專利名稱：一種姜烯酚提取物的制備方法及其醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，具體涉及一種6-姜烯酚提取物的制備方法及其醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
姜來源于姜科姜屬植物姜(Zingiber officinale Rose.)的新鮮或干燥根莖。 姜屬于藥食同源類中藥，其臨床應(yīng)用相當(dāng)廣泛，國外對(duì)其關(guān)注程度亦較高。近年來，針對(duì)姜及其主要活性化學(xué)成分的化學(xué)和藥理報(bào)道較為豐富。研究表明，姜酚類在姜中的含量很高，而姜烯酚類化合物為姜酚類的脫水產(chǎn)物，其含量較低。但是，在抗炎、抗氧化以及抗腫瘤等方面，姜烯酚類的活性作用均顯著優(yōu)于姜酚類化合物[Comparative antioxidant and anti-inflammatory effects of [6]-gingerol, [8]-gingerol, [10]-gingerol and[6]-shogaol. J Ethnopharmaco1. 2009 Oct 13 ；6-Shogaol, an active constituent of dietary ginger，induces autophagy by inhibiting the AKT/mTORpathway in human non-small cell lung cancer A549 cells. J Agric Food Chem. 2009 Oct 28]。正因?yàn)榻┓宇惢衔镌诮械暮亢艿?，從姜中大?guī)模制備姜烯酚類化合物一直難以實(shí)現(xiàn)。這不僅制約了姜烯酚類化合物的活性研究，更給以姜烯酚類化合物為基礎(chǔ)開展的姜類中藥的藥理和活性研究帶來挑戰(zhàn)。因此，姜烯酚類藥物的制備對(duì)推進(jìn)該類成分及姜類中藥的藥理活性研究具有重要的意義。發(fā)明人在前期研究中發(fā)明了一種從姜超臨界萃取物中分離6-姜烯酚的方法，公開于CN101735030A中，先將姜的超臨界萃取物于含乙醇的酸水中加熱轉(zhuǎn)化，再經(jīng)硅膠柱色譜分離、制備HPLC精制。它在第一步硅膠分離時(shí)，通過洗脫劑石油醚、乙酸乙酯在體積比 25 50 1范圍內(nèi)，用三個(gè)不同梯度洗脫(例如45 1,33 1和25 1)，得到純度約為80 %的6-姜烯酚，收率僅為10 20 %，因此必須經(jīng)后續(xù)精制，包括用乙酸乙酯溶解6-姜烯酚粗品，過中壓柱、用石油醚和乙酸乙酯洗脫，才得純度約為90%的6-姜烯酚，此步驟收率約為35%。此方法步驟繁瑣，得率很低，并且增加了成本。以姜超臨界流體萃取物或干姜提取物為基礎(chǔ)，應(yīng)用轉(zhuǎn)化前處理、色譜分離手段有序聯(lián)用，研究一種大幅度提高姜烯酚類產(chǎn)量，快速、簡單的制備姜烯酚類組合物的方法，并利用所得組合物研究其抗腫瘤活性，是本技術(shù)領(lǐng)域面臨的主要問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)提取方法做了進(jìn)一步的優(yōu)化，優(yōu)化后的方法革除了精制步驟，只需提取、萃取、經(jīng)硅膠柱色譜分離即可得到含量大于90%的6-姜烯酚。本發(fā)明的提取方法包括姜超臨界流體萃取物或干姜提取物經(jīng)含乙醇的酸水加熱回流提取，回收乙醇，酸水液用乙酸乙酯萃取，減壓回收乙酸乙酯得到萃取后濃縮物，濃縮物過硅膠色譜柱、用石油醚和乙酸乙酯梯度洗脫，收集洗脫液濃縮，即得，其中洗脫用的石油醚和乙酸乙酯分六個(gè)梯度洗脫，體積比依次為50 1、33 1、25 1,20 1、17 1、14 1，收集14 1的流分，濃縮即得。洗脫時(shí)每個(gè)梯度洗脫優(yōu)選3 6個(gè)柱體積。加熱回流所用的含乙醇的酸水，其中乙醇的濃度優(yōu)選40% 80% v/v，鹽酸的濃度優(yōu)選0. 2 0. 8M。加熱回流的溫度優(yōu)選70 100°C，回流時(shí)間優(yōu)選2 4小時(shí)。其中姜超臨界萃取物或干姜提取物與含乙醇的酸水的重量體積比優(yōu)選不低于 3 80mg/ml。更優(yōu)選 1 40 3 80mg/ml。所述干姜提取物優(yōu)選干姜的乙醇提取物。更優(yōu)選用80% 90% ν/ν乙醇提取。通過外標(biāo)定量法計(jì)算，原萃取物中6-姜烯酚的含量約為2. 5%，當(dāng)進(jìn)行酸水反應(yīng)處理后提取物中的6-姜烯酚的含量可達(dá)20% (外標(biāo)法定量)，見

圖1。推測可能原料中部分6-姜酚轉(zhuǎn)換成了 6-姜烯酚。研究發(fā)現(xiàn)，在洗脫劑石油醚和乙酸乙酯優(yōu)化體積比14 1 50 1范圍內(nèi)，利用體積比依次為50 1、33 1、25 1、20 1、17 1、14 1的六個(gè)梯度依次洗脫，不同極性梯度所得6-姜烯酚含量不同，例如在17 1段時(shí)，所得組合物中小極性雜質(zhì)較多， 所得6-姜烯酚純度僅為50% w/w，而在洗脫至14 1時(shí)，測得6-姜烯酚純度較高，約為 90% w/w，后再加極性至10 1時(shí)，所得組合物大極性雜質(zhì)較多，并且含量很低，純度僅為 40% w/w。發(fā)明人前期發(fā)明的一種從姜超臨界萃取物中分離6-姜烯酚的方法，在洗脫劑石油醚和乙酸乙酯體積比25 50 1范圍內(nèi)，利用三個(gè)梯度洗脫(例如45 1,33 1和 25 1)，雖然也能將6-姜烯酚洗脫出來，但是洗脫劑各梯度所洗脫的柱體積數(shù)很多(約16 個(gè)柱體積)，并且由于極性增加緩慢，6-姜烯酚在柱內(nèi)被吸附摻雜嚴(yán)重，使得純度、收率都有很大的損失。因此，本發(fā)明優(yōu)選用石油醚和乙酸乙酯分六個(gè)梯度洗脫，體積比依次為50 1、 33 1、25 1,20 1、17 1、14 1，最后收集 14 1 的流分。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)洗脫劑石油醚和乙酸乙酯在各個(gè)梯度時(shí)所洗脫的柱體積過多時(shí) (超過6個(gè)柱體積)，會(huì)使6-姜烯酚流出時(shí)間變長，并且純度降低，所得組合物含6-姜烯酚僅為70% w/w，而且由于洗脫時(shí)間變長，6-姜烯酚于硅膠柱上吸附增加，收率降低(約 45%)；各梯度所洗脫的柱體積過少時(shí)(低于3個(gè)柱體積)，會(huì)使6-姜烯酚與許多小極性雜質(zhì)共流出，也影響其純度，所得組合物含6-姜烯酚僅為60% w/w。六個(gè)極性梯度段所洗脫的柱體積優(yōu)選為3 6。并洗脫至14 1段時(shí)，TLC檢測， 收集14 1含6-姜烯酚段，通過外標(biāo)定量法計(jì)算，得本發(fā)明的提取物中含6-姜烯酚90 93%,8-姜烯酚3 5%，見圖2。本發(fā)明的制備方法易于操作、成品質(zhì)量好且產(chǎn)量高，只需轉(zhuǎn)化后硅膠柱層析分離一遍即得姜烯酚類組合物，并且收率很高，可達(dá)60 65%，為工業(yè)化生產(chǎn)帶來極大便利。體外抗腫瘤藥效學(xué)研究表明，本發(fā)明的姜烯酚類組合物對(duì)宮頸癌有顯著的療效。發(fā)明人以6-姜烯酚的含量作為指標(biāo)，對(duì)比了 6-姜烯酚單體以及含等量6-姜烯酚的本發(fā)明提取物在宮頸癌中的治療活性。研究發(fā)現(xiàn)，在給定劑量范圍內(nèi)本發(fā)明提取物的活性要優(yōu)于6-姜烯酚。說明轉(zhuǎn)化分離后8-姜烯酚并不影響6-姜烯酚的活性，反而使得轉(zhuǎn)化分離后本發(fā)明提取物的活性得到提高，試驗(yàn)方法和結(jié)果如下姜烯酚類組合物的體外抗腫瘤作用
取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞的大小接種3 5 X IO3個(gè)于96孔板上，待生長M 小時(shí)后，棄上清，然后按以下分組給藥腫瘤細(xì)胞設(shè)不加藥組和加藥組(濃度1 25 μ M，以 6-姜烯酚為指標(biāo))，每組設(shè)5或6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24小時(shí)，棄上清，加入100 μ 1含0. 5mg/ml 的MTT (四氮唑鹽)無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)4小時(shí)，加入100 μ 1DMS0 (二甲亞砜)，放置于微型振蕩儀上振蕩lOmin，再至于酶標(biāo)儀上570nm處檢測OD值。加藥組樣品的用量以6-姜烯酚為指標(biāo)，轉(zhuǎn)化后本發(fā)明提取物(90% 6-姜烯酚，5% 8-姜烯酚)配置成含等量的6-姜烯酚。結(jié)果見表1表16-姜烯酚和本發(fā)明提取物的體外抗腫瘤IC50值
權(quán)利要求
1.一種6-姜烯酚提取物的制備方法，包括姜超臨界流體萃取物或干姜提取物經(jīng)含乙醇的酸水加熱回流提取，回收乙醇，酸水液用乙酸乙酯萃取，減壓回收乙酸乙酯得到萃取后濃縮物，濃縮物過硅膠色譜柱，用石油醚和乙酸乙酯梯度洗脫，收集洗脫液濃縮，即得，其特征是石油醚和乙酸乙酯分六個(gè)梯度洗脫，體積比依次為50 1、33 1、25 1,20 1、 17 1、14 1，收集14 1的流分，濃縮即得。
2.權(quán)利要求1的制備方法，其中每個(gè)梯度洗脫3 6個(gè)柱體積。
3.權(quán)利要求1的制備方法，其中含乙醇的酸水中乙醇的濃度為40% 80%v/v，鹽酸的濃度為0. 2 0. 8M。
4.權(quán)利要求1的制備方法，其中加熱回流的溫度為70 100°C，回流時(shí)間為2 4小時(shí)。
5.權(quán)利要求1的制備方法，其中姜超臨界萃取物或干姜提取物與含乙醇的酸水的重量體積比為1 40 3 80mg/ml。
6.權(quán)利要求1的制備方法，其中干姜提取物用以下方法制得干姜用80% 90%ν/ν 乙醇提取濃縮即得。
全文摘要
本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，具體涉及一種6-姜烯酚提取物的制備方法及其醫(yī)藥用途。姜超臨界流體萃取物或干姜提取物經(jīng)含乙醇的酸水加熱回流提取，回收乙醇，酸水液用乙酸乙酯萃取，減壓回收乙酸乙酯得到萃取后濃縮物，濃縮物過硅膠色譜柱、用石油醚和乙酸乙酯梯度洗脫，收集洗脫液濃縮，即得，其中洗脫用的石油醚和乙酸乙酯分六個(gè)梯度洗脫，體積比依次為50∶1、33∶1、25∶1、20∶1、17∶1、14∶1，收集14∶1的流分，濃縮即得。本發(fā)明的制備方法易于操作、成品質(zhì)量好且產(chǎn)量高，只需轉(zhuǎn)化后硅膠柱層析分離一遍即得姜烯酚類組合物，并且收率很高，可達(dá)60～65％，為工業(yè)化生產(chǎn)帶來極大便利。
文檔編號(hào)C07C45/79GK102260152SQ201110148248
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月2日
發(fā)明者李萍, 馬江, 齊煉文 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)