專利名稱：一種新型純化pe類重組毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物蛋白快速純化檢驗領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
綠膿桿菌外毒素PE為全長613個氨基酸的單鏈蛋白，可分為三個功能區(qū):1a區(qū)(l-252aa)為細胞結(jié)合區(qū)，II區(qū)(253_364aa)負責毒素的跨膜轉(zhuǎn)運，III區(qū)(400_613aa)包含ADP核糖基化功能及eEF2失活功能區(qū)；Ib區(qū)(365_399aa)處于II區(qū)與III區(qū)之間，含有一個二硫鍵，功能未知。PE殺細胞機制包括如下步驟:C末端的Lys613殘基被胞漿或培養(yǎng)液中的羧肽酶去除，露出REDL (Arg-Glu-Asp-Leu)末端；Ia區(qū)結(jié)合到動物細胞表面的α -巨球蛋白受體上，內(nèi)化后經(jīng)由內(nèi)涵體到達高爾基體；Furin蛋白酶將II區(qū)內(nèi)的Arg279與Gly280氨基酸殘基間的肽鍵切斷；連接兩個片段的Cys253與Cys364間的二硫鍵斷裂；REDL結(jié)合胞內(nèi)的KDEL受體,將37kDa的羧基端大片段從高爾基體轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER), lipid sorting to theER may occur ;280_313aa介導毒素轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)；III區(qū)內(nèi)的ADP-核糖基化酶功能區(qū)滅活eEF2，ADP核糖基化涉及到His440和Glu553殘基，His440經(jīng)由腺苷5’ -單磷酸核糖結(jié)合至NAD，Glu553的側(cè)鏈羧基與Tyr481、Glu546形成氫鍵，環(huán)堆積機制使得Tyr481與NAD連接。蛋白合成受到抑制最終引起細胞死亡；PE毒素也可通過其它路徑誘導細胞凋亡。PE是構(gòu)建免疫毒素的優(yōu)良分子，因為其高殺細胞潛力及細胞毒作用方式已得到詳細闡明，變PE的靶向為其它細胞表面受體可以將PE作為藥物選擇性殺傷特異細胞，新的靶向單元由特異結(jié)合受體的抗體或配體構(gòu)成，通過化學交聯(lián)或基因工程重組與PE連接。目前針對PE類重組毒素，國外主要采用包涵體復性的方法，該方法耗時長得率低且復性條件難以掌握，其應用受到很大限制；國內(nèi)有人采用疏水層析、金屬親和層析、離子交換層析等常規(guī)方法進行純化，操作繁瑣且得率很低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新型純化PE類重組毒素的方法，以解決目前純化方法耗時長、得率低、操作繁瑣的問題。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:表達PE類重組蛋白的重組菌經(jīng)誘導后，菌體經(jīng)超聲破碎、離心取上清，加入終飽和度為50%的硫酸銨離心；
沉淀由50mM Tris>600mM NaCl、pH7.9溶液重懸后過抗體親和層析柱；50mM Tris、600mM NaCl、pH7.9 溶液繼續(xù)沖洗 5 倍柱體積后，40% 丙二醇、850mM NaCl、50mM Tris、pH7.9洗脫液洗劑，收集洗脫峰，PBS透析后進行SDS-PAGE分析得到高純度的PE類重組毒素；
所述抗體親和層析柱所制備過程如下:
(1)抗PE毒素的醇洗脫性抗體的制備；
(2)親和層析介質(zhì)制備:
制備螯合緩沖液，0.1M NaHC03、0.5M NaCl pH7，置于冰浴中備用；用等體積4°C的ImMHCl浸泡CNBr actived Sepharose 4 Fast Flow介質(zhì)5min,棄濾液；重復洗劑3-5次；測量凝膠體積，加入1/2體積的螯合緩沖液，其中抗PE毒素的醇洗脫性抗體的含量為10mg/ml，室溫靜置4h或4°C過夜；5倍體積的螯合緩沖液洗滌，加入0.1M的Tris-HCl pH8.0或IM乙醇胺，PH8.0，靜置2h封閉未結(jié)合抗體的活化基團；用I個體積的0.1M乙酸、0.5M NaClρΗ4.0洗劑3次，然后用I體積的0.1M Tris-HCU0.5Μ NaCl ρΗ8.0洗劑3次；重復上述洗劑步驟6次;20%乙醇中保存。本發(fā)明所述表達PE類重組蛋白的重組菌株包括如下三株菌株:
Rosetta(pET_rG17PE38)、
Rosetta (pET-MSH-PE38)或BL21(DE3) (pET_20b- GnRH -PE38)。本發(fā)明是以切膠純化的綠膿桿菌外毒素重組蛋白免疫小鼠制備單克隆抗體，篩選可在溫和條件下進行抗原識別、洗脫的抗體，建立一種快速高效且不影響PE(綠膿桿菌外毒素)類重組毒素活性的親和層析純化方法。本發(fā)明通過篩選丙二醇洗脫性抗體、制備親和層析介質(zhì)，可在溫和條件下進行PE類重組毒素的快速純化。本發(fā)明的抗體親和純化方法，大大減少了操作步驟，節(jié)約了純化時間。


圖1是PE38重組蛋白大腸桿菌表達分布圖；在37°〇培養(yǎng)誘導時，目的蛋白以包涵體形式表達，M.低分子量蛋白Marker; 1.對照；2.Rosetta(DE3) (pET_rG17PE38)的IPTG誘導結(jié)果；3.胞質(zhì)表達組分；4.包涵體；
圖2是免疫小鼠融合前血清抗體效價圖，2次免疫后，3只小鼠的血清效價均達到1:25600以上，可以進行細胞融合實驗；
圖3是丙二醇洗脫性單克隆抗體篩選圖，獲得穩(wěn)定雜交瘤細胞株后，再次進行PR-ELISA洗脫實驗；篩選OD值降低50%以上的細胞孔，認為具有較好的丙二醇洗脫反應性；
圖4是腹水純化前后效果圖；腹水純化后，經(jīng)SDS-PAGE分析可見到清晰重鏈和輕鏈，殘留的少許雜蛋白不影響親和層析純化效率，1，純化前腹水；2，純化后的抗體；
圖5A是抗體親和層析洗脫條件篩選圖；篩選醇洗脫抗體的最佳洗脫溶劑、最佳洗脫鹽離子濃度；圖中洗脫條件篩選為甘油、乙二醇、丙二醇；
圖5B是抗體親和層析洗脫條件篩選圖；篩選醇洗脫抗體的最佳洗脫溶劑、最佳洗脫鹽離子濃度；圖中洗脫條件篩選為NaCl ；
圖6是免疫親和層析方法從大腸桿菌裂解液中純化PE類重組蛋白l.rG17PE38、
2.MSH-PE38、3.GnRH_PE38的效果圖；經(jīng)硫酸銨沉淀去除核酸、脂類及不溶性細胞碎片后、親和層析純化即可得到高純度的PE類免疫毒素，SDS-PAGE分析未見雜蛋白殘留。
具體實施方式
表達PE類重組蛋白的重組菌經(jīng)誘導后，菌體經(jīng)超聲破碎、離心取上清，加入終飽和度為50%的硫酸銨離心；
沉淀由50mM Tris>600mM NaCl、pH7.9溶液重懸后過抗體親和層析柱；50mM Tris、600mM NaCl、pH7.9 溶液繼續(xù)沖洗 5 倍柱體積后，40% 丙二醇、850mM NaCl、50mM Tris、pH7.9洗脫液洗劑，收集洗脫峰，PBS透析后進行SDS-PAGE分析得到高純度的PE類重組毒素；
所述抗體親和層析柱所制備過程如下:
(1)抗PE毒素的醇洗脫性抗體的制備；
(2)親和層析介質(zhì)制備:
制備螯合緩沖液，0.1M NaHC03、0.5M NaCl pH7，置于冰浴中備用；用等體積4°C的ImMHCl浸泡CNBr actived Sepharose 4 Fast Flow介質(zhì)5min,棄濾液；重復洗劑3-5次；測量凝膠體積，加入1/2體積的螯合緩沖液，其中抗PE毒素的醇洗脫性抗體的含量為10mg/ml，室溫靜置4h或4°C過夜；5倍體積的螯合緩沖液洗滌，加入0.1M的Tris-HCl pH8.0或IM乙醇胺，PH8.0，靜置2h封閉未結(jié)合抗體的活化基團；用I個體積的0.1M乙酸、0.5M NaClρΗ4.0洗劑3次，然后用I體積的0.1M Tris-HCU0.5Μ NaCl ρΗ8.0洗劑3次；重復上述洗劑步驟6次;20%乙醇中保存。本發(fā)明所述表達PE類重組蛋白的重組菌株包括如下三株菌株:
Rosetta(pET_rG17PE38)、
Rosetta (pET-MSH-PE38)或BL21(DE3) (pET_20b- GnRH -PE38)。下邊結(jié)合具體實施例對發(fā)明做進一步說明。實施例1免疫原的大量制備和切膠回收
參考 rG17PE38, a novel immunotoxin target to gastric cancer withoverexpressed CCK2R, Jie Song, Honglin Ren, Zengshan Liu; J Drug Target, PMID:23311704中的方法構(gòu)建重組大腸桿菌菌株Rosetta (DE3) (pET_28a_rG17PE38)，以1%接種于LB培養(yǎng)基(50mg/L氨芐青霉素)。37°C劇烈搖蕩培養(yǎng)至0D600=0.6時，加入終濃度為lmmol/L的異丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷(IPTG)進行誘導,220r/min搖培4h。離心收集菌體，PBS懸浮并經(jīng)超聲波裂解，離心分別收集上清和沉淀，通過SDS-PAGE分別檢測全菌、上清和沉淀，發(fā)現(xiàn)該PE重組蛋白以包涵體的形式大量表達(見圖1)。切膠純化方法,取500 μ L超聲后的包涵體沉淀重懸液,加入2M尿素溶解后不插樣品梳直接上樣，按常規(guī)方法進行SDS-PAGE ;將膠浸入2 mol/L KCl溶液中3min，切割下染成銀白色的目的蛋白膠來，放在密封透析袋內(nèi)，以電泳的方法使目的蛋白游離出來，將透析袋中的凝膠取出后，用PEG20000進行濃縮，然后PBS溶液透析去除小分子；經(jīng)SDS-PAGE分析后分裝，放入-80度冰箱備用。實施例2動物免疫
以切膠純化的PE重組蛋白免疫8周齡Balb/C雌性小鼠，SOyg/只，足墊注射；首次免疫用弗氏完全佐劑(1:1)乳化抗原，間隔I周后，采用弗氏不完全佐劑(1:1)乳化抗原進行第2次免疫。2免后一周測效價如附圖2所示，三只小鼠效價均達1:25600以上，可以進行融合實驗。實施例3間接ELISA及醇洗脫反應ELISA方法的建立
以純度達98%以上的重組蛋白GnRH-PE40 (朱平老師惠贈，專利名稱:與短肽激素嵌合的靶特異性細胞毒性劑)包被酶標板孔；以未免疫的小鼠血清和SP2/0細胞上清為陰性對照，免疫小鼠血清為陽性對照，酶標儀測定492 nm光吸收值。經(jīng)過多次ELISA檢測，確定最佳工作條件為:抗原的最適合包被濃度為I μ g/ml，4°C包被過夜；細胞上清37°C孵育Ih ；酶標二抗最佳工作濃度為1:4000，37°C孵育Ih。醇洗脫反應ELISA (PR-ELISA):將細胞上清分為兩份，在洗脫時分別采用TEbuffer(50mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, ρΗ7.9)和 PR 洗脫 buffer(50mM Tris-HCl, ρΗ7.9，
0.1mM EDTA, 750mM硫酸銨，40%丙二醇)孵育IOmin ;再與HRP標記的羊抗小鼠IgG (購自中杉金橋公司)結(jié)合，加入底物溶液顯色；測OD值分析兩孔數(shù)值變化，OD值降低50%以上的為具有醇洗脫反應性。實施例4陽性雜交瘤細胞株的建立和穩(wěn)定性檢測
取二次免疫7d后的小鼠胭細胞與SP2/0細胞以5: I在PEG1450的作用下融合，以建立的間接ELISA及PR-ELISA方法篩選出陽性雜交瘤細胞株；通過多次克隆化和篩選后，獲得穩(wěn)定分泌醇洗脫反應性抗體的雜交瘤細胞(見圖3)。實施例5腹水制備及抗體純化
取10周齡雌性Balb/C小鼠，腹腔注射0.5ml石蠟油(無菌)，7 10天后腹腔注射雜交瘤細胞(5X105)。小鼠腹部明顯膨大后，用20號針頭于腹部采集腹水，37°C放置lh，4°C放置過夜，3000g，4°C離心15min，收集腹水。采用辛酸-硫酸銨法純化腹水:將腹水10000Xg，4°C離心15min，去除油脂等雜質(zhì)；腹水上清以1:4加入0.06mol/L pH4.0的醋酸鈉緩沖液，NaOH調(diào)至pH4.5 ;逐滴加入終濃度11 μ /ml的辛酸，室溫攪拌30min ;靜置2h，IOOOOg離心30min，取上清；加入1/10體積的0.1M PBS, NaOH調(diào)pH7.4 ;冷卻至4°C，加入終濃度為50%飽和的硫酸銨，攪拌30min ；5000g離心30min，棄上清，1/10原體積的0.0lM PBS重懸沉淀；PBS透析，5000g離心30min，上清定容至原體積，測定蛋白濃度后-80°C保存。將純化前后的腹水 進行SDS-PAGE分析，如圖4所示，純化后得到的蛋白僅含有極少量雜蛋白，該蛋白即為醇洗脫反應性抗體，少量雜蛋白不影響親和純化效果。實施例6親和層析介質(zhì)制備
制備螯合緩沖液，0.1M NaHC03、0.5M NaCl pH7，置于冰浴中備用；用等體積4°C的ImMHCl浸泡CNBr actived Sepharose 4 Fast Flow介質(zhì)(購自通用電氣醫(yī)療集團)5min,棄濾液；重復洗劑3-5次；測量凝膠體積，加入1/2體積的螯合緩沖液，其中含抗PE毒素的醇洗脫性抗體10mg/ml，室溫靜置4h或4°C過夜；5倍體積的螯合緩沖液洗滌，加入0.1M的Tris-HCl pH8.0(或IM乙醇胺，pH8.0)，靜置2h封閉未結(jié)合抗體的活化基團；用1個體積的
0.1M 乙酸、0.5M NaCl ρΗ4.0 洗劑 3 次，然后用 I 體積的 0.1M Tris-HCU0.5Μ NaCl ρΗ8.0洗劑3次；重復上述洗劑步驟6次；20%乙醇中保存。實施例7抗體親和洗脫條件篩選
分別采用10%、20%、30%、40%、50%和60%濃度的甘油、乙二醇、丙二醇為洗脫溶劑進行ELISA 洗脫試驗；在此基礎(chǔ)上，分別添加 100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、lM 和 1.5M 的 NaCl 進行洗脫。得到最佳洗脫條件為:40%丙二醇、800mM NaCl、50mM Tris、pH7.9 (見圖 5)。實施例8從重組大腸桿菌裂解液中純化PE類重組毒素
重組大腸桿菌 Rosetta (pET-rG17PE38)、Rosetta (pET-MSH_PE38)及 BL21(DE3)(pET-20b-GnRH_PE38),參照論文 rG17PE38, a novel immunotoxin target to gastriccancer with overexpressed CCK2R, Jie Song, Honglin Ren, Zengshan Liu; JDrug Target, PMID: 23311704及專利“與短肽激素嵌合的靶特異性細胞毒性劑、專利號99122205.9”、“一種靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì)及其制備方法、專利號201010620599.0”中的相
關(guān)描述構(gòu)建。各菌株經(jīng)ImM IPTG誘導后，菌體經(jīng)超聲破碎、離心取上清，加入終飽和度為50%的硫酸銨離心以去除核酸、脂類及部分雜蛋白；沉淀由50mM Tris、600mM NaCl、pH7.9溶液重懸后過抗體親和層析柱；50mM Tris,600mM NaCl、pH7.9溶液繼續(xù)沖洗5倍柱體積后，40%丙二醇、850mM NaCl、50mM Tris、pH7.9洗脫液洗劑，收集洗脫峰，PBS透析后進行SDS-PAGE分析得到高純度的PE類重組毒素(見圖6)。表達PE類重組蛋白的重 組菌株包括但不限于本專利所驗證的三株菌株: Rosetta(pET_rG17PE38)、
Rosetta (pET-MSH-PE38)和 BL21 (DE3) (pET-20b-LHRH_PE38)，其應該包括所有表達 PE融合蛋白的菌株。
權(quán)利要求
1.一種新型純化PE類重組毒素的方法，表達PE類重組蛋白的重組菌經(jīng)誘導后，菌體經(jīng)超聲破碎、離心取上清，加入終飽和度為50%的硫酸銨離心； 其特征在于還包括如下方法: 沉淀由50mM Tris>600mM NaCl、pH7.9溶液重懸后過抗體親和層析柱；50mM Tris、600mM NaCl、pH7.9 溶液繼續(xù)沖洗 5 倍柱體積后，40% 丙二醇、850mM NaCl、50mM Tris、pH7.9洗脫液洗劑，收集洗脫峰，PBS透析后進行SDS-PAGE分析得到高純度的PE類重組毒素； 所述抗體親和層析柱所制備過程如下: (1)抗PE毒素的醇洗脫性抗體的制備； (2)親和層析介質(zhì)制備: 制備螯合緩沖液，0.1M NaHC03、0.5M NaCl pH7，置于冰浴中備用；用等體積4°C的ImMHCl浸泡CNBr actived Sepharose 4 Fast Flow介質(zhì)5min,棄濾液；重復洗劑3-5次；測量凝膠體積，加入1/2體積的螯合緩沖液，其中抗PE毒素的醇洗脫性抗體的含量為10mg/ml，室溫靜置4h或4°C過夜；5倍體積的螯合緩沖液洗滌，加入0.1M的Tris-HCl pH8.0或IM乙醇胺，PH8.0，靜置2h封閉未結(jié)合抗體的活化基團；用I個體積的0.1M乙酸、0.5M NaClρΗ4.0洗劑3次，然后用I體積的0.1M Tris-HCU0.5Μ NaCl ρΗ8.0洗劑3次；重復上述洗劑步驟6次;20%乙醇中保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新型純化PE類重組毒素的方法，其特征在于:表達PE類重組蛋白的重組 菌株包括如下三株菌株Rosetta (pET-rG17PE38)、Rosetta(pET-MSH-PE38)或BL21(DE3)(pET-20b- GnRH -PE38)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型純化PE類重組毒素的方法，屬生物蛋白快速純化檢驗領(lǐng)域，以切膠純化的綠膿桿菌外毒素重組蛋白免疫小鼠制備單克隆抗體，篩選可在溫和條件下進行抗原識別、洗脫的抗體，建立一種快速高效且不影響綠膿桿菌外毒素類重組毒素活性的親和層析純化方法。本發(fā)明的抗體親和純化方法，大大減少了操作步驟，節(jié)約了純化時間。
文檔編號C07K14/21GK103087161SQ201310024739
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月23日
發(fā)明者柳增善, 宋杰, 任洪林, 盧士英, 李巖松, 周玉, 張茂林, 高世奇, 吳南玄 申請人:吉林大學