專(zhuān)利名稱(chēng)：純化B群β－溶血性鏈球菌毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于一種多糖純化的改進(jìn)方法。
背景CM101，一種GBS毒素，是一種從B群β-溶血性鏈球菌(GBS)分離的致病性分子。新生嬰兒可以被GBS感染(一種被稱(chēng)之為GBS肺炎或“早發(fā)性疾病”的情形)，以及感染膿毒癥、粒細(xì)胞減少癥和呼吸窘迫，即肺動(dòng)脈高壓癥與蛋白性肺水腫(Hellerqvist,C.G.等人，B群β-溶血性鏈球菌的研究Ⅰ，一種細(xì)胞外毒素的分離及部分表征，兒科學(xué)研究(Pediatr.Res.),12:892-898(1981))。
除了對(duì)接觸GBS的新生兒的有害作用，尚不知道CM101對(duì)年長(zhǎng)的人能引起毒性。實(shí)際上，對(duì)這種毒素的研究已經(jīng)揭示了一個(gè)重要的治療應(yīng)用。見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,010,062號(hào)以及Hellerqvist,C.G.等人，CM101在癌癥患者的第Ⅰ階段試驗(yàn)的早期結(jié)果，美國(guó)癌癥研究協(xié)會(huì)年會(huì)學(xué)報(bào)(Proceeding of the American Association of Cancer Research AnnualMeeting)(1995)，其中CM101被用于抑制腫瘤的血管形成。因此，對(duì)研究和治療兩個(gè)目的來(lái)說(shuō)獲得純化的CM101是關(guān)鍵。
CM101是一種復(fù)雜的多糖毒素，分子量大約為300,000道爾頓，且包含N-乙?；?半乳糖胺、N-乙?；?葡萄糖胺、葡萄糖、半乳糖以及甘露糖殘基。Nmr(核磁共振)結(jié)果提示糖醇?xì)埢部赡艽嬖?。羧酸功能基團(tuán)(可能為半乳糖醛酸)也被認(rèn)為是此分子的一個(gè)組成部分。在對(duì)CM101的病理生理反應(yīng)中，通過(guò)靶內(nèi)皮上的交聯(lián)受體重復(fù)的活性表位很可能起著重要的作用。(Hellerqvist,C.G.等人，CM101在癌癥患者的第I階段試驗(yàn)的早期結(jié)果。美國(guó)癌癥研究協(xié)會(huì)年會(huì)學(xué)報(bào)(1995)；DeVore,R.F.，等人，抗新生血管生成藥物CM101的第1階段研究，臨床癌癥研究雜志(J.Clin.Can.Res.3:365-372(1997)))。
美國(guó)第5,010,062號(hào)專(zhuān)利提供了一種純化GBS毒素的方法。但是這種方法勞動(dòng)強(qiáng)度大，需要很多步驟并伴隨著生物學(xué)活性水平連續(xù)的丟失。
當(dāng)前，在本領(lǐng)域中已知純化CM101提供的最終材料通過(guò)化學(xué)分析和生物學(xué)測(cè)定其純度僅有40％。其余60％包括植物及酵母多糖和內(nèi)源性細(xì)菌多糖。植物和酵母污染物絕大部分源自為了GBS細(xì)菌的最佳生長(zhǎng)在商業(yè)培養(yǎng)基中使用的添加劑。內(nèi)源性污染包括含有群及型特異性抗原的GBS多糖。(Paoletti,L.C.等人，通過(guò)四價(jià)GBS多糖-破傷風(fēng)毒素偶聯(lián)疫苗免疫母鼠對(duì)新生小鼠感染多重B群鏈球菌(GBS)血清型的保護(hù)，感染與免疫雜志(Infect.Immun.)62(8):3236-43(1994)；Michon,F.,B群鏈球菌的多觸角群特異性多糖，生物化學(xué)(Biochem.)27:5341-51(1988))。40％純度水平的CM101代表了當(dāng)前的臨床等級(jí)。因此需要導(dǎo)致最終產(chǎn)物純度全面增加的CM101純化方法，優(yōu)選地清除外源性植物和酵母多糖以及GBS抗原性多糖。
另外，在本領(lǐng)域中已知的純化方案中包括環(huán)境不安全步驟，例如在苯酚水抽提中大量苯酚的使用。苯酚是眾所周知的腐蝕性材料。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種純化方法，其導(dǎo)致(ⅰ)一種高純度的材料，(ⅱ)使用最少的步驟，(ⅲ)最小限度地使用腐蝕性或毒性材料如苯酚，以及(ⅳ)增加產(chǎn)物產(chǎn)量。
發(fā)明概述用在此描述的發(fā)明已經(jīng)達(dá)到了的上述目的。特別是，一種為從GBS培養(yǎng)基中純化CM101的包括疏水相互作用層析(HIC)樹(shù)脂的純化方案使產(chǎn)物的純度高于95％。
本發(fā)明的一個(gè)方面是從GBS細(xì)菌中純化多糖毒素的一種方法，此方法包括一種HIC樹(shù)脂的使用。本發(fā)明也包括一種用此處公開(kāi)的方法從GBS細(xì)菌中產(chǎn)生基本上純的多糖毒素的方法，以及一種包括基本上純的毒素和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。這種藥物組合物可以用于治療具有病癥的患者。例如，腫瘤患者可以用本發(fā)明的組合物治療。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示本發(fā)明的CM101純化方案。
圖2顯示已知的CM101純化方案。
圖3是定量水解標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，顯示了PAD檢測(cè)器對(duì)5、20和50μg葡聚糖(葡萄糖多聚體)與6-脫氧葡萄糖的作為恒定內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的劑量反應(yīng)。
圖4顯示了標(biāo)準(zhǔn)的糖樣品的分離。
圖5a-b是在丁基-Sepharose HIC柱上一種培養(yǎng)基濃縮物的洗脫分布圖。圖5a是在UV206吸光度處測(cè)量的。圖5b是在UV280吸光度處測(cè)量的。
圖6a是HIC純化的含有CM101(16分鐘峰)水洗脫級(jí)分的HPLC分布圖，通過(guò)Millenium 2000 Diodo-Ray檢測(cè)器(Waters,Millford,MA)在UV203吸光度處監(jiān)控。
圖6b是與圖6a相應(yīng)的Diodo-Ray頻譜，闡明了含有CM101峰(16分鐘)的260吸收(RNA和DNA)和280吸收(含有酪氨酸蛋白)的最小存在。
圖7a是在203nm監(jiān)控的洗脫分布圖，顯示了經(jīng)苯酚/鹽水抽提和DEAE層析后圖6a中HIC水洗脫峰的純度。
圖7b是Diodo-Ray頻譜，闡明了圖7a中含有CM101峰的純度，通過(guò)窄的對(duì)稱(chēng)峰及在260nm(RNA/DNA)和280nm(蛋白質(zhì))處的無(wú)吸收得到證明。
圖8是通過(guò)從HIC柱獲得級(jí)分的ANA-1測(cè)定的IL-6活性分布圖，更特別的，從經(jīng)過(guò)100ml丁基Sepharose的10K5P6濃縮物獲得級(jí)分的IL-6活性分布圖。(FT=流出液；1M=1M磷酸鹽級(jí)分；0.25M=0.25M磷酸鹽級(jí)分；H2O=水級(jí)分；EtOH=乙醇級(jí)分)。
圖9闡明了通過(guò)本發(fā)明的方法純化的CM101的糖分析。
圖10是經(jīng)過(guò)HIC層析的當(dāng)前臨床等級(jí)CM101的HPLC分布圖。
圖11闡明通過(guò)HIC和HPLC進(jìn)一步純化的當(dāng)前臨床等級(jí)CM101樣品的糖分析。
圖12a是使用pH8.4 10mM磷酸鹽緩沖液通過(guò)已知的方法純化的CM101之HPLC分布圖。
圖12b是用本發(fā)明的方法純化CM101的HPLC分布圖，使用了與圖12a HPLC分布圖同樣的洗脫條件。
實(shí)施方案詳述這里使用的GBS毒素被定義為從自然界或裂解的GBS細(xì)菌中分離或來(lái)自裂解和/或高壓滅菌的GBS細(xì)菌的任何級(jí)分或組分，它具有通過(guò)綿羊中呼吸窘迫測(cè)定的誘導(dǎo)證明了的生物學(xué)活性(Hellerqvist,C.G.等人，B群β-溶血性鏈球菌的研究I，一種細(xì)胞外毒素的分離及部分特征，兒科學(xué)研究(Pediatr.Res.),12:892-898(1981))或補(bǔ)體的活化作用，并且通過(guò)腫瘤組織標(biāo)本的過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶(PAP)測(cè)定證明結(jié)合到新生血管上。(Hellerqvist,C.G.等人，GBS毒素的抗腫瘤作用來(lái)自B群β-溶血性鏈球菌的一種多糖外毒素，癌癥研究臨床腫瘤學(xué)雜志(J.Canc Res.Clin.Oncon.),120:63-70(1993)；以及Hellerqvist,C.G.等人，CM101對(duì)癌癥患者的第Ⅰ階段試驗(yàn)的早期結(jié)果。美國(guó)癌癥研究協(xié)會(huì)年會(huì)學(xué)報(bào)(1995))。
基本上純的GBS毒素意味著其中GBS毒素的純度高于40％(例如，當(dāng)前濃度至少大約40％重量比)，優(yōu)選地純度至少大約60％，更優(yōu)選純度至少大約90％，最優(yōu)選純度至少大約95％的制劑。
在本發(fā)明的方法中使用的GBS初始材料來(lái)源，可以通過(guò)培養(yǎng)最近已經(jīng)感染或有能力感染新生嬰兒的B群β-溶血性鏈球菌菌株獲得。這種菌株的分離株可以從被感染的嬰兒的血液中得到。
高產(chǎn)量的CM101通常需要用復(fù)雜的THB培養(yǎng)基發(fā)酵，它含有用于優(yōu)化GBS生長(zhǎng)及CM101產(chǎn)生的多糖和蛋白質(zhì)形式的大分子材料。在發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)菌產(chǎn)自不同于CM101的蛋白質(zhì)、核酸和多糖的營(yíng)養(yǎng)素。估計(jì)在發(fā)酵肉湯中，CM101的濃度少于重量的0.1％。
本發(fā)明的純化方法應(yīng)用了疏水相互作用層析(HIC)，其比已知的方法更有效地消除了大量?jī)?nèi)源的和外源的污染蛋白質(zhì)、核酸及多糖，并且導(dǎo)致最終產(chǎn)物中含有10-50％純的CM101。這表示在GBS初始材料接觸HIC樹(shù)脂的一個(gè)步驟中，比初始材料純化了100-500倍。
使用HIC樹(shù)脂來(lái)純化多糖是令人驚訝和新奇的，因?yàn)镠IC柱是設(shè)計(jì)用來(lái)純化疏水性蛋白質(zhì)的，并不認(rèn)為對(duì)沒(méi)有蛋白質(zhì)和脂類(lèi)的多糖有用處。多糖因?yàn)槠浔姸嗟牧u基通常表現(xiàn)為親水特性。在生產(chǎn)者推薦的條件下通過(guò)本領(lǐng)域熟練的實(shí)踐者使用，將初始材料用于HIC柱，籍此，柱上保留蛋白質(zhì)，并允許多糖通過(guò)層析柱。
令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是CM101具有疏水特性，允許使用本純化方案以達(dá)到高水平的純度。特別令人驚訝的是,CM101比其所分離自的上清液中存在的大多數(shù)蛋白質(zhì)和多糖具有顯著的更為疏水的特性。大于98％的這些蛋白質(zhì)和多糖污染物通過(guò)HIC柱。雖然HIC樹(shù)脂通常用于HIC柱，但這一步驟可以選擇性地以另外的方式通過(guò)樹(shù)脂和初始材料接觸來(lái)進(jìn)行。例如，GBS原始材料和樹(shù)脂可以在分批方法中一起放進(jìn)容器中，并且隨后通過(guò)如離心的方法將含有毒素部分從樹(shù)脂中分離出來(lái)。
附加的純化步驟可包括以相對(duì)于先前方法較小體積(大約減小1000倍)的苯酚/鹽水抽提和離子交換柱。這些附加的純化步驟對(duì)純度超過(guò)95％的最終產(chǎn)物有益。
HIC是一種基于蛋白質(zhì)的疏水特性用于分離蛋白質(zhì)，例如膜蛋白的方法。HIC樹(shù)脂被定義為含有疏水相互作用基團(tuán)的樹(shù)脂，這些基團(tuán)通常共價(jià)吸附于支持物上以便能自由地與接觸樹(shù)脂的物質(zhì)相互作用。疏水基團(tuán)的實(shí)例包括烷基、烷氧基和芳基基團(tuán)。依照本發(fā)明將使用的優(yōu)選HIC樹(shù)脂具有與含有兩個(gè)或更多碳的脂族基團(tuán)，優(yōu)選地含有2到12個(gè)碳的烷基基團(tuán)以及更優(yōu)選地正常或分支的丁基基團(tuán)聯(lián)結(jié)的支持物。含高達(dá)20個(gè)碳的苯基或烷氧基基團(tuán)也是優(yōu)選的疏水相互作用基團(tuán)。疏水相互作用基團(tuán)優(yōu)選地由Sepharose(Pharmacia)、丙烯酰胺(Toso Haas,Montgomeryville.PA)或硅膠支持。依照使用HIC柱的標(biāo)準(zhǔn)方法，含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的初始材料在高達(dá)2M的鹽溶液中用于層析柱，然后通過(guò)降低展開(kāi)緩沖液的離子強(qiáng)度來(lái)減少疏水相互作用使結(jié)合的蛋白質(zhì)被洗脫并分離。pH值和/或溫度的改變也可用來(lái)改變疏水相互作用。
從B群鏈球菌純化CM101需要獲得GBS的細(xì)菌培養(yǎng)物。細(xì)菌接種物在通過(guò)補(bǔ)充2g/l或更多的葡萄糖及Na2HPO4而改進(jìn)的Todd Hewitt肉湯(THB)中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。然后如圖1所示，高壓滅菌培養(yǎng)物。CM101存在于GBS的發(fā)酵培養(yǎng)物的上清液中，在高壓滅菌后其濃度達(dá)2-15mg/l。培養(yǎng)基中包含約15g/l的其它細(xì)菌和培養(yǎng)基組分。因而CM101構(gòu)成上清液中組分的大約0.01-0.1％。在高壓滅菌后，將培養(yǎng)基過(guò)濾。雖然50,000道爾頓(50kD)或較小截?cái)嘀档倪^(guò)濾器可以使用，但濾出液優(yōu)選地通過(guò)10,000道爾頓(10kD)截?cái)嘀档倪^(guò)濾器濃縮。
然后依照本發(fā)明純化CM101，如圖1所示，通過(guò)將上清濃縮液或重構(gòu)的乙醇沉淀(其在0.75-2M的磷酸鉀或另外的鹽如磷酸鈉、硫酸鈉或硫酸鉀、氯化物或醋酸鹽中配制)上樣于優(yōu)選地用同樣摩爾濃度的同樣鹽溶液平衡過(guò)的HIC柱。此方法中優(yōu)選的是培養(yǎng)基濃縮液或10kD-50kD沒(méi)有乙醇沉淀和重構(gòu)的初始材料，因?yàn)榕囵B(yǎng)基濃縮液初始材料提供了比重構(gòu)的乙醇沉淀更高的CM101產(chǎn)量。
含有CM101的初始材料應(yīng)用于HIC柱，并用0.75-2M的磷酸鹽水溶液洗滌。在0.75-2M洗滌后，用0.5-1M然后是2M的鹽溶液優(yōu)選地用磷酸鹽將層析柱進(jìn)一步展開(kāi)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，CM101用水從層析柱上洗脫為一個(gè)含有10-50％ CM101的單峰。另外，將CM101從HIC柱洗脫的水可用水中含10％乙醇、pH6.8的10mM磷酸鹽溶液(緩沖液A)代替，然后使用水中含20％乙醇的溶液。在緩沖液A和20％乙醇兩個(gè)級(jí)分中回收CM101活性。一般，緩沖液A不足以從HIC柱上清除所有CM101，所以緩沖液A洗滌后附加20％的乙醇洗滌。然而，在放大時(shí)，乙醇構(gòu)成環(huán)境危害并且后來(lái)的水峰或緩沖液A及20％乙醇峰級(jí)分的苯酚/鹽水抽提產(chǎn)生大約相等純度的CM101。HIC方法清除了98％以上的殘存在10k濃縮液或重構(gòu)乙醇沉淀中的蛋白質(zhì)和培養(yǎng)基多糖。
從HIC柱得到的濃縮的CM101可以通過(guò)苯酚和鹽水溶液，優(yōu)選0.05M鹽水抽提進(jìn)一步純化。這種附加的步驟提供了CM101級(jí)分大約95％的純度。
從HIC柱上洗脫的水或結(jié)合的緩沖液A及20％乙醇級(jí)分或者對(duì)水透析并冷凍干燥并在0.05M鹽溶液中重構(gòu)，或者在濃縮后對(duì)鹽水透析。典型地，苯酚被加到材料中并且將溶液快速加熱到70-80℃。當(dāng)形成單一相時(shí)，溶液冷卻到4℃。所得苯酚/鹽水抽提的鹽水相含有CM101，然后應(yīng)用于陽(yáng)離子交換柱上，例如DEAE。
對(duì)于DEAE柱方法，DEAE柱在水中平衡，然后用0.1M鹽水、0.05MNaOAc,pH7.4洗柱并用梯度達(dá)0.34M NaCl的步驟展開(kāi)。CM101的洗脫通過(guò)ANA-1測(cè)定和定量。如同HIC樹(shù)脂步驟一樣，一種離子交換樹(shù)脂可以通過(guò)使用除層析柱外的儀器與含有毒素的材料接觸。然后含有CM101的級(jí)分對(duì)水透析并冷凍干燥。在苯酚/鹽水抽提和離子交換層析步驟后，CM101純度達(dá)到95％以上。
層析柱洗脫液或從樹(shù)脂接觸步驟產(chǎn)生的材料之生物學(xué)活性通過(guò)ANA-1和/或斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)測(cè)定。然后用綿羊試驗(yàn)證實(shí)生物學(xué)活性。表1描述了幾種從不同批的初始材料獲得的并應(yīng)用到HIC柱上的AP和10k材料數(shù)次分離物。變性蛋白質(zhì)和培養(yǎng)基多糖及其它物質(zhì)的去除是相似的。
雖然優(yōu)選的純化順序是執(zhí)行HIC步驟，隨后是苯酚/鹽水抽提，然后是離子交換步驟，但是純化也可以另外的順序進(jìn)行。
圖2顯示了用一種已知的方法純化CM101的一個(gè)實(shí)施例。值得注意的是使用了70％乙醇沉淀的步驟，隨后用苯酚/水抽提。在該已知純化方法的早期階段需要大量的乙醇及苯酚，表現(xiàn)了在環(huán)境上不安全的操作。圖2描繪的方法也需要離子交換柱、凝膠過(guò)濾柱和晶狀體凝集素柱。
先前的方法包括眾多的步驟，其中包括對(duì)環(huán)境危險(xiǎn)的步驟。另一方面，本發(fā)明的方法效率高，提供了較高純度，產(chǎn)量達(dá)2到25倍，并且最小限度使用環(huán)境不安全材料。
與以前使用的方法相比，環(huán)境上有危害的苯酚-水抽提步驟減少了1000倍。而且，通過(guò)凝膠過(guò)濾方法取消了附加的純化步驟。先前方法中的晶狀體凝集素層析步驟也被去掉。HIC柱、苯酚/鹽水抽提以及離子交換柱步驟的最終產(chǎn)物已有大約95％的純度，所以其它的處理是不必要的。
通過(guò)本發(fā)明的方法純化的CM101可以用于研究或治療目的。當(dāng)CM101與一種藥學(xué)可接受的載體結(jié)合時(shí)，它是特別有用的，例如在鹽溶液中重構(gòu)并對(duì)患者靜脈內(nèi)施用。施用純化的CM101的其它劑型也可使用。本發(fā)明的藥物組合物包含與一種藥學(xué)可接受載體結(jié)合的本發(fā)明基本上純的GBS毒素。通常，這種載體將易于與毒素混合形成能通過(guò)靜脈(Ⅳ)途徑施用的組合物。因此，此載體優(yōu)選為水，其可包含另外的藥學(xué)可接受的賦形劑以保證適于靜脈施用。所得組合物是無(wú)菌的并有適宜的滲透性。通常適宜的靜脈注射制劑是依照任何本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備的。例如Salvatore J.Turco著的Remington’s藥物科學(xué)第18版，Mach出版公司(Remington’s PharmaceuticalSciences,Mach Publishing Co.)(1990)，第85章題為“靜脈內(nèi)混合物”，在此引入作為參考，提供了用于如本發(fā)明的制備藥學(xué)可接受的Ⅳ組合物標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
另外，發(fā)現(xiàn)對(duì)CM101有積極應(yīng)答的病況的患者可以用本發(fā)明的藥物組合物治療。例如，患有腫瘤的患者可以通過(guò)在這里講的藥物組合物靜脈用藥方便地給予治療。美國(guó)專(zhuān)利第5,010,062號(hào)討論了人類(lèi)某些腫瘤的治療，在此引入作為參考。
定量及定性分析HPLC分析獲自經(jīng)HIC層析后的樣品的CM101之純度及數(shù)量是通過(guò)高壓液相層析(HPLC)凝膠過(guò)濾分析確定的。凝膠過(guò)濾柱一般用10％乙腈水溶液平衡，并且生物學(xué)活性的CM101洗脫為含有其的均勻窄峰。另外可以在pH8.4的10mM磷酸鹽緩沖液中展開(kāi)，產(chǎn)生一個(gè)內(nèi)含更多CM101的峰。pH8.4的醋酸銨(NH4OAc)緩沖液可以用作10mM磷酸鹽緩沖液的另一種替代。
使用30、50和100μg純的CM101標(biāo)準(zhǔn)于100μl展開(kāi)緩沖液中注入Hydragel 1000柱(Waters,Millford,MA)，典型的檢測(cè)反應(yīng)(UV203吸收值)分別其是26×106、48×106和97×106面積單位，其對(duì)未知樣品的數(shù)量產(chǎn)生一個(gè)劑量反應(yīng)曲線(xiàn)。
CM101的分子量也可通過(guò)凝膠過(guò)濾層析測(cè)定。非變性緩沖液，如前面描述的乙腈、磷酸鹽或醋酸銨可用來(lái)上樣于層析柱。CM101的洗脫物與不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)右旋糖苷多糖標(biāo)記物的洗脫物類(lèi)似。在這些條件下，CM101的分子量大約為300,000道爾頓。
氨基酸分析定量和定性的自動(dòng)化氨基酸分析可以用標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)化可得的儀器，例如來(lái)自Waters,Millford.MA的PicoTag進(jìn)行。
ANA-1分析為了監(jiān)測(cè)不同發(fā)酵和純化步驟的生物學(xué)活性，在體外試驗(yàn)中可應(yīng)用一種經(jīng)轉(zhuǎn)化的鼠巨噬細(xì)胞系。這種試驗(yàn)測(cè)定了鼠巨噬細(xì)胞ANA-1應(yīng)答與CM101接觸產(chǎn)生的IL-6。
特別是，在體外CM101通過(guò)IL-6的產(chǎn)生誘導(dǎo)raf/myc轉(zhuǎn)化的鼠骨髓巨噬細(xì)胞系A(chǔ)NA-1的應(yīng)答。其它的巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系以及新鮮的外周血白細(xì)胞也可使用。
為進(jìn)行ANA-1試驗(yàn)，樣品首先稀釋到合適的范圍(根據(jù)預(yù)期的CM101活性)，并在1∶4稀釋度測(cè)定4到8個(gè)濃度。通過(guò)使用在PBS中重構(gòu)的臨床等級(jí)的CM101產(chǎn)生一種CM101標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在PBS中配制4000ng/ml溶液，其在加了細(xì)胞之后達(dá)到2000ng/ml的最終濃度，以及六個(gè)連續(xù)的1∶2稀釋度。例如可以使用2×106/ml濃度的細(xì)胞。通過(guò)在A(yíng)NA-1細(xì)胞中加入200U/ml的鼠IFN-γ增加這個(gè)試驗(yàn)的敏感度。最終培養(yǎng)物是100U/ml IFN-γ。
帶有培養(yǎng)物的微量滴定板應(yīng)放于37℃含5％ CO2氣體的潮濕孵箱中過(guò)夜(16-18小時(shí))，然后進(jìn)行ELlSA IL-6檢測(cè)(R.D.系統(tǒng)，Minneapolis,MN)。特別是，培養(yǎng)物上清液被轉(zhuǎn)移到IL-6測(cè)定板上，并把此板保持在4℃直到IL-6檢測(cè)完成。
斑點(diǎn)印跡測(cè)定在溶液中或生物學(xué)液體中定量測(cè)定CM101的另一種快速方法是在聚偏氟乙烯(PVDF)膜上以系列稀釋度印跡樣品。通過(guò)使用針對(duì)CM101的鼠單克隆抗體或熒光標(biāo)記的針對(duì)CM101的鼠單克隆抗體，繼之以熒光標(biāo)記的抗鼠IgG，測(cè)定CM101的數(shù)量。直接針對(duì)CM101抗原的抗體7A3可用于此目的。在不同級(jí)分中CM101的數(shù)量是通過(guò)與系列稀釋的CM101的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較確定的。
綿羊肺動(dòng)脈壓力試驗(yàn)通過(guò)肺動(dòng)脈壓力增加和肺血管的滲透性增加證明，毒素通過(guò)增加肺動(dòng)脈高壓影響綿羊肺部。
在磷酸緩沖鹽液(PBS)中的CM101樣品可以通過(guò)灌注施用于羔羊，以15分鐘的間隔記錄肺動(dòng)脈壓的變化。這些壓力的變化與CM101的活性相關(guān)。(Hellerqvist,C.G.等人。B群β-溶血性鏈球菌的研究Ⅰ，一種細(xì)胞外毒素的分離及部分特征，兒科學(xué)研究(Pediatr.Res.),12:892-898(1981))。
糖分析100μg量的樣品在比例為5∶70∶25的三氟乙酸(TFA)、醋酸(HOAc)和水的混合物中100℃水解2小時(shí)。蒸發(fā)溶液，樣品在TFA和水以2∶8比例的混合物中100℃進(jìn)一步水解2小時(shí)。這種方法完全地水解樣品中的所有糖苷鍵。最初存在于氨基糖上的N-乙酰基基團(tuán)也被清除。
然后使用PAD(脈沖電流探測(cè)器)探測(cè)器在Dionex糖分析系統(tǒng)上分析樣品。結(jié)果示于圖4。
樣品的純度通過(guò)糖的定量和定性分析確定。原理在圖3和圖4中得到闡明。通過(guò)HPLC定量的多糖樣品用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)6-脫氧-D-葡萄糖的水解和分析得到補(bǔ)充。此部分描述的方法在測(cè)定的范圍內(nèi)有線(xiàn)性劑量反應(yīng)，并且通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)比較未知的保留時(shí)間完成定性分析。
實(shí)施例實(shí)施例1放大的CM101純化方案B群鏈球菌血清型Ⅲ型分離工作原種與3,000加侖發(fā)酵罐一同使用。細(xì)菌培養(yǎng)物的25ml種子用于65升有效容積(lwv)的80升容器，然后其用于接種750lwv的容器，并依次接種入最終7500lwv(3,000加侖)的發(fā)酵罐。另外，65lwv可以直接用于接種7500lwv發(fā)酵罐。
在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期通過(guò)高壓滅菌終止培養(yǎng)。然后通過(guò)10,000×g連續(xù)離心，繼之以0.45微米盒式過(guò)濾器過(guò)濾(Millipore公司，Bedford,MA)除去細(xì)菌。
然后使用10kD到50kD截?cái)嘀档暮惺竭^(guò)濾器(Millipore)將所得培養(yǎng)物上清液濃縮15倍到500升。然后通過(guò)透析，將濃縮的材料制成2M的鹽溶液，優(yōu)選地用pH7.4的磷酸鹽(加樣緩沖液)。
然后通過(guò)使用BioPilot系統(tǒng)(Pharmacia)的60升正丁基-Sepharose層析柱將濃縮的上清液進(jìn)行疏水相互作用層析(Pharmacia,Uppsaia,瑞典)。對(duì)于培養(yǎng)基濃縮物中CM101生物學(xué)活性，無(wú)活性流出的正丁基Sepharose樹(shù)脂的容量大約是80升培養(yǎng)基對(duì)1升樹(shù)脂。在濃縮的上清液加到層析柱之后，用加樣緩沖液洗滌柱，然后用0.5-1M繼之是0.25MpH7.4磷酸鹽緩沖液洗滌。用水洗脫含有CM101的級(jí)分于大約120升或兩倍柱體積的水中，并在10kD到50kD范圍的截?cái)嘀岛兄袧饪s到2升。通過(guò)BioPiot中預(yù)先設(shè)定的程序控制層析柱洗脫，并通過(guò)在206和280nm的UV吸收、電導(dǎo)率和pH值監(jiān)控洗脫。
含有CM101的2升級(jí)分對(duì)pH7.0的0.05M的鹽水透析，然后加熱到75-80℃并加0.2-2升的苯酚。然后把混合物加熱到80℃并在此溫度保持5分鐘。繼之，將混合物冷卻到4℃。由這一步驟產(chǎn)生的水相在加到用水平衡的DEAE Sephacel FF層析柱(Pharmacia,Uppsala，瑞典)之前，優(yōu)選地用0.2倍體積的氯仿抽提2次。層析柱用100mM的鹽水，pH7.4的0.05M NaOAc洗滌，然后把生物學(xué)活性物質(zhì)CM101用NaCl梯度從DEAE柱洗脫。用IL-6檢測(cè)和HPLC分析檢測(cè)生物學(xué)活性。通過(guò)HPLC和糖分析以及IL-6及綿羊試驗(yàn)測(cè)定生物學(xué)活性確定本方法純化的CM101的質(zhì)量。
本放大的純化方案所提供的優(yōu)點(diǎn)避免了以前方法中使用的乙醇沉淀中大體積的早期苯酚-水抽提方法。
結(jié)果圖5a-b顯示了在2M K2HPO4,pH7.2的丁基Sepharose HIC柱上，培養(yǎng)基濃縮物的洗脫分布圖。不同的峰是在洗脫梯度中隨時(shí)間逐漸變化的結(jié)果。圖5a表現(xiàn)了在UV206吸光度測(cè)量的分布圖，其測(cè)定了全部有機(jī)材料峰級(jí)分的量，并顯示CM101在最后的窄峰(大約383分鐘)。圖5b表現(xiàn)了在UV280吸光度處測(cè)定的分布圖，其測(cè)定了不同級(jí)分中蛋白質(zhì)的量。
通過(guò)進(jìn)行HIC柱步驟，CM101被結(jié)合到層析柱上，而高達(dá)99.7％的蛋白質(zhì)和高達(dá)98.5％的中性及帶電荷的多糖通過(guò)層析柱，如表1所示。
表1通過(guò)HIC層析純化的CM101活性通過(guò)積分UV280和206分布圖定量最終洗脫可能的蛋白質(zhì)UV280 總有機(jī)物UV206回收％ 回收％AP6P6水 0.852.67AP2P9水 1.080.1910KSP6 水 0.821.0510K5P6 水 0.462.43AP1P9緩沖液A0.391.9010K5P6 緩沖液A0.501.51AP6P6緩沖液A0.191.35
在表1中，以乙醇沉淀(AP)、AP1、AP2和AP6以及10K濃縮的不同發(fā)酵批次應(yīng)用于HIC層析并用水或緩沖液A洗脫。兩種方法對(duì)外源性或內(nèi)源性蛋白質(zhì)(UV280)和多糖及普通有機(jī)物(UV206)產(chǎn)生大約相同效率的清除。
圖6a-b表現(xiàn)了包含CM101的HIC純化的水洗脫級(jí)分在UV203吸光度監(jiān)測(cè)的HPLC分布圖和Diodo-Ray頻譜。這些圖形說(shuō)明了含有CM101峰的260吸收(RNA和DNA)及280吸收(蛋白質(zhì))的最小存在。
在HIC級(jí)分進(jìn)一步經(jīng)過(guò)苯酚/鹽水抽提和離子交換步驟后，HIC水洗脫峰的純度進(jìn)一步提高，如圖7a-b所示。注意到從時(shí)間零點(diǎn)始于約16分鐘處的窄的對(duì)稱(chēng)峰以及在260(RNA/DNA)和280(蛋白質(zhì))處無(wú)吸收。對(duì)圖6a-b和7a-b所顯示的洗脫分布圖，HPLC是用10％乙腈水溶液進(jìn)行的，流速大約是0.3ml/分鐘。
這些洗脫分布圖及生物學(xué)活性與當(dāng)乙醇沉淀用作上樣到HIC柱的初始材料時(shí)獲得的那些是相似的。
來(lái)自10k初始材料的HIC級(jí)分在A(yíng)NA-1細(xì)胞中誘導(dǎo)IL-6合成的能力在圖8中得到闡明。如ANA-1試驗(yàn)測(cè)得，HIC層析能回收培養(yǎng)基上清中大約總生物學(xué)活性的50％。為了確認(rèn)ANA-1試驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)CM101抗原存在時(shí)顯示免疫反應(yīng)性的相同材料進(jìn)行了斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)。
HIC層析后從10k濃縮液得到的不同級(jí)分也在用于測(cè)定生物學(xué)活性的綿羊模型中檢測(cè)。CM101活性的量是基于使用當(dāng)前臨床CM101(1活性單位對(duì)應(yīng)7.5μg/kg)的劑量反應(yīng)曲線(xiàn)確定的。結(jié)果顯示在表2中，其中比較了乙醇沉淀(AP)和培養(yǎng)基濃縮液(10k)的HIC級(jí)分。
表2基于在綿羊模型中生物學(xué)活性定量的獲自AP和10K材料的HIC層析的CM101的數(shù)量乙醇沉淀(AP) 培養(yǎng)基濃縮液級(jí)分(10k)CM101活性μg/l CM101活性μg/l預(yù)加樣 466 沒(méi)有提供1M磷酸鹽 118 2090.25M磷酸鹽 28 2970水 225 7520通過(guò)本發(fā)明的方法純化的CM101生物學(xué)活性也在綿羊中用肺動(dòng)脈壓試驗(yàn)進(jìn)行了測(cè)定，然后與用舊方法純化的CM101活性進(jìn)行比較，例如在美國(guó)專(zhuān)利第5,010,062號(hào)中所講。依照本發(fā)明純化的材料，比用不與HIC樹(shù)脂接觸的舊方法純化的材料顯示強(qiáng)2到3倍的比活性。
用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的產(chǎn)物也在上文證明，與上文顯示的7520μg/l值相比，已知的方法每升發(fā)酵體積提供約300μg的CM101。
在圖7a-b闡明的通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的純化CM101也進(jìn)行了糖分析。糖的產(chǎn)生顯示在圖9中。
定量地，通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的CM101是純度高于95％的碳水化合物，并含有少于5％的蛋白質(zhì)，它是通過(guò)上面介紹的定性及定量以及自動(dòng)氨基酸分析(PicoTag,Waters,Millford,MA)確定的。
實(shí)施例2當(dāng)前臨床等級(jí)與新組合物的比較通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的CM101比當(dāng)前臨床等級(jí)CM101更好。特別的，圖10與圖7a的HPLC洗脫分布圖相比較，說(shuō)明依據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的樣品純度較高。圖7a顯示了一個(gè)窄的對(duì)稱(chēng)主要峰而不是數(shù)個(gè)峰。
為了進(jìn)一步證明使用HIC柱的優(yōu)點(diǎn)并提供純化已知為CM101的毒素的證據(jù)，當(dāng)前臨床等級(jí)的CM101被加到HIC柱并進(jìn)行HPLC純化以及糖分析。示于圖11中的結(jié)果可以與圖9比較。糖分析顯示了最終產(chǎn)物在數(shù)量和質(zhì)量上相似，證明了HIC層析方法去除糖，并不涉及生物學(xué)活性的CM101。結(jié)果在表3中也同樣得到證實(shí)。表3CM101的碳水化合物組分(以整體的碳水化合物比率表示)

*在天然的多糖中分別以“N-乙?；?葡糖胺和N-乙?；?半乳糖胺”表示。
上面所示的糖殘基表提供了大概的摩爾比例。依照本方法純化的CM101實(shí)際的殘基范圍是(第一欄)(0.2-1甘露糖)∶(2.5-3.5半乳糖)∶(0.5-1葡萄糖)∶(1N-乙?；咸前?∶(0.5-1N-乙?；肴樘前?。上述數(shù)目用N-乙?；咸前返臄?shù)目標(biāo)準(zhǔn)化，因此N-乙?；咸前繁辉O(shè)成1。
為了進(jìn)一步的比較，圖12a-b顯示了用舊方法(圖12a)以及依照本發(fā)明的方法(圖12b)生產(chǎn)的CM101的HPLC分布圖。凝膠過(guò)濾柱(Ultrage 100,Waters,Milford,MA)在pH8.4的10mM磷酸鹽緩沖液中展開(kāi)。如圖12b所見(jiàn)，依照本發(fā)明的方法純化的CM101洗脫在一個(gè)大約超過(guò)約5分鐘的范圍相對(duì)窄的峰里。以0.3ml/分鐘流速?gòu)臅r(shí)間零點(diǎn)起洗脫時(shí)間大約是24分鐘。與此相比，通過(guò)舊的方法純化材料洗脫在一個(gè)大約超過(guò)12分鐘的寬峰里。
實(shí)施例3通過(guò)SDS-PAGE/Western印跡分析CM101
使用4-20％的梯度膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。CM101的樣品在2％SDS、0.5M Tris-HCL、5％甘油、0.05％溴酚蘭和5％β-巰基乙醇組成的，pH0.8的緩沖液中55℃孵育10分鐘，加到4％的積層膠并用4-20％的SDS分離膠電泳。凝膠以200伏電壓電泳90分鐘。
凝膠在Western印跡緩沖液(25mM Tris,192mM甘氨酸和20％甲醇)中展開(kāi)并以100伏電壓印跡2小時(shí)。凝膠在室溫下于含5％脫脂奶粉的PBS中封閉1小時(shí)，用結(jié)合緩沖液(磷酸鹽緩沖液，2％胎牛血清和0.5％吐溫-20去垢劑(BBT))清洗兩次，然后與10μg/ml的7A3(針對(duì)CM101的單克隆抗體)孵育1小時(shí)。
凝膠用BBT清洗4次10分鐘，然后與堿性磷酸酶結(jié)合的抗鼠抗體孵育45分鐘，用BBT清洗4次，用Pierce Single-Step AP顯影劑顯影50分鐘。
在這些條件下分析時(shí)，SDS-PAGE/Western印跡分析提示CM101中含有一種或多種26,000道爾頓的成分。
因而，本發(fā)明的方法提供了一個(gè)改進(jìn)的純化方法，其把危險(xiǎn)步驟的困難降到最小并提供極好的純度。另外，通過(guò)在這里講的方法生產(chǎn)的產(chǎn)物比當(dāng)前用到的CM101更好。
在本說(shuō)明書(shū)中提及的所有的出版物及專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖艘胱鳛橄嗤秶膮⒖?，好象每一單?dú)的出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)被明確和個(gè)別地指出在此引入作為參考。
本發(fā)明現(xiàn)已經(jīng)完全描述，在不偏離這些附加權(quán)利要求的精神或范圍的情況下能夠?qū)λ龊芏喔淖兒托揎?，這對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都是顯而易見(jiàn)的。
權(quán)利要求
1．一種從GBS細(xì)菌中純化多糖毒素的方法，此方法包括將一種含有該毒素的水混合物與一種HIC樹(shù)脂接觸。
2．權(quán)利要求1的方法，其中HIC樹(shù)脂接觸步驟還包括從HIC樹(shù)脂中分離毒素。
3．權(quán)利要求1的方法，其中該毒素是CM101。
4．權(quán)利要求1的方法，其中自HIC樹(shù)脂接觸步驟產(chǎn)生的毒素純度增加約100-500倍。
5．權(quán)利要求1的方法，其中自HIC樹(shù)脂接觸步驟產(chǎn)生的毒素純度高于40％。
6．權(quán)利要求5的方法，其中自HIC樹(shù)脂接觸步驟產(chǎn)生的毒素純度至少大約是60％。
7．權(quán)利要求6的方法，其中自HIC樹(shù)脂接觸步驟產(chǎn)生的毒素純度至少大約是90％。
8．權(quán)利要求1的方法，其中自HIC樹(shù)脂接觸步驟產(chǎn)生的毒素純度至少大約是95％。
9．權(quán)利要求1的方法，其中HIC樹(shù)脂還包括一種含選自烷基、烷氧基和芳基基團(tuán)中的活性基團(tuán)的樹(shù)脂。
10．權(quán)利要求9的方法，其中活性基團(tuán)是含范圍在2到12個(gè)碳的烷基基團(tuán)。
11．權(quán)利要求10的方法，其中活性基團(tuán)是丁基基團(tuán)。
12．權(quán)利要求11的方法，其中活性基團(tuán)是正丁基基團(tuán)。
13．權(quán)利要求9的方法，其中活性基團(tuán)是苯基基團(tuán)。
14．權(quán)利要求1的方法，其還包括用一種水酚混合物抽提毒素。
15．權(quán)利要求1的方法，其還包括用一種離子交換樹(shù)脂接觸毒素。
16．權(quán)利要求1的方法，其還包括在HIC樹(shù)脂接觸步驟后，用一種水酚混合物抽提毒素，以及用一種離子交換樹(shù)脂接觸毒素。
17．一種用權(quán)利要求1的方法純化的來(lái)自GBS細(xì)菌的毒素。
18．權(quán)利要求17的毒素，其中該毒素是CM101。
19．權(quán)利要求18的毒素，其中該毒素純度至少大約為60％。
20．權(quán)利要求19的毒素，其中該毒素純度至少大約為90％。
21．權(quán)利要求20的毒素，其中該毒素純度至少大約為95％。
22．權(quán)利要求18的毒素，其還包含甘露糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰基葡糖胺以及N-乙?；肴樘前返奶菤埢?，其摩爾比為(0.2-1甘露糖)∶(2.5-3.5半乳糖)∶(0.5-1葡萄糖)∶(1N-乙?；咸前?∶(0.5-1N-乙?；肴樘前?。
23．權(quán)利要求22的毒素，其中甘露糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙?；咸前芬约癗-乙酰基半乳糖胺的糖殘基以(1甘露糖)∶(3半乳糖)∶(1葡萄糖)∶(1N-乙?；咸前?∶(1N-乙?；肴樘前?的摩爾比存在。
24．用于一種治療方法的權(quán)利要求18的毒素。
25．權(quán)利要求18的毒素，其在非變性條件下通過(guò)凝膠過(guò)濾層析測(cè)量得分子量約為300,000道爾頓。
26．權(quán)利要求18的毒素，其特征在于當(dāng)通過(guò)10％乙腈緩沖液，流速大約為0.3ml/分鐘的HPLC分析時(shí)，在從時(shí)間零點(diǎn)起于大約16分鐘處，在203nm吸光度測(cè)量到毒素洗脫于一個(gè)窄的對(duì)稱(chēng)峰。
27．權(quán)利要求18的毒素，其特征在于當(dāng)通過(guò)以pH8.4 10mM磷酸鹽緩沖液的HPLC分析時(shí)，在從時(shí)間零點(diǎn)起于大約24分鐘處在203nm吸光度測(cè)量到毒素洗脫于一個(gè)窄的對(duì)稱(chēng)峰。
28．權(quán)利要求18的毒素，通過(guò)一種增加綿羊肺動(dòng)脈壓力的試驗(yàn)測(cè)量，其具有未與HIC樹(shù)脂接觸的GBS毒素大約強(qiáng)2到3倍的比活性。
29．一種從GBS細(xì)菌中純化多糖毒素的方法，其包括(1)將GBS細(xì)菌毒素原料上樣于HIC柱，(2)洗脫HIC柱以獲得包含毒素的HIC洗脫物，(3)用苯酚和水溶液的混合物抽提HIC洗脫物，以形成包含毒素的水相，(4)將該水相上樣于離子交換柱，并(5)洗脫離子交換柱以獲得離子交換洗脫物，其中離子交換洗脫物包含基本上純的毒素。
30．權(quán)利要求29的方法，其中基本上純的毒素是CM101。
31．權(quán)利要求30的方法，其中基本上純的毒素純度至少大約是60％。
32．權(quán)利要求31的方法，其中基本上純的毒素純度至少大約是95％。
33．一種組合物，其基本上由基本上純的GBS毒素組成。
34．權(quán)利要求33的組合物，其中基本上純的GBS毒素是CM101。
35．權(quán)利要求34的組合物，其中該毒素純度至少大約是60％。
36．權(quán)利要求35的組合物，其中該毒素純度至少大約是90％。
37．權(quán)利要求36的組合物，其中該毒素純度至少大約是95％。
38．權(quán)利要求34的組合物，其中該毒素還包含甘露糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙?；咸前芬约癗-乙?；肴樘前返奶菤埢?，其摩爾比為(0.2-1甘露糖)∶(2.5-3.5半乳糖)∶(0.5-1葡萄糖)∶(1N-乙酰基葡糖胺)∶(0.5-1N-乙?；肴樘前?。
39．權(quán)利要求38的毒素，其中甘露糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙?；咸前芬约癗-乙酰基半乳糖胺的糖殘基以(1甘露糖)∶(3半乳糖)∶(1葡萄糖)∶(1N-乙?；咸前?∶(1N-乙酰基半乳糖胺)的摩爾比存在。
40．權(quán)利要求34的組合物，其中該毒素在非變性條件下通過(guò)凝膠過(guò)濾層析測(cè)量其分子量約為300,000道爾頓。
41．權(quán)利要求34的組合物，其中當(dāng)通過(guò)10％乙腈緩沖液，流速大約0.3ml/分鐘的HPLC分析時(shí)，在從時(shí)間零點(diǎn)起于大約16分鐘處在203nm吸光度測(cè)量到毒素洗脫于一個(gè)窄的對(duì)稱(chēng)峰。
42．權(quán)利要求34的組合物，其中當(dāng)通過(guò)pH8.4,10mM磷酸鹽緩沖液的HPLC分析時(shí)，在從時(shí)間零點(diǎn)起于大約24分鐘處在203nm吸光度測(cè)量到毒素洗脫于一個(gè)窄的對(duì)稱(chēng)峰。
43．一種藥物組合物，其包含基本上純的CM101和一種藥學(xué)可接受的載體。
44．權(quán)利要求43的藥物組合物，其中該組合物純度至少大約為60％。
45．一種治療具有病癥患者的方法，其包括向患者施用權(quán)利要求43的藥物組合物。
46．一種治療腫瘤患者的方法，其包括向患者施用權(quán)利要求43的藥物組合物。
全文摘要
一種用于從B群β－溶血性鏈球菌(GBS)中純化多糖的方法,其包括將細(xì)菌發(fā)酵原液與疏水相互作用層析(HIC)樹(shù)脂接觸。附加的步驟可包括苯酚/鹽水抽提以及離子交換層析。這種方法導(dǎo)致有很高純度的產(chǎn)物。純化的產(chǎn)物提供一種在研究和治療用途中均非常有用的組合物。
文檔編號(hào)C12P19/26GK1235642SQ97199369
公開(kāi)日1999年11月17日 申請(qǐng)日期1997年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月30日
發(fā)明者C·G·赫勒韋斯特 申請(qǐng)人:范德比爾特大學(xué) 被以下專(zhuān)利引用 (1),