專利名稱：一種基于sds緩沖液高效土壤殘留bt蛋白提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對(duì)不同類型土壤中殘留BT蛋白的提取方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。適 用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、環(huán)境保護(hù)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等部門使用。
背景技術(shù)：
Bt (Bacillus thuringiensis)是一種革蘭氏陽(yáng)性、需氧型芽孢桿菌，在其芽孢 形成過(guò)程中，能產(chǎn)生一種以上的殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins，簡(jiǎn)稱 ICPs)。BT殺蟲蛋白可分為α外毒素，β-外毒素、δ-內(nèi)毒素和虱因子，其中用于轉(zhuǎn)基因 植物的主要是外毒素、S -內(nèi)毒素。這兩種毒素被敏感昆蟲幼蟲取食后，在其消化道內(nèi) 消化酶的作用下，蛋白被水解釋放出約虬60Χ IO3 70Χ IO3的活性毒蛋白分子(toxin)。 毒蛋白與昆蟲中腸上皮細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合，并發(fā)生作用而使細(xì)胞膜穿孔。消化道細(xì) 胞內(nèi)的離子濃度和滲透壓平衡遭到破壞，使上皮細(xì)胞裂解，最終導(dǎo)致昆蟲死亡(崔洪志等， 2001)。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，Bt基因陸續(xù)被導(dǎo)入到棉花、玉米、水稻中。轉(zhuǎn)Bt作物的面 世與推廣種植，給作物害蟲防治帶來(lái)了一條新的途徑(Wu等，2003 ；Wan等，2004 ；李浩賓等， 2006)。自上世紀(jì)90年代以來(lái)，轉(zhuǎn)Bt棉花在我國(guó)進(jìn)行商業(yè)化種植已達(dá)10余年。據(jù)2006 年統(tǒng)計(jì)，轉(zhuǎn)Bt棉花種植面積已占我國(guó)棉花種植總面積的70%以上(吳孔明，2007)。隨著轉(zhuǎn) Bt作物種植面積的不斷擴(kuò)大，其對(duì)生態(tài)環(huán)境的潛在風(fēng)險(xiǎn)也日益成為國(guó)內(nèi)外專家和學(xué)者研究 的熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)Bt作物在種植以后，在其整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)，會(huì)通過(guò)根系分泌物、花粉、植物殘茬向 土壤釋放Bt毒素(Sexena等，1999)，這些分泌的Bt毒素會(huì)和土壤中的粘土礦物和腐殖質(zhì) 等表面活性顆粒吸附，且該結(jié)合態(tài)毒素仍具有較強(qiáng)的殺蟲活性，在土壤環(huán)境中可長(zhǎng)時(shí)間存 留(Sexena等，2004)。土壤是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化的重要場(chǎng)所，土壤中的動(dòng)物 和微生物種群對(duì)于土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)降解和能量轉(zhuǎn)換起著非常重要的作用。這些殘留的 毒索可能會(huì)對(duì)土壤中無(wú)脊椎動(dòng)物、微生物種群產(chǎn)生潛在的毒性，影響土壤動(dòng)物及微生物種 群的多樣性結(jié)構(gòu)，從而破壞土壤的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換(李云河等，2006)。因此，研究轉(zhuǎn)Bt 基因植物毒蛋白在土壤中的殘留和降解動(dòng)態(tài)對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境安全、保障人類健康具有十 分重要的意義。目前，對(duì)于土壤中殘留BT蛋白的檢測(cè)方法，主要有生物測(cè)定法和Dot-ELISA試劑 盒檢測(cè)法。生物測(cè)定法以目標(biāo)害蟲取食轉(zhuǎn)Bt作物組織后的死亡率、化蛹率、羽化率、體重 變化等作為指標(biāo)，是確認(rèn)土壤中殘留的Bt毒蛋自殺蟲活性的一種直接、有效、簡(jiǎn)便易行的 手段，只需將含有Bt毒蛋白的抽提液直接加入到敏感昆蟲的人工飼料中即可，且靈敏度 高，可檢測(cè)到亞致死劑量的Bt毒蛋白。但生物測(cè)試法需要統(tǒng)一蟲源、蟲齡和飼養(yǎng)條件，且占 用的空間大，檢測(cè)所需的時(shí)間長(zhǎng)，環(huán)境因素干擾大，因此難以對(duì)大量的樣品進(jìn)行檢測(cè)(Sims 等，1996 ；Zwahleh等，1994 ；Tapp等，1997)。ELISA檢測(cè)法通過(guò)提取緩沖液提取土壤中的BT 蛋白，然后采用ELISA檢測(cè)方法對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定性或定量。ELISA檢測(cè)法操作相對(duì)生物 測(cè)定法較為簡(jiǎn)單，檢測(cè)所需時(shí)間短，因此成為目前檢測(cè)土壤中殘留BT蛋白最常用的一種方法(沈法富等，1999)。由上述兩種方法可以看出，在對(duì)土壤中BT蛋白檢測(cè)的過(guò)程中，最為 關(guān)鍵的就是能否高效地從土壤中提取BT蛋白。目前提取土壤中殘留BT蛋白的方法主要有 碳酸鹽法(徐海根等，2008)、人造蠕蟲腸道蛋白提取液法(Shan等，2005)、PBST法。碳酸 鹽法和人造蠕蟲腸道蛋白提取液法分別是在蛋白的提取緩沖液添加碳酸鹽和人造蠕蟲腸 道蛋白提取液，以提高緩沖液對(duì)土壤蛋白的提取效率。碳酸鹽提取法提取效率偏低，對(duì)于BT 蛋白含量較低的土壤中，無(wú)法提取出BT蛋白，易造成假陰性結(jié)果。人造蠕蟲腸道蛋白提取 液由于添加液成本較高，無(wú)法滿足大量樣品檢測(cè)的需要。PBST法是采用美國(guó)Envirologix 公司生產(chǎn)的CrylAb/CrylAc檢測(cè)試劑盒自帶的提取緩沖液提取方法，該試劑盒由于價(jià)格昂 貴，且提取效率不高，在一定程度上限制了其使用范圍。因此，開(kāi)發(fā)出一種高效、低成本、操作較為簡(jiǎn)單的土壤BT蛋白提取方法顯得尤為 重要。通過(guò)該技術(shù)，提高土壤中BT蛋白的提取效率，降低檢測(cè)成本，避免由于提取蛋白效率 過(guò)低造成的假陰性結(jié)果，從而對(duì)土壤中BT蛋白的殘留降解動(dòng)態(tài)進(jìn)行更加準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)。本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種新的土壤BT蛋白提取緩沖液，并在此基礎(chǔ)上建立了 SDS法提取 土壤中殘留BT蛋白提取方法。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中土壤殘留BT提取效率過(guò)低、檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)假 陰性等問(wèn)題，提供用于提取土壤殘留BT蛋白的緩沖液以及土壤殘留BT蛋白提取方法，對(duì)不 同類型土壤中殘留BT蛋白進(jìn)行提取，效率高、成本低、操作簡(jiǎn)便。技術(shù)方案本發(fā)明的目的意在克服現(xiàn)有土壤BT殘留蛋白提取技術(shù)的不足，提供一種新的高 效提取土壤BT毒蛋白方法，該方法可以簡(jiǎn)單方便地從各種類型土壤中提取BT毒蛋白并用 于各種后續(xù)檢測(cè)。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案1.用于提取土壤中殘留BT蛋白的緩沖液配方NaCl 8g、KCl 0. 2g、Na2HP04 1. 44g、KH2P04 0.24g、SDS 2g、甘油 50ml，溶于 800ml
滅菌的去離子水中，調(diào)節(jié)pH值至7. 4，定容至1L。2.用于提取土壤中殘留BT蛋白的提取方法土壤中殘留BT蛋白的提取方法，包括如下步驟(I)SDS 蛋白提取緩沖液的配制NaCl 8g、KCl 0. 2g、Na2HPO4 1. 44g、KH2P040. 24g、 SDS 2g、甘油50ml、溶于800ml水中，調(diào)節(jié)pH值至7. 4，加去滅菌后的離子水定容至IL ；(2)取IOOg 土壤樣品，采用300目網(wǎng)篩過(guò)篩去除植物殘?bào)w根系等雜質(zhì)，稱取5g過(guò) 篩后的土壤樣品置于研缽中，充分研磨3 5分鐘，稱取0. 5g充分研磨后的土壤樣品；(3)將0.5g充分研磨后的土壤樣品置于2ml離心管中，加入1.5ml SDS蛋白提取 緩沖液，置于渦旋混合儀上震蕩1分鐘，使其充分混合均勻?qū)⑸鲜鐾寥缿腋∫褐糜诳煽販?搖床中，50°C下200rpm震蕩14 16小時(shí)；(4)將震蕩后的離心管取出，迅速置于離心機(jī)中，6000rpm離心1分鐘；(5)離心結(jié)束后，用微量移液器小心吸取離心管中的上清液，轉(zhuǎn)入新的離心管中，該上清液即為含有BT毒蛋白的溶液，該溶液可直接用于BT蛋白Elisa試劑盒檢測(cè)及其他 各種后續(xù)檢測(cè)。有益效果采用上述技術(shù)方案，突出的技術(shù)進(jìn)步在于1.提取效率高與現(xiàn)有的土壤BT蛋白提取方法(碳酸鹽緩沖液提取法，人造蠕蟲腸道液提取法，Envirologix試劑盒自帶提取緩沖液提取法)相比，效率分別大約提高了 3 倍、8倍和10倍；且提取產(chǎn)物可直接用于ELISA，western blot, SDS-PAGE凝膠電泳，BCA總 蛋白濃度檢測(cè)等后續(xù)試驗(yàn)。2.實(shí)用性好通過(guò)對(duì)不同類型含BT殘留蛋白的土壤樣品進(jìn)行效果驗(yàn)證后，結(jié)果顯 示，對(duì)于不同類型土壤樣品，本方法提取效率均高于碳酸鹽緩沖液提取法，人造蠕蟲腸道液 提取法(AGF法)，Envirologix試劑盒自帶提取緩沖液提取法(PBST法)；3.成本低本方法中使用試劑均為實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)實(shí)驗(yàn)試劑，成本較低；4.操作簡(jiǎn)便本方法僅需5步便可從不同類型土壤中高效提取BT蛋白，無(wú)需進(jìn)行 專業(yè)的培訓(xùn)。采用SDS緩沖液提取法作為土壤BT殘留蛋白提取方法，彌補(bǔ)了現(xiàn)有土壤BT殘留 蛋白提取方法提取效率過(guò)低、成本高、檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)假陰性等問(wèn)題，為土壤中BT蛋白殘 留動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供了一種高效、低成本、易操作的技術(shù)途徑。(四)說(shuō)明書附圖表1.采用SDS緩沖液提取法對(duì)不同土壤類型省份土壤殘留BT蛋白提取結(jié)果。表2.采用SDS緩沖液提取法和其他三種提取法對(duì)不同土壤類型省份土壤殘留BT 蛋白提取結(jié)果。

圖1.采用SDS緩沖液提取法和其他三種提取法對(duì)不同土壤類型省份土壤殘留BT 蛋白提取比較結(jié)果。 結(jié)果表明，采用SDS緩沖液提取法可以成功地從各種不同類型的土壤中提取BT殘 留蛋白，提取效率顯著高于其他三種提取方法。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 一種高效提取土壤中殘留BT蛋白的方法，用于提取不同類型土壤中的 BT殘留蛋白。用于提取各種不同類型土壤中殘留BT蛋白的SDS提取緩沖液NaCl 8g、KCl 0. 2g、Na2HPO4 1. 44g、KH2PO4 0. 24g、SDS 2g、甘油 50ml，溶于 800ml 滅菌的去離子水中，調(diào)節(jié)pH值至7. 4，定容至1L。提取的主要步驟包括(1)取IOOg 土壤樣品，采用300目網(wǎng)篩過(guò)篩去除植物殘?bào)w根系等雜質(zhì)，稱取5g過(guò) 篩后的土壤樣品置于研缽中，充分研磨3 5分鐘；稱取0. 5g充分研磨后的土壤樣品；(2)將0. 5g充分研磨后的土壤樣品置于2ml離心管中，加入1. 5ml SDS蛋白提取 緩沖液，置于渦旋混合儀上震蕩1分鐘，使其充分混合均勻；(3)將上述土壤懸浮液置于可控溫?fù)u床中，50°C下200rpm震蕩14 16小時(shí)；(4)將震蕩后的離心管取出，迅速置于離心機(jī)中，6000rpm離心1分鐘；(5)離心結(jié)束后，用微量移液器小心吸取離心管中的上清液，轉(zhuǎn)入新的離心管中，該上清液即為含有BT毒蛋白的溶液。(6)采用酶標(biāo)儀對(duì)含有BT毒蛋白的溶液進(jìn)行定量。實(shí)例1從河南、江西、新疆、陜西種植轉(zhuǎn)Bt棉花田塊土壤樣品中提取BT殘留蛋白上述SDS提取緩沖液和提取方法用于提取河南、江西、新疆、陜西種植轉(zhuǎn)Bt棉花田塊土壤樣品中的殘留蛋白，方法包括1)將上述四個(gè)省、自治區(qū)的轉(zhuǎn)Bt棉花田塊土壤樣品作為提取對(duì)象。2)參照上述技術(shù)方案利用SDS提取緩沖液法對(duì)上述樣品進(jìn)行BT殘留蛋白的提取。 提取結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明采用SDS緩沖液提取法均能上述四個(gè)省、自治區(qū)的土壤樣品中提 取BT蛋白。證明了上述技術(shù)方案能夠應(yīng)用于不同類型土壤樣品BT殘留蛋白的實(shí)際提取。
權(quán)利要求
提取土壤蛋白的SDS緩沖液配方NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.44g、KH2PO4 0.24g、SDS 2g、甘油50ml，溶于800ml滅菌的去離子水中，調(diào)節(jié)pH值至7.4，定容至1L。
2.權(quán)利要求提取土壤BT殘留蛋白的方法，包括如下步驟(1)取IOOg土壤樣品，采用300目網(wǎng)篩過(guò)篩去除植物殘?bào)w根系等雜質(zhì)，稱取5g過(guò)篩后 的土壤樣品置于研缽中，充分研磨3 5分鐘，稱取0. 5g充分研磨后的土壤樣品；(2)將0.5g充分研磨后的土壤樣品置于2ml離心管中，加入1.5mlSDS蛋白提取緩沖 液，置于渦旋混合儀上震蕩1分鐘，使其充分混合均勻?qū)⑸鲜鐾寥缿腋∫褐糜诳煽販負(fù)u床 中，50°C下200rpm震蕩14 16小時(shí)；(3)將上述土壤懸浮液置于可控溫?fù)u床中，50°C下200rpm震蕩14 16小時(shí)；(4)將震蕩后的離心管取出，迅速置于離心機(jī)中，6000rpm離心1分鐘；(5)離心結(jié)束后，用微量移液器小心吸取離心管中的上清液，轉(zhuǎn)入新的離心管中，該上 清液即為含有BT毒蛋白的溶液。
全文摘要
本發(fā)明為提取各種不同類型土壤中的殘留BT蛋白提取方法，屬于環(huán)境監(jiān)測(cè)與環(huán)境保護(hù)范疇。SDS提取緩沖液的配方NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.44g、KH2PO4 0.24g、SDS 2g、甘油50ml，溶于800ml滅菌的去離子水中，調(diào)節(jié)pH值至7.4，定容至1L。以此緩沖液為基礎(chǔ)結(jié)合BT殘留蛋白提取技術(shù)能夠高效提取不同類型土壤中的殘留BT蛋白，這種提取方法具較高的提取效率、易操作性及較低的成本，為土壤BT蛋白殘留檢測(cè)和監(jiān)測(cè)提供了高效、易操作性及較低成本的技術(shù)方法。圖為SDS緩沖液提取法和其他三種提取法對(duì)不同類型土壤殘留BT蛋白提取比較結(jié)果。
文檔編號(hào)C07K14/325GK101812121SQ201010137168
公開(kāi)日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2010年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月1日
發(fā)明者劉標(biāo), 劉燕, 孟軍, 方志翔 申請(qǐng)人:環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所