專利名稱：酪氯酸蛋白激酶受體EphA2優(yōu)勢表位復合物及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種抗原表位復合物，特別涉及一種酪氯酸蛋白激酶受體EphA2的優(yōu)勢表位復合物，還涉及該優(yōu)勢表位復合物的制備方法和應用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤的治療已取得很多進展，但微小殘留病灶仍難以被現(xiàn)行的放療、化療、手術(shù)等方案徹底清除。應用腫瘤免疫治療激發(fā)機體免疫監(jiān)視系統(tǒng)，消滅殘存腫瘤細胞，有可能徹底治愈腫瘤。因此，腫瘤疫苗的開發(fā)成為現(xiàn)今研究熱點之一。針對腫瘤抗原在機體內(nèi)免疫原性下降，造成特異性細胞免疫激活不足、外周免疫耐受的狀況，腫瘤疫苗設計的總體思路是應用各種技術(shù)增強免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的識別能力，改善免疫微環(huán)境，引發(fā)有力的特異性抗腫瘤細胞免疫，從而阻止腫瘤進展，并最終消除腫瘤。CD8+T細胞是機體免疫系統(tǒng)的主要組成部分，在針對病毒、細菌和真菌等病原性微生物以及惡性腫瘤等的免疫監(jiān)視、免疫防御以及免疫治療過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。細胞毒性T細胞(CTL)是通過其T細胞受體(TCR)特異識別抗原遞呈細胞(APC)表面的MHC-I類分子-抗原肽復合物而得以活化，并最終殺死靶細胞。與MHC-I類分子結(jié)合的抗原肽(長 8^10個氨基酸)被定義為CTL表位。大多數(shù)MHC-I類分子僅結(jié)合內(nèi)源性抗原肽，外源性抗原肽絕大多數(shù)是被APC內(nèi)吞后進入MHC-II類抗原遞呈途徑以激活輔助性T細胞(Th細胞)， 僅有少數(shù)外源性抗原肽可被MHC-I類分子遞呈，即交叉遞呈。因此，如何將外源性抗原肽有效地投入MHC-I類抗原提呈途徑是激發(fā)特異性CTL應答的關(guān)鍵。生促紅素月干細胞(erythropoietin producing hepatocellular, Eph)是受體酷氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTKs)超家族中的一個亞族，EphA2是Eph受體酪氨酸激酶之一，在人類上皮來源的多種組織或細胞中廣泛表達，對調(diào)節(jié)細胞生長、遷移及血管形成有潛在的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EphA2在許多腫瘤組織中呈過度表達，尤其在高侵襲性的腫瘤細胞中表達更高，包括結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等，可能是惡性腫瘤治療的一個新靶點。HIV-I的反式激活蛋白Tat能主動穿過細胞膜進入細胞內(nèi)部，與Tat共價結(jié)合的異源蛋白也可被其轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)，而細胞的正常結(jié)構(gòu)和功能不受影響。研究發(fā)現(xiàn)，由Tat第 49-57 位氨基酸殘基組成的序列(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg, RKKRRQRRR)即可完全行使蛋白轉(zhuǎn)導的功能，這是Tat既有穿膜特性又無細胞毒性的最小片段。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是MHC-I類分子遞呈抗原肽的最重要場所，若將外源性抗原肽靶向轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，有望增強外源性抗原肽被MHC-I類分子提呈的效率。賴氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(Lys-Asp-Glu-Leu，KDEL)基序是一種經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列。研究發(fā)現(xiàn)， 位于肽羧基末端的KDEL基序能夠有效促進與之偶聯(lián)的外源性抗原肽進入MHC-I類抗原遞呈途徑，且該抗原遞呈過程表現(xiàn)為抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運體/蛋白酶體非依賴。
LIGHT (homologous to lymphotoxins, inducible, competes with HSV glycoprotein D for HVEM, expressed by Tlymphocyte)是一個新發(fā)現(xiàn)的月中瘤壞死因子 (TNF)超家族成員，為一種II型跨膜糖蛋白，多以三聚體的形式誘導表達于活化的T細胞和選擇性表達于未成熟的樹突狀細胞(DC)上，是一個多功能多效應分子，兼具共刺激和細胞毒兩方面的活性。研究發(fā)現(xiàn)，LIGHT在淋巴器官的發(fā)生、腫瘤免疫、自身免疫病、移植排斥反應和抗病毒免疫中均發(fā)揮重要作用。但迄今為止，尚未見由EphA2表位、穿膜序列HIV-Tat49_57、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列 KDEL和LIGHT組成的復合物的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種酪氯酸蛋白激酶受體EphA2優(yōu)勢表位復合物，目的之二在于提供所述酪氯酸蛋白激酶受體EphA2優(yōu)勢表位復合物的制備方法， 目的之三在于提供所述酪氯酸蛋白激酶受體EphA2優(yōu)勢表位復合物在制藥領(lǐng)域的應用。為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
1.酪氯酸蛋白激酶受體EphA2優(yōu)勢表位復合物，由EphA2 58-66表位融合肽、EphA2 550-558表位融合肽、EphA2 253-261表位融合肽與LIGHT基因重組真核表達載體組成；所述EphA2 58-66表位融合肽、EphA2 550-558表位融合肽和EphA2 253-261表位融合肽的摩爾比為1:1:1;
所述EphA2 58-66表位融合肽由EphA2 58-66表位、穿膜序列HIV_Tat49_57、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列KDEL和接頭序列AAY組成；穿膜序列位于融合肽的氨基端，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列位于融合肽的羧基端，EphA2 58-66表位位于穿膜序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列之間并分別通過接頭序列與穿膜序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列連接；
所述EphA2 550-558表位融合肽由EphA2 550-558表位、穿膜序列HIV_Tat49_57、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列KDEL和接頭序列AAY組成；穿膜序列位于融合肽的氨基端，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列位于融合肽的羧基端，EphA2 550-558位于穿膜序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列之間并分別通過接頭序列AAY與穿膜序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列連接；
所述EphA2 253-261表位融合肽由EphA2 253-261表位、穿膜序列HIV_Tat49_57、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列KDEL和接頭序列AAY組成；穿膜序列位于融合肽的氨基端，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列位于融合肽的羧基端，EphA2 253-261表位位于穿膜序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列之間并分別通過接頭序列與穿膜序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列連接。進一步，所述LIGHT基因重組真核表達載體是在真核表達載體PCI-neo中插入 LIGHT cDNA全長序列而得到。2.所述酪氯酸蛋白激酶受體EphA2優(yōu)勢表位復合物的制備方法，包括以下步驟在攪拌條件下，向溶解有LIGHT基因重組表達載體的磷酸鹽緩沖液中滴加摩爾比為 1:1: 1的EphA2 58-66表位融合肽、EphA2 550-558表位融合肽和EphA2 253-261表位融合肽的混合水溶液，滴加完畢后繼續(xù)攪拌30分鐘，再靜置30分鐘，即得酪氯酸蛋白激酶受體2優(yōu)勢表位復合物。3.所述酪氯酸蛋白激酶受體EphA2優(yōu)勢表位復合物在制備腫瘤治療性疫苗中的應用。
進一步，所述腫瘤治療性疫苗為肺癌治療性疫苗。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明利用分子軟件在線預測了酪氯酸蛋白激酶受體EphA2的優(yōu)勢表位，選取得分排名前三位的優(yōu)勢表位EphA2 58-66、EphA2 550-558和 EphA2 253461，融合穿膜序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列，分別構(gòu)建了三種優(yōu)勢表位融合肽， 再進一步聯(lián)合LIGHT基因重組真核表達載體構(gòu)建了 EphA2優(yōu)勢表位復合物。三種優(yōu)勢表位聯(lián)合，能夠有效彌補單一表位免疫效果的不足，從而能夠更有效的誘發(fā)免疫應答，得到理想的免疫效果；三種優(yōu)勢表位融合肽可以在穿膜序列的導向作用下進入細胞內(nèi)，再在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列的作用下靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，最終高效進入MHC-I類抗原遞呈途徑，激發(fā)表位特異性CTL應答；同時，LIGHT基因重組真核表達載體在細胞內(nèi)表達LIGHT分子，LIGHT分子可以發(fā)揮分子佐劑作用，有效調(diào)節(jié)CTL的功能，促進表位特異性CTL的免疫應答。實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明的EphA2優(yōu)勢表位復合物在體外能夠有效激發(fā)CTL分泌干擾素-Y并產(chǎn)生細胞毒效應，殺傷腫瘤細胞；在體內(nèi)能夠抑制腫瘤生長，延長荷瘤動物的平均生存期并提高平均生存率，可用于制備腫瘤治療性疫苗例如肺癌治療性疫苗。本發(fā)明的EphA2優(yōu)勢表位復合物的制備方法簡單，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域有著良好的開發(fā)應用前景。


圖1為LIGHT基因的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。圖2為EphA2優(yōu)勢表位復合物的透射電鏡圖。圖3為酶聯(lián)免疫斑點(ELISP0T)法檢測EphA2優(yōu)勢表位復合物激發(fā)T細胞分泌干擾素-Y (IFN-Y)的能力。圖4為51Cr釋放法檢測EphA2優(yōu)勢表位復合物激發(fā)T細胞對肺癌細胞Lewis的特異性殺傷效應。圖5為給予或未給予EphA2優(yōu)勢表位復合物的荷瘤小鼠的腫瘤生長曲線。圖6為給予或未給予EphA2優(yōu)勢表位復合物的荷瘤小鼠的平均生存率。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件， 例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、EphA2優(yōu)勢表位復合物的制備 l、EphA2優(yōu)勢表位的預測
超基序是指在同一 HLA家族，甚至是不同家族的HLA同種異型分子接納的抗原肽具有相同和相似的錨著殘基構(gòu)成的肽基序。超基序主要的錨定殘基是肽鏈第2位(P》和第9 位(Pi^)的氨基酸殘基，當P2、P9位氨基酸殘基為合適的氨基酸殘基時，肽與HLA-A*0201 有高親和力。利用 SYFPEITHI 在線軟件(http://www. syfpeithi. de/scripts/MHCServer. dll/home. htm)對腫瘤抗原EphA2的Kd限制性CTL表位進行預測。結(jié)果獲得分值大于25 的 3 個 EphA2 優(yōu)勢表位，分別是 EphA2 58-66 (IMNDMPIYM)、EphA2 550-558 (VLAGVGFFI) 和 EphA2 253-261 (WLVPIGQCL)。
2、EphA2優(yōu)勢表位融合肽的合成
選擇預測出的 3 個 EphA2 優(yōu)勢表位EphA2 58-66、EphA2 550-558 和 EphA2 253-261， 分別設計了三條表位融合肽EphA2 58-66表位融合肽、EphA2 550-558表位融合肽和EphA2 253-261表位融合肽。每條表位融合肽由相應的EphA2優(yōu)勢表位、穿膜序列 HIV-I^tAg-STaKKRRQRRR)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列KDEL和接頭序列AAY組成，穿膜序列位于肽的氨基端，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列位于肽的羧基端，EphA2優(yōu)勢表位位于穿膜序列與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列之間并通過接頭序列與二者連接，以便于EphA2優(yōu)勢表位保持獨立性和能夠有效遞呈。即，EphA2 58-66表位融合肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，EphA2 550-558 表位融合肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2K*，EphA2 253-261表位融合肽的氨基酸序列如 SEQ ID No. 3所示。同時，設計氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示的卵清蛋白(OVA) 257-264 表位融合肽作為對照肽。表位融合肽的合成在ABI 431A型固相多肽合成儀上進行。采用標準芴甲氧羰基 (Fmoc)方案，精氨酸采用兩次偶聯(lián)。起始選用0. 125mmol對羥甲基苯氧甲基聚苯乙烯樹脂 (HMP樹脂)，按照多肽的氨基酸序列使肽鏈從羧基端逐個向氨基端延伸，每種氨基酸的用量為0.5mmol，與樹脂的摩爾比為4:1。各種氨基酸的α -氨基為Fmoc保護，其余側(cè)鏈保護基團分別為:Lys (Boc)、Ser (tBu)、Glu (OtBu)、Arg (Pmc)、His (Trt)、Thr (tBu)和 Tyr (tBu)。 第一個氨基酸連接到樹脂上用4-二甲氨基吡啶(DMAP)，氨基酸的活化用1-羥基苯并三唑 (HOBt)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，偶聯(lián)后用體積分數(shù)為20%的哌啶水溶液去除Fmoc保護基。多肽合成后，將樹脂-粗肽產(chǎn)品在冰浴條件下混合于IOmL切割液A(由結(jié)晶苯酚0. 75g、 1，2-乙二硫醇即EDT 0. 25mL、苯甲硫醚0. 5mL、去離子水0. 25mL和三氟乙酸即TFA IOmL組成)中，待切割液溫度上升至室溫后，攪拌反應2小時，使肽鏈從樹脂上裂解下來，同時去除多種保護基團。將反應混合液經(jīng)G4玻砂漏斗過濾以去除樹脂，先后用ImL TFA、5 10mL 二氯甲烷反復沖洗反應瓶、樹脂和漏斗。將濾液在常溫低壓下蒸發(fā)至廣2mL，加入50mL預冷乙醚沉淀多肽，4°C放置過夜，G6玻砂漏斗過濾，真空抽干，即得多肽粗品，-20°C保存?zhèn)溆?。將多肽粗品用二甲基亞?DMSO)溶解制成濃度為20mg/mL的溶液，經(jīng)孔徑為 0. 45 μ m的微孔濾膜過濾后，在AKTA explorer 100型中壓液相色譜儀(瑞典Amerssham Bioscienc公司)上用SOURCE凝膠柱進行純化。流動相A由體積分數(shù)為10%的乙醇和體積分數(shù)為0. 1%的TFA組成，流動相B由體積分數(shù)為90%的乙醇和體積分數(shù)為0. 1%的TFA組成；洗脫梯度為先用流動相A洗脫1. 5個柱體積，再用流動相A和流動相B的混合液洗脫 8個柱體積(流動相B占混合液的體積分數(shù)在8個柱體積內(nèi)由0%逐漸增加至80%)，再用流動相A和流動相B的混合液洗脫0. 5個柱體積(流動相B占混合液的體積分數(shù)在0. 5個柱體積內(nèi)由80%逐漸增加至100%)，在主峰處收集多肽溶液，冷凍干燥，即得多肽純品，用DMSO 溶解，-20°C保存?zhèn)溆?。將多肽純品用Delta 600型高壓液相色譜儀鑒定純度，采用Symmetry Shield C18柱，流動相由體積分數(shù)為10%飛0%的乙腈和體積分數(shù)為0. 1%的TFA組成，流速為ImL/ min。結(jié)果顯示，合成多肽的純度均達到90%以上。同時，將多肽純品用API 2000 LC/MS型電噴霧離子化質(zhì)譜儀測定分子量。結(jié)果顯示，合成多肽的分子量分別與EphA2 58-66表位融合肽、EphA2 550-558表位融合肽、EphA2 253-261表位融合肽和OVA 257-264表位融合肽的理論分子量相符。
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3、LIGHT基因重組真核表達載體的構(gòu)建
收集人外周血單個核細胞(PBMC)，用重組白介素4 (rIL-4)和重組粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rGM-CSF)誘導分化成未成熟DC，用RNA抽提試劑盒抽提未成熟DC總RNA， 紫外分光光度法測定濃度和純度后，-70°C保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank登錄號為NM_003807的LIGHT基因的完整開放閱讀框0RF，設計如下 PCR 引物上游引物5，-cttgggcatggaggagagtgtcgta-3，(SEQ ID No.6)，下游引物 5，-tcacaccat- gaaagccccgaagtaag-3，(SEQ ID No. 7)，委托寶生物工程(大連)有限公司合成。將未成熟DC總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以該cDNA為模板，采用前述上下游引物PCR 擴增LIGHT cDNA全長，PCR體系總體積為IOOyI^PCR循環(huán)條件參數(shù)為94°C預變性2分鐘； 再94°C變性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸1分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。 將PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定(結(jié)果如圖1所示，M泳道為DNA分子量標準，1泳道為PCR產(chǎn)物，可見PCR產(chǎn)物在分子量約720bp處有唯一條帶，與預期分子量相符)后，切膠回收純化，再與T載體pGEM-T Easy在T4 DNA連接酶作用下于16°C連接過夜， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，挑取陽性克隆單菌落，用含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶 EcoR I和I^st I進行雙酶切鑒定，并委托上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行測序驗證，正確插入了 LIGHT cDNA全長序列(SEQ ID No. 5)的陽性克隆質(zhì)粒命名為LIGHT-pGEM_T Easy。用EcoR I從LIGHT-pGEM-T Easy中酶切出LIGHT cDNA全長，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切膠回收純化，紫外分光光度法測定濃度；同時，用EcoR I酶切真核表達載體PCI-neo使線性化，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切膠回收純化， 紫外分光光度法測定濃度；再將LIGHT cDNA全長與線性化的真核表達載體pCI-neo在T4 DNA連接酶作用下于16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，挑取陽性克隆單菌落，用含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用EcoR I和Kpn I進行雙酶切鑒定，所得陽性克隆質(zhì)粒即LIGHT基因重組真核表達載體命名為LIGHT-pCI-neo。4、EphA2優(yōu)勢表位復合物的制備
將LIGHT基因重組真核表達載體LIGHT-pCI-neo用濃度為0. lmol/L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解制成濃度為500μ g/mL的溶液，取該溶液100 μ L，在混旋狀態(tài)下以 5 μ L/min的速度向其中滴入總濃度為1000 μ g/mL的多肽混合溶液(由摩爾比為1 :1:1 的EphA2 58-66表位融合肽、EphA2 550-558表位融合肽和EphA2 253-261表位融合肽組成)100 μ L，滴加完畢后繼續(xù)混旋30分鐘，再靜置30分鐘，即得EphA2優(yōu)勢表位復合物。將新鮮制備的EphA2優(yōu)勢表位復合物滴于200目銅網(wǎng)上，吸附3分鐘，用吸水紙吸干，晾干30秒，以質(zhì)量分數(shù)為1%的醋酸鈾水溶液負染30秒，用吸水紙吸干，晾干30秒，SOkV 透射電鏡觀察。結(jié)果如圖2所示，所得EphA2優(yōu)勢表位復合物呈大小均一的近圓形顆粒，絕大多數(shù)顆粒長徑小于25nm。按照上述同樣方法，以OVA 257-264表位融合肽替代EphA2 58_66表位融合肽、 EphA2 550-558表位融合肽和EphA2 253-261表位融合肽，制得OVA表位復合物。
二、EphA2優(yōu)勢表位復合物促進抗原特異性T細胞免疫應答的檢測
將30只6、周齡雌性C57BL/6小鼠隨機分為3組實驗組、對照組和空白組，每組10 只；將EphA2優(yōu)勢表位復合物和OVA表位復合物分別用濃度為0. lmol/L、pH為7. 4的PBS 溶解制成濃度為lmg/mL的溶液；實驗組以濃度為lmg/mL的EphA2優(yōu)勢表位復合物溶液為免疫原，對照組以濃度為lmg/mL的OVA表位復合物溶液為免疫原，空白組以濃度為0. Imol/ L、pH為7. 4的PBS為免疫原；各組于小鼠背側(cè)尾根部皮下注射免疫原，每只100 μ L，之后每間隔1周，用同樣方法加強免疫1次，共免疫3次；末次免疫后1周，斷頸處死各組小鼠，在無菌條件下取脾臟，用100目篩網(wǎng)碾磨，收集細胞懸液，用聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心法分離脾淋巴細胞，用含有質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞密度為lX106/mL，作為效應細胞。1、ELISP0T法檢測EphA2優(yōu)勢表位復合物激發(fā)T細胞分泌IFN- γ的能力
采用ELISP0T檢測試劑盒進行檢測，具體操作參照試劑盒說明書每孔加入體積分數(shù)為70%的乙醇100 μ L，室溫放置10分鐘，PBS洗滌，再加入IFN-γ捕獲抗體(稀釋度為1 100) 100 μ L，溫度4°C孵育過夜，PBS洗滌，再加入質(zhì)量分數(shù)為洲的脫脂奶粉溶液 100 μ L，室溫封閉2小時，PBS洗滌，再加入效應細胞100 μ L，溫度37°C孵育48小時，PBST (即含有質(zhì)量分數(shù)為0. 1%的吐溫20的PBS)洗滌，再加入生物素標記的抗IFN-Y抗體(稀釋度為1 100) 100 μ L，溫度37°C孵育1. 5小時，PBST洗滌，再加入鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶(稀釋度為1 5000)100 μ L，溫度37°C孵育1小時，PBST洗滌，拍干培養(yǎng)板，再加入即用型BCIP/NBT底物反應液100 μ L，室溫避光顯色2 10分鐘至斑點形成，用蒸餾水終止反應，干燥后檢測斑點數(shù)，各組斑點數(shù)以3個復孔的均值表示。結(jié)果見圖3，實驗組的斑點數(shù)(247個/IO5細胞)明顯高于其它2組(對照組為39 個/IO5細胞，空白組為11個/IO5細胞)，表明本發(fā)明的EphA2優(yōu)勢表位復合物具有良好的免疫原性，能夠有效激發(fā)T細胞分泌IFN- γ。2,51Cr釋放法檢測EphA2優(yōu)勢表位復合物激發(fā)T細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷效應
將肺癌細胞Lewis用含有質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)， 收集細胞，離心洗滌2次后，用含有質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞密度為IX 106/mL，取ImL細胞懸液置IOmL血清瓶中，加入100 μ Ci Na51 CrO4，溫度37°C孵育90分鐘，充分洗滌細胞除去未結(jié)合的51Cr,再用含有質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為lX105/mL，作為靶細胞。在96孔U型板中，分別按效靶比(E/ T)為100 1,50 1和25 1加入效應細胞和靶細胞，每種效靶比設3個復孔，同時設最大釋放組(用濃度為2mol/L的鹽酸替代效應細胞)和最小釋放組(用含有質(zhì)量分數(shù)為10% 的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基替代效應細胞);將96孔板500r/min離心30秒，溫度37°C 孵育4小時，再lOOOr/min離心10分鐘，各孔取上清lOOyL，用、計數(shù)器測定每分鐘放射活性(cpm值)并計算殺傷率殺傷率(%)=[(實驗組cpm均值-最小釋放組cpm均值)/ (最大釋放組cpm均值-最小釋放組cpm均值)]X 100%,殺傷率大于15%判為特異性殺傷。結(jié)果見圖4，實驗組在各效靶比對Lewis細胞均有特異性殺傷作用，且隨著效靶比增大，特異性殺傷作用逐漸增強，當E/T為100 1時，殺傷率為52.7%，而對照組和空白組對Lewis細胞無特異性殺傷作用，表明本發(fā)明的EphA2優(yōu)勢表位復合物能夠有效激發(fā)T細胞產(chǎn)生對腫瘤細胞的特異性殺傷效應。3、EphA2優(yōu)勢表位復合物體內(nèi)抗腫瘤活性檢測
將30只C57BL/6小鼠隨機分為3組實驗組、對照組和空白組，每組10只；將EphA2優(yōu)勢表位復合物和OVA表位復合物分別用濃度為0. lmol/L、pH為7. 4的PBS溶解制成濃度為 lmg/mL的溶液；實驗組以濃度為lmg/mL的EphA2優(yōu)勢表位復合物溶液為免疫原，對照組以濃度為lmg/mL的OVA表位復合物溶液為免疫原，空白組以濃度為0. lmol/L、pH為7. 4的 PBS為免疫原；各組于小鼠背側(cè)尾根部皮下注射免疫原，每只100 μ L，之后每間隔1周，用同樣方法加強免疫1次，共免疫3次；第一次免疫后，于各組小鼠左側(cè)背后皮下注射1 X IO6個 Lewis細胞，觀察各組小鼠的生存率和腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。各組小鼠的腫瘤生長曲線見圖5，第30天時對照組小鼠腫瘤體積達到1300mm3，而實驗組小鼠腫瘤生長緩慢，腫瘤體積僅為600mm3。各組小鼠的平均生存率見圖6，對照組小鼠60天的生存率為30%，而實驗組小鼠生存率較高，60天的生存率為50%。說明本發(fā)明的 EphA2優(yōu)勢表位復合物能夠有效抑制腫瘤生長，延長荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.酪氯酸蛋白激酶受體EphA2優(yōu)勢表位復合物，其特征在于由EphA258-66表位融合肽、EphA2 550-558表位融合肽、EphA2 253-261表位融合肽與LIGHT基因重組真核表達載體組成；所述EphA2 58-66表位融合肽、EphA2 550-558表位融合肽和EphA2 253-261表位融合肽的摩爾比為1:1:1;所述EphA2 58-66表位融合肽由EphA2 58-66表位、穿膜序列HIV_Tat49_57、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列KDEL和接頭序列AAY組成；穿膜序列位于融合肽的氨基端，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列位于融合肽的羧基端，EphA2 58-66表位位于穿膜序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列之間并分別通過接頭序列與穿膜序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列連接；所述EphA2 550-558表位融合肽由EphA2 550-558表位、穿膜序列HIV_Tat49_57、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列KDEL和接頭序列AAY組成；穿膜序列位于融合肽的氨基端，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列位于融合肽的羧基端，EphA2 550-558位于穿膜序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列之間并分別通過接頭序列AAY與穿膜序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列連接；所述EphA2 253-261表位融合肽由EphA2 253-261表位、穿膜序列HIV_Tat49_57、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列KDEL和接頭序列AAY組成；穿膜序列位于融合肽的氨基端，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列位于融合肽的羧基端，EphA2 253-261表位位于穿膜序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列之間并分別通過接頭序列與穿膜序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酪氯酸蛋白激酶受體EphA2優(yōu)勢表位復合物，其特征在于 所述LIGHT基因重組真核表達載體是在真核表達載體PCI-neo中插入LIGHT cDNA全長序列而得到。
3.權(quán)利要求1所述的酪氯酸蛋白激酶受體EphA2優(yōu)勢表位復合物的制備方法，其特征在于在攪拌條件下，向溶解有LIGHT基因重組表達載體的磷酸鹽緩沖液中滴加摩爾比為 1:1: 1的EphA2 58-66表位融合肽、EphA2 550-558表位融合肽和EphA2 253-261表位融合肽的混合水溶液，滴加完畢后繼續(xù)攪拌30分鐘，再靜置30分鐘，即得酪氯酸蛋白激酶受體2優(yōu)勢表位復合物。
4.權(quán)利要求1所述的酪氯酸蛋白激酶受體EphA2優(yōu)勢表位復合物在制備腫瘤治療性疫苗中的應用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的酪氯酸蛋白激酶受體EphA2優(yōu)勢表位復合物的應用，其特征在于所述腫瘤治療性疫苗為肺癌治療性疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酪氯酸蛋白激酶受體EphA2優(yōu)勢表位復合物、其制備方法以及在制備腫瘤治療性疫苗中的應用，該復合物由摩爾比為1∶1∶1的EphA258-66表位融合肽、EphA2550-558表位融合肽和EphA2253-261表位融合肽與LIGHT基因重組真核表達載體組成；EphA258-66/550-558/253-261表位融合肽分別由EphA258-66/550-558/253-261表位與穿膜序列HIV-Tat49-57、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列KDEL和接頭序列AAY組成；三種EphA2優(yōu)勢表位聯(lián)合，能夠有效彌補單一表位免疫效果的不足；三種表位融合肽可在穿膜序列的導向作用下進入胞漿，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列的作用下靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高效進入MHC-I類抗原遞呈途徑；而LIGHT基因重組真核表達載體可在體內(nèi)表達LIGHT蛋白，發(fā)揮分子佐劑作用，促進表位特異性T細胞的免疫應答。
文檔編號C07K19/00GK102258773SQ20111014589
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月1日
發(fā)明者王如密, 王守森, 袁邦青, 趙琳, 鄭兆聰, 陳宏頡, 高進喜 申請人:中國人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院