一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)胡蘿卜成分用的引物組的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)胡蘿卜成分用的引物組，包括內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物，屬于利用核酸擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行植物源性成分快速檢測(cè)的【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地說(shuō)是采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)食品和飲料中胡蘿卜成分的引物組。本發(fā)明針對(duì)胡蘿卜核糖體RNA基因，根據(jù)其基因的保守序列，設(shè)計(jì)一組特異性引物，使用該組引物，采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可快速、靈敏、特異地檢測(cè)胡蘿卜成分。
【專利說(shuō)明】—種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)胡蘿卜成分用的引物組
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)胡蘿卜成分用的引物組，屬于利用核酸擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行植物源性成分快速檢測(cè)的【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]全球經(jīng)濟(jì)一體化和貿(mào)易國(guó)際化的的不斷擴(kuò)大，對(duì)于發(fā)展中的中國(guó)，是機(jī)遇也是挑戰(zhàn)。目前，我國(guó)已成為世界上第五大農(nóng)產(chǎn)品出口國(guó)，農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易持續(xù)增長(zhǎng)。美國(guó)、歐盟、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)為了維護(hù)本國(guó)的經(jīng)濟(jì)利益，爭(zhēng)奪國(guó)際市場(chǎng)，竭力通過(guò)名目繁多的檢驗(yàn)項(xiàng)目和嚴(yán)格甚至苛刻的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品設(shè)置貿(mào)易障礙，導(dǎo)致我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品出口增長(zhǎng)遭受較大壓力。就進(jìn)出口的農(nóng)產(chǎn)品而言，合格的產(chǎn)品，不僅要無(wú)毒無(wú)害，滿足安全衛(wèi)生要求；而且要無(wú)攙雜攙假，滿足品質(zhì)要求。其中品質(zhì)合格，又主要包含兩方面的含義:1.原料來(lái)源與標(biāo)簽一致。2.組分含量與標(biāo)簽一致。歐盟自2006年I月I日起開(kāi)始實(shí)施新的食品衛(wèi)生法規(guī)，新法規(guī)突出了食品生產(chǎn)過(guò)程中的可追溯管理與食品的可追溯性，強(qiáng)調(diào)食品的身份鑒定標(biāo)識(shí)與健康標(biāo)識(shí)。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 7718-94《食品標(biāo)簽通用標(biāo)準(zhǔn)》和國(guó)家出入境檢驗(yàn)檢疫局發(fā)布的《進(jìn)出口食品標(biāo)簽管理辦法》，也明確提出食品標(biāo)簽標(biāo)注內(nèi)容應(yīng)與食品相符。為此，國(guó)家質(zhì)檢總局專門發(fā)文，要求嚴(yán)厲打擊制假制劣的違法行為，對(duì)假冒偽劣產(chǎn)品要依法沒(méi)收并監(jiān)督銷毀，追查生產(chǎn)源頭和去向，嚴(yán)防流入消費(fèi)環(huán)節(jié)。
[0003]在食品和飲料的生產(chǎn)與銷售中，產(chǎn)品無(wú)標(biāo)簽或標(biāo)簽不規(guī)范，利用摻雜摻假、以次充好等手段欺騙消費(fèi)者謀取暴利的事件，國(guó)內(nèi)、國(guó)外均屢屢發(fā)生。各種原料被加工成食品和飲料成品后，已無(wú)法從外觀對(duì)其組成進(jìn)行鑒定。生產(chǎn)者受利益驅(qū)動(dòng)，擅自改變產(chǎn)品組成，或摻入價(jià)廉的替代品，或直接減少原料用量，導(dǎo)致產(chǎn)品的真實(shí)屬性與標(biāo)簽不符。這種造假行為不僅僅涉及經(jīng)濟(jì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，更直接影響著消費(fèi)者的健康，可能引發(fā)食源性過(guò)敏反應(yīng)。
[0004]胡蘿卜是一種質(zhì)脆味美的家常蔬菜，素有“小人參”之稱，其富含糖類、脂肪、揮發(fā)油、胡蘿卜素、維生素A、維生素B1、維生素B2、花青素、鈣、鐵等多種營(yíng)養(yǎng)成分，常作為食品配料用于制作各種糕點(diǎn)、面食和飲料。胡蘿卜雖營(yíng)養(yǎng)豐富，但同時(shí)也是一種常見(jiàn)的食物過(guò)敏原。有文獻(xiàn)報(bào)道，胡蘿卜、蘋果、大豆、榛子、獼猴桃、小麥?zhǔn)前亓秩俗畛Ｒ?jiàn)的食物過(guò)敏原。瑞士專家報(bào)道，大約25%的食物過(guò)敏者會(huì)對(duì)胡蘿卜產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)?！秮嗊\(yùn)食品安全食品過(guò)敏原標(biāo)識(shí)標(biāo)注》地方技術(shù)規(guī)范已于2009年頒布實(shí)施，規(guī)范列出可導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)的食品名單，要求含有名單上過(guò)敏原的亞運(yùn)食品必須如實(shí)標(biāo)注，胡蘿卜位列其中。鑒于此，盡快建立可靠有效的胡蘿卜成分檢測(cè)方法，確保食物標(biāo)簽真實(shí)準(zhǔn)確，對(duì)于減少食源性過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生，加強(qiáng)食品過(guò)敏原標(biāo)識(shí)管理，改進(jìn)食品安全，保護(hù)消費(fèi)者利益具有重要意義。
[0005]食品中植物源性成分檢測(cè)，常采用蛋白檢測(cè)和DNA檢測(cè)的方法。兩類方法，對(duì)于不同產(chǎn)品中植物源性成分的檢出和定量檢測(cè)，各有優(yōu)、缺點(diǎn)。以DNA為測(cè)試對(duì)象的方法與以蛋白為測(cè)試對(duì)象的方法相比，在產(chǎn)品成分復(fù)雜的情況下，目標(biāo)DNA可以有效提取，受產(chǎn)品基質(zhì)的影響較?。淮送?，DNA比較穩(wěn)定，不象蛋白質(zhì)組成那樣易受加工工藝的影響。當(dāng)前，基于DNA的檢測(cè)方法中，常用的有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR)，該方法靈敏、特異，但需要高品質(zhì)熱循環(huán)儀，而且因?yàn)闇囟妊h(huán)導(dǎo)致耗時(shí)較長(zhǎng)。其他新開(kāi)發(fā)的核酸擴(kuò)增方法，比如 NASBA (nucleic acid sequence-based amplification)>3SR (self-sustainedsequence replication)、SDA (strand displacement amplification)等，在擴(kuò)增循環(huán)方面，都有各自的創(chuàng)新點(diǎn)。NASBA和3SR使用一系列轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄過(guò)程來(lái)循環(huán)以避免高溫變性作用，SDA則使用限制性內(nèi)切酶和修飾過(guò)的模板來(lái)循環(huán)擴(kuò)增。雖然它們的敏感性都很高，可以檢測(cè)并擴(kuò)增小于10個(gè)拷貝的核酸樣本，但是它們還有各自需要克服的缺點(diǎn)。技術(shù)要求、材料儀器要求、技術(shù)本身特異性缺陷等方面嚴(yán)重束縛了這些技術(shù)的推廣應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification,簡(jiǎn)稱LAMP)技術(shù)則在這些方面有所突破。LAMP有比較高的特異性和抗干擾能力，只有當(dāng)2對(duì)引物與目的片段的六個(gè)區(qū)域都匹配上時(shí)才能進(jìn)行擴(kuò)增。非目的片段對(duì)LAMP反應(yīng)的干擾比較小，這方面比常規(guī)的PCR要強(qiáng)。LAMP的反應(yīng)體系比較穩(wěn)定可靠，在室溫下放置2周后仍然穩(wěn)定并且對(duì)于樣品中原有或污染的無(wú)關(guān)、干擾片段仍然不敏感。同時(shí)LAMP的敏感性也比較高，可以以單拷貝的基因?yàn)槟０暹M(jìn)行擴(kuò)增。LAMP反應(yīng)的過(guò)程簡(jiǎn)單快速而且高效，能夠在Ih內(nèi)將單拷貝的基因模板擴(kuò)增到IO9個(gè)拷貝，如果在體系中增加2條環(huán)狀引物，還可使LAMP的反應(yīng)時(shí)間縮短至20-40min，從而提高檢測(cè)效率。而且這一過(guò)程是在60-70°C的恒溫下進(jìn)行的。這就擺脫了昂貴儀器的束縛，一個(gè)水浴鍋即可完成絕大多數(shù)檢測(cè)過(guò)程。此外，LAMP結(jié)果的檢測(cè)可使用濁度儀檢測(cè)沉淀濁度，也可通過(guò)使用染料，在日光下肉眼直接判定。因此，相比于其他基于DNA的檢測(cè)方法，LAMP方法更加簡(jiǎn)便、快捷，是真正普及型的核酸檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)胡蘿卜，設(shè)計(jì)一組特異性引物，進(jìn)而建立一種快速檢測(cè)胡蘿卜DNA的方法，以克服基于蛋白的檢測(cè)方法在某些產(chǎn)品檢測(cè)中的局限性，為胡蘿卜成分檢
測(cè)提供有效工具，確保食品標(biāo)簽的一致性和消費(fèi)者的飲食安全。
[0007]本發(fā)明的主要原理為:設(shè)計(jì)6條特異引物，依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成在恒溫條件下不停地自我循環(huán)。LAMP擴(kuò)增分兩個(gè)階段:第I階段為起始階段:任何一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈。上游內(nèi)部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結(jié)合，在鏈置換型DNA聚合酶的作用下向前延伸啟動(dòng)鏈置換合成。外部引物F3與模板F3c結(jié)合并延伸，置換出完整的FIP連接的互補(bǔ)單鏈。FIP上的Flc與此單鏈上的Fl為互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，自我堿基配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。以此鏈為模板，下游引物BIP與B3先后啟動(dòng)類似于FIP和F3的合成，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)的單鏈。迅速以3’末端的Fl區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板，進(jìn)行DNA合成延伸形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是LAMP基因擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。第2階段是擴(kuò)增循環(huán)階段:以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板，F(xiàn)IP與莖環(huán)的F2c區(qū)結(jié)合，開(kāi)始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會(huì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。迅速以3’末端的BI區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板，進(jìn)行DNA合成延伸及鏈置換，形成長(zhǎng)短不一的2條新莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA。BIP引物上的B2與其雜交，啟動(dòng)新一輪擴(kuò)增，且產(chǎn)物DNA長(zhǎng)度增加一倍。在反應(yīng)體系中添加2條環(huán)狀引物L(fēng)F和LB，它們也分別與莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合啟動(dòng)鏈置換合成，周而復(fù)始。該循環(huán)反應(yīng)可使靶DNA累積到IO9-1Oltl拷貝。擴(kuò)增結(jié)果通過(guò)熒光染料染色肉眼觀察。
[0008]本發(fā)明涉及的胡蘿卜環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)用的引物，其序列如下:(1)上游內(nèi)引物(FIP):5’_ AACCACCGATGTCGCGATGCCTTTTGTGTGCGGTTGGC-3’ ；
(2)下游內(nèi)引物(BIP):5’_ GTCGTTGTGTATACCCGCCGCGGGTCACAATCGAAGTGCA-3’ ；
(3)上游外引物(F3):5’- GAAATTGGCCTCCCGTGC-3’ ；
(4)下游外引物(B3):5’- GCTTAAACTCAGCGGGTAGT-3’ ；
(5)上游環(huán)引物(FLP):5’- CGTCACCAGAGACTCATTTTTGA-3’ ；
(6)下游環(huán)引物(BLP):5’- GGCCCTTGGGCACAGCAAA-3’ ；
在應(yīng)用中，上游內(nèi)引物、下游內(nèi)引物、上游外引物、下游外引物、上游環(huán)引物、下游環(huán)引物體積比為:8:8:1:1:4:4 ；
使用上述引物，檢測(cè)產(chǎn)品中胡蘿卜成分的方法，依次包括下列步驟(1) - (3):
(I)待檢樣品DNA的提取
DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒。
[0009](2)胡蘿卜環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
A.在反應(yīng)管中加入IOXBstbuffer反應(yīng)緩沖液2.5μL (內(nèi)含200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲燒-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1%曲拉通 X-100)、25mmol/L dNTPl.3μL、100mmol/L 硫酸鎂 1.5PL、5mol/L 甜菜堿 4μL、10Mmol/L上游內(nèi)引物2.4gL、10Mmol/L下游內(nèi)引物2.4pL、10Mmol/L上游外引物0.3μL、10Mmol/L下游外引物 0.3PL、10Mmol/L 上游環(huán)引物 1.2PL、10Mmol/L 下游環(huán)引物 1.2μL,8υ/μL Bst DNA聚合酶1PL、ddH20 (滅菌雙蒸水)2.9μL，混勻；
B.在反應(yīng)管中加入待檢樣品DNA4μL (lOOng)，混勻；
C.于恒溫水浴上63°C放置40min；
D.將水浴調(diào)到85°C中止反應(yīng)，5min后取出待檢。
[0010]擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)設(shè)立2個(gè)對(duì)照:陽(yáng)性對(duì)照(取胡蘿卜提取的基因組DNA)、空白對(duì)照(不含DNA模板，可以水代替)。
[0011](3)顯色檢測(cè)
在待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入?μL顯色劑SYBR Green，直接用肉眼觀察顏色變化。在陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照都成立的情況下(即胡蘿卜DNA出現(xiàn)擴(kuò)增，加入顯色劑后，擴(kuò)增反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色；空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增，加入顯色劑后，擴(kuò)增反應(yīng)液顏色為橙色)，如果反應(yīng)管中擴(kuò)增反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，說(shuō)明待檢樣品檢出胡蘿卜成分，如果顏色為橙色，則說(shuō)明待檢樣品中未檢出胡蘿卜成分。
[0012]本發(fā)明根據(jù)胡蘿卜核糖體RNA基因的保守序列，設(shè)計(jì)了 2條特異性內(nèi)引物、2條特異性外引物和2條特異性環(huán)引物。該組引物可保證不同食品和飲料中胡蘿卜成分的檢出。使用該組引物，采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可靈敏、特異地檢出產(chǎn)品中的胡蘿卜成分。該方法不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋，且結(jié)果不必用凝膠電泳方法來(lái)觀察，使用熒光染料肉眼觀察即可，簡(jiǎn)單而快速，特別適用于一些基層單位。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為用胡蘿卜環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法檢測(cè)同屬傘形科植物的孜然、香芹、香菜、大茴香、小茴香，常見(jiàn)蔬菜青椒、黃瓜、菜花、圓白菜、洋蔥以及常見(jiàn)食品花生、牛奶、大豆、小麥、雞蛋、豬肉、牛肉DNA，上述樣品的顯色反應(yīng)，圖中管I為陽(yáng)性對(duì)照(胡蘿卜DNA)顯色結(jié)果。管2為空白對(duì)照(水)的顯色結(jié)果；管3-管19依次為孜然、香芹、香菜、大茴香、小茴香、青椒、黃瓜、菜花、圓白菜、洋蔥、花生、牛奶、大豆、小麥、雞蛋、豬肉、牛肉的顯色結(jié)果。
[0014]圖2為用胡蘿卜環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法檢測(cè)不同含量胡蘿卜成分DNA溶液的顯色反應(yīng)。圖中管I為空白對(duì)照(水)的顯色結(jié)果。管2-管7依次為含10%、1%、0.1%、0.01%、
0.001%,0.0001%胡蘿卜成分DNA溶液的顯色結(jié)果。
[0015] 圖3為用胡蘿卜環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法檢測(cè)米粉樣品DNA，樣品的顯色反應(yīng)。圖中管I為陽(yáng)性對(duì)照(胡蘿卜DNA)的顯色結(jié)果，管2為空白對(duì)照(水)的顯色結(jié)果，管3為米粉樣品的顯色結(jié)果。
[0016]圖4為用胡蘿卜環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法檢測(cè)面條樣品DNA，樣品的顯色反應(yīng)。圖中管I為陽(yáng)性對(duì)照(胡蘿卜DNA)的顯色結(jié)果，管2為空白對(duì)照(水)的顯色結(jié)果，管3為面條樣品的顯色結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0018]實(shí)施例1
按照以下程序進(jìn)行檢測(cè):
(I)非胡蘿卜樣品DNA的提取
A.稱取0.1g樣品，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中。加入600μL預(yù)熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；
B.在管中加入等體積酚/氯仿600μL，上下顛倒充分混勻，抽提2min；
C.12000g離心5min,吸取上清到一新的離心管中,加入與上清等體積的沉淀液,混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀；
D.在沉淀中加入60μLRNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300μL緩沖液，上下顛倒混勻10次；
Ε.取出離心柱，將離心柱放置在I個(gè)2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；
F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加入200μL洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次；
G.在離心柱中加入200μL70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次；
H.12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；
1.將離心柱放置在一個(gè)新的1.5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50μL洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作LAMP反應(yīng)的模板。
[0019](2)非胡蘿卜樣品DNA的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增:
A.在反應(yīng)管中加入IOXBst buffer反應(yīng)緩沖液2.5μL (內(nèi)含200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲燒-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1%曲拉通 X-100)、25mmol/L dNTPl.3μL、100mmol/L 硫酸鎂 1.5PL、5mol/L 甜菜堿 4μL、10Mmol/L上游內(nèi)引物2.4gL、10Mmol/L下游內(nèi)引物2.4pL、10Mmol/L上游外引物0.3μL、10Mmol/L下游外引物 0.3PL、10Mmol/L 上游環(huán)引物 1.2PL、10Mmol/L 下游環(huán)引物 1.2μL,8υ/μL Bst DNA聚合酶1PL、ddH20 (滅菌雙蒸水)2.9μL，混勻；B.在反應(yīng)管中加入待檢樣品DNA4ML，混勾；
C.于恒溫水浴上63°C放置40min；
D.將水浴調(diào)到85°C中止反應(yīng)，5min后取出待檢。
[0020](3)加入顯色劑SYBR Green,顯色檢測(cè)
管3-管19，即孜然、香芳\香菜、大茴香、小茴香、青椒、黃瓜、菜花、圓白菜、洋蔥、花生、牛奶、大豆、小麥、雞蛋、豬肉、牛肉DNA均無(wú)擴(kuò)增，反應(yīng)液顏色為橙色；陽(yáng)性對(duì)照管管1(胡蘿卜基因組DNA作為反應(yīng)模板)反應(yīng)液顏色為綠色、空白對(duì)照管管2 (以水作為反應(yīng)模板)反應(yīng)液顏色為橙色，見(jiàn)圖1。
[0021]該組引物，經(jīng)在線BLAST的結(jié)果證實(shí)，具有很高的特異性，不會(huì)與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)。胡蘿卜為傘形科植物，因此在特異性實(shí)驗(yàn)中特別選擇同屬傘形科的孜然、香芹、香菜、大茴香、小茴香，以及其他常見(jiàn)食品青椒、黃瓜、花生、牛奶、大豆、小麥、雞蛋DNA等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。經(jīng)驗(yàn)證，除胡蘿卜基因組DNA出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色外，其他物種均無(wú)擴(kuò)增，反應(yīng)液顏色為橙色，與預(yù)期相符，表明該組引物有良好的特異性，與上述物種沒(méi)有交叉反應(yīng)。
[0022]實(shí)施例2
按照以下程序進(jìn)行檢測(cè):
(I)不同含量胡蘿卜樣品DNA的提取
A.將胡蘿卜和大豆，加入液氮，研磨成粉末狀后，各稱取0.1 g，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中。加入600μL預(yù)熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；
B.在管中加入等體積酚/氯仿600μL，上下顛倒充分混勻，抽提2min；
C.將胡蘿卜和大豆樣品的DNA抽提緩沖液按比例(10%,1%，0.1%，0.01%, 0.001%,
0.0001%)進(jìn)行混合；
D.加入與上清等體積的沉淀液，混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min，去上清，保留沉淀；
E.在沉淀中加入60μLRNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300μL緩沖液，上下顛倒混勻10次；
F.取出離心柱，將離心柱放置在I個(gè)2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；
G將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加入200μL洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次；
H.在離心柱中加入200μL70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次；
1 .12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；
J.將離心柱放置在一個(gè)新的1.5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50μL洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作LAMP反應(yīng)的模板。
[0023](2)不同含量胡蘿卜樣品DNA的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增:
A.在反應(yīng)管中加入IOXBst buffer反應(yīng)緩沖液2.5μL (內(nèi)含200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲燒-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1%曲拉通 X-100)、25mmol/L dNTPl.3μL、100mmol/L 硫酸鎂 1.5PL、5mol/L 甜菜堿 4μL、10Mmol/L上游內(nèi)引物2.4gL、10Mmol/L下游內(nèi)引物2.4pL、10Mmol/L上游外引物0.3μL、10Mmol/L下游外引物 0.3PL、10Mmol/L 上游環(huán)引物 1.2PL、10Mmol/L 下游環(huán)引物 1.2μL,8υ/μL Bst DNA聚合酶1PL、ddH20 (滅菌雙蒸水)2.9μL，混勻；
B.在反應(yīng)管中加入待檢樣品DNA4ML，混勾；
C.于恒溫水浴上63°C放置40min；
D.將水浴調(diào)到85°C中止反應(yīng)，5min后取出待檢。
[0024](3)加入顯色劑SYBR Green,顯色檢測(cè)
管2-管6，即胡蘿卜含量為10%、1%、0.1%、0.01%,0.001%的DNA樣品均出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色；空白對(duì)照管管I (以水作為反應(yīng)模板)反應(yīng)液顏色為橙色，見(jiàn)圖2。
[0025]胡蘿卜樣品取0.lg，提取得到的核酸濃度為103.2ng/yL。檢測(cè)中使用4yL，據(jù)此可計(jì)算出，當(dāng)DNA抽提緩沖液中的胡蘿卜成分含量為0.001%，胡蘿卜成分DNA總量為4.128pg，即該方法的絕對(duì)檢測(cè)限為4.128pg。
[0026]實(shí)施例3
按照以下程序進(jìn)行檢測(cè):
(I)待測(cè)米粉樣品DNA的提取
A.稱取0.1g米粉，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中。加入600μL預(yù)熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；
B.在管中加入等體積酚/氯仿600μL，上下顛倒充分混勻，抽提2min；
C.12000g離心5min,吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉淀液,混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀；
D.在沉淀中加入60μLRNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300μL緩沖液，上下顛倒混勻10次；
Ε.取出離心柱，將離心柱放置在I個(gè)2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；
F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加入200μL洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次；
G.在離心柱中加入200μL70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次；
H.12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；
1.將離心柱放置在一個(gè)新的1.5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50μL洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作LAMP反應(yīng)的模板。
[0027](2)待測(cè)米粉樣品DNA的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
A.在反應(yīng)管中加入IOXBstbuffer反應(yīng)緩沖液2.5μL (內(nèi)含200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲燒-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1%曲拉通 X-100)、25mmol/L dNTPl.3μL、100mmol/L 硫酸鎂 1.5PL、5mol/L 甜菜堿 4μL、10Mmol/L上游內(nèi)引物2.4gL、10Mmol/L下游內(nèi)引物2.4pL、10Mmol/L上游外引物0.3μL、10Mmol/L下游外引物 0.3PL、10Mmol/L 上游環(huán)引物 1.2PL、10Mmol/L 下游環(huán)引物 1.2μL,8υ/μL Bst DNA聚合酶1PL、ddH20 (滅菌雙蒸水)2.9μL，混勻；
B.在反應(yīng)管中加入待檢樣品DNA4μL (100ng)，混勻；
C.于恒溫水浴上63°C放置40min；
D.將水浴調(diào)到85°C中止反應(yīng)，5min后取出待檢。[0028](3)加入顯色劑SYBR Green,顯色檢測(cè)
樣品管管3反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，見(jiàn)圖3。陽(yáng)性對(duì)照管管I (以胡蘿卜基因組DNA作為反應(yīng)模板)反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色、空白對(duì)照管管2 (以水作為反應(yīng)模板)反應(yīng)液顏色為橙色，結(jié)果均正常，據(jù)此可判定該樣品檢出胡蘿卜成分。
[0029]實(shí)施例4
按照以下程序進(jìn)行檢測(cè):
(I)待測(cè)面條樣品DNA的提取
A.取面條適量，磨碎后，稱取0.1g轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中。加入600μL預(yù)熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ； B.在管中加入等體積酚/氯仿600μL，上下顛倒充分混勻，抽提2min；
C.12000g離心5min,吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉淀液,混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀；
D.在沉淀中加入60μLRNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300μL緩沖液，上下顛倒混勻10次；
Ε.取出離心柱，將離心柱放置在I個(gè)2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；
F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加入200μL洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次；
G.在離心柱中加入200μL70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次；
H.12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；
1.將離心柱放置在一個(gè)新的1.5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50μL洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作LAMP反應(yīng)的模板。
[0030](2)待測(cè)面條樣品DNA的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
A.在反應(yīng)管中加入IOXBstbuffer反應(yīng)緩沖液2.5μL (內(nèi)含200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲燒-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1%曲拉通 X-100)、25mmol/L dNTPl.3μL、100mmol/L 硫酸鎂 1.5PL、5mol/L 甜菜堿 4μL、10Mmol/L上游內(nèi)引物2.4gL、10Mmol/L下游內(nèi)引物2.4pL、10Mmol/L上游外引物0.3μL、10Mmol/L下游外引物 0.3PL、10Mmol/L 上游環(huán)引物 1.2PL、10Mmol/L 下游環(huán)引物 1.2μL,8υ/μL Bst DNA聚合酶1PL、ddH20 (滅菌雙蒸水)2.9μL，混勻；
B.在反應(yīng)管中加入待檢樣品DNA4μL (100ng)，混勻；
C.于恒溫水浴上63°C放置40min；
D.將水浴調(diào)到85°C中止反應(yīng)，5min后取出待檢。
[0031](3)加入顯色劑SYBR Green,顯色檢測(cè)
樣品管管3反應(yīng)液顏色為橙色，見(jiàn)圖4。陽(yáng)性對(duì)照管管I (以胡蘿卜基因組DNA作為反應(yīng)模板)反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色、空白對(duì)照管管2 (以水作為反應(yīng)模板)反應(yīng)液顏色為橙色，結(jié)果均正常，據(jù)此可判定該樣品未檢出胡蘿卜成分。
【權(quán)利要求】
1.一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)胡蘿卜成分用的引物組，包括內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物，其特征在于: 上游內(nèi)引物序列為:5’- AACCACCGATGTCGCGATGCCTTTTGTGTGCGGTTGGC -3’， 下游內(nèi)引物序列為:5’_ GTCGTTGTGTATACCCGCCGCGGGTCACAATCGAAGTGCA -3’， 上游外引物序列為:5’_ GAAATTGGCCTCCCGTGC -3’， 下游外引物序列 為:5’_ GCTTAAACTCAGCGGGTAGT -3’， 上游環(huán)引物序列為:5’_ CGTCACCAGAGACTCATTTTTGA -3’， 下游環(huán)引物序列為:5’_ GGCCCTTGGGCACAGCAAA -3’。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103937900SQ201410183954
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月26日
【發(fā)明者】孫敏, 肖西志, 鄧明俊, 高宏偉 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心