專利名稱：抑制丙型肝炎病毒侵入的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制丙型肝炎病毒侵入的多肽。
背景技術(shù)：
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒Ofepatitis C virus, HCV)感染引起的，經(jīng) 急性期感染后相當(dāng)一部分患者可轉(zhuǎn)歸為慢性感染(Chronic hepatitis C)、肝硬化 (Cirrhosis)禾口月干細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC) (Kiyosawa K, Sodeyama T, Tanaka E, Gibo Y, Yoshizawa K, Nakano Y, Furuta S, Akahane Y, Nishioka K, Purcell RH, et al.Interrelationship of blood transfusion, non_A, non-B hepatitis andhepatocellular carcinoma analysis by detection of antibody to hepatitis Cvirus. Hepatology. 1990 Oct; 12 (4 Pt 1) :671_5.)。HCV 感染的慢性化率非常高，為 50% 85%，對患者的健康和生命危害極大，相關(guān)醫(yī)療成本逐年增加，已成為嚴(yán)重的社會 和公共衛(wèi)生問題。根據(jù)世界衛(wèi)生組織1999年的調(diào)查，全球HCV感染者達(dá)1. 7億，感染率為 3. 1% (Lauer GM, Walker BD. Hepatitis C virus infection. N EnglJ Med. 2001 Jul 5 ； 345(1) :41-52.)。我國的HCV感染者和發(fā)病者總數(shù)均居世界首位，屬于丙肝高發(fā)區(qū)之一。 我國一般人群的HCV感染率為3. 2%，感染者約為4200萬左右，且近年來一直呈快速上升 趨勢(中華醫(yī)學(xué)會，《丙型肝炎防治指南》，2005)。更為嚴(yán)峻的是目前世界上還沒有可預(yù)防 HCV感染的疫苗，無法阻斷新發(fā)的丙肝感染。而且目前也沒有直接針對HCV病毒靶點(diǎn)的藥 物。聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)和利巴韋林(Ribavirin)的聯(lián)合治療作為目前唯一治療手 段對于我國和全球流行性毒株(lb和la基因型)的有效率不高(約50% )，治療周期長， 費(fèi)用昂貴并且有強(qiáng)烈的副作用。因此，研究開發(fā)新型抗HCV藥物和治療方案將對丙型肝炎 的防治具有極其重要的意義。HCV具有獨(dú)特的基因組結(jié)構(gòu)及生活周期。HCV屬黃病毒科(Flaviviridae)單股 正鏈RNA病毒，該科的主要人類病原體還包括Yellow fever virus、Dengue virus、West Nile virus等。HCV基因組長約9. 6kb，包含一個(gè)大的開放閱讀框，編碼一個(gè)由約3000個(gè) 氨基酸組成的前體蛋白，開放閱讀框兩側(cè)為非翻譯區(qū)(Untranslatedregions，UTRs) (Choo QL, Kuo G, ffeiner AJ, Overby LR, Bradley Dff, Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viralhepatitis genome. Science. 1989 Apr 21 ；244 (4902) :359_62. )。HCV前體蛋白經(jīng)由宿主和病毒編碼的蛋白酶的聯(lián)合作用下，加工 成熟為四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白:Core, El，E2和p7，以及六個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白:NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 和NS5B。其中E1和E2為囊膜糖蛋白。HCV的重要遺傳特征之一是其基因組的高度變異性， 其中E1和E2區(qū)域變異程度最高，而3’和5’ -UTR相對較為保守。這一特性為設(shè)計(jì)和開發(fā) HCV疫苗帶來了相當(dāng)程度的困難。目前HCV可分為6個(gè)主要基因型及近百種不同亞型，按照 國際通行的方法，以阿拉伯?dāng)?shù)字表示HCV基因型，以小寫的英文字母表示基因亞型(如lb、 2a、3c等)?；?型呈全球性分布，占所有HCV感染的70%以上。HCV與許多其他RNA病 毒類似，感染宿主后，經(jīng)一定時(shí)期，在感染者體內(nèi)形成以一個(gè)優(yōu)勢株為主的相關(guān)突變株病毒群，稱為準(zhǔn)種(Quasispecies)。HCV完整生活周期通常分為病毒吸附與侵入宿主細(xì)胞；前 體蛋白的翻譯、加工與成熟；病毒基因組復(fù)制；病毒組裝等環(huán)節(jié)。HCV感染宿主細(xì)胞的第一個(gè)環(huán)節(jié)為利用細(xì)胞膜表面受體完成病毒顆粒的侵入過 程。近兩年來，關(guān)于發(fā)現(xiàn)和鑒定HCV受體的工作異?；钴S，且成果豐碩。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的特 異性 HCV 受體主要包括:CD81，SR-BI，Claudin-l (CLDN1)和 Occludin (0CLN)。CD81 分子屬 于四次跨膜蛋白家族成員之一，主要通過其胞外區(qū)與HCV囊膜蛋白E2相互作用，完成介導(dǎo) 病毒侵入宿主細(xì)胞(Pileri P,Uematsu Y,Campagnoli S,Galli G,Falugi F,Petracca R, ffeiner AJ, Houghton M,Rosa D,Grandi G, Abrignani S.Binding of hepatitis C virus to CD81. Science. 1998 Oct 30 ；282 (5390) :938_41.)。El 與 E2 結(jié)合為異源二聚體后具 有增強(qiáng) E2 與 CD81 結(jié)合的能力。SR-BI (Scavengerrec印tor class B type I)為由 509 個(gè) 氨基酸組成的二次跨膜蛋白，具有一個(gè)大的胞外區(qū)，其胞外區(qū)含9個(gè)糖基化位點(diǎn)。SR-BI主 要與 HCV 的 E2 結(jié)合(Scarselli, E. , Ansuini, H. , Cerino, R. , Roccasecca, R. M. , Acali, S. , Filocamo, G. , Traboni, C. , Nicosia, A. ,Cortese,R.and Vitelli, A. (2002)The human scavenger receptorclass B type I is a novel candidate receptor for the hepatitis C virus. EMB0J. 21，5017-5025.)。此外有證據(jù)表明SR_BI也可作為乙?；脱趸牡兔芏?脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDLs)的受體，而HDLs等脂蛋白可通過SR-BI促進(jìn)HCV的 感染。需要著重指出的是四次跨膜蛋白CLDm作為細(xì)胞緊密連接(Tight junction)的 組分之一，2007年被美國洛克菲勒大學(xué)的Rice博士及其同事報(bào)道可以作為HCV的新的輔助
(Evans MJ, von Hahn T, Tscherne DM, Syder AJ, Panis M,WolkB, Hatziioannou T, McKeating JA, Bieniasz PD, Rice CM. Claudin—1 is a hepatitisC virus co-receptor required for a late step in entry. Nature. 2007 Aprl2 ；446 (7137) :801_5.)。盡管過 表達(dá)CUM1可以使得HCV進(jìn)入非敏感細(xì)胞系293T，但仍有一系列相關(guān)問題等待回答HCV的 囊膜蛋白是否可以與CUM1相互作用？為什么一些非敏感細(xì)胞(如HeLa)在過表達(dá)CLDW 后HCV仍然無法進(jìn)入？另外，關(guān)于CUM1介導(dǎo)HCV進(jìn)入的分子機(jī)理人們也知之甚少。目前， 針對HCV侵入的抑制劑主要集中于抗HCV囊膜蛋白和先前發(fā)現(xiàn)的受體CD81和SR-BI的中 和抗體。鑒于HCV新受體CLDm、0CLN以及細(xì)胞Tight junction結(jié)構(gòu)在HCV進(jìn)入宿主細(xì)胞 過程中可能發(fā)揮的重要作用，同時(shí)，為了延續(xù)對HCV受體的一些創(chuàng)新性研究，迫切需要得到 針對HCV新受體的較短氨基酸序列的多肽類病毒侵入抑制劑。這一類多肽類抑制劑應(yīng)具有 易合成、靶點(diǎn)明確、副作用小、對多種基因型病毒有效的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供抑制丙型肝炎病毒侵入的多肽。本發(fā)明提供的抑制丙型肝炎病毒侵入的多肽，為如下十種多肽中的任意一種多肽i 氨基酸序列如序列表的序列1所示；nh2-managlqllgfilaflgw-cooh ；多肽ii 氨基酸序列如序列表的序列2所示；nh2-llgfilaflgwigaivst-cooh ；多肽iii 氨基酸序列如序列表的序列3所示；nh2-filaflgwigaivstalp-cooh ；多肽iv 氨基酸序列如序列表的序列4所示；nh2-aflgwigaivstalpqwr-cooh ；多肽v 氨基酸序列如序列表的序列5所示；nh2-gwigaivstalpqwriys-cooh ；
多肽vi 氨基酸序列如序列表的序列6所示；nh2-gaivstalpqwriysyag-cooh ；多肽vii 氨基酸序列如序列表的序列7所示；nh2-managlqllgfilafl-cooh ；多肽viii:氨基酸序列如序列表的序列8所示；
nh2-managlqllgfilaflgwig-cooh ；多肽ix 氨基酸序列如序列表的序列9所示；nh2-managlqllgfilaflgwigai-cooh 多肽x 氨基酸序列如序列表的序列10所示；nh2-managlqllgfilaflgwigaivs-co oh。本發(fā)明還保護(hù)所述多肽的衍生物，為如下⑴或(2)、(1)將所述多肽進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入和/或替換和/或缺失，得到的衍生 物；(2)將所述多肽或(1)所述衍生物與載體聯(lián)接，得到的衍生物。將所述多肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基用構(gòu)象為D-型的氨基酸、自然界存在的 稀有氨基酸或人工修飾的氨基酸替換，可以增加生物利用度及提高抗病毒活性。所述載體 包括但不局限于多肽串聯(lián)體、蛋白質(zhì)、聚乙二醇和脂類物質(zhì)等。所述多肽或所述多肽的衍生 物，可直接或與其它分子偶聯(lián)用于制備抑制多種包膜病毒感染的藥物，或作為先導(dǎo)肽開發(fā) 為新型抗病毒藥物。所述多肽或所述衍生物在制備丙型肝炎病毒侵入抑制劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)一種丙型肝炎病毒侵入抑制劑，它的活性成分為所述多肽或所述衍 生物。所述丙型肝炎病毒可為H77基因型(la)的丙型肝炎病毒、Conl基因型(lb)的丙 型肝炎病毒或JFH1基因型(2a)的丙型肝炎病毒。所述H77基因型(la)的丙型肝炎病毒 具體可為基因組DNA中具有序列表的序列11所示DNA的丙型肝炎病毒；所述Conl基因型 (lb)丙型肝炎病毒具體可為基因組DNA中具有序列表的序列12所示DNA的丙型肝炎病毒； 所述JFH1基因型(2a)的丙型肝炎病毒具體可為基因組DNA中具有序列表的序列13所示 DNA的丙型肝炎病毒。所述多肽或所述衍生物在制備治療或預(yù)防丙型肝炎的藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)一種治療或預(yù)防丙型肝炎的藥物，它的活性成分為所述多肽或所述 衍生物。本發(fā)明多肽可以直接單獨(dú)用于hcv感染的治療，也可以與已知的一種或多種抗 hcv藥物聯(lián)合使用，這些藥物包括但不限于干擾素、利巴韋林等。本發(fā)明以hcv病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的受體為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)了抑制性多肽文庫，篩選獲得 了具有較強(qiáng)的抗病毒活性的候選抑制多肽。對候選多肽序列與結(jié)構(gòu)進(jìn)行重頭設(shè)計(jì)和優(yōu)化 后，得到一系列具有抗hcv活性的多肽。這些多肽既能抑制hcv假病毒又能抑制感染性hcv 病毒，其主要作用靶點(diǎn)為阻斷病毒與其受體的結(jié)合而抑制病毒的早期進(jìn)入。本發(fā)明所提供的多肽在有機(jī)相或接觸到脂質(zhì)雙分子層等膜結(jié)構(gòu)時(shí)，具有典型的a 螺旋結(jié)構(gòu)。
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本發(fā)明所提供的多肽具有下述優(yōu)點(diǎn)(1)制備方便由16-24個(gè)氨基酸殘基組成，相對較短，既可以通過化學(xué)合成的方 法制備，也便于通過重組表達(dá)的方式制備。(2)多肽序列和作用位點(diǎn)與現(xiàn)有HCV侵入抑制劑不同本發(fā)明所提供的多肽作用 靶點(diǎn)明確，為特異性地抑制HCV病毒囊膜與宿主受體CLDrn的相互作用。(3)不易產(chǎn)生耐藥性由于本發(fā)明提供的多肽序列來源于人類蛋白CUM1，而非來 源于HCV病毒囊膜蛋白，因此其對多種基因型(亞型)的HCV具有抑制作用。


圖1為各種受體來源的多肽文庫對HCV假病毒侵入效率的影響。圖2為多肽1的圓二色譜圖。圖3為多肽1對H77基因型(la)的HCVpp假病毒的侵入抑制能力。圖4為多肽1對Conl基因型(lb)的HCVpp假病毒的侵入抑制能力。圖5為多肽1對JH11基因型(2a)的HCVpp假病毒的侵入抑制能力。圖6為多肽1處理Huh7細(xì)胞后，免疫熒光染色檢測HCV受體Claudin-1的亞細(xì)胞 定位；結(jié)果表明多肽1處理并不影響細(xì)胞表面受體Claudin-1的表達(dá)水平及其定位。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。293T細(xì)胞購自美國典藏細(xì)胞庫ATCC，目錄號CRL_11268。Huh7細(xì)胞(肝癌細(xì)胞 系)購自美國Apath公司。質(zhì)粒PNL4.3-LUC-R-E—購自美國國立衛(wèi)生研究院艾滋病研究與 參比試劑計(jì)劃(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)。HepG2:購自美國 典藏細(xì)胞庫ATCC。胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司，轉(zhuǎn)染試劑購自Giantagen 公司。一次性細(xì)胞培養(yǎng)板以及移液管等耗材購自Corning公司。實(shí)施例1、抗病毒多肽的設(shè)計(jì)抗病毒多肽的設(shè)計(jì)原理如下。HCV感染宿主的首要環(huán)節(jié)是病毒的E1和E2囊膜蛋白依次與宿主細(xì)胞表面受體 SR-BI、⑶81、CLDm和0CLN相互作用，通過細(xì)胞內(nèi)吞與膜融合作用完成病毒感染的第一步。 理論上，細(xì)胞表面受體的特定區(qū)域具有結(jié)合HCV囊膜蛋白的能力，通過多肽文庫篩選的方 法，可以得到相應(yīng)的競爭性多肽。鑒于以上實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性，以HCV受體SR-BI、⑶81、CUM1和0CLN的氨基酸序 列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)多肽文庫，每條多肽長18個(gè)氨基酸，相鄰的兩條多肽具有5個(gè)氨基酸的重復(fù) 區(qū)域(overlap)。多肽文庫共包含113條多肽。以假病毒(HCVpp)和Huh7肝癌細(xì)胞系為篩選模型， 對113條多肽(初篩濃度為50PM)進(jìn)行抗病毒篩選，獲得2條抗病毒活性>90%的多肽 (多肽1和多肽2)，分別位于受體CUM1的N端(見圖1)。圖1為多肽文庫篩選示意圖；圖中的受體1-4分別代表HCV受體CD81、SR-BI、CLDN1和0CLN ；其中58號和59號兩個(gè)多 肽顯示出良好的抗病毒活性。多肽1 (CL58) :MANAGLQLLGFILAFLGW ；多肽4(CL58.4) :AFLGffIGAIVSTALPQffR0其中，多肽1在50 ii M的處理濃度下的抑制效率> 99%，而多肽4的抑制效果較 CL58稍差，在50 iiM的終濃度下的抑制效率> 90%。根據(jù)以上兩條多肽的序列，對多肽1和多肽4的氨基酸序列進(jìn)行重頭設(shè)計(jì)和優(yōu)化， 得到10條多肽，見表1。表110條多肽的氨基酸序列 以后各個(gè)實(shí)施例中的多肽1、多肽2、多肽3、多肽4、多肽5、多肽6、多肽7、多肽8、 多肽9和多肽10均指的是表1中的各條多肽。實(shí)施例2、多肽的合成及其化學(xué)性質(zhì)測定一、多肽1和對照多肽的合成1、多肽1的合成由美國Genscript公司通過化學(xué)方法合成多肽1。用DMS0溶解多肽1，配制成10mM 的儲備液，_20°C冷凍保存。2、對照多肽的合成對照多肽(NH2-多肽-C00H):SWLRDIWDWICEVLSDH(。對照多肽同樣為來源于CUM1的序列，在原始多肽文庫中的序號為60號，位置緊鄰58號和59號多肽，在58號和59號多肽的C端；經(jīng)過篩選，對照多肽對HCV的侵入不具 有任何影響。由美國Genscript公司通過化學(xué)方法合成對照多肽。用DMS0溶解對照多肽，配制 成10mM的儲備液，-20°C冷凍保存。二、多肽1的物理化學(xué)性質(zhì)(圓二色譜分析)1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^測定多肽1的螺旋度或螺旋含量，確定多肽1可能的二級結(jié)構(gòu)。2、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及方法利用Jasco J-720 圓二色譜(CD)儀(Jasco，Easton, MD)，在 25 °C溫和條件下 (50mMKH2P04/K2HP04/100mM KC1，pH7)，和含有 50% a -螺旋誘導(dǎo)試劑 2，2，2-三氟乙醇 (TFE)的條件下(50mM KH2P04/K2HP04/100mM KC1，pH7 緩沖液/50% TFE)，分別測定多肽 1 的平均殘基摩爾橢圓度系數(shù)。將500 u M的多肽存儲母液經(jīng)過10倍稀釋以后加入到0. 02cm 石英測試管中，通過190到250nm的掃描得到產(chǎn)物多肽的橢圓度系數(shù)。在222nm波長下測 定得到的多肽摩爾橢圓度系數(shù)被用于評估多肽的a“螺旋性。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果典型的a -螺旋在⑶圖上顯示為208nm和222nm處有雙負(fù)峰。從圖2中可以看 出，多肽1在含50% TFE條件下，在208nm和222nm處出現(xiàn)雙負(fù)峰。表明多肽1在疏水相中 (例如含有膜的結(jié)構(gòu))具有螺旋構(gòu)象，而在水溶液中(Buffer)則為無序構(gòu)象。用實(shí)施例2制備的多肽進(jìn)行后續(xù)實(shí)施例的檢測。實(shí)施例3、多肽1對病毒侵入的抑制能力一、各種基因型的HCVpp假病毒的制備1、H77基因型(la)的HCVpp假病毒的制備(1)重組質(zhì)粒的制備根據(jù)HCVdb數(shù)據(jù)庫(http://www. hcvdb. org)中的序列，由Genscript公司合成序 列表的序列11所示的H77基因。通過Hindlll和EcoRI酶切識別位點(diǎn)，將序列11所示的 H77基因插入載體質(zhì)粒pcDNA3(Invitrogen)，得到重組質(zhì)粒pcDNA3_H77 (H77基因克隆于 CMV啟動子下游)。(2)H77基因型的HCVpp假病毒的制備293T細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前一天接種于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密 度為50 %。 以pNL4. 3-Luc-RT"質(zhì)粒和pcDNA3_H77共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，其中 pNL4. 3-Luc-RI pcDNA3_H77 轉(zhuǎn)染試劑的量為 15 ii g 15u g 60u L0 轉(zhuǎn)染后 48 小 時(shí)收取病毒上清(HCVpp)，以0. 45 y M濾器過濾分裝，保存于-80°C。2、Conl基因型(lb)的HCVpp假病毒的制備(1)重組質(zhì)粒的制備根據(jù)HCVdb數(shù)據(jù)庫(http //www. hcvdb. org)中的序列，由Genscript公司合成序 列表的序列12所示的Conl基因。通過Hindlll和EcoRI酶切識別位點(diǎn)，將序列12所示的 Conl基因插入載體質(zhì)粒pcDNA3，得到重組質(zhì)粒pcDNA3_Conl (Conl基因克隆于CMV啟動子 下游)。(2) Conl基因型的HCVpp假病毒的制備
同步驟1的(2)。3、JFH1基因型(2a)的HCVpp假病毒的制備(1)重組質(zhì)粒的制備根據(jù)HCVdb數(shù)據(jù)庫(http://www. hcvdb. org)中的序列，由Genscript公司合成序 列表的序列13所示的JFH1基因。通過Hindlll和EcoRI酶切識別位點(diǎn)，將序列13所示的 JFH1基因插入載體質(zhì)粒pcDNA3，得到重組質(zhì)粒pcDNA3-JFHl (JFH1基因克隆于CMV啟動子 下游)。。(2) JFH1基因型的HCVpp假病毒的制備同步驟1的(2)。將pcDNA3-H77、pcDNA3_Conl 和 pcDNA3_JFHl 統(tǒng)稱為 HCV 囊膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3-ElE2。二、多肽1對病毒的抑制能力1、HCV假病毒侵入實(shí)驗(yàn)①假病毒包裝293T細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前一天接種于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度為 50 %。以 pNL4. 3-Luc-RT"質(zhì)粒和 pcDNA3_ElE2 質(zhì)粒(pcDNA3_H77、pcDNA3_Conl 或 pcDNA3-JFHl)共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，其中 pNL4. 3-Luc-ITE- pcDNA3_ElE2 轉(zhuǎn)染試劑的量為 15ug 15ug 60iiL。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收取病毒上清(HCVpp)，以0.45 iiM濾器過濾分 裝，保存于-80°C。②假病毒侵入實(shí)驗(yàn)將Huh7細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)至90%匯合密度；取100 u L步驟①得到的病 毒上清與各個(gè)濃度(0、5、10、15、20i!M)的多肽1混合，然后加入Huh7細(xì)胞進(jìn)行感染，48小 時(shí)后裂解細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(檢測試劑購自Promega公司，儀器為Turner BioSystems 公司的 Modulus Microplate Luminometer)。結(jié)果如圖3、圖4和圖5所示，多肽1(CL58)對于在我國的HCV主要流行株la、lb 和2a亞型的病毒均有明顯的抑制作用。實(shí)施例4、抗病毒多肽的半數(shù)有效量1、H77基因型的HCVpp假病毒的制備同實(shí)施例3的步驟一的1。2、半數(shù)有效量測定取100 y L步驟1制備的病毒上清分別與各個(gè)多肽混合均勻(每種多肽分別設(shè)置 若干濃度；多肽終濃度分別為 20iiM、10iiM、5iiM、2. 5iiM、l. 25iiM、0. 625iiM、0. 3125uM 和0 y M)，將混合物加入肝癌細(xì)胞系Huh7中感染3小時(shí)，更換新鮮含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基(Invitrogen公司購買)繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，利用熒光素酶檢測系統(tǒng)(購自Promega 公司)進(jìn)行病毒感染效率的測定。結(jié)果見表2。表210條多肽的IC50值 實(shí)施例5、多肽1對肝癌細(xì)胞系Huh7以及H印G2、293T細(xì)胞等的細(xì)胞毒性利用MTT檢測試劑盒(購自Promega公司)分別分析多肽1對各種細(xì)胞(肝癌細(xì) 胞系Huh7、HepG2和293T)的細(xì)胞毒性等細(xì)胞的細(xì)胞毒性分析。對每種細(xì)胞的分析方法如 下細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中至細(xì)胞密度達(dá)到50%， 取不同終濃度的多肽1(211] 、411]\1、811]\1、1611]\1、3211]\1、6411]\1和 128 yM)處理上述細(xì)胞 48 小時(shí)，按照Promega公司試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定細(xì)胞毒性。結(jié)果多肽1對于肝癌細(xì)胞系Huh7、IfepG2和293T等細(xì)胞的毒性(半數(shù)致死劑量) 均大于100 PM。實(shí)施例6、多肽1的抗病毒機(jī)理研究由于多肽1的序列來源于HCV的受體CUM1，為深入研究多肽1抑制HCV侵入的 機(jī)制，探討多肽1的抗病毒活性是否由于改變了受體CLDm的亞細(xì)胞定位而造成的，分別用 20 uM的多肽1和相同體積的溶劑DMS0作為對照處理Huh7細(xì)胞24小時(shí)后，利用免疫熒光 染色的方法分析CUM1的細(xì)胞定位情況。細(xì)胞接種于含玻片的96孔板中，進(jìn)行相應(yīng)處理。處理結(jié)束后，以PBS洗滌細(xì)胞3 次，采用2%的多聚甲醛固定細(xì)胞后，以Triton-XlOO處理通透細(xì)胞3次，每次10分鐘。分 別以抗Claudin-1的抗體和FITC熒光標(biāo)記二抗進(jìn)行細(xì)胞染色，細(xì)胞核以DAPI標(biāo)記。通過 Leica TCS SP5采集圖像。結(jié)果如圖6所示，多肽1處理Huh7肝癌細(xì)胞不改變HCV受體CUM1的表達(dá)量及亞 細(xì)胞定位。其中DMS0處理作為陰性對照。兩種處理后CUM1蛋白仍然定位于細(xì)胞緊密連 接處(Tight Junction) 0這一結(jié)果說明多肽1的作用靶點(diǎn)并不在宿主，因此其細(xì)胞毒性可 能極低。
權(quán)利要求
如下十種多肽中的任意一種多肽I氨基酸序列如序列表的序列1所示；多肽II氨基酸序列如序列表的序列2所示；多肽III氨基酸序列如序列表的序列3所示；多肽IV氨基酸序列如序列表的序列4所示；多肽V氨基酸序列如序列表的序列5所示；多肽VI氨基酸序列如序列表的序列6所示；多肽VII氨基酸序列如序列表的序列7所示；多肽VIII氨基酸序列如序列表的序列8所示；多肽IX氨基酸序列如序列表的序列9所示；多肽X氨基酸序列如序列表的序列10所示。
2.權(quán)利要求1所述多肽的衍生物，為如下⑴或(2)(1)將權(quán)利要求1所述多肽進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入和/或替換和/或缺失，得到 的衍生物； (2)將權(quán)利要求1所述多肽或(1)所述衍生物與載體聯(lián)接，得到的衍生物。
3.權(quán)利要求1所述多肽或權(quán)利要求2所述衍生物在制備丙型肝炎病毒侵入抑制劑中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述丙型肝炎病毒為H77基因型的丙型肝 炎病毒、Conl基因型的丙型肝炎病毒或JFHl基因型的丙型肝炎病毒。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述H77基因型的丙型肝炎病毒為基因組 DNA中具有序列表的序列11所示DNA的丙型肝炎病毒；所述Conl基因型的丙型肝炎病毒 為基因組DNA中具有序列表的序列12所示DNA的丙型肝炎病毒；所述JFHl基因型的丙型 肝炎病毒為基因組DNA中具有序列表的序列13所示DNA的丙型肝炎病毒。
6.一種丙型肝炎病毒侵入抑制劑，它的活性成分為權(quán)利要求1所述多肽或權(quán)利要求2 所述衍生物。
7.如權(quán)利要求6所述的抑制劑，其特征在于所述丙型肝炎病毒為H77基因型的丙型 肝炎病毒、Conl基因型的丙型肝炎病毒或JFHl基因型的丙型肝炎病毒。
8.如權(quán)利要求7所述的抑制劑，其特征在于所述H77基因型的丙型肝炎病毒為基因 組DNA中具有序列表的序列11所示DNA的丙型肝炎病毒；所述Conl基因型的丙型肝炎病 毒為基因組DNA中具有序列表的序列12所示DNA的丙型肝炎病毒；所述JFHl基因型的丙 型肝炎病毒為基因組DNA中具有序列表的序列13所示DNA的丙型肝炎病毒。
9.權(quán)利要求1所述多肽或權(quán)利要求2所述衍生物在制備治療或預(yù)防丙型肝炎的藥物中 的應(yīng)用。
10.一種治療或預(yù)防丙型肝炎的藥物，它的活性成分為權(quán)利要求1所述多肽或權(quán)利要 求2所述衍生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制丙型肝炎病毒侵入的多肽。本發(fā)明提供如下十種多肽多肽I如序列表的序列1所示；多肽II如序列2所示；多肽III如序列3所示；多肽IV如序列4所示；多肽V如序列5所示；多肽VI如序列6所示；多肽VII如序列7所示；多肽VIII如序列8所示；多肽IX如序列9所示；多肽X如序列10所示。本發(fā)明的多肽有下述優(yōu)點(diǎn)由16-24個(gè)氨基酸組成，相對較短，既可通過化學(xué)合成，也便于通過重組表達(dá)制備；多肽序列和作用位點(diǎn)與現(xiàn)有HCV侵入抑制劑不同，靶點(diǎn)明確，特異性抑制HCV病毒囊膜與宿主受體CLDN1的相互作用；不易產(chǎn)生耐藥性由于本發(fā)明提供的多肽序列來源于人類蛋白CLDN1，非HCV病毒囊膜蛋白，對多種基因型的HCV具有抑制作用。
文檔編號C07K7/08GK101851274SQ201010136368
公開日2010年10月6日 申請日期2010年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月29日
發(fā)明者楊威 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所