專利名稱：敬釗毒素－v的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用作河豚毒素不敏感型鈉通道抑制劑的敬釗毒素-V。
背景技術：
生物毒素是一種重要的生命現象，是生物界在億萬年進化過程中為了生存而形成的，是一個巨大的潛在發(fā)現新的生物活性分子的重要資源。目前國際上已經成功篩選到一些生物毒素分子用于治療某些相關疾病或作為新型藥物的設計參考。最近疼痛治療的重大突破是發(fā)現了新的河豚毒素不敏感型鈉通道亞型Nav1.8。實驗顯示抑制該通道亞型能夠產生鎮(zhèn)痛效果卻沒有類似目前臨床鎮(zhèn)痛藥物的毒副作用，Nav1.8為治療神經性和炎癥性疼痛提供了一個高效專一的分子靶標，該通道的高效專一性抑制劑非常有希望開發(fā)成為下一代鎮(zhèn)痛新藥。因此如何獲得高效的Nav1.8抑制劑將是世界各大制約公司、科研院所的研究焦點與追逐目標。

發(fā)明內容
本發(fā)明旨在提供一種作為高效河豚毒素不敏感型鈉通道抑制劑的敬釗毒素-V。
本發(fā)明提供的這種敬釗毒素-V(JZTX-V)，其氨基酸序列如下Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Ser Lys Arg Ala Cys1 5 10 15Cys Glu Gly Leu Arg Cys Lys Leu Trp Cys Arg Lys Ile Ile20 25本發(fā)明敬釗毒素-V的理化性狀為純化凍干樣品為白色或類白色疏松體，無氣味，極易溶解于水，水溶液近于無色透明；對河豚毒素不敏感型以及敏感型鈉離子通道的半數最大抑制濃度分別為27.6nmol/L和30.23nmol/L，因此是一種很強的趨向于抑制河豚毒素不敏感型鈉通道的抑制劑。JZTX-V不但可以從蜘蛛毒液中提取，還可以通過多肽化學合成再經氧化還原復性的途徑獲得，從JZTX-V的一級化學結構來看它的氨基酸殘基很少，非常有利于大規(guī)模的工業(yè)生產和降低生產成本，可以該分子為模板，通過分子設計與蛋白質工程改造，將該分子對Kv4.2鉀通道與TTX-S型鈉離子通道的關鍵殘基突變成丙氨酸，從而得到更加高效專一的TTX-R型鈉通道抑制劑。而已有的科學研究發(fā)現TTX-R型鈉通道抑制劑具有很好的鎮(zhèn)痛活性而且毒副作用極小。因此本發(fā)明為日后大量生產這種鎮(zhèn)痛藥提供了可靠保障。


圖1是敬釗毒素-V(JZTX-V)的分離純化圖譜。圖1中的A是粗毒的陽離子交換層析圖譜，“*”表示目的峰；圖1中的B是目的峰的反相高效液相色譜圖，“→”表示目的峰。
圖2是JZTX-V的質譜鑒定圖譜。
圖3是JZTX-V的一級化學結構。
圖4是JZTX-V的全長cDNA序列克隆。
圖5是JZTX-V的三維模建結構。圖中感興趣的堿性氨基酸用藍色標記，酸性氨基酸用紅色標記，疏水性氨基酸用紫色標記。
圖6-1JZTX-V對成年鼠DRG細胞上鈉通道的影響。圖6-1中的A反映的是JZTX-V對TTX-R和TTX-S型鈉電流的影響；圖6-.1中的C、D分別是JZTX-V抑制TTX-R和TTX-S型鈉電流的濃效曲線。
圖6-2JZTX-V對DRG細胞鈉通道激活與失活動力學特征的影響。其中圖6-2中的A反映的是JZTX-V對TTX-R型鈉電導激活與失活曲線的影響，圖6-2中的B反映的是JZTX-V對TTX-S型鈉電導激活與失活曲線的影響。有三角形的曲線代表激活曲線，有圓圈的曲線代表失活曲線。
圖7是JZTX-V對爪蟾卵母細胞上表達的電壓門控鉀通道Kv4.2的影響。圖7中A顯示10μM JZTX-V能夠完全抑制Kv4.2鉀通道；圖7中B是JZTX-V抑制Kv4.2鉀通道的濃效曲線；圖7中C是JZTX-V對Kv4.2鉀通道穩(wěn)態(tài)失活動力學特征的影響。
圖8是JZTX-V與磷脂膜的結合活性測定。圖中A～C是JZTX-V在超離心上清中的反相HPLC圖譜。圖8中的A反映的是未加脂質體；圖8中的B反映的是加入帶由75％POPE/25％POPG制備的脂質體；圖8中的C反映的是加入由100％POPC制備的脂質體。
圖9是JZTX-V與磷脂膜相互作用的熒光活性測定。圖9中的A是加入(虛線)和未加(實線)由75％POPE/25％POPG制備脂質體JZTX-V的熒光譜；圖9中的B是存在75％POPE/25％POPG或100％POPC脂質體時JZTX-V的紅移激發(fā)漂移曲線；圖9中的C是丙烯酰胺對加入脂質體后JZTX-V分子上色氨酸熒光淬滅作用的Stern-Volmer圖譜。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發(fā)明作詳細說明敬釗毒素-V(JZTX-V)可通過從敬釗纓毛蛛粗毒中提取，具體操作如下(1)毒液的采集用一個固定在鐵架臺上，內徑3cm、高5cm的塑料杯作為毒液接收器，持大鑷子從側面夾住蜘蛛的腹部，讓蜘蛛張開螯爪伸入杯中，然后用5～10V的脈沖電流刺激兩螯肢基部外側3～5s。蜘蛛感受電刺激后，即用觸肢緊緊抱住杯壁，同時將螫爪有力刺向杯內壁并射出毒液。毒液用微量注射器抽取收集后，放入-40℃冷凍干燥機中經真空冷凍干燥成白色或淺黃色粉末即為粗毒。
(2)分離純化根據蛋白質的帶電荷性質和蛋白質的疏水性，結合陽離子交換和反相HPLC色譜法進行兩次分離。將15mg敬釗纓毛蛛粗毒用2mL雙蒸水(ddH2O)溶解，14000轉/分鐘離心10分鐘后棄去沉淀，取上清液進樣到事先用0.1M磷酸鹽緩沖液平衡好的Water Protein Pak CM 8HR陽離子交換柱(5毫米×50毫米)中，用0-50％氯化鈉線性梯度洗脫，時間為60分鐘，流速為3mL/min。收集最后一個峰進一步反相HPLC純化(見圖1中的A)。用C18反相分析柱在60min內以10-55％的乙腈(含0.1％三氟乙酸)線性梯度洗脫，收集目的峰進一步反相HPLC，得到單一目的峰(見圖1的B)，質譜儀檢測為單一組分并測得準確分子量為3605.73Da(見圖2)。樣品經冷凍干燥成白色粉末，純度可達99％以上。該毒素的理化性狀為純化凍干樣品為白色或類白色疏松體，無氣味，極易溶解于水，水溶液近于無色透明。敬釗毒素-V經491-A測序儀準確得到該毒素N-端28個氨基酸的序列(見圖3)。由于該毒素C-末端的疏水性氨基酸殘基在測序過程中容易被有機溶劑洗脫，因此第29個殘基的測序得不到信號。但是根據該毒素的質譜測定分子量與N-端28個氨基酸殘基的理論分子量推測第29位的氨基酸殘基可能是一個異亮氨酸(Ile)或亮氨酸(Leu)，為了作出正確的判斷，以下通過獲得敬釗毒素-V全長cDNA序列使敬釗毒素-V的氨基酸序列得到了確定。
(3)敬釗毒素-V全長cDNA序列的獲得① 3′RACE首先從敬釗纓毛蛛毒腺中快速抽提總RNA，反轉錄總RNA得到總cDNA。根據已知敬釗毒素-V的氨基酸序列設計基因特異性簡并引物p1-a5′-TA(T/C)TG(T/C)CA(G/A)AA(G/A)TGG ATG TGG-3′和p 1-b5′-AA(G/A)TGG ATG TGGAC(G/A/C/T)TG(T/C)GG-3′。用基因特異性引物和AUAP與少量cDNA鏈進行PCR擴增得到大小在300bp左右的一段cDNA鏈，純化后克隆入pGEM Teasy載體(購自Promega公司)，進行測序。
② 5′RACE根據已得到的3′RACE測序結果設計并合成5′RACE的反義引物p2-a5′-TCAATG CAA AAT TGC TTC AG-3′和p2-b5′-ACG TAA GCC TTC GCA GCA TGC-3′。用基因特異性引物和巢氏引物做PCR擴增，產物純化后克隆入pGEM Teasy載體(購自Promega公司)進行測序。
③全長 cDNA將3′RACE和5′RACE測序結果進行拼接，得到敬釗毒素-V的全長cDNA序列gggggggggg ggggggggac tcagttctta ctgaaacact ggtgctgctcccgaaaagaa 60taattggtga cttgaaactc cagtaggaag atg aag gct tca gtt ttc gct gtcata ttg 120Met Lys Ala Ser Val Phe Ala Val Ile Leu
-53 -50gga ttg gtt gtg ttg tgc gcc tgt tcc ttt gct gaa gat gaa caa gat caattt gtt tca 180Gly Leu Val Val Leu Cys Ala Cys Ser Phe Ala Glu Asp Glu Gln Asp Gln PheVal Ser-40 -30cct aat gaa ctg cta aaa tca atg ttt gtg gag agt aga cat gaa ttc act cctgaa gtg 240Pro Asn Glu Leu Leu Lys Ser Met Phe Val Glu Ser Arg His Glu Phe Thr ProGlu Val-20 -10gaa gga aga tat tgc caa aaa tgg atg tgg acc tgt gat tca aaa aga gcatgc tgc gaa 300Glu Gly Arg Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Set Lys Arg AlaCys Cys Glu-1 1 10ggc tta cgt tgc aaa ctg tgg tgc aga aag ata ata gga taa 342Gly Leu Arg Cys Lys Leu Trp Cys Arg Lys Ile Ile Gly End20 30ttccgaatta atataccatt ctgaagcaat tttgcattga aattatagttgtgtaaatcc 402gagaaatgtg aatatgtgat atttcccttt gtttaggggt attaaaagaaatcgaaataa 462agtgtattca tcttgaaaaa aaaaaaaaaa aaaa496從該序列可以看出它包括3′非翻譯序列、5′非翻譯序列、編碼分子前體的閱讀框、一個成熟的毒素序列和一個插入的pro序列(見圖4)。將JZTX-V的氨基酸序列與該毒素的全長cDNA序列及其翻譯后氨基酸序列進行比較發(fā)現，JZTX-V第30位的甘氨酸在成熟肽中已經被切除，顯示該毒素的C-末端發(fā)生了酰氨化，同時也證實該毒素第29位的氨基酸殘基是一個異亮氨酸殘基。
(4)JZTX-V化學合成與氧化還原復性。
根據JZTX-V的氨基酸序列，在PS3固相多肽合成儀上，采用Fmoc-氨基酸和HBTU的偶聯(lián)方法合成線性JZTX-V。合成的多肽粗品采用反相HPLC進行初步純化，通過質譜分析確定目的峰，并進行第二次反相HPLC純化，樣品經冷凍干燥后在0.1M的Tris-HCl(pH＝7.5)，1.0mM/0.1mM GSH/GSSG條件下進行氧化還原復性24小時，復性產物經HPLC純化和MALDI-TOF質譜分析顯示其測定質量值與理論值相一致，復性產物與天然JZTX-V進行HPLC共洗脫呈現一個單峰，進一步的電生理活性測定證實通過化學合成得到的JZTX-V具有與天然毒素同樣強的離子通道抑制活性。采用化學合成結合氧化還原復性的方法可以成功大量得到JZTX-V。
為了揭示該毒素分子的作用，我們利用膜片鉗和電壓鉗技術測定了JZTX-V對電壓門控鈉、鉀離子通道的抑制活性，利用脂質體離心共沉淀以及固有色氨酸熒光測定了該毒素對磷脂膜的結合活性。實驗結果表明JZTX-V是一種高效的河豚毒素不敏感型鈉通道抑制劑。
1.主要材料和儀器全細胞膜片鉗系統(tǒng)采用德國HEKA公司的EPC-9放大器記錄系統(tǒng)，倒置顯微鏡是日本的Olympus IX70；雙極桿電壓鉗放大器為Turbo-Tec 03X。單層小脂質體采用寧波新芝科器研究所生產的超聲波細胞粉碎機超聲制備，熒光分光光度計為日立F-4500，合成儀為美國安萊公司的PS3多肽合成儀。
2.實驗方法和結果2.1 JZTX-V的同源結構模建根據同源毒素PaTxl的三維溶液結構，我們在InsightII軟件上模建了JZTX-V的三維結構，發(fā)現JZTX-V的結構特征是有一個由三個芳香族氨基酸殘基和二個脂肪族氨基酸殘基組成的較大疏水斑片，并被一些帶電荷的氨基酸殘基環(huán)繞(見圖5)。
2.2敬釗毒素-V對電壓門控鈉通道的抑制活性
50nM敬釗毒素-V對成年大鼠背根神經節(jié)DRG細胞上的河豚毒素不敏感型和河豚毒素敏感型鈉電流都有明顯的抑制作用，這種抑制作用呈劑量依賴性(見圖6-1中的A和B)。敬釗毒素-V對河豚毒素不敏感型和河豚毒素敏感型鈉電流的半數最大抑制濃度分別為27.6nmol/L和30.23nmol/L(見圖6-1中C)。
2.3敬釗毒素-V對鈉通道激活與失活動力學的影響實驗顯示50nM JZTX-V能夠導致河豚毒素不敏感型和河豚毒素敏感型鈉電導的半數最大激活電勢分別往去極化方向飄移約4.1mV和6.6mV(見圖6-2中的A和B)，能夠導致河豚毒素不敏感型和敏感型鈉電導的半數最大穩(wěn)態(tài)失活電勢分別往超極化方向飄移約6.7mV和5.5mV(見圖6-2中的C和D)。
2.4敬釗毒素-V對Kv4.2鉀通道的影響實驗顯示10μM的JZTX-V也能夠完全抑制爪蟾卵母細胞上表達的Kv4.2鉀電流，這種抑制呈劑量依賴性，其半數最大抑制濃度(IC50)是604.2±9.3nM(見圖7)。JZTX-V對Kv4.2鉀電流的抑制也會引起其電流電壓曲線往去極化方向漂移。然而10μM JZTX-V爪蟾卵母細胞上表達對Kv1.2、Kv1.3和Kv1.4鉀電流沒有任何影響。
2.5敬釗毒素-V與脂質體的結合活性測定圖8中的A是在沒有單層脂質體存在的條件下，超離心上清中JZTX-V的高效液相色譜圖，而當單層小脂質體(75％POPE/25％POPG)與含有JZTX-V的緩沖溶液混合后，通過超速離心沉降，發(fā)現幾乎所有的JZTX-V都能從離心上清中被刪除(見圖8中的B)。實驗顯示JZTX-V與磷脂膜的結合需要帶負電荷的磷脂，因為當JZTX-V與由中性磷脂(100％POPC)制備的脂質體混合并且離心沉降時，只有極少量的毒素肽能從離心上清中被刪除(見圖8中的C)。
2.6敬釗毒素-V的熒光活性測定在JZTX-V的溶液中加入由75％ POPE/25％ POPG制備的單層脂質體后，其熒光譜的最大發(fā)射波長經歷了5.7nm的藍移，而熒光強度出現明顯增強(見圖9的A)。當加入由75％ POPE/25％ POPG制備的脂質體，JZTX-V的最大發(fā)射波長發(fā)生了5.7nm的紅移激發(fā)漂移。而加入100％POPC的中性脂質體時，JZTX-V的紅移激發(fā)漂移只有2.7nm(見圖9的B)。紅移激發(fā)漂移實驗結果顯示，當有帶負電荷的磷脂膜存在時，JZTX-V分子上的色氨酸殘基處在一個運動限制的環(huán)境中。丙稀酰胺熒光淬滅實驗顯示伴隨著丙稀酰胺的加入，JZTX-V的熒光強度會以濃度依賴的方式進行衰減(見圖9的C)，證實JZTX-V與帶負電荷的脂質體的相互作用會引起JZTX-V分子疏水面上的色氨酸殘基與水溶液的接觸減少。
權利要求
1.一種敬釗毒素-V(JZTX-V)，其氨基酸序列如下Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Ser Lys Arg Ala Cys15 10 15Cys Glu Gly Leu Arg Cys Lys Leu Trp Cys Arg Lys Ile Ile20 2全文摘要
本發(fā)明公開了一種敬釗毒素－V它的一級化學結構由29個氨基酸殘基組成。該毒素的理化性狀為純化凍干樣品為白色或類白色疏松體，無氣味，極易溶解于水，水溶液近于無色透明；對河豚毒素不敏感型以及敏感型鈉離子通道的半數最大抑制濃度分別為27.6nmol/L和30.23nmol/L，是一種很強的趨向于抑制河豚毒素不敏感型鈉通道的抑制劑。
文檔編號A61P29/00GK1872878SQ20061003186
公開日2006年12月6日 申請日期2006年6月22日 優(yōu)先權日2006年6月22日
發(fā)明者梁宋平, 曾雄智, 謝錦云, 王賢純 申請人:湖南師范大學