如在室溫包被96孔平板達(dá)2小時(shí)?？梢詫⑵桨逶跍y(cè)定法本身之前很久堆積和包被，然后可以以手動(dòng)、半自動(dòng)、或自動(dòng)方式(諸如通過使用機(jī)器人技術(shù))同時(shí)對(duì)數(shù)個(gè)樣品實(shí)施測(cè)定法。[0068]然后典型地用封閉劑處理經(jīng)包被的平板，所述封閉劑非特異性結(jié)合至結(jié)合位點(diǎn)并使其飽和以阻止游離配體對(duì)平板的孔上過多位點(diǎn)的不想要結(jié)合。適用于此目的的封閉劑的例子包括例如明膠、牛血清清蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、及脫脂乳。封閉處理典型地在如下條件發(fā)生，即在環(huán)境溫度約1-4小時(shí)，優(yōu)選約I至3小時(shí)，或在0-4°C過夜。[0069]包被和封閉后，將VEGF標(biāo)準(zhǔn)品(純化的VEGF)或待分析的生物學(xué)樣品(適當(dāng)稀釋的)添加至固定化相。優(yōu)選的稀釋率按體積計(jì)是約1-15%，優(yōu)選約10%。為此目的的、可以用于稀釋的緩沖液包括:(a)含有0.5%BSA,0.05%TWEEN20?去污劑(P20)、0.05%PR0CLIN?300抗生素、5mMEDTA、0.25%Chaps表面活性劑、0.2%βI球蛋白、及0.35ΜNaCl的PBS,pH7.4；(b)含有0.5%牛血清清蛋白、0.05%聚山梨酯20、5mMEDTA、0.25%CHAPS、0.2%牛Y-球蛋白、及0.35MNaCl的PBS,ρΗ7.4;(c)含有0.5%BSA、0.05%聚山梨酯20(Ρ20)、及0.05%PR0CLIN?300的PBS,pH7；(d)含有0.5%BSA、0.05%P20、0.05%PR0CLIN?300、5mMEDTA、及0.35MNaCl的PBS,ρΗ6.35；(e)含有0.5%BSA、0.05%P20、0.05%PR0CLIN?300、5mMEDTA、0.2%β_Y球蛋白、及0.35MNaCl的PBS,pH7.4;及(f)含有0.5%BSA,0.05%Ρ20、0.05%PR0CLIN?300、5mMEDTA,0.25%Chaps、及0.35ΜNaCl的PBS，pH7.4。PR0CLIN?300充當(dāng)防腐劑，而TWEEN20?充當(dāng)去污劑以消除非特異性結(jié)合。[0070]雖然捕捉試劑的濃度一般會(huì)由VEGF的感興趣濃度范圍來確定(要考慮生物學(xué)樣品的任何必需稀釋)，但是正常情況下捕捉試劑的終濃度會(huì)憑經(jīng)驗(yàn)來確定以使測(cè)定法在感興趣范圍里的靈敏度最大化。[0071]選擇用于溫育樣品和固定化的捕捉試劑的條件以使測(cè)定法的靈敏度最大化并使解離最小化。優(yōu)選地，溫育在相當(dāng)恒定的溫度完成，其范圍從約0°c至約40°C，優(yōu)選約20-25°C。溫育時(shí)間主要取決于溫度，一般不大于約10小時(shí)以避免不靈敏的測(cè)定法。優(yōu)選地，溫育時(shí)間從約0.5至3小時(shí)，更優(yōu)選1.5-3小時(shí)，在室溫，以使游離VEGFlltl+或VEGF對(duì)捕捉試劑的結(jié)合最大化。若添加蛋白酶抑制劑以阻止生物學(xué)流體中的蛋白酶降解VEGF，則溫育的持續(xù)時(shí)間可以更長(zhǎng)。[0072]在本階段，溫育混合物的pH通常會(huì)在約4-9.5的范圍內(nèi)，優(yōu)選在約6_9的范圍內(nèi)，更優(yōu)選約7-8，且最優(yōu)選的測(cè)定(ELISA)稀釋劑的pH是pH7.4。選擇溫育緩沖液的pH以維持捕捉試劑對(duì)正被捕捉的VEGFlltl+或VEGF的顯著水平特異性結(jié)合?？梢圆捎酶鞣N緩沖液以在本步驟過程中達(dá)到并維持期望的pH，包括硼酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、Tris-HCl或Tris-磷酸鹽、醋酸鹽、巴比妥等。采用的具體緩沖液對(duì)于本發(fā)明不是至關(guān)重要的，但在各個(gè)測(cè)定法中，一種緩沖液可能比另一種優(yōu)選。[0073]第2步[0074]在本文測(cè)定方法的第2步(其是任選的)中，將生物學(xué)樣品與固定化的捕捉試劑分開(優(yōu)選通過清洗來實(shí)現(xiàn))以除去未捕獲的分子。用于清洗的溶液一般是緩沖液(“清洗緩沖液”)，其PH使用上文所述針對(duì)溫育步驟的考慮因素和緩沖液來確定，優(yōu)選的pH范圍是約6-9?？梢赃M(jìn)行三次或更多次清洗。清洗溫度一般從冰箱溫度至中等溫度(測(cè)定期間維持恒定溫度)，典型地為約0-40°C，更優(yōu)選約4-30°C。例如，可以在清洗之前將清洗緩沖液放置在貯存器中在4°C在冰中，并可以將洗板器用于本步驟。在該階段還可以添加交聯(lián)劑或其它合適的試劑以容許新結(jié)合的VEGFlltl+或VEGF被共價(jià)附著至捕捉試劑，若對(duì)所捕獲的VEGFlltl+或VEGF可能在隨后的步驟中在某種程度上解離存有任何擔(dān)心的話。[0075]第3步[0076]在下一步中，使固定化的捕捉試劑與可檢測(cè)抗體接觸，優(yōu)選在約20_40°C的溫度，更優(yōu)選約20_25°C，其中接觸的準(zhǔn)確溫度和時(shí)間主要取決于采用的檢測(cè)手段。例如，在使用鏈霉親合素-過氧化物酶和3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺作為檢測(cè)手段時(shí)，例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，實(shí)施接觸(例如約I小時(shí)或更長(zhǎng))以使信號(hào)放大至最大限度。在清洗平板后，優(yōu)選將相對(duì)于游離VEGFlltl+或VEGF的預(yù)期最高濃度(如上文所述)摩爾過量的抗體添加至平板。該抗體是可直接檢測(cè)的或可間接檢測(cè)的。雖然可檢測(cè)抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，例如在某些實(shí)施方案中，但是其是單克隆抗體，在一個(gè)實(shí)施方案中，其是鼠的，且在一個(gè)實(shí)施方案中，其是單抗A4.6.1。同樣，可檢測(cè)抗體可以是可直接檢測(cè)的，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，其具有比色標(biāo)記物，且在另一個(gè)實(shí)施方案中，其具有熒光測(cè)定標(biāo)記物。更優(yōu)選地，可檢測(cè)抗體是生物素化的，且檢測(cè)手段是親合素或鏈霉親合素-過氧化物酶和3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺。檢測(cè)手段的讀出可以是熒光測(cè)定的或比色的?？贵w的親和力必須高得足以使得可以檢出少量的游離VEGFlltl+或VEGF，但又高得不足以引起VEGFlltl+或VEGF從捕捉試劑中拖出。[0077]第4步[0078]在測(cè)定方法的最后一步中，使用針對(duì)可檢測(cè)抗體的檢測(cè)手段來測(cè)量目前被結(jié)合至捕捉試劑的游離VEGF的水平。若生物學(xué)樣品來自血管、糖尿病、或癌癥患者，則測(cè)量步驟優(yōu)選包括比較作為以上三步結(jié)果而發(fā)生的反應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線以測(cè)定與正常個(gè)體相比的VEGFlltl+或VEGF的水平，或優(yōu)選包括比較作為以上三步結(jié)果而發(fā)生的反應(yīng)和識(shí)別不同同等型或總VEGF的另一種VEGFELISA以在比較ELISA且任選地與正常個(gè)體比較后測(cè)定VEGF類型的水平。[0079]抗體生成[0080]針對(duì)VEGF的多克隆抗體一般通過在動(dòng)物中多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射VEGF和佐劑來生成。使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來酰亞胺苯甲?；腔牾啺孵?通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N=C=NR,其中R和R1是不同的烴基，將VEGF或包含靶氨基酸序列的片段與在待免疫物種中有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的，例如匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制劑。[0081]用作包被或可檢測(cè)抗體的抗體可以獲自任何方便的脊椎動(dòng)物來源，諸如鼠、靈長(zhǎng)類、兔類(Iagomorpha)、山羊、家兔、大鼠、雞、牛、羊、馬、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物、或豬。還可以采用嵌合的或人源化的抗體，如記載于例如美國(guó)專利N0.4，816，567;Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851(1984);Neuberger等,Nature312:604(1984);Takeda等.Nature314:452(1985);及1998年10月15日公布的WO98/45331，以及上述那些別的參考文獻(xiàn)中的。[0082]通過將Img或Iμg偶聯(lián)物(分別用于家兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和，并將該溶液皮內(nèi)注射于多個(gè)部位，由此將動(dòng)物針對(duì)免疫原性偶聯(lián)物或衍生物進(jìn)行免疫。一個(gè)月后，通過多個(gè)部位的皮下注射，用弗氏不完全佐劑中偶聯(lián)物初始量的1/5-1/10對(duì)動(dòng)物進(jìn)行強(qiáng)化。7-14天后，采集動(dòng)物的血液，并測(cè)定血清的抗VEGF滴度。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行強(qiáng)化直到滴度達(dá)到平臺(tái)(plateaus)。優(yōu)選的是,將動(dòng)物用VEGF但與不同蛋白質(zhì)和/或通過不同交聯(lián)劑偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物進(jìn)行強(qiáng)化。偶聯(lián)物還可在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中作為蛋白質(zhì)融合物來制備。同樣，使用凝聚劑諸如明礬來增強(qiáng)免疫應(yīng)答。生成多克隆抗體的方法記載于很多免疫學(xué)教科書中，諸如Davis等，Microbiology,第3版,(Harper和Row,NewYork,NewYork,1980)。[0083]如下制備單克隆抗體，即從經(jīng)免疫的動(dòng)物中回收脾細(xì)胞，以常規(guī)方式使該細(xì)胞永生化(例如通過與骨髓瘤細(xì)胞融合或通過埃巴(Epstein-Barr)病毒轉(zhuǎn)化而實(shí)現(xiàn))，并篩選表達(dá)期望抗體的克隆。參見例如Kohler和Milstein,Eur.1.1mmunol.6:511(1976)。單克隆抗體或單克隆抗體的抗原結(jié)合區(qū)(諸如Fab或(Fab)2片段)可以備選地通過重組方法來生成。[0084]合適抗體的例子包括已經(jīng)用于正被討論的蛋白質(zhì)的已知RIA的那些抗體，例如針對(duì)本文介紹中給出的參考文獻(xiàn)所述VEGF的那些抗體。[0085]在某些實(shí)施方案中，使用了抗VEGF抗體5C3(該抗體可以由以ATCC編號(hào)PTA-7737保藏的雜交瘤獲得或生成)，任選地，與另一種抗VEGF抗體A4.6.1一起使用。本發(fā)明還提供了不能結(jié)合VEGF1-110但能與雜交瘤細(xì)胞系PTA-7737所生成的單克隆抗體結(jié)合相同VEGFlltl+表位的抗體。提供了以ATCC保藏號(hào)PTA-7737保藏的雜交瘤5C3.1.1。[0086]檢測(cè)[0087]向固定化的捕捉試劑添加的抗體會(huì)被或是直接標(biāo)記，或是間接標(biāo)記，其通過在洗去過量的第一抗體后添加摩爾過量的針對(duì)第一抗體的動(dòng)物物種IgG的第二標(biāo)記抗體來實(shí)現(xiàn)。在后者即間接測(cè)定法中，將針對(duì)第一抗體的經(jīng)標(biāo)記抗血清添加至樣品，使得在原位產(chǎn)生經(jīng)標(biāo)記的抗體。[0088]用于或是第一抗體或是第二抗體的標(biāo)記物是不干擾游離VEGFlltl+或VEGF對(duì)抗體結(jié)合的任何可檢測(cè)官能度。合適標(biāo)記物的例子是那些已知用于免疫測(cè)定法的眾多標(biāo)記物，包括可以直接檢測(cè)的模塊，諸如熒光染料、化學(xué)發(fā)光的、及放射性的標(biāo)記物，以及必須進(jìn)行反應(yīng)或衍生化才能被檢測(cè)的模塊，諸如酶。此類標(biāo)記物的例子包括放射性同位素32p、14c、1251、3H、及1311，熒光團(tuán)諸如稀土螯合物或熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹酰、傘形酮、螢光素酶例如螢火蟲螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶(美國(guó)專利N0.4，737，456)、螢光素、2，3-二氫酞嗪二酮，辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶，3-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖類氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，雜環(huán)氧化酶諸如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，偶聯(lián)有使用過氧化氫來氧化染料前體的酶諸如HRP，乳過氧化物酶，或微過氧化物酶，生物素/親合素，生物素/鏈霉親合素，生物素/鏈霉親合素-3-半乳糖苷酶及MUG，自旋標(biāo)記物，噬菌體標(biāo)記物，穩(wěn)定自由基，等等。如上文所述，熒光測(cè)定檢測(cè)是一個(gè)例子。[0089]可利用常規(guī)方法來將這些標(biāo)記物共價(jià)地結(jié)合至蛋白質(zhì)或多肽。例如，偶聯(lián)齊IJ(諸如二醛、碳二亞胺、二馬來酰亞胺、二亞氨酸酯(bis-1midate)、重偶氮化聯(lián)苯胺(bis-diazotizedbenzidin)等等)可以用于使抗體加上上述突光的、化學(xué)發(fā)光的、及酶標(biāo)記物的標(biāo)簽。參見例如美國(guó)專利N0.3，940，475(熒光測(cè)定法)和3，645，090(酶)；Hunter等，Nature144:945(1962);David等，Biochemistry13:1014-1021(1974);Pain等,1.1mmuno1.Methods40:219-230(1981);及Nygren,1.Histochem.andCytochem.30:407-412(1982)。在某些實(shí)施方案中，本文的標(biāo)記物是熒光的以使放大和靈敏度增加至8pg/ml，更優(yōu)選生物素與鏈霉親合素-半乳糖苷酶和MUG用于放大信號(hào)。在某些實(shí)施方案中，使用比色標(biāo)記物，例如，其中可檢測(cè)抗體是生物素化的，且檢測(cè)手段是親合素或鏈霉親合素-過氧化物酶和3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺。[0090]此類標(biāo)記物(包括酶)與抗體的偶聯(lián)是免疫測(cè)定技術(shù)中對(duì)于普通技術(shù)人員而言標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)程。參見例如O’Sullivan等，“MethodsforthePreparationofEnzyme-antibodyConjugatesforUseinEnzymeImmunoassay,”于MethodsinEnzymology,編J.J.Langone和H.VanVunakis,卷73(AcademicPress,NewYork,NewYork,1981)，頁(yè):147-166。[0091]添加最后的經(jīng)標(biāo)記抗體后，如下測(cè)定所結(jié)合抗體的量，即通過清洗而除去過量的未結(jié)合經(jīng)標(biāo)記抗體，然后使用對(duì)標(biāo)記物適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法來測(cè)量附著的標(biāo)記物量，并將測(cè)量得到的量與生物學(xué)樣品中游離VEGFlltl+或VEGF的量相關(guān)聯(lián)。例如，在酶的情況中，顯現(xiàn)并測(cè)量的顏色量會(huì)是對(duì)VEGFlltl+或VEGF存在量的直接測(cè)量。具體地，若HRP是標(biāo)記物，則使用底物3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺在450nm吸光度檢測(cè)顏色。[0092]在一個(gè)例子中，從固定化相中清洗針對(duì)第一未標(biāo)記抗體的經(jīng)酶標(biāo)記的第二抗體后，通過將固定化的捕捉試劑與酶底物一起溫育來顯現(xiàn)并測(cè)量顏色或化學(xué)發(fā)光。然后通過與平行運(yùn)行的標(biāo)準(zhǔn)VEGF所產(chǎn)生的顏色或化學(xué)發(fā)光相比較而計(jì)算游離VEGFlltl+或VEGF濃度的量。[0093]試劑盒[0094]為方便起見，本發(fā)明的測(cè)定方法可以以試劑盒形式提供。該試劑盒是包括如下基本元件的成套組合:[0095](a)由針對(duì)人VEGF分子的單克隆抗體構(gòu)成的捕捉試劑，其中所述單克隆抗體識(shí)別VEGF110+;和[0096](b)由能結(jié)合VEGF的KDR和FLTl受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可檢測(cè)(經(jīng)標(biāo)記的或未標(biāo)記的)抗體構(gòu)成的檢測(cè)試劑。這些基本元件在上文有限定。在某些實(shí)施方案中，檢測(cè)試劑包含能結(jié)合VEGFl-110表位的可檢測(cè)抗體。[0097]優(yōu)選地，試劑盒還包含捕捉試劑的固體支持物，其可以作為分開的元件提供或者其上已經(jīng)固定化捕捉試劑。因此，試劑盒中的捕捉抗體可以固定化在固體支持物上，或者它們可以固定化在試劑盒所包括的或與試劑盒分開提供的這種支持物上。[0098]優(yōu)選地，捕捉試劑包被在微量滴定板上。檢測(cè)試劑可以是直接檢測(cè)的經(jīng)標(biāo)記抗體或由不同物種中產(chǎn)生的針對(duì)未標(biāo)記抗體的經(jīng)標(biāo)記抗體檢測(cè)的未標(biāo)記抗體。若標(biāo)記物是酶，則試劑盒通常會(huì)包括酶所需輔因子和底物，且若標(biāo)記物是熒光團(tuán)，則包括提供可檢測(cè)生色團(tuán)的染料前體。若檢測(cè)試劑是未標(biāo)記的，則試劑盒還可以包含針對(duì)可檢測(cè)抗體的檢測(cè)手段，諸如針對(duì)未標(biāo)記抗體的經(jīng)標(biāo)記抗體，優(yōu)選以熒光測(cè)定檢測(cè)形式。若標(biāo)記物是酶，則試劑盒通常會(huì)包括酶所需輔因子和底物，若標(biāo)記物是熒光團(tuán)，則包括提供可檢測(cè)生色團(tuán)的染料前體，且若標(biāo)記物是生物素，則包括親合素，諸如親合素、鏈霉親合素、或與HRP或β-半乳糖苷酶偶聯(lián)的鏈霉親合素及MUG。[0099]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，捕捉試劑是單克隆抗體，優(yōu)選嚙齒類動(dòng)物的，更優(yōu)選鼠的或大鼠的或小鼠的，還更優(yōu)選鼠的，且最優(yōu)選單抗5C3。同樣，在某些實(shí)施方案中，可檢測(cè)抗體是生物素化的單克隆抗體，該單克隆抗體是嚙齒類動(dòng)物的，更優(yōu)選鼠的或大鼠的或小鼠的，還更優(yōu)選鼠的，還更優(yōu)選單抗A4.6.1。在某些實(shí)施方案中，捕捉試劑固定化在這種試劑盒中。[0100]在某些實(shí)施方案中，試劑盒可以包含用于本文所述比較研究的多種ELISA，用于檢測(cè)各種形式的VEGF和VEGF11Q+。[0101]典型地，試劑盒還包含實(shí)施測(cè)定法的說明書，和/或作為抗原標(biāo)準(zhǔn)品的VEGF(例如純化的VEGF，優(yōu)選重組生成的VEGF，及VEGF110)，以及其它添加物，諸如穩(wěn)定劑、清洗和溫育緩沖液等等。[0102]VEGF標(biāo)準(zhǔn)品的例子是可以從Genentech,Inc.(SouthSanFrancisco,California)和本文所述的那些公司和方法獲得的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生成的重組人VEGF。[0103]試劑盒的成分會(huì)以預(yù)定比例提供，各試劑的相對(duì)量適當(dāng)?shù)刈兓栽谠噭┤芤褐刑峁┗旧鲜箿y(cè)定法的靈敏度最大化的濃度。具體地，試劑可以以干粉(通常是凍干的，包括賦形劑)提供，在溶解后其會(huì)提供濃度適于與待測(cè)試樣品組合的試劑溶液。[0104]材料保藏[0105]以下材料已保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209USA)(ATCC):[0106]5C3.1.1于2006年7月19日保藏于ATCC且保藏號(hào)為PTA-7737。[0107]分類命名保藏單位保藏號(hào)保藏日期[0108]小鼠的脾細(xì)胞系:抗VEGF5C3.1.1ATCCPTA-77372006年7月19日[0109]以下材料已保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,12301ParklawnDrive,Rockville,MD20852USA)(ATCC):[0110]A4.6.1于1991年3月29日保藏于ATCC且保藏號(hào)為HB10709。[0111]分類命名保藏單位保藏號(hào)保藏日期[0112]雜交瘤，A4.6.1(抗-hVEGF)ATCCHB107091991年3月29日[0113]保藏是依據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約(BudapestTreaty)及其(布達(dá)佩斯條約)實(shí)施細(xì)則的規(guī)定進(jìn)行的。這保證了自保藏之日起保存保藏的存活培養(yǎng)物30年。保藏物可根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款通過ATCC獲得，并服從Genentech公司與ATCC之間的協(xié)議，它保證了在有關(guān)美國(guó)專利授權(quán)后或者在任何美國(guó)或外國(guó)專利申請(qǐng)向公眾公開后，以兩者中居先者為準(zhǔn)，公眾可永久且不受限制的獲得保藏培養(yǎng)物的后代，而且保證了依據(jù)35USC§122及依照它的管理章程(包括37CFR§1.14，特別要提及8860G638)由美國(guó)專利和商標(biāo)局長(zhǎng)批準(zhǔn)的個(gè)人可獲得保藏培養(yǎng)物的后代。[0114]本申請(qǐng)的受讓人已同意，若保藏材料的培養(yǎng)物在合適條件下培養(yǎng)時(shí)死亡、丟失或遭到破壞，則他將在接到通知后迅速用同一培養(yǎng)物的另一份材料更換。所保藏材料的可獲得性并不解釋為對(duì)違反任何政府機(jī)構(gòu)依據(jù)其專利法所授予的權(quán)利實(shí)施本發(fā)明的許可。[0115]認(rèn)為說明書足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。本發(fā)明的范圍不受所保藏構(gòu)建體的限制，因?yàn)樗２貙?shí)施方案意圖作為本發(fā)明某些方面的單一例證，任何功能相當(dāng)?shù)臉?gòu)建物都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文中的材料保藏不構(gòu)成承認(rèn)書面說明不足以能夠?qū)嵺`本發(fā)明的任何方面，包括其最佳模式，也不應(yīng)解釋為將權(quán)利要求的范圍限制于它所呈現(xiàn)的具體例證。實(shí)際上，根據(jù)上述描述，除了本文所顯示和描述的，本發(fā)明的各種更改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，而且落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。[0116]應(yīng)理解本文所述實(shí)施例和實(shí)施方案僅僅為了例示目的，并且依照它們的各種修飾或變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是有提示的，并包括在本申請(qǐng)的精神和范圍及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。通過提及將本文中所引用的所有出版物、專利、和專利申請(qǐng)完整收入本文以用于所有目的。實(shí)施例[0117]實(shí)施例1:[0118]已知血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)(其由于可變RNA剪接而以不同同等型表達(dá))在腫瘤血管發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。我們測(cè)量了VEGF165和總VEGF的濃度，并評(píng)估了VEGFlltl(其是通過纖溶酶消化VEGF而生成的活性片段)的相對(duì)量。ELISAA(VEGF165-206ELISA)檢測(cè)VEGF165和更長(zhǎng)的同等型但不是VEGF121。ELISAB(VEGF110-206ELISA)檢測(cè)VEGF165及同等型VEGF121和VEGF11q。ELISAC(VEGF121-206ELISA)檢測(cè)VEGF165及更長(zhǎng)的同等型，VEGF121及分子量大于VEGFlltl但不是VEGFlltl的VEGF片段(本文稱為“VEGF11(I+”)。[0119]材料和方法[0120]試劑和細(xì)胞:重組VEGF165(Genentech)、VEGF121(PeproTech,RockyHill,NewJersey)、VEGF8109(由VEGF165的氨基酸8-109組成)及截短的VEGF121(R&DSystems,Minneapolis,MN)在大腸桿菌中生成。根據(jù)質(zhì)譜法，截短的VEGF121具有完整的N端，但具有26KDa的質(zhì)量，這與依照制造商從羧基末端截短大約9個(gè)氨基酸一致。它在通過還原性條件下的SDS-PAGE分析時(shí)在VEGFlltl和VEGF121之間遷移。VEGFlltl通過纖溶酶消化VEGF165而制備(KeytBA等，Thecarboxyl-terminaldomain(111-165)ofvascularendothelialgrowthfactoriscriticalforitsmitogenicpotency.TBiolChem271:7788-7795(1996))。質(zhì)譜法測(cè)量得到的分子量是25390，其與理論質(zhì)量25389匹配。濃度使用bicinchorinicacid法(Pierce,Rockford,IL)測(cè)定。用于VEGF8_109、VEGF121和VEGF165濃度計(jì)算的分子量分別是23.8、28.9和38.2KDa。單克隆抗VEGF抗體A4.6.1,3.5F8、2E3和5C3通過用CHO細(xì)胞中生成的VEGF165免疫小鼠來生成(KimKJ等，Thevascularendothelialgrowthfactorproteins:1dentificationofbiologicallyrelevantregionsbyneutralizingmonoclonalantibodies.GrowthFactors7:53-64(1992))。乳腺細(xì)胞系SK-BR-3、BT-474、T-47D和MCF-7以及卵巢細(xì)胞系ES-2、0VCAR-3和SK-0V-3(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville,MD)培養(yǎng)在RPM1、2mML-谷氨酰胺及10%FBS(除對(duì)于0VCAR-3的20%外)中，在37°C于增濕的5%C02培養(yǎng)箱中。[0121]A673細(xì)胞的條件化培養(yǎng)基中的VEGF的純化:將A673細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)培養(yǎng)于50:50F12/DMEM、2mML-谷氨酰胺及5%FBS中至60%匯合，然后在無血清培養(yǎng)基(Genentech)中直至匯合。使用用CNBr活化的Sepharose(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)制備的A4.6.1-Sepharose柱從上清液中純化VEGF。將柱洗脫液和重組VEGF對(duì)照(每道0.2μg)在還原性條件下的18%Tris-甘氨酸凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA)上電泳,并印跡至硝酸纖維素上。將印跡用含3%牛血清清蛋白的0.5MTris-HClρΗ7.5、1.5MNaCl、50mMEDTA、0.5%Tritionl00封閉，并用200ng/ml3.5F8或A4.6.1接著用2ng/ml山羊抗小鼠Fc-HRP(JacksonImmunoResearch)探查。將信號(hào)使用SuperSignalWestDura(Pierce)來顯現(xiàn)，并記錄在X射線膠片上。[0122]用于測(cè)量VEGF濃度的VEGFELISA[0123]ELISAA(VEGF165-206ELISA):除非另有說明，熒光測(cè)定ELISAA用于測(cè)量樣品中的VEGF。熒光測(cè)定ELISAA使用3.5F8來包被，使用生物素化的A4.6.1接著使用鏈霉親合素-P-半乳糖苷酶來檢測(cè)，并使用4-甲基傘形基-P-D-半乳糖苷作為底物(RodriguezCR等，Asensitivefluorometricenzyme-linkedimmunosorbentassaythatmeasuresvascularendothelialgrowthfactorl65inhumanplasma.TTmmunoIMethods219:45-55(1998))。VEGF165標(biāo)準(zhǔn)品為l_128pg/mL、或0.026-3.35pM。比色ELISAA使用3.5F8來包被，使用生物素化的A4.6.1來檢測(cè)，其遵循用于下文所述ELISAC的方案。VEGF165標(biāo)準(zhǔn)品為1.6-200pg/mL。[0124]ELISAB(VEGF110-206ELISA)(先前稱為VEGF121-206ELISA,KonecnyGE等,AssociationbetweenHER-2/neuandVascularEndothelialGrowthFactorExpressionPredictsClinicalOutcomeinPrimaryBreastCancerPatients.ClinicalCancerResearchlO:1706-1716(2004)):用50mM碳酸鹽緩沖液pH9.6中的0.g/ml抗體A4.6.1以100111/孔在41:包被]\&?150印96孔微孔板過夜。這步之后且在與含0.05%聚山梨酯20的PBS，pH7.4進(jìn)行的隨后室溫溫育步驟之間清洗平板。用PBS(150ia/孔)中的0.5%牛血清清蛋白、10ppmProclin?300(Supelco,Bellefonte,PA)封閉平板達(dá)I小時(shí)。將VEGF標(biāo)準(zhǔn)品(1.56-200pg/mlVEGF165或0.0409-5.24pMVEGF,以二倍連續(xù)稀釋)及含有0.5%牛血清清蛋白、0.05%聚山梨酯20、5mMEDTA、0.25%CHAPS、0.2%牛球蛋白(Sigma,St.Louis,MO)及0.35MNaCl的PBS,pH7.4(樣品緩沖液)中以兩倍或三倍連續(xù)稀釋的連續(xù)稀釋樣品(最小1:10稀釋)添加至平板(100yl/孔)并溫育2小時(shí)。如下檢測(cè)所結(jié)合的VEGF，即在平板上溫育生物素化的2E3(或能結(jié)合VEGF的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的另一種抗體)達(dá)I小時(shí)，接著溫育鏈霉親合素-HRP(Amersham,Copenhagen,Denmark)達(dá)30分鐘,溫育生物素基-酪酸胺(tyramide)(ELASTELISA放大系統(tǒng)，PerkinElmerLifeSciencesInc.,MA)達(dá)15分鐘，并溫育鏈霉親合素-HRP達(dá)30分鐘。添加底物TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)(Kirkegaard&PerryLaboratories),并通過添加IM憐酸來停止反應(yīng)。在Titertek疊式讀板儀(ICN，CostaMesa,CA)上在450nm處讀取吸光度。使用四參數(shù)回歸曲線擬合程序(KaleidaGraph,Synergysoftware,Reading,PA)來擬合滴定曲線。使用落入標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍里的數(shù)據(jù)點(diǎn)來計(jì)算樣品中推定的VEGF濃度。在減去用于本研究的10%血漿中推定的2.lpg/ml內(nèi)源VEGF后，10%人EDTA血衆(zhòng)(GoldenWestBiologicalsInc.,Temecula,CA)中1.56-200pg/mlVEGF165的回收率是92-120%。[0125]ELISAC(VEGF121-206ELISA):將微孔板用IUg/ml抗VEGF5C3抗體包被，并如上所述進(jìn)行封閉。將VEGF標(biāo)準(zhǔn)品(4.00-512pg/mlVEGF165或0.105-13.4pMVEGF，以2倍連續(xù)稀釋)和樣品緩沖液中連續(xù)稀釋的樣品添加至平板。將平板溫育2小時(shí)。通過添加生物素化的A4.6.1接著添加鏈霉親合素-HRP和作為底物的TMB來檢測(cè)所結(jié)合的VEGF。讀取平板，并如上文所述的那樣分析數(shù)據(jù)。在減去用于本研究的10%血漿中1.6pg/ml推定的內(nèi)源VEGF后，10%血漿中4.00-512pg/mlVEGF165的回收率是77-101%。[0126]結(jié)果與討論[0127]VEGFELISA:前述ELISAA使用3.5F8來包被，并使用生物素化的A4.6.1來檢測(cè)(RodriguezCR等，Asensitivefluorometricenzyme-linkedimmunosorbentassaythatmeasuresvascularendothelialgrowthfactorl65inhumanplasma.JTmmunoIMethods219:45-55,1998)。其檢測(cè)VEGF165(VEGF165)而非VEGF121(I)(VEGF121(I))(其購(gòu)白R(shí)&DSystems并從羧基末端缺失大約9個(gè)氨基酸)、及VEGF121(2)(VEGF121(2))(其購(gòu)自P印roTech)(圖1A)。根據(jù)BIAcore，3.5F8結(jié)合VEGF165而非VEGF121。A4.6.1結(jié)合所有同等型和VEGFllt!中存在的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(KimKJ等，Thevascularendothelialgrowthfactorproteins:1dentificationofbiologicallyrelevantregionsbyneutralizingmonoclonalantibodies.GrowthFactors7:53—64,1992)。3.5F8可倉(cāng)泛在氨基酸116和118(其不存在于VEGF121中)附近結(jié)合。5C3可能在氨基酸111-113(其不存在于VEGFlltl中)附近結(jié)合(圖3)。ELISAA可能可以檢測(cè)含有VEGF165序列的VEGF同等型，包括VEGF183、VEGF189和VEGF206(參見例如StimpflM等,VascularEndothelialgrowthfactorsplicevariantsandtheirprognosticvalueinbreastandovariancancer.ClinicalCancerResearch8:2253-2259,2002)oELISAB(先前稱為VEGF121-206ELISA,KonecnyGE等,AssociationbetweenHER-2/neuandVascularEndothelialGrowthFactorExpressionPredictsClinicalOutcomeinPrimaryBreastCancerPatients.ClinicalCancerResearchlO:1706-1716，2004)使用A4.6.1來包被，并使用生物素化的2E3來檢測(cè)。A4.6.1和2E3結(jié)合所有三種分子中存在的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。參加例如KimKJ等，Thevascularendothelialgrowthfactorproteins:1dentificationofbiologicallyrelevantregionsbyneutralizingmonoclonalantibodies.GrowthFactors7:53-64(1992);及MullerYA等，Vascularendothelialgrowthfactor:Crystalstructureandfunctionalmappingofthekinasedomainreceptorbindingsite.ProcNatlAcadSciUSA94:7192-7197(1997)。還可以使用在這些區(qū)域里結(jié)合的其它抗體。這種ELISA平等地檢測(cè)VEGF165、VEGF121、截短的VEGF121(從羧基末端缺失大約9個(gè)氨基酸)、VEGF110及VEGF8_1Q9(圖1B)。這種ELISA可以檢測(cè)總VEGF，包括大于通過基質(zhì)金屬蛋白酶消化所生成的VEGFlltl的片段。本文所述ELISAC(其使用5C3來包被，并使用生物素化的A4.6.1來檢測(cè))平等地檢測(cè)VEGF165、VEGF121、及截短的VEGF121，但不檢測(cè)VEGF110或VEGF8-109(圖1C)。根據(jù)BIAcore,5C3結(jié)合VEGF121而非VEGF81090這種ELISA可以檢測(cè)VEGF1ich2ci6所檢測(cè)的所有VEGF分子，除VEGFlltl及更小片段外。[0128]對(duì)于使用最小1:10稀釋的樣品中的VEGF，ELISAA、ELISAB和ELISAC的靈敏度分別是10、16和40pg/mlVEGF165(或?qū)τ诓煌琕EGF同等型和片段分別為0.26,0.41和1.05pM)。ELISAB和ELISAC是可重現(xiàn)的(表I和2)。ELISAB和ELISACfVEGF(VEGF-A)是特異性的。濃度高至50ng/ml的VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D僅給出背景信號(hào)。胰島素樣生長(zhǎng)因子1、生長(zhǎng)激素、重組神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子(Genentech)、血小板衍生生長(zhǎng)因子AB、胎盤生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子0I(R&DSystems)(高至200ng/ml)僅給出背景信號(hào)。肝素(LeoLaboratories,Bucks,UK和Dublin,Ireland)(高至100U/ml)對(duì)測(cè)定法沒有顯著效應(yīng)。[0129]表I=ELISAB(VEGF110_206ELISA)。標(biāo)準(zhǔn)品范圍是緩沖液中的1.56_200pg/mlVEGF165(0.0409-5.24pMVEGF)。1.56pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)于空白的OD比率是1.37±0.11。CV是變異系數(shù)。【權(quán)利要求】1.一種用于在生物學(xué)樣品中檢測(cè)選擇性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)形式(VEGFlltl+)的方法，包括如下步驟:(a)使生物學(xué)樣品與固定化至固體支持物的捕捉試劑接觸并一起溫育，其中所述捕捉試劑是與針對(duì)人VEGF的抗體5C3識(shí)別相同表位的抗體，所述單克隆抗體特異性結(jié)合人VEGF中大于110的殘基；(b)將所述生物學(xué)樣品與所述固定化捕捉試劑分開；(C)使所述固定化捕捉試劑-靶物分子復(fù)合物與可檢測(cè)抗體接觸，所述可檢測(cè)抗體能結(jié)合VEGF的KDR和/或FLTl受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或能結(jié)合VEGFl-110中的表位；并(d)使用針對(duì)所述可檢測(cè)抗體的檢測(cè)手段來測(cè)量所述捕捉試劑所結(jié)合的VEGFlltl+的水平。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物學(xué)樣品是從人受試者中分離的。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述人受試者是血管、糖尿病、或癌癥患者，且所述測(cè)量步驟(d)還包括與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較以測(cè)定與正常個(gè)體相比的VEGF水平。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物學(xué)樣品是腫瘤溶胞產(chǎn)物、血漿、血清或尿。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述捕捉試劑是5C3單克隆抗體。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述固定化捕捉試劑包被在微量滴定板上。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述可檢測(cè)抗體是可直接檢測(cè)的。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述可檢測(cè)抗體受熒光測(cè)定試劑放大。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述可檢測(cè)抗體是生物素化的，且所述檢測(cè)手段是親合素或鏈霉親合素-過氧化物酶和3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述可檢測(cè)抗體是單克隆抗體。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述可檢測(cè)抗體是鼠單克隆抗體。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述固定化單克隆抗體是單抗5C3，且所述可檢測(cè)抗體是單抗A4.6.1。13.一種用于在生物學(xué)樣品中檢測(cè)VEGFlltl+的免疫測(cè)定試劑盒，該試劑盒包含:(a)作為捕捉試劑的針對(duì)人VEGF的抗體，其中所述單克隆抗體能特異性結(jié)合人VEGF中大于110白勺殘基;和(b)作為檢測(cè)試劑的可檢測(cè)抗體，其能結(jié)合VEGF的KDR和/或FLTl受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或能結(jié)合VEGFl-110中的表位。14.權(quán)利要求13的試劑盒，其還包含所述捕捉試劑的固體支持物。15.權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述捕捉試劑固定化在所述固體支持物上。16.權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述捕捉試劑包被在微量滴定板上。17.權(quán)利要求16的試劑盒，其還包含所述可檢測(cè)抗體的檢測(cè)手段。18.權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述檢測(cè)手段是比色法的。19.權(quán)利要求13的試劑盒，其還包含作為抗原標(biāo)準(zhǔn)品的純化的VEGF。20.權(quán)利要求13的試劑盒，其中所述捕捉試劑抗體是鼠單克隆抗體單抗5C3，且所述可檢測(cè)抗體是單抗A4.6.1。21.一種抗體5C3，其可以由保藏號(hào)為PTA-7737的雜交瘤5C3.1.1獲得(或生成)。22.權(quán)利要求21的抗體，其偶聯(lián)有可檢測(cè)標(biāo)記物。23.—種雜交瘤5C3.1.1，其保藏于ATCC且保藏號(hào)為PTA-7737。24.一種抗體，其不能結(jié)合VEGFl10但能與雜交瘤細(xì)胞系PTA-7737所生成的單克隆抗體結(jié)合相同表位。25.權(quán)利要求24的單克隆抗體，其偶聯(lián)有可檢測(cè)標(biāo)記物?！疚臋n編號(hào)】C07K16/22GK103454434SQ201310406549【公開日】2013年12月18日申請(qǐng)日期:2007年10月3日優(yōu)先權(quán)日:2006年10月4日【發(fā)明者】玉茹.G.孟,洪圭熙,約翰尼.古鐵雷斯申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司