專利名稱：檢測維生素d的分析方法及用于其的抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于維生素D的分析方法(測定分析，assaying)，更具體地涉及用于具有維生素D結合蛋白質(zhì)的復合物中的維生素D的分析方法。
背景技術：
在動物中，維生素D主要用來保持血液、在體內(nèi)影響諸如骨礦化、肌肉收縮、神經(jīng)傳導以及其他一般細胞功能的特性/過程的物質(zhì)中的鈣和磷酸鹽(酯)的循環(huán)水平。因而， 維生素D濃度的變化會影響肌肉功能以及免疫、神經(jīng)、心臟和循環(huán)系統(tǒng)，并與多種病征如骨病、II型糖尿病和癌癥關聯(lián)。維生素D以多種形式出現(xiàn)，其中主要的兩種形式被認為是D2和D3，盡管本領域技術人員認為該術語泛指相關的脂溶性分子族，以及這些物質(zhì)的代謝物、衍生物和其他類似物。相應地，下文中的維生素D將用于指代本領域的全體已知和/或被廣泛描述的/稱為維生素D的分子組的所有成員。維生素D可由飲食中獲取，或通過陽光的作用在皮膚中光化學產(chǎn)生。還不知曉維生素D2由動物合成，而是在飲食中從真菌和植物源獲取。維生素D3可類似地經(jīng)由肉食性飲食被動物獲取，或者如上文所述，在皮膚中重新合成。然而，無論其來源，維生素D主要以 25羥基維生素D (下文中的25 (OH) D)形式在體內(nèi)貯存，該25羥基維生素D在肝臟中通過維生素D的羥基化生成。25 (OH)D是血液中發(fā)現(xiàn)的維生素D的主要形式，并且是1，25_ 二羥基維生素D (下文中的1，25 (OH)2D)的前體，該1，25 (OH) 2D是主要在腎臟中產(chǎn)生的維生素D 的生理活性形式。1，25 (OH)2D結合到維生素D受體(VDR)上，其在所述結合之后，可介導快速和長期的基因組響應。維生素D的生物學活性形式通過與靶細胞中例如在腸道、骨頭或腎臟中的維生素 D受體(VDR)結合發(fā)揮作用。維生素D在水中溶解性差，因此為了使其能夠在血液中運輸?shù)桨屑毎S生素D結合到具有可溶性52kDa載體蛋白質(zhì)的復合物中，該可溶性52kDa載體蛋白稱為維生素D結合蛋白質(zhì)或組特異性成分(group specific component，Ge)。維生素D 結合蛋白質(zhì)具有變體，該變體包括但不限于類型1S、1F和2。下文中，包括本領域已知為維生素D結合蛋白質(zhì)或Gc的所有變體的蛋白質(zhì)組(group)被稱作DBP。DBP的濃度通常是血液中維生素D濃度的20倍，因此由于DBP對維生素D具有非常高的結合親合力(binding affinity)，所以發(fā)現(xiàn)大多數(shù)血液維生素D與DBP結合在一起。 這種維生素D-DBP復合物在下文稱作holo-DBP。根據(jù)結合親合力，DBP以下列相對親合力結合到維生素D的不同形式/代謝物上 25 羥基維生素 EK25 (OH)D) = 24，25-二羥基維生素 D ( ，25 (OH) 2D) > 1，25 (OH) 2D >膽鈣化酉享(cholcalciferol)。循環(huán)的25 (OH) D中，超過90%通常被發(fā)現(xiàn)結合在DBP上，雖然其他蛋白質(zhì)，如人血清白蛋白(HSA)已顯示與25(0H)D結合，但是親合力明顯較低。維生素D對于健康具有廣泛而重要的影響，顯然醫(yī)學上需要能夠簡單并精確地測定體內(nèi)維生素D的水平。在體液中，可測定兩種主要形式的維生素D，即25(0H)D和1，25(0H)2D。如上所述，25 (OH) D通常在血液中的濃度比1，25(0H) 2D高，而且，由于具有相對長的半衰期，所以 25 (OH) D通常被測定從而評估和監(jiān)測個體中維生素D的狀況。此外，作為維生素D的活性形式，1，25 (OH) 2D的血漿/血清水平趨于保持在恒定水平，所以25 (OH) D水平是個體總體循環(huán)維生素D狀況的更好的指示物。然而，確定1，25(0H)2D的水平可作為這種化合物的活性形式在腎臟中是否有足夠產(chǎn)量的指示。當試圖確定目標的水平時，直接測定是常規(guī)慣例。因此，現(xiàn)行的確定維生素D水平的分析方法要求在測定在水性介質(zhì)中溶解性差的維生素D水平之前，首先將維生素D從其 DBP上離解。這種分離可通過變性并除去DBP或使用置換試劑釋放維生素D，再測定所產(chǎn)生的游離維生素D而實現(xiàn)。離解DBP的要求顯然使得在任何維生素D分析中引入這樣的步驟成為必需，并且因此增加執(zhí)行分析的時間和復雜性。由于維生素D的疏水性質(zhì)，當前的分析技術，例如，使用溶劑來釋放維生素D并使 DBP變性。這樣的方法使得隨后的變性DBP的分離和維生素D含量可被評估前的溶劑抽提成為必需。此外，當前評估維生素D水平的方法被報告有顯著的易變性問題，既與單個技術有關，也與不同的分析方法被比較時有關。由于工藝復雜性增加，所以諸如可靠性的問題變得更具挑戰(zhàn)性。不精確水平對于高敏感度分析變得非常重要，而且因為現(xiàn)有工藝的多階段性(包括維生素D置換、液體添加和去除，及多重洗滌步驟)，誤差可以積累并且因此精確度受損失。所以，需要能夠提供不精確度較低的簡化的維生素D分析方法。為了解決這些問題，本發(fā)明試圖克服與現(xiàn)有技術相關的問題。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了一種識別holo-DBP但是不識別apo-DBP(也稱為未結合DBP或DBP)或對其(apo-DBP)具有相對低親合力的分子。相對低親合力可例如通過對apo-DBP表現(xiàn)出的交叉反應性< 10%或優(yōu)選< 1%，以使其相對于apo-DBP優(yōu)先結合holo-DBP的分子表示。該識別分子(recognition molecule)將能夠準確且有效地區(qū)分holo-DBP和 apo-DBP。這將允許這種分子用于樣本如組織樣本或體液中維生素D檢測的測試。以該方式，通過允許選擇性確定DBP的holo形式和apo形式，本發(fā)明允許比現(xiàn)有程序所準許的更精確、更快速和更有益的靶向測量維生素D的水平。該識別分子可主要識別維生素D，但是與holoDBP交叉反應(crossreact)，使得 holoDBP被識別。關于這一點，本說明書中的措辭“識別”(或它的任何衍生詞(如“認識”))的使用認為是覆蓋主要識別、交叉反應性或任何二級(輔助，secondary)或繼后 (subsequent)形式的識別。術語“識別分子”應被理解為涵蓋以任何方式與靶相互作用或結合的分子。優(yōu)選地，所述識別分子可用于捕獲、濃縮、分離或檢測holo-DBP。優(yōu)選地，識別分子不識別未結合的維生素D?？商鎿Q地，識別分子可以識別樣本中未結合維生素D連同holo-DBP。
優(yōu)選地，識別分子對維生素D的特定變體形式例如25(0H)D表現(xiàn)出選擇性。優(yōu)選地，用于產(chǎn)生和測試識別分子的DBP是混合型DBP，即，含有該蛋白質(zhì)的遺傳性變型混合物的DBP?？商鎿Q地，DBP可以是DBP的特定遺傳性變型。方便地，所述識別分子選自抗體(例如單克隆抗體)、抗體片段(例如F(ab)、 F(ab' )2、F(V)、scFv)、蛋白質(zhì)、分子印跡聚合物(MIP)、互補決定區(qū)(CDR)、寡肽、寡核苷酸 (例如適體(aptamer))或對holo-DBP有親合力的小有機化學物質(zhì)?？蛇x地，所述識別分子包括信號成分(signal component)，其中所述成分是放射性同位素、熒光團、發(fā)色團、結合配體(binding ligand)或酶底物，以便所述信號成分使所述組合物能夠被檢測?？晒曹椊Y合到識別分子的信號分子的實例是但不限于酶，如辣根過氧化物酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酶、S-5-類固醇異構酶(delta-5-steroid isomerase)、酵母乙醇脫氫酶、α -磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、過氧化氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、葡糖淀粉酶、和乙酰膽堿酯酶；化學發(fā)光性化合物，如吖啶酯；合適的熒光標記化合物包括異硫氰酸熒光素、若丹明(rhodamine)、藻紅蛋白(phycoerythrin)、藻青蛋白 (phycocyanin)、別藻藍蛋白(allophycocyanin)、鄰苯二醛(o-phthaldehyde)和熒光胺 (fluorescamine)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種與本文中描述的識別分子競爭的分子。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于檢測樣品中的維生素D的方法，該方法包括使樣品與本發(fā)明的分子接觸以及檢測樣品中存在的維生素D的量。這種方法在確定維生素D水平時，消除了對于從DBP上離解維生素D的需要，且因此允許更快和更簡單地測定分析維生素D。樣品中holo-DBP的量與維生素D的數(shù)量有直接關系。該方法也可根據(jù)所使用的識別分子而用來檢測不同形式的維生素D。例如，如果要評估腎臟處理維生素D的功能，則可使用1，25 (OH) 2D的識別分子；或者如果要評估血液中維生素D的量，則要么使用識別結合DBP的所有維生素D的通用識別分子，要么使用識別結合到DBP的血液中維生素D的主要形式Q5(0H)D)的識別分子。方便地，樣本可以是任何組織樣本或體液，優(yōu)選為血液、血清或血漿。本領域技術人員將理解，這樣的方法可以大量不同方式并依賴于不同的原理實施。例如，使用中識別分子可以是，或能夠被固定從而使得holo-DBP能夠從樣本其余部分中分離。如果所述識別分子被固定，則識別分子可以直接或間接地偶聯(lián)(coupled to)到固體表面，如濾器或管壁，或作為進一步的實例，偶聯(lián)到液體色譜法使用的載體(support) 或基質(zhì)(matrix)(可裝載到柱子中)。如果識別分子能夠被固定，則可通過下面的方法實現(xiàn)，即將該分子偶聯(lián)到特異性結合配對物(specific binding partnership)(例如， 生物素/抗生蛋白鏈菌素)的一個成員，并且隨后用該配對物的另一成員來固定或聚集 (agglomerate)來自樣本其余部分的分子。本領域技術人員將進一步理解，該方法可以有可能作為競爭性或替代性分析實施，因而，例如，可使用可以是可選標記的并與holo-DBP競爭結合識別分子的分子(即， holo-DBP競爭性分子)。而且，應理解，在本發(fā)明的某些實施方式中也可以使用與holo-DBP 識別分子和/或holo-DBP識別分子復合物相互作用的其他分子。
在本發(fā)明不同實施方式中，在溶液或沉淀物中測定識別分子和/或holo-DBP競爭分子(二者之一或二者都可被固定)是理想的，。在進一步的實施方式中，測量適當標記的 holo-DBP競爭分子和適當標記的識別分子之間的空間相互作用是方便的。大量檢測技術可用于本發(fā)明的不同實施方式中?？墒褂弥苯釉u估如質(zhì)譜分析或高效液相色譜(HPLC)，或方便地使用的成分可偶聯(lián)到信號分子或標記物，例如是發(fā)冷光的、化學發(fā)光的、放射活性的、發(fā)熒光的、適合用于比色檢測的結合蛋白質(zhì)(binding protein)、表位或酶或底物的那些。而且，成分中可選地并入放射標記物或電化學標記物。實際上，本發(fā)明的實施方式中可并入本領域已知的任何信號分子或標記物。本領域技術人員將理解，本發(fā)明的方法可利用各種各樣的系統(tǒng)實施，例如 放射性免疫計量分析(IRMA)和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、微粒子酶免疫測定法 (MEIA)、免疫沉淀反應和液相色譜，以及直接測定分析形式如表面等離激元(Surface Plasmon Resonance)、表面聲波禾口石英晶體微天平法(Quartz Crystal Microbalance methodologies)。方便地，識別分子被固定在微滴定板(microtitre plate)或微粒如珠粒上，其中珠粒包括膠乳、聚苯乙烯、二氧化硅、螯合瓊脂糖和/或是磁性的。根據(jù)本發(fā)明進一步的方面，提供了一種利用本文中描述的識別分子從apo-DBP中分離holo-DBP的方法。根據(jù)本發(fā)明進一步的方面，提供了一種包括本文中描述的分子的試劑盒，該分子用于上文描述的檢測維生素D的方法或從apo-DBP中分離holo-DBP的方法。本發(fā)明將通過以下非限制性實施例進行舉例說明。在以下實施例中，holo-DBP是 25-0H-D3(獲自 Merck Chemicals Ltd.，目錄號為 679102)和混合型 DBP (也獲自 Merck Chemicals Ltd.，目錄號為；345802)的復合物，但holo-DBP可等同地涉及任何形式維生素 D和任何形式DBP的復合物、特定形式的維生素D和非特定形式DBP或非特定形式維生素D 和特定形式DBP。


本發(fā)明將參考附圖進行描述，其中圖1示出了抗體產(chǎn)生脾細胞與骨髓瘤細胞初始融合后，holo-DBP抗體對 holo-DBP (1 μ g/mL)和 apo-DBP (1 μ g/mL)的差異結合。圖2示出了第一輪有限稀釋(limiting dilution)后holo-DBP抗體對 holo-DBP (1 μ g/mL)和 apo_DBP(l μ g/mL)的差異結合。圖3示出了第二輪有限稀釋后holo-DBP抗體對holo-DBP (1 μ g/mL)和 apo-DBP(1 μ g/mL)的差異結合。圖4示出了 SELEX工藝過程。
具體實施例方式實施例1單克隆抗體的制備holo-DBP (維生素D復合于DBP)的鼠科單克隆抗體通過改進的Kohler和Milstein 方法(G. Kohler 和 C. Milstein，Nature，1975256，495)制備。雌性 BaLb/C 小鼠通過皮下注射未軛合的holo-DBP (每鼠50μ g)進行免疫。免疫原在弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant)中提供。弗氏不完全佐劑中提供的抗原加強(antigen boosts)用來增強抗體響應(每次加強每只小鼠20yg)。通過holo-DBP的固相免疫分析監(jiān)視免疫響應。 在收獲脾細胞及脾細胞與鼠科骨髓瘤細胞的融合體之前，小鼠經(jīng)過四次或五次加強。脾淋巴細胞和骨髓瘤細胞的融合在PEG存在下，免疫小鼠脾細胞和NSO小鼠骨髓瘤細胞融合。將細胞接種于培養(yǎng)皿的孔中，并在選擇性HAT (次黃嘌呤、氨蝶呤和腺嘧啶脫氧核苷)培養(yǎng)基存在下進行培養(yǎng)， 該培養(yǎng)基允許選擇融合的脾和骨髓瘤細胞。通過標準固相免疫分析技術，測試來自融合細胞的上清液對holo-DBP和/或apo-DBP的反應性(見后面的實施例)。腹水中免疫球蛋白組分(immunoglobulin fraction)的分離為了從腹水中分離免疫球蛋白組分，免疫球蛋白組分首先通過加入等體積飽和硫酸銨溶液在4°C從腹水中沉淀。將沉淀物離心，再用與原腹水等體積的Tris緩沖液溶解，然后從同樣的iTris緩沖液進行透析。免疫球蛋白溶液用單Q柱(mono Q column)和鹽梯度洗脫免疫球蛋白進行進一步純化。然后測試免疫球蛋白組分對于抗原的免疫響應。實施例2多克隆抗血清(polyclonal antisera)的制備根據(jù) Methods in Enzymology, H. Van Vunatis and J.J.Langone(Eds)1981, (729b) and 1983，92 (E)中描述的方法，holo-DBP的多克隆抗血清可通過使用holo-DBP在羊或兔體內(nèi)進行培養(yǎng)。本領域已知的其他物種也可被用于產(chǎn)生多克隆抗體。對holo-DBP具有選擇性的多克隆抗體可用本領域技術人員熟知的技術，如親合純化進行分離。例如，多克隆抗血清可與涂覆有holo-DBP的固相孵育，孵育后不與該固相結合的材料(物質(zhì))可被洗去，只留下能與holo-DBP結合的分子，通過包括使用離液離子 (chaotropic ion)在內(nèi)的多種技術，這些分子本身可以從該固相釋放出來。釋放的抗體然后可以與涂覆apo-DBP的固相孵育，由此在溶液中只留下相對于apo-DBP對holo-DBP表現(xiàn)出特異性的那些抗體。實施例3噬菌體顯示文庫的淘選可在噬菌體表面上利用組合免疫球蛋白文庫實施具有可結合復合于DBP的維生素D而非僅識別維生素D或DBP的前述特性的抗體篩選，如在Bartas C. F. and Lerner, R. Α. (1991)Combinatorial immunoglobulin libraries on the surface of phage (phabs)中描述的。抗原特異性Fabs的快速選擇。方法(METHODS) =A Companion to Methods in Enzymology2 :119-124。顯示所期望抗體的噬菌體通過“噬菌體淘選(phage panning) ”進行選擇，“噬菌體淘選”是一種與固相免疫分析具有相似性的技術。將Holo-DBP固定在固體表面上，如微滴定板、珠粒如但不限于磁性珠粒、或柱子。然后將噬菌體加入并允許與holo-DBP相互作用。 在洗滌以去除所有未相互作用的材料后，將結合的噬菌體洗脫并通過在新的細菌性宿主細胞中復制而進行擴增。為了增強holo-DBP抗體的選擇，當與holo-DBP相互作用時，向該相溶液中加入提高濃度的apo-DBP。這種選擇工藝重復幾次，從而選擇只表達結合holo-DBP的抗體的噬菌體種群。隨后分離抗體基因，并插入表達載體從而產(chǎn)生可溶性抗體片段，因為抗體基因必須在無噬菌體外殼蛋白的情況下表達。這可通過使用標準聚合酶鏈式反應(PCR)擴增或限制酶來實現(xiàn)，其中輕鏈和重鏈的Fab基因被分離并被克隆入新載體。測試該fab片段對以 5 μ g/mL磷酸鹽緩沖液(PBQ涂覆在平板上的apo-DBP或holo-DBP的差異結合。Fab在 0. 1 μ g/mL或0. 2 μ g/mL的PBS溶液中的濃度下進行測定分析。為了產(chǎn)生單克隆抗體，將載體-Fab基因轉化到新的宿主中并以單克隆菌落分離。 分離幾個克隆菌落并誘導抗體表達，在通過細胞溶解而釋放單克隆抗體后，通過酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)測試溶解產(chǎn)物中holo-DBP抗體的存在。實施例4抗體結合測定分析和克隆選擇NUNC maxisorb平板用濃度為1 μ g/mL的holo-DBP或apo-DBP碳酸鹽緩沖液(pH 為9. 5)涂覆過夜，每孔100 μ L。次日，丟棄涂覆混合物，并用BSA Omg/mL磷酸鹽緩沖液 (PBS)，pH 7. 5)在室溫下阻斷平板60分鐘。用PBS+0. 吐溫20 (PBST)洗滌平板一次。 樣本，即在PBS中稀釋的血液/細胞上清液材料，用holo-DBP或apo-DBP室溫孵育60分鐘。為了促使對holo-DBP而不是apo-DBP的特異性抗體的選擇，在涂覆holo-DBP的孔中孵育前，也可以將遞增過量濃度(即相比蛋白質(zhì)的相關涂覆濃度過量10至100倍，即每樣本 IugMlOyg)的apo-DBP (即缺乏結合的維生素D的DBP)加入抗體溶液進行1小時預孵育。然后丟棄上清液并用PBST洗滌該板三次。將在PBS中以1 5000稀釋度使用的第二抗體(共軛結合于辣根過氧化物酶的山羊抗小鼠抗體，Bio-Rad目錄號170-6516)與平板室溫下孵育60分鐘。在加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物(從Biopanda Diagnostics獲得， 目錄號TMB Solution II)前，用PBST洗滌平板三次。通過加入2M H2SO4終止反應。然后在分光光度計上測定450nM處樣本的吸光率/光密度值。圖1示出了來自抗體產(chǎn)生脾細胞與骨髓瘤細胞初始融合后產(chǎn)生的抗體一組實驗的對holo-DBP和apo-DBP的典型差異結合。 表1示出了 holo-DBP抗體上清液與apo-DBP的交叉反應性。
融合克隆體與apo-DBP的交叉反應性1B584. 2%1B978. 0%2F1277. 0%4E173. 1%10A1233. 9%表1 融合后鑒定的holo-DBP抗體與克隆體的apo-DBP的交叉反應性。進一步篩選了所有相對于apo-DBP對holo-DBP具有更大特異性的孔(樣本)。 移去得到抗體產(chǎn)生細胞的所有孔中的樣本并通過至少兩個回合的標準有限稀釋克隆程序進行克隆。在每回合的有限稀釋后，如上文指出的，測試克隆上清液中相對于apo-DBP對 holo-DBP顯示更大特異性的抗體表達。參見圖2和3，其分別示出第一和第二回合有限稀釋后，holo-DBP抗體克隆體對 holo-DBP和apo-BDP的差異結合的一組實驗的結果，并且表2和表3示出了 holo-DBP抗體上清液與apo-DBP的交叉反應性(表2涉及圖2的樣本，而表3涉及圖3的樣本)。
權利要求
1.一種識別holo-DBP但不識別apo-DBP的分子。
2.一種識別holo-DBP且對apo-DBP具有相對較低親合力的分子。
3.根據(jù)權利要求2所述的分子，其中，與apo-DBP的交叉反應性小于10%。
4.根據(jù)權利要求3所述的分子，其中，與apo-DBP的交叉反應性小于1%。
5.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的分子，其進一步包括信號成分。
6.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的分子，其中，所述分子不識別維生素D。
7.根據(jù)權利要求1到5中任一項所述的分子，其中，所述分子識別維生素D。
8.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的分子，其中，所述holo-DBP包括與DBP相關聯(lián)的 25(OH)D。
9.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的分子，其中，所述DBP是混合型DBP。
10.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的分子，其中，所述分子是抗體或其片段。
11.一種與根據(jù)前述權利要求中任一項所述的分子競爭的分子。
12.一種用于檢測樣本中的維生素D的方法，所述方法包括使所述樣本與根據(jù)前述權利要求中任一項所述的分子接觸以及確定所述樣本中存在的維生素D的量。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中，結合的holo-DBP的量是所述樣本中維生素D 的量的指示。
14.根據(jù)權利要求12或13所述的方法，其中，所述樣本是體液。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中，所述體液是血漿或血清。
16.一種使用根據(jù)權利要求1到11中任一項所述的分子從apo-DBP中分離holo-DBP 的方法。
17.—種試劑盒，包括根據(jù)權利要求1到11中任一項所述的分子，用于根據(jù)權利要求 12到15中任一項所述的檢測維生素D的方法或根據(jù)權利要求16所述的從apo-DBP中分離 holo-DBP的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種識別holo-DBP但不識別apo-DBP或對apo-DBP具有相對較低親合力的分子。
文檔編號C07K16/44GK102333790SQ201080009231
公開日2012年1月25日 申請日期2010年3月2日 優(yōu)先權日2009年3月2日
發(fā)明者戴維·普里查德, 拉爾斯·奧爾寧, 瑪格麗特·勞洛爾, 穆爾多·布萊克 申請人:?？宋魉?希爾德診斷有限公司