專利名稱：大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
哺乳動物的核糖體是由4種RNA和大約80個不同的蛋白質(zhì)組成，其中核糖體蛋白的命名與蛋白在核糖體的大小亞基有關(guān)，小亞基核糖體蛋白命名為Sl至S31，大亞基核糖體蛋白命名為Ll至LA4。RPL23a蛋白是60s核糖體蛋白的組成部分，由rpl23a基因編碼。目前，rpl23a基因在人類及部分動植物中的研究有報道，大熊貓的核糖體蛋白亞基S7、S12、S15、S20、S24、S28以及LSM3等基因的克隆與分析也有報道(羅曉燕等，2008 ；杜玉杰等，2009 ；郝彥澤等，2009 ；侯怡鈴等，2009 ；張?zhí)锏龋?009 ；Hou W R et al.，2009 ；Zhang etal.，2009)，而大熊貓rpl23a基因及其RPL23a蛋白在國內(nèi)外尚未見報道。尤其是大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白的抗癌功能在國內(nèi)外更無任何報道。大熊貓是我國特有珍稀物種，屬國家一級保護動物，它具有極高的生態(tài)、科研、經(jīng)濟、文化和美學(xué)價值。國內(nèi)外學(xué)者從不同角度和領(lǐng)域?qū)Υ笮茇堖M行了大量的研究。目前，大熊貓功能基因的研究在國內(nèi)外已成為研究的熱點(汪曉晶等，2002;侯萬儒等，2007 ；Hou WR et al.，2007 ；Hou Y L et al.，2009 ；Qiao et al.，2009 ；Xu et al.，2009 ；Wan et al.，2009 ；Tao et al.，2010)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)人(Homosapiens)、牛(Bos Taurus)、野豬(Sus scrofa)、、小家鼠(Mus mUSCUlUS)4個哺乳動物物種已知的序列設(shè)計引物，以大熊貓骨骼肌為材料，運用RT-PCR和PCR技術(shù)分別對大熊貓rpl23a基因的表達序列進行了擴增，克隆和測序；對其序列進行比較、分析，并且構(gòu)建了含有rpl23acDNA的重組表達載體，轉(zhuǎn)化進入E. coliBL21進行超表達；對超表達產(chǎn)物進行純化獲得大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白；用大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白作用于H印-2細胞，觀察其大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白對H印-2細胞生長抑制效應(yīng)，旨在揭示大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白的抗癌功能，為抗癌蛋白藥物的研發(fā)與抗癌機理的研究提供科學(xué)基礎(chǔ)和資源。


圖1大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白對H印-2細胞生長的影響；(1-8 分別為 0，7. 4，2. 96,1.48,0. 74，0. 37，0. 185,0. 148 μ g/mL 大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白濃度)；圖2大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白對H印-2細胞的形態(tài)影響；(1-8 分別為 0,7. 4,2. 96，1. 48，0. 74，0. 37，0. 185,0. 148 μ g/mL 大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白濃度)。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。1. 1材料和方法1. 1. 1材料及試劑大熊貓骨骼肌組織取自四川臥龍中國保護大熊貓研究中心死亡的大熊貓，為防止RNA降解，所取組織立即凍存于液氮中；人喉癌!fep-2細胞(購于川北醫(yī)學(xué)院生化與分子免疫研究所)。總 RNA 抽提試劑盒 Total Tissue/cell RNA Extractiob Kits 購自 Waton公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcription System購自Promega公司；膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；T載體試劑盒(PMD-18T Vector Systems)及限制性內(nèi)切酶Sma I，Pst I，SeaILEcoR I和Ml I均購自寶生物(大連)有限公司；Taqplus聚合酶購自上海生物工程公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。宿主菌E. coli Dffia由四川省野生動植物保護與利用重點實驗室保存。CW0009 Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒購自北京易萊西諾生物科技有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒(Mbchem M2031)購自上海美季生物技術(shù)有限公司；RPMI1640粉末購于Gibco公司(美國)，胎牛血清購于四季青生物制品公司，雙抗(青霉素，鏈霉素，購于Gibco公司)。1.1. 2 方法1. 1. 2. 1 總 RNA 的提取取600mg左右的樣品組織，液氮中充分研磨，按照抽提試劑盒說明書推薦的方法提取總RNA。將所提總RNA溶于經(jīng)DEPC處理過的水中，于_70°C保存?zhèn)溆谩?. 1. 2. 2 引物設(shè)計及 RT-PCR從GenBank 數(shù)據(jù)庫中檢索到人(NM_000984)、牛(ΝΜ_001045958)、野豬(AK233511)、小家鼠(NM_207523)4個哺乳動物物種RPL23a基因的編碼區(qū)序列的相關(guān)信息，根據(jù)編碼序列的保守性，利用I^rimer Premier 5. O軟件設(shè)計上、下游引物(分別為Pd-RPL23a-F,Pd-RPL23a-R)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，所設(shè)計引物編號及序列如下Pd-RPL23a-F 5' -CCTTTTCGAC AAGATGGCGC-3‘ (SEQ ID NO 1)Pd-RPL23a-R 5' -GAATTAGCCA GCTGGACTCA-3‘ (SEQ ID NO 2)以肌肉總RNA為模板，Oiligo (dT)為反轉(zhuǎn)錄引物，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作手冊進行cDNA第1鏈的合成，反應(yīng)總體積20 μ L，其中含總RNA lug, dNTPs ImM, MgCl25mM,0iligo(dT)15 0. 5 μ g，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 15U，RNA 酶抑制劑 IOU/μ L0 反轉(zhuǎn)錄條件:42°C 60min ；再以適量第1鏈產(chǎn)物為模板，采用25μ L PCR反應(yīng)體系進行PCR擴增，各成分濃度為=MgCl21. 5Mm, dNTP 0. 2mM, Pd-RPL23a_F 和 Pd-RPL23a_R 各 0. 3 μ M，Taq plus 聚合酶 5U。反應(yīng)條件94°C 5min，94°C lmin，52°C 0. 5min，72°C 1. 5min，32 個循環(huán)；72°C IOmin0 然后用質(zhì)量分數(shù)為1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產(chǎn)物，并于_20°C保存。1. 1. 2. 3cDNA的克隆及鑒定對PCR產(chǎn)物進行回收純化，用Sma I限制性內(nèi)切酶酶切并平端化質(zhì)粒pUC18片段，將回收產(chǎn)物與酶切并平端化后的質(zhì)粒片段連接，22°C連接過夜。按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，再涂于含氨芐青霉素、IPTG及x-gal的LB培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，用接種針挑取5個白色菌落，堿裂解法提取質(zhì)粒，采用雙酶切(Pst I和ka II)和PCR這2種方法對重組質(zhì)粒進行鑒定。經(jīng)鑒定的陽性重組質(zhì)粒由北京華大生物科技發(fā)展有限公司測序。1.1. 2. 4 數(shù)據(jù)處理采用Genescan (http://genes, mit. edu/GENSCAN. html)軟件，對所克隆的基因序列進行氨基酸序列推定；采用ORF finder軟件(http //www. ncbi. nlm. gov/gorf. htlm)進行DNA序列的ORF查找；1. 1. 2. 5RPL23a cDNA 表達片段的克隆1. 1. 2. 5. 1引物的設(shè)計分別在RPL23a的正向引物和反向引物中引入限制性內(nèi)切酶EcoR I識別位點(GAATTC)和Ml I識別位點(GTCGAC)。所設(shè)計的上、下游引物編號及序列如下RPL23abd-F 5，-CAGAATTCATGGCGCCGAAG C_3，(EcoRI) (SEQ ID NO 3)RPL23a bd-R 5，~CGGTCGACTTAGATGATCCCA~3’ (Sail) (SEQ ID NO :4)引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。1. 1. 2. 5. 2PCR 擴增以連接cDNA的重組質(zhì)粒為模板，用新合成的含有酶切位點的引物RPL23abd_F和RPL23a bd_R進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系如前所述，反應(yīng)條件為94°C 2min ；94°C 30s,55°C 45s, 72°C lmin,35個循環(huán)；72°C 7min, PCR結(jié)束后，然后用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并割膠回收目的DNA片段。1. 1. 2. 6RPL23a基因融合表達載體的構(gòu)建1. 1. 2. 6. lRPL23a基因融合表達片段的獲得反應(yīng)體系為40ul 雙酶切目的 DNA片段 IOul，IOxK buffer 4. Oul,EcoR I 1. Oul,Sal I 1.0ul,ddH20 Mul。反應(yīng)條件37°C過夜充分酶切；酶切后65°C水浴lOmin，冰水浴l-2min ；4°C，12000g，離心Imin ；1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，回收酶切表達片段，回收產(chǎn)物于_20°C保存?zhèn)溆谩?. 1. 2. 6. 2 表達載體 pET_28a 的處理1. 1. 2. 6. 2. 1 小量制備 pET_28a 載體利用堿裂解法小量從DH5 α中提取pET_28a質(zhì)粒，小提質(zhì)粒的具體步驟如下1. 5ml (750ul X 2)菌液，12000g, 4°C 2min離心，去上清，再瞬時離心，徹底去上清；加入裂解液buffer I 133ul，用槍頭吹散，混勻；加入13!3ul 2% SDS, 133ul 0.4MNa0H，顛倒混勻5次(現(xiàn)用現(xiàn)混合)；加入bufferIII 200ul顛倒混勻，冰水浴5min ；取出，12000g4°C，9min離心，將上清轉(zhuǎn)移到新的EP管；12000g，4°C，5min離心，將上清轉(zhuǎn)移新的EP管中；加入2倍體積的無水乙醇(SOOul)，顛倒混勻；放入冰箱(_20°C )，半小時左右(時間可長一些或過夜)；取出12000g，4°C，離心9min，去上清；加入70% C2H5OH IOOOul，12000g，離心3min ；加入70% C2H5OH lOOOul，12000g，離心;3min，用槍頭吸凈上清(可瞬時離心再吸)；放入超凈工作臺風干(15min)；用ddH20(20-25ul)溶解，_20°C保存?zhèn)溆谩?. 1. 2. 6. 2. 2 表達載體 pET-28a 的準備表達載體的消化反應(yīng)體系為40ul :pET-28a表達載體IOul，IOxK buffer 4. Oul，EcoR I 1. Oul, Sal I 1. Oul, ddH20 Mul。反應(yīng)條件37°C過夜充分酶切，取出65°C水浴lOmin，冰水浴l-anin，4°C，12000g，離心Imin用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，回收酶切表達片段，回收產(chǎn)物于-20°C保存?zhèn)溆谩?. 1. 2. 7目的基因與表達載體的連接與轉(zhuǎn)化連接反應(yīng)體系為20ul :RPL23a酶切片段2ul，IOxligase buffer 2ul，酶切表達載# pET-28a 3ul，T4 連接酶 lul，ddH20 12ul. Total 20ul。反應(yīng)條件16°C保溫過夜，65°C保溫lOmin，終止反應(yīng)。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞Dffia，轉(zhuǎn)化后的細胞懸液鋪于LB平板上[含有X-gal (40ug/mL)，IpTG (25ug/mL)和 Amp (100ug/mL) ]，37°C恒溫箱培養(yǎng)過夜。1. 1. 2. 7. 1重組子的篩選及重組質(zhì)粒制備隨機挑取5個單菌落(帶有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的平板)分別進行PCR和酶切鑒定，以保證篩選的可靠性；同時于5ml/50ml的尖底離心管中，37°C液體培養(yǎng)16h，堿裂解法提取重組質(zhì)粒，0.8%瓊脂糖電泳檢測。1. 1. 2. 7. 2pET-RPL23a重組載體在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達1. 1. 2. 7. 3 轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達菌株BL21 (DE3)，具體操作同1. 1. 2. 3。1. 1. 2. 7. 4誘導(dǎo)表達載體常用的誘導(dǎo)表達方法有溫度誘導(dǎo)和藥物誘導(dǎo)，本實驗采用IPTG(異丙基硫代-β -D-半乳糖苷，isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)誘導(dǎo)外源基因表達，具體操作步驟將菌液轉(zhuǎn)入100ml LB培養(yǎng)基+Kan(80ul/100ml)中，37°C，培養(yǎng)至0D_ = 0. 5-0. 6，收集Iml菌液做為對照；加入最適誘導(dǎo)濃度的誘導(dǎo)劑IPTG 50ul，使其終濃度位0. 2g/L ；誘導(dǎo)培養(yǎng)4h時各收集菌液，為純化做準備。1. 1. 2. 8大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白的純化1. 1. 2. 8. 1組裝層析柱將填料混勻后加入層析柱，室溫靜止10分鐘，待凝膠與溶液分層后，讓乙醇通過重力作用緩慢流出。向裝填好的柱中加入5倍柱床體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后，再用8倍柱體積的Binding Buffer平衡柱子，平衡結(jié)束后即可上樣。1. 1.2. 8. 2蛋白的純化收集菌體后，每IOOmg菌體(濕重)加入l_5ml細菌裂解液，超聲裂解菌體。離心，棄上清，將沉淀重懸于Soluble Binding Buffer中。冰浴1小時，使包涵體溶解。10，000 X g離心20分鐘，將上清以孔徑為0.45μπι的濾膜過濾。將蛋白溶液負載上柱，流速為10倍柱體積/小時。使用15倍柱體積的hclusion Body Binding Buffer沖洗柱子，收集流穿峰。使用5倍柱體積的hclusion Body Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。合并洗脫液，DS-PAGE檢測大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白的純度。用Bradford蛋白濃度測定試劑盒(Mbchem M2031)測定重組蛋白的濃度。1. 1.2.9 細胞培養(yǎng)人喉癌H印-2細胞株用含有10 %的滅活的胎牛血清(f etalbovine serum,FBS) 100U/ml 青霉素、100 μ g/ml 鏈霉素、pH7. 4 的 RPMI-1640 完全培養(yǎng)液于 37°C、5% CO2 培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。1. 1. 2. 9. IMTT法檢測細胞活性
取對數(shù)生長期的細胞，用胰蛋白酶消化后將細胞數(shù)調(diào)整到1 X IO5個/mL，接種于 96孔板，每孔細胞液量為200 μ L，放入(X)2培養(yǎng)箱內(nèi)，于37°C ,5% CO2及飽和濕度的條件下孵育至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，然后加入大熊貓核糖體蛋白亞基RPL23a重組蛋白使其終濃度分別為0,7. 4,2. 96、1. 48,0. 74,0. 37,0. 185,0. 148 μ g/mL,每個濃度設(shè)6個重復(fù)孔，空白組為不含細胞的RPMI1640培養(yǎng)液，放入(X)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后取出96孔板，加入MTT(5mg/mL)溶液10 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，然后加入150 μ L的二甲基亞砜(DMSO) 振蕩lOmin，待藍紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶標儀在在490am的波長下測定各孔的吸光度 (OD)值，計算不同濃度下大熊貓核糖體蛋白亞基RPL23a重組蛋白作用Hep_G2細胞的抑制率(％ )，公式如下細胞生長抑制率=(1-A實驗組/A對照組)X100% ·1. 1. 2. 9. 2形態(tài)學(xué)觀察將96孔板放在倒置顯微鏡下觀察，拍照記錄不同濃度下細胞的形態(tài)變化。2 結(jié)果2. 1大熊貓核糖體蛋白亞基RPL23a基因的cDNA序列及編碼的氨基酸序列將所得到的RT-PCR擴增產(chǎn)物用的瓊脂糖凝膠進行電泳，可見1條500bp左右的清晰的特異性擴增條帶。重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示，所得序列長度為506bp (SEQ ID NO 5))。在NCB I數(shù)據(jù)庫中利用Blast檢索軟件，進行基因同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與人和其他動物RPL23a基因的cDNA序列同源性很高，這證明所克隆的序列為大熊貓RPL23acDNA 序列。該序列的ORF為471bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為碼子TAA.編碼156個氨基酸殘基(SEQ ID NO :6)，預(yù)測大熊貓核糖體蛋白亞基RPL23a的分子量為17. 72KDa，等電點為 10. 44.2. 2大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白獲得的大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白的序列(190個氨基酸殘基)， (SEQ ID NO 7)。該重組蛋白的分子量為21. 265KDa ；等電點為10. 57 ；2. 3大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白對H印_2細胞生長的影響采用MTT法檢測不同濃度的大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白在24h 下對H印-2細胞生長活性的影響。從圖1可以看出，大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白對Hep-2細胞的生長抑制率具有時間和劑量的依賴性。發(fā)現(xiàn)在低濃度下的效果優(yōu)于高濃度下的效果，其中濃度為0. 185 μ g/ml時大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白對!fep-2細胞的生長抑制率最好，可以達到36. 31% (見圖1)。2. 4大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白對H印_2細胞形態(tài)的影響用倒置顯微鏡觀察不同濃度大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白(0， 7. 4，2. 96，1. 48，0. 74，0. 37，0. 185，0. 148 μ g/mL)處理 24h 的 H印_2 細胞形態(tài)變化(圖 2)。 從圖2可以看到，在Mh的處理時間下，與對照組相比，隨著大熊貓核糖體蛋白亞基基因 RPL23a重組蛋白濃度的降低，細胞出現(xiàn)變圓，細胞內(nèi)顆粒增多，細胞成團，脫落甚至裂解成碎片的現(xiàn)象(圖2)，其中濃度為0. 185 μ g/ml時大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白對Hep-2細胞的形態(tài)影響最大。應(yīng)當理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換， 而所有這些改進和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。
權(quán)利要求
1.大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白，該重組蛋白的氨基酸序列由SEQIDNO 7所定義。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，該重組蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO7所定義。用大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白作用于Hep-2細胞，觀察其大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白對Hep-2細胞生長抑制效應(yīng)，旨在揭示大熊貓核糖體蛋白亞基基因RPL23a重組蛋白的抗癌功能，為抗癌蛋白藥物的研發(fā)與抗癌機理的研究提供科學(xué)基礎(chǔ)和資源。
文檔編號C07K14/47GK102558333SQ20111036937
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月21日
發(fā)明者丁祥, 伍春蓮, 侯萬儒, 侯怡鈴, 孫冰, 李俊, 王婷, 蘇秀蘭 申請人:西華師范大學(xué)