專利名稱：：單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于分子生物學領域并涉及熱力學穩(wěn)定的單鏈蛋白，所述蛋白在水性溶液中基本上由三鏈，反向平行的α-螺旋卷曲型螺旋支架結構構成。這樣的分子非常穩(wěn)定，并對氨基酸取代具有耐受性。因此，它們滿足基于蛋白質(zhì)的支架的基本要求。這種表現(xiàn)出治療、診斷和/或純化能力的支架可用于藥物發(fā)現(xiàn)、分析研究、純化
技術領域：
，并可用作模型改進新的蛋白類(類似蛋白的)支架結構的設計?；诘鞍踪|(zhì)的支架分子通常被認為是“下一代”用于分子識別的化合物類型，其與基于免疫球蛋白的化合物進行著越來越多的競爭。因此，本發(fā)明的化合物提供了免疫球蛋白的可替代方法以及另一種類型的基于蛋白質(zhì)(蛋白類)支架。
背景技術：
：三鏈α-螺旋卷曲型螺旋復合物(卷曲型螺旋結構、卷曲型螺旋)是通過個體(獨立的、單體、游離的)肽分子在溶液中結合(聚在一起)成三聚物(3分子復合物)而形成的。個體肽典型地包含一個或多個七殘基重復序列(七個一組的單元，七殘基)，其為這種結合提供了熱力學驅(qū)動力。三聚復合物的形成在實際中所遇到重要問題是這種反應極其依賴于濃度這一事實。因此，除非熱力學驅(qū)動力極強(即除非七殘基形成極緊密的相互作用)，否則人們必須使用相對高的濃度才能使三聚復合物形成。當施用藥物化合物(作為藥物化合物給藥)時，高濃度可能具有大量不利效應。與三聚復合物相反，本發(fā)明的單鏈卷曲型螺旋結構的形成(折疊)不依賴于它們在溶液中的濃度。因此，本發(fā)明意圖為濃度依賴性問題提供解決方案。第二個與使用肽寡聚(多聚)復合物相關的問題是通過重組技術(即使用分子生物學技術)難以產(chǎn)生(合成)組成肽。這與理想地適合于重組合成的穩(wěn)定折疊單鏈蛋白形成對比。因此，本發(fā)明為與合成肽形式的三聚卷曲型螺旋支架相關的技術問題提供了解決方案。第三，本發(fā)明旨在為產(chǎn)生異源三聚卷曲型螺旋結構的問題提供實用的解決方案。肽卷曲型螺旋的寡聚性質(zhì)一般由結合的肽的數(shù)量(例如對于二聚、三聚、四聚復合物來說分別為2、3、4個)、它們的相互取向(例如平行或反向平行)及其化學相似性(即它們的具有任選衍生化的氨基酸序列；例如同三聚體卷曲型螺旋由三個相同肽形成，異源三聚體卷曲型螺旋包含至少一種不同序列或衍生的肽)所決定。寡聚卷曲型螺旋可以通過將不相同的肽在水性溶液中混合來獲得。然后，在足夠長的溫育時間后，將形成同聚和異聚卷曲型螺旋的分布，其主要取決于后者的熱力學適合度(穩(wěn)定性、自由能、結合質(zhì)量)。由于存在于熱力學適合度基礎上的復雜的原子相互作用以及由此產(chǎn)生的寡聚物偏好性(分布)，產(chǎn)生特定的所需類型的異聚卷曲型螺旋在技術上難以控制。就此而言，本發(fā)明為技術難題提供了實用的解決方案因為形成卷曲型螺旋的肽片段共價連接在一起形成單鏈(通過適當選擇的連接物片段)，它們形成預定(所需)性質(zhì)卷曲型螺旋結構的傾向與由自由肽集合物構成的等價的卷曲型螺旋相比，大大增加了。因此，特定異聚(例如異源三聚)卷曲型螺旋的構建大大簡化。此外，單鏈卷曲型螺旋格式還提供了避免形成不想要的(例如無功能的)結合類型(或極大減少其風險)的優(yōu)點?？偟膩碚f，適用于本發(fā)明的所有實施方案的單鏈格式，為控制和保留其中形成卷曲型螺旋的肽片段的氨基酸序列(任選地)不同的三聚卷曲型螺旋的折疊特異性提供了實用解決方案。本發(fā)明的所有實施方案涉及“單鏈”并且“三鏈的”α-螺旋卷曲型螺旋結構。為了清楚起見，在這里進行解釋(并且將在下文進一步詳細討論)，性質(zhì)“單鏈”是指本發(fā)明的完整分子，而性質(zhì)“三鏈”是指這些分子中的α-螺旋卷曲型螺旋部分。當使用描述“單鏈卷曲型螺旋”時，它應該被解釋為由(兩個)結構撓性的連接物片段共價互連的(三個)形成卷曲型螺旋的肽片段之間的緊密結合；所述肽和連接物片段一起形成了由單個連續(xù)的氨基酸鏈構成的一個蛋白分子。本發(fā)明的單鏈卷曲型螺旋蛋白也是單體(溶液中的單體蛋白分子)，其不與包含在每個這種蛋白中的卷曲型螺旋結構的三聚性質(zhì)相混淆。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(ProteinDataBank)(在后文中稱為PBD)中的絕大多數(shù)三鏈卷曲型螺旋結構是平行卷曲型螺旋，即“平行的α-螺旋肽”類型。這意味著卷曲型螺旋作為每個結構三個α-螺旋肽的復合物(非共價結合)存在，并且其中螺旋以平行構型(取向)定向。在很少情況下，三個α-螺旋中的一個與其他兩個(其彼此平行)的走向反向平行。這種反向平行排列方式在天然蛋白中是罕見的，并且在由常規(guī)七殘基重復基序構成并穩(wěn)定化的規(guī)則卷曲型螺旋結構形式中還未發(fā)現(xiàn)過。表1顯示了來自PDB的179個肽三鏈卷曲型螺旋復合物的詳細清單，其中175個是平行的，只有4個是反向平行的。這表明對于肽三聚卷曲型螺旋來說，平行取向是最穩(wěn)定的構型。平行構型大量存在的可能原因是保留3折疊對稱性，其允許最大的數(shù)量的最適接觸。相反，本發(fā)明的所有實施方案涉及采用反向平行取向的單鏈卷曲型螺旋。由于PDB中反向平行三鏈卷曲型螺旋結構的實例非常稀少，這種結構的設計和產(chǎn)生絕對不是顯而易見的。例如，這項工作不僅由于缺少代表性模板(示例)結構而變得復雜，而且事先也不清楚是否能夠開發(fā)出與平行三鏈卷曲型螺旋中觀察到的具有相當質(zhì)量的核心相互作用的反向平行卷曲型螺旋。有鑒于此，本發(fā)明的一個主要創(chuàng)造性方面是出人意料地發(fā)現(xiàn)可以獲得高度穩(wěn)定的反向平行三鏈卷曲型螺旋。這表明常規(guī)七殘基重復位置處的核心殘基在反向平行構型中也能制造準最優(yōu)的相互作用，這在以前是未知的。發(fā)明概述本發(fā)明人構建了預期以平行構型折疊的單鏈的三鏈卷曲型螺旋蛋白結構，但是具有明顯太短而不允許這種類型折疊的連接物片段。出人意料的是，發(fā)現(xiàn)后面的構建物與具有非常長連接物的變體具有相同的物理性質(zhì)(α-螺旋含量、熱穩(wěn)定性、溶解性等)。盡管一般來說具有物理上太短的連接物的構建物使結構不能折疊，但本發(fā)明的三聚支架結構出人意料地在明顯偏離生理條件的條件下，例如在8Μ尿素中或在超過90°C的溫度下表現(xiàn)出高的熱穩(wěn)定性，并且這種現(xiàn)象與連接物長度無關。這些發(fā)現(xiàn)有力地表明本發(fā)明的分子折疊成反向平行構型。后者也通過NMR波譜學得到證實。因此，這種新的卷曲型螺旋結構對于許多基于支架的應用來說極有價值。本發(fā)明涉及一類新的式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的單鏈蛋白，其中HRS1、L1、HRS2、L2和HRS3表示共價互連的氨基酸序列片段，并且其中a)片段HRSl、HRS2和HRS3是七殘基重復序列，并且b)片段Ll和L2是結構撓性的連接物序列；并且其中所述蛋白在水性溶液中通過HRS1、HRS2和HRS3片段自發(fā)折疊形成三鏈反向平行的α-螺旋卷曲型螺旋結構。用更明確的方式陳述，本發(fā)明涉及一類新的、分離的、優(yōu)選非天然的式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的單鏈蛋白，其中HRSl、Li、HRS2、L2和HRS3表示共價互連的氨基酸序列片段，所述蛋白在水性溶液中通過HRS1、HRS2和HRS3片段自發(fā)折疊形成三鏈反向平行的α-螺旋卷曲型螺旋結構，并且其中a)HRSUHRS2和HRS3各自獨立地是七殘基重復序列，其特征為由(a-b-C-d-e-f-g-)n或(d-e-f-g-a-b-C-)n所表示的η次重復的7殘基氨基酸類型序列模式，其中序列模式的元件“a”到“g”表示所述氨基酸類型所處的常規(guī)七殘基位置，并且η是等于或大于2的數(shù)字，并且b)常規(guī)七殘基位置“a”和“d”主要被疏水氨基酸類型占據(jù)，常規(guī)七殘基位置“b”、“c”、“e”、“f”和“g”主要被親水氨基酸類型占據(jù)，得到的疏水和親水氨基酸類型之間的分布能夠鑒定所述七殘基重復序列，并且c)Ll和L2各自獨立地是由1至30個氨基酸殘基構成的連接物，該連接物包括不能明確指派給七殘基重復序列的任何氨基酸殘基。附圖簡述圖1顯示了包含七殘基重復的合成肽的氨基酸序列。氨基酸序列用單字母表示法顯示，其中A表示丙氨酸、I表示異亮氨酸、Q表示谷氨酰胺、K表示賴氨酸。肽包含七殘基重復序列(HRx)、核心殘基(黑框)、非核心殘基(灰框)和側翼區(qū)域(白框)。肽還包含標記為“t”的C-端七殘基核心殘基。肽還包含分別標記為“N”和“C”的N-端和C-端側翼片段。每個七殘基重復序列殘基進一步用指數(shù)“a”到“g”和對應于七殘基重復序列個數(shù)的數(shù)字標注。核心殘基位于a-和d-位置。圖2顯示了三鏈α-螺旋卷曲型螺旋復合物的原理。圖提供了三鏈α-螺旋卷曲型螺旋結構的螺旋輪狀表示。左圖顯示了平行卷曲型螺旋的頂視圖。右圖顯示了反向平行卷曲型螺旋的頂視圖。中圖顯示了七殘基重復序列位置的線性序列。為了清楚的原因，只顯示了一個七殘基重復序列。不同的陰影用于指示特定的拓撲位置。圖3顯示了通過圓二色性(CD)監(jiān)測的肽卷曲型螺旋的熱變性。顯示了肽Ac-MSIEEIQKQQAAIQKQIAAIQKQIYRMTP-NH2在5和90°C下的CD譜(分別為黑色和灰色曲線)。肽以292μM的濃度溶解在20mM磷酸鹽緩沖液(PBS)，150mMNaCl，pH7.2中。圖4顯示了通過⑶信號監(jiān)測的222nM的圖3的肽的可逆解折疊和折疊隨溫度的變化(顯示了上下掃描)。圖5顯示了圖4的熱解折疊曲線的其他熱力學分析。黑色曲線表示從圖4獲得的實驗數(shù)據(jù)，而白色曲線表示擬合曲線。理論(擬合)曲線通過實施例3中解釋的步驟獲得。擬合參數(shù)(擬合結果)列于圖5的右側?！稗D變T”對應于Tt，但是用攝氏度表示。參數(shù)“Δ”保持恒定在3.OkJπιοΓ1Γ1。參數(shù)“θΜ(Τ)”和“θτ(Τ)”作為T的線性函數(shù)進行處理，產(chǎn)生了由圖的右側標出的相應偏移和斜率所描述的點狀線?！癛MSResid.”表示實驗和理論數(shù)據(jù)點之間的差的均方根。圖6顯示了在與實施例3相同的條件下Q2al肽的樣品制備物的⑶熱掃描曲線。Q2al肽具有氨基酸序列Ac-MSIEEIQKQIAAIQKQIAAIQKQIYRMTP-NH2。上下掃描的結果分別顯示為黑色和灰色。圖7顯示了圖6的Q2al肽的分析性沉降平衡超離心結果。沉降曲線以每分鐘25000轉(rpm)獲得。該圖顯示了線性化光密度(OD)曲線與標記所指示的單體、二聚和三聚復合物的理論曲線的比較。圖8顯示了圖6的Q2al肽的靜態(tài)光散射結果。將200微升PBS中濃度為Img/ml的肽置于與紫外(UV)、折射率(RI)和靜態(tài)光散射(SLQ檢測器相連的Superdex7510/300GL凝膠過濾柱上。來自三個不同檢測器的信號(曲線)被相應標出。圖9顯示了形成本發(fā)明的特定實施方案的兩種蛋白的氨基酸序列。這兩種蛋白分別被稱為“scQ2aI_L8”和“scQ2aI_L16”。它們的完整氨基酸序列列于每個表圖的底部，在標志“完全”的右側。同一序列中的特定區(qū)段也顯示在頂部，以便于N-和C-端側翼區(qū)段(分別標記為“N”和“C”)、連接物區(qū)段(分別標記為“Li，，和“L2”)和實際七殘基重復序列(標記為“HRS1”、“HRS2”和“HRS3”)的鑒定。七殘基的和d_位置提供在最高一排中，以便于它們在七殘基重復序列中的鑒定。圖10顯示了scQ2aI_L16構建物的⑶熱掃描圖。對于該構建物，在20mMPBS,150mMNaCl,pH7.2中記錄掃描。圖11顯示了6MGuHCl中的scQ2aI_L16和scQ2aI_L8(分別標出)的熱變性，其以約30μM的蛋白濃度在PBS緩沖液中在222nm處通過⑶進行記錄。將熱掃描圖擬合于雙穩(wěn)態(tài)轉變模型并轉變成部分折疊蛋白。圖12顯示了形成本發(fā)明的具體實施方案的各種構建物的轉變溫度隨GuHCl(變性劑)濃度的變化。所述構建物被稱為“scQ2aI_L16”、“短_L6”、“短_L10”、“短_L14”和“短_L18”，并且相應的曲線分別標出。所述構建物的序列、產(chǎn)生它們的方法和實驗條件，在實施例5中進一步詳細描述。圖13顯示了構建物scQ2aI_L16和scQ2aI_L8(分別標出)的15N1HHSQCNMR波■；並圖14顯示了實施例6中解釋的自旋標記的scQ2aI_L16構建物的色氨酸-半胱氨酸雙突變體的NMR波譜的放大圖。對于未處理的樣品和維生素C處理的樣品(共振被相應標出)記錄了波譜。圖15顯示了平行和反向平行的3鏈單鏈卷曲型螺旋的分子模型(分別標出)。模型如實施例7中所解釋的進行制備。每個模型中的3個α-螺旋被標記為“Α”、“Β”和“C”，并分別表示該單鏈卷曲型螺旋中的七殘基重復序列HRS1、HRS2和HRS3。標記“Li”和“L2”指示相應的連接物區(qū)段?！癗t”和“Ct”分別指示每個構建物的N-和C-端。發(fā)明詳述在本發(fā)明的上下文中，術語“支架”是指特定的、構型(結構)和熱力學(熱學和化學)穩(wěn)定的蛋白類(類似蛋白或蛋白)分子，其具有由一個或多個蛋白或蛋白類多肽鏈構成的特定、固定的(不可變、不變的)三維(3-D，三級)結構(組成元件的空間排列)，所述結構對各個氨基酸殘基位置處的各種單和多氨基酸取代具有可證實的耐受性。概念“對氨基酸取代耐受”在本文中將被理解為在執(zhí)行所述氨基酸取代后結構的完整性(正確性)基本保持不變。顯然，蛋白中任何氨基酸取代將在某種程度上改變3-D結構，但是這種改變是不受限制的，并且如果突變的(被取代的)3_D結構的蛋白骨架(主鏈)保持與未突變(原始的、野生型)結構的結構可重疊性，這種改變在本文被認為是不重要的；如果兩種結構的至少70%的骨架原子(不包含氫原子)能夠以優(yōu)選低于1埃(IA)、較不優(yōu)選2A或3A的均方根(RMS)偏差重疊時，這兩種結構被認為是可重疊的。在其中結構重疊不可實行(例如如果兩種3-D結構不能獲得)的情況下，那么概念“對氨基酸取代耐受”將在熱力學意義上解釋如果取代使熱躍遷的中點(轉變溫度Tt，熔解溫度Tm，解折疊溫度Tu)與野生型相比降低優(yōu)選不超過10攝氏度(°C)、不太優(yōu)選時不超過20°C或30°C或40°C或50°C，并且在任何情況下不達到被取代蛋白在生理溫度(37°C)下定量解折疊的程度時，蛋白被認為對氨基酸取代耐受?！霸诟鱾€位置處對各種取代耐受”的性質(zhì)在本文中打算表示對至少5個不同氨基酸位置、更優(yōu)選10個位置或20個位置、最優(yōu)選所有氨基酸位置的約50%或更多的位置處的至少約10種不同氨基酸殘基耐受。通常被理解為支架分子的精華在于分子用作化學基團的載體。同樣，本文中的支架蛋白(或簡稱支架)是指用作氨基酸側鏈的載體的蛋白質(zhì)或蛋白類分子。它們也可以用作附著于它們的任一末端(即作為融合構建物的一部分)的其他蛋白質(zhì)或片段、結構域或肽的載體，但著不是在本發(fā)明的情形中所打算的意義。因為蛋白中的氨基酸側鏈附著于主鏈(骨架)上，折疊的骨架在形式上構成了化學上最純粹的支架形式。然而，純的蛋白骨架，其最接近的多肽類似物是聚甘氨酸，在溶液中不能穩(wěn)定折疊，因此不滿足有用支架的要求。因此，被部分或完全剝奪其側鏈的蛋白質(zhì)不形成本發(fā)明的主題。相反，本發(fā)明要求保護真實的蛋白質(zhì)，其采用給定的3-D折疊(在本發(fā)明情況下是單鏈的三鏈反向平行α-螺旋卷曲型螺旋結構)，并且即使在經(jīng)歷顯著數(shù)量的突變后仍以熱力學穩(wěn)定的方式采用這種折疊。因此，術語“支架”是指它們的結構和熱力學穩(wěn)健性而不是載體功能。本發(fā)明的蛋白分子可用作支架，與許多其他已發(fā)表的支架相似(綜述在SkerraLJMolRecognit2000，13167-187]，Binz等[NatBiotechnol2005，231257-1268]，Hosse等[ProteinSci2006，15:14-27]中)?！坝米髦Ъ堋钡母拍罨旧弦馕吨璺肿?例如具有某種官能性)可以從預先選擇的參比構建物(參比支架)獲得(衍生)。衍生的分子典型為參比支架的氨基酸取代或環(huán)取代的變體。在本
技術領域：
中，基于非免疫球蛋白蛋白的(蛋白類)支架分子被認為是用于分子識別的“下一代”化合物類型。它們主要源自于在優(yōu)選的物理化學性質(zhì)和可用的實驗數(shù)據(jù)的基礎上選擇的天然蛋白質(zhì)分子。這類化合物的實例列于Hosse等[ProteinSci2006，15:14-27]和Binz等[NatBiotechnol2005,23:1257-1268]中。本發(fā)明公開了特定類型的非免疫球蛋白蛋白分子，其具有用作蛋白支架的優(yōu)異性質(zhì)。因為它們的高穩(wěn)定性和結構穩(wěn)健性，可以構建具有基本上相同的三級結構和略微不同序列的分子的大型文庫(基于支架的文庫、支架文庫)?？蛇x地，通過使用標準的蛋白質(zhì)工程方法，可以改變表面殘基。利用本領域技術人員的知識，可以將適當選擇的方法應用于鑒定具有與免疫球蛋白類似的非常需要的結合性質(zhì)(例如親和性和特異性)的變體(支架衍生物、特定分子化合物)的目的?；诘鞍椎闹Ъ芊肿訐碛谐^免疫球蛋白的大量優(yōu)點，包括例如它們相對小的尺寸、高結構穩(wěn)定性和不存在翻譯后修飾。這些特點對于它們的合成、純化和儲存相當有利。此外，不需要進行免疫接種步驟就能產(chǎn)生高親和性化合物。本發(fā)明的蛋白支架體現(xiàn)了所有上面提到的特點，從而使它們特別適合于基于支架的應用。本發(fā)明涉及特定類型的基于蛋白的支架，其對表面殘基的取代和標準蛋白質(zhì)工程的作用非常不敏感。本發(fā)明的所有實施方案涉及到目前為止還未被用作可高度突變的蛋白支架的特定類型的蛋白結構(3-D結構，三級結構，折疊)，即在本發(fā)明的情況下為單鏈的三鏈反向平行α-螺旋卷曲型螺旋結構。本發(fā)明的蛋白具有基本上與免疫球蛋白相當?shù)膹V泛的可能應用范圍。更具體來說，特定的支架來源的突變體可能可用作治療化合物(例如抑制劑)、檢測探針(例如檢測重組蛋白)和純化探針(例如在親和層析中)，正如下文中詳細描述的。本發(fā)明的蛋白分子可能適合用作治療化合物。更具體來說，它們可以通過妨礙(阻斷、抑制)天然化學反應或天然分子識別事件、或通過產(chǎn)生非天然分子識別事件來干擾(影響、改變)生物學過程。生物學干擾的實例包括但不限于阻斷人類受體、與病原性物種結合以及與疾病或障礙相關的蛋白結合。這些類型的生物學干擾典型地打算用于治愈嚴重疾病或障礙。這些應用屬于治療性研究和開發(fā)領域。當前的治療性治療一般是基于藥理學或生物技術化合物，后者包括免疫球蛋白(來源的)或非免疫球蛋白化合物。兩種類型的生物技術化合物的生產(chǎn)、純化、測試和優(yōu)化一般是勞動密集、高風險和昂貴的。因此，對于具有特定生物活性的新的生物技術化合物以及用于生產(chǎn)、純化、測試和優(yōu)化這些化合物的改進的方法，存在著需求。本發(fā)明的蛋白分子可能適合用作檢測探針。在給定目標樣品(研究樣品)中應用特異性探測分子(探針)檢測目標被分析物(靶被分析物)的存在的實例，包括但不限于人類、動物、植物、細菌、病毒、生物技術或合成來源的樣品的實驗分析。這些樣品典型地包含能夠與所選探針分子特異性相互作用的生物分子(例如多肽、多核苷酸、多糖、激素、維生素或脂類，或其衍生物)。后者的相互作用典型地產(chǎn)生特征性(例如光譜學或放射活性)信號，表明了所述研究樣品中所述靶被分析物的存在。這些應用屬于分析研究和開發(fā)領域?？捎行в糜卺t(yī)學和生物技術應用的不同類型的探針和靶的組合的數(shù)量，事實上是不受限制的。由于這些領域的不斷發(fā)展，對于具有所需物理化學性質(zhì)(例如特異性、親和性、穩(wěn)定性、溶解性)的新的分析工具(例如探針)以及用于生產(chǎn)、純化、測試和優(yōu)化這些化合物的改進的方法，存在著持續(xù)的需求。本發(fā)明的蛋白分子可能適用于純化應用。在給定目標樣品(粗樣品)中使用特異性配體分子(配體)以留存(提取、分離、純化、過濾)其他目標分子(靶、靶被分析物)的實例，包括但不限于人類、動物、植物、細菌、病毒、生物技術或合成來源的樣品，其含有能夠與所選配體分子以高特異性相互作用(結合)的生物分子(例如多肽、多核苷酸、多糖、激素、維生素或脂類，或其衍生物)，其中后者從粗樣品分離或可以從粗樣品分離(例如通過附著到固相支持物上或通過沉淀)，用于從粗樣品共分離靶分子的目的。這些應用屬于純化
技術領域：
。純化方法的更具體的實例包括親和層析和免疫沉淀。由于這些領域的不斷發(fā)展，對于具有所需物理化學性質(zhì)(例如特異性、親和性、穩(wěn)定性、溶解性)的新的純化配體以及用于生產(chǎn)、純化、測試和優(yōu)化這些化合物的改進的方法，存在著持續(xù)的需求。本發(fā)明的蛋白支架分子折疊成α-螺旋卷曲型螺旋結構。α-螺旋卷曲型螺旋形成特定類型的3-D結構框架(結構基序、折疊)。卷曲型螺旋折疊發(fā)生在廣泛的各種蛋白中，包括動力蛋白、DNA結合蛋白、細胞外蛋白和病毒融合蛋白(例如Burlihard等，[TrendsCellBiol2001,11:82-88])。據(jù)估計，天然蛋白中所有氨基酸的3至5%或以上是卷曲型螺旋結構的一部分[Wolf等，ProteinSci1997,6:1179-1189]。卷曲型螺旋在功能上已被定性為折疊(組裝、寡聚化)基序，即卷曲型螺旋結構的形成在許多情況下驅(qū)動不同蛋白鏈的非共價結合。卷曲型螺旋在結構上被定性為以平行、反向平行或混合拓撲結構排列的α-螺旋的2_、3_、4-或5-鏈組裝體(例如Lupas[TrendsBiochemSci1996，21:375-382])。螺旋以左手或右手方式圍繞彼此輕微卷繞(盤繞、纏繞)，被稱為超螺旋。所有本發(fā)明的實施方案只涉及三鏈(3-鏈、三聚)卷曲型螺旋結構。已在氨基酸序列水平上對α-螺旋卷曲型螺旋進行了進一步定性，即每個螺旋由一系列七殘基重復序列構成。七殘基重復序列(七殘基單元、七殘基)是可以編碼為ΗρρΗρρρ的7殘基序列基序，其中每個“H”表示(可能不同的)疏水殘基，并且每個“P”是(可能不同的)極性殘基。偶爾(間或)，可以在H位置上觀察到ρ-殘基，反之亦然。七殘基重復序列也常常由序列模式a-b-c-d-e-f-g(abcdefg)或d-e-f-g-a-b-c(defgabc)編碼，其中指數(shù)“a”到“g”是指觀察到典型氨基酸類型的常規(guī)七殘基位置。按照慣列，指數(shù)“a”和“d”表示卷曲型螺旋中核心殘基(中心、被埋殘基)的位置。在核心a_和d-位置處觀察到的典型氨基酸類型是疏水氨基酸殘基類型；在所有其他位置(非核心位置)處，觀察到的主要是極性(親水性)殘基類型。因此，常規(guī)的七殘基序列模式“ΗρρΗρρρ”與序列模式表示法“abcdefg”匹配(“HpppHpp”序列模式與序列模式表示法“defgabc”匹配，這種表示法用于以d-位置處的疏水殘基開始的卷曲型螺旋)。本發(fā)明的所有實施方案，在卷曲型螺旋結構的每個α-螺旋中包括至少2個、優(yōu)選3個或更多個連續(xù)的(未中斷的)七殘基重復序列。螺旋中每個連續(xù)的七殘基重復序列系列被稱為“七殘基重復序列”(HRQ。如果可用，七殘基重復序列的起點和終點優(yōu)選在實驗測定的3維(3-D)結構的基礎上確定。如果3-D結構不可用，七殘基重復序列的起點和終點優(yōu)選在具有實際氨基酸序列的(HppHppp)n或(HpppHpp)n序列模式的最適重疊的基礎上確定，其中“H”和“ρ”分別表示疏水和極性殘基，并且其中“η”是等于或大于2的數(shù)字。然后將每個七殘基重復序列的起點和終點分別取為a-或d-位置處的第一個和最后一個疏水殘基。常規(guī)的H-殘基優(yōu)選選自纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、絲氨酸和丙氨酸，更優(yōu)選選自纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸，最優(yōu)選為異亮氨酸。常規(guī)的P-殘基優(yōu)選選自甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸。在這種簡單方法不能將氨基酸殘基明確指派給七殘基重復序列的情況下，可以使用更專門化的分析方法，例如Lupas等的COILS方法[Science1991，252:1162-1164；http//www,russell.embl~heidelberg.de/cgi-bin/coils-svr.pi]。已對卷曲型螺旋進行如下熱力學表征。當序列折疊成α-螺旋時，疏水殘基(H)形成疏水縫，而極性殘基(P)形成極性面。不同α-螺旋的疏水縫，當結合成卷曲型螺旋時，形成了中央疏水核心(中心、內(nèi)部、內(nèi)側部分)。該核心的形成與極性面朝向溶劑的取向相組合，被假定提供了穩(wěn)定結合所需的主要熱力學驅(qū)動力，盡管某些非核心殘基也可以增加穩(wěn)定性。本發(fā)明的所有實施方案涉及由每個α-螺旋至少兩個七殘基重復序列構成的三鏈卷曲型螺旋，并且其中七殘基重復序列的H-殘基形成疏水核心，并由此為結構的折疊提供了主要的熱力學驅(qū)動力。盡管依賴于寡聚化并因此具有高的濃度依賴性，但肽(非單鏈)3鏈卷曲型螺旋能夠表現(xiàn)出高的熱穩(wěn)定性。例如Suzuki等的亮氨酸拉鏈[ProteinEng1998,11=1051-1055]顯示出具有超過80°C的熔解(解折疊、轉變)溫度。同樣，Harbury等[Science1993，262:1401-1407；Nature1994,371:80-83]設計了源自于GCN4的三鏈卷曲型螺旋，被稱為GCN4-pII，其被發(fā)現(xiàn)在晶體和溶液中穩(wěn)定。此外，也已成功設計了異源三聚體平行卷曲型螺旋[Nautiyal和Alber，ProteinSci1999，8:84-90]。肽組裝成三聚平行構型的主要規(guī)律也已粗略了解[Yu,AdvDrugDelivRev2002,54:1113-1129]此外，國際申請PCT/EP2008/061886已經(jīng)要求保護非天然的、熱力學穩(wěn)定的蛋白類支架形式下的肽類3鏈卷曲型螺旋。本發(fā)明的分子還包含3鏈卷曲型螺旋結構，但是它們與肽類卷曲型螺旋(其形成三聚復合物)的基本區(qū)別在于它們由作為單體蛋白折疊的單一氨基酸鏈制成。盡管前面的描述可能表明3鏈平行卷曲型螺旋的設計相對直接，但許多研究已經(jīng)報道了嚴重的困難。例如，被設計為平行二聚體的卷曲型螺旋在晶體結構中被觀察到作為反向平行的三聚體[Lovejoy等，Science1993,2591288_1四3]。此外，對用于增加折疊動力學的引發(fā)序列的要求存在著爭論[仇，如上]。此外，熱解折疊過程不總是服從簡單的雙穩(wěn)態(tài)機制[Dragan和I^rivalov，JmolBiol2002,321:891-908]，并且組裝(折疊)過程有時非常慢[Dragan等，Biochemistry2004，4314891-14900]。因此，盡管關于平行卷曲型螺旋存在大量的實驗數(shù)據(jù)，但專業(yè)研究人員仍獲得許多預料之外的結果，由此看來可以得出結論，即使是平行α-螺旋卷曲型螺旋分子的設計和應用也絕不是顯而易見的。因此可以設想，反向平行卷曲型螺旋的開發(fā)將更為復雜。本發(fā)明人最初考慮使用肽類三鏈卷曲型螺旋支架，而在同時嘗試為這種復合物的內(nèi)在缺點、即在采取適合(即所需的、功能性)折疊之前必須首先在溶液中三聚化，尋找實用解決方案。這種解決方案最終在單鏈版本的三聚體形式下發(fā)現(xiàn)，其中第一個組成性α-螺旋的C-末端(C-端)與第二個α-螺旋的N-末端(N-端)連接(聯(lián)合、相連)，并且后者的C-末端與第三個α-螺旋的N-末端連接。根據(jù)Harris等[JMoIBiol1994，236:1356-1368]的術語，平行螺旋之間的連接被稱為“上手”(或“長”)連接，反向平行螺旋之間的連接被他們稱為“下手”(或“短”)連接。在本發(fā)明的實施方案中，連續(xù)的α-螺旋之間的連接通過使用結構撓性的連接物片段來實現(xiàn)，產(chǎn)生了其中三個α-螺旋被兩個撓性連接物連接在一起的構建物。本發(fā)明的所有實施方案都屬于這種類型的排列。因此，本發(fā)明的分子能夠在形式上被書寫成式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的序列，其中HRS1、L1、HRS2、L2和HRS3表示以在所述式中指示的次序共價和連續(xù)互連的氨基酸序列片段，并且其中片段HRS1、HRS2和HRS3是如上所述的七殘基重復序列，并且其中片段Ll和L2是結構撓性的連接物序列。撓性連接物片段在蛋白質(zhì)工程領域中常常用于將不同的功能單位互連，例如在從抗體可變區(qū)輕鏈(VL)和可變區(qū)重鏈(VH)產(chǎn)生單鏈可變區(qū)片段(scFv)構建物中。到目前為止，將撓性連接物片段與三聚卷曲型螺旋結構相組合應用于產(chǎn)生單鏈的并且三鏈卷曲型螺旋支架結構的目的，還沒有以不受限制的狀態(tài)公開或預期。此外，顯然在表述“單鏈并且三鏈”中沒有矛盾，因為“單鏈”是指全部氨基酸序列，而“三鏈”是常用術語，用于表示卷曲型螺旋結構由三個單獨的α-螺旋鏈(鏈片段)構成。本發(fā)明的所有實施方案在3鏈卷曲型螺旋結構的情形中都確切地包含兩個撓性連接物區(qū)段(片段)。連接物區(qū)段在長度或氨基酸序列方面不是必需一致的。此外，為了增加它們在溶液中構象撓性的可能性，它們優(yōu)選并主要由極性氨基酸殘基類型構成。在撓性連接物中典型的(通常使用的)氨基酸是絲氨酸和甘氨酸。在優(yōu)選性較低情況下，撓性連接物也可以包含丙氨酸、蘇氨酸和脯氨酸。優(yōu)選性更低(因為發(fā)生不需要的相互作用的風險增加)的是摻入半胱氨酸、組氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸或其非天然衍生物，并與所述更優(yōu)選的氨基酸組合。區(qū)別連接物片段和七殘基重復序列的優(yōu)選并且簡單的方法，是首先通過如上描述的任何方法確定后者，然后將剩余的氨基酸片段包含在連接物中。這種方法同時適用于不存在實驗確定的蛋白分子3-D結構的情況以及存在一個或多個這種結構的情況。如果這種實驗確定的結構對于任何連接物的結構撓性狀態(tài)產(chǎn)生不確定性或不明確性，那么概念“撓性連接物”將僅僅被解釋為能夠在兩個七殘基重復序列之間連接(相連，橋接)的片段，而不是作為結構動態(tài)或易變的片段。在本發(fā)明中使用撓性連接物的主要目的是將α-螺旋片段互連以便產(chǎn)生線性氨基酸序列(單鏈構建物)。盡管這在技術上是直截了當?shù)?，但必須考慮的重要方面是每個連接物的長度(氨基酸殘基的數(shù)量)。對于其中螺旋包含相同數(shù)量殘基的平行卷曲型螺旋來說，從給定α-螺旋的終點(C-端)到相鄰α-螺旋(上手連接)的起點(N-端)的3-D空間距離，可以通過公式“每個α-螺旋的殘基數(shù)乘以1.5?！眮泶致杂嬎?。在伸展構象中可以被連接物橋接的距離可以通過公式“連接物片段中的殘基數(shù)乘以3.0埃”來粗略計算。因此，作為規(guī)則，連接物必須具有每個α-螺旋的殘基數(shù)量的至少一半，以便能夠以松弛方式形成上手連接。(這一規(guī)則的例外是當螺旋具有不同長度或當螺旋至連接物轉角不容易制造時在這些情況下，優(yōu)選添加少量附加的連接物殘基)。重要的是，所述規(guī)則為計算平行構型中α-螺旋元件之間的上手連接所需的最小連接物長度提供了實用方法，而不是強加平行取向的方法。撓性連接物在溶液中的構象將是、或至少打算是在結構上基本隨機并且在行為上是動態(tài)的(即結構隨時間可變)。因此，“足夠長度”的連接物將允許但不強迫平行折疊。相反，“長度不足”的連接物(“太短的連接物”)將不允許平行折疊，從而誘導了不折疊或可選折疊的形成(倘若后者自身是穩(wěn)定的)。這種可選折疊的一種可能性是反向平行卷曲型螺旋結構對反向平行螺旋之間的連接(下手連接)的要求在拓撲學上非常復雜，但通常限制較少。換句話說，明顯太短而不能橋接平行取向中α-螺旋之間的距離的連接物，可能非常好地允許反向平行折疊。重要的是，后者并不暗示這種短的連接物是反向平行折疊所需或?qū)⒈厝徽T導反向平行折疊，——后者基本上依賴于在反向平行方式中形成物理和熱力學上穩(wěn)定的核心的概率，可能受到非核心殘基之間的其他有利相互作用的增強。因為已經(jīng)觀察到三聚卷曲型螺旋結構除了很少例外之外以平行取向折疊，因此不可能同樣的序列也能采取穩(wěn)定的反向平行折疊。后者對于本發(fā)明來說是特別相關的，因為本發(fā)明人已經(jīng)產(chǎn)生并表征了單鏈的三鏈卷曲型螺旋結構，其提供有對于平行折疊來說明顯太短的連接物，而分子仍以完全保留α-螺旋含量的方式折疊，并且對熱解折疊實驗中的轉變溫度具有可忽略的影響(參見實施例5)?；谶@些實驗可以得出結論，即這些構建物(以及可能還有具有長連接物的構建物)可能采用反向平行折疊。為了測試反向平行折疊在結構上是否可行，本發(fā)明人嘗試了產(chǎn)生單鏈三聚卷曲型螺旋的3-D模型，其中第二個α-螺旋(“B”)反向平行于第一個(“Α”)和第三個(“C”)α-螺旋。出人意料的是，通過標準的蛋白質(zhì)模擬操作能夠產(chǎn)生具有規(guī)則的“孔包CN102245623A說明書10/25頁節(jié)(knobs-into-holes)”堆積的可信模型(參見實施例7)。所有形成核的側鏈能夠被置于其最松弛構象異構體構象中。有趣的是，反向平行的B-螺旋的常規(guī)七殘基a_位置堆積在A-和C-螺旋的d-殘基上(d-層)。通過這種方式，B-螺旋在整個長度上與A和C相互作用，表明所有七殘基的核心位置都對折疊的穩(wěn)定性有貢獻。盡管這沒有證明反向平行折疊發(fā)生了這種情況，但模擬結果表明它至少在結構上是可行的，這與原來的推測相反。Lovejoy等[Science1993,259:1288-1293]對于“CoiHer”做出了類似的出人意料的觀察，這種肽被設計用于形成雙鏈平行卷曲型螺旋，但實際上組裝成三鏈卷曲型螺旋。由8個層構成的獨特的、非故意產(chǎn)生的疏水界面使該結構穩(wěn)定作用(發(fā)現(xiàn)平行螺旋中的每個a-層與來自反向平行螺旋的d-殘基結合，每個d-層與a-殘基結合，層分別被稱為"a-a-d，lP“d-d-a，，)。在另一項由Holton和Alber[ProcNatlAcadSciUSA2004，1011537-1542]進行的研究中，GCN4亮氨酸拉鏈Ala突變體也從默認的平行二聚體構型轉變成反向平行三聚體構型。已發(fā)現(xiàn)這種結構轉換是由于在核心中避免產(chǎn)生空腔。在Holton和Alber的研究中也發(fā)現(xiàn)了同樣的交替的a-a-d和d-d-a層的排列方式。重要的是，這兩項研究都涉及具有由亮氨酸殘基形成的核心(“Leu拉鏈”)的卷曲型螺旋，而本發(fā)明人觀察到了具有由異亮氨酸殘基形成的核心(“He拉鏈”)的卷曲型螺旋的反向平行取向；以前從未發(fā)現(xiàn)Ile拉鏈形成反向平行3鏈卷曲型螺旋。其次，所述兩項研究都涉及肽類卷曲型螺旋，而本發(fā)明的分子專門涉及單鏈卷曲型螺旋；以前從未以單鏈分子形式(單鏈格式)制造反向平行3鏈卷曲型螺旋。還不了解這些蛋白分子的反向平行取向是由于存在連接物片段、還是由于它們的特定氨基酸序列、還是由于任何其他原因或這些原因的組合。在任何情況下，本發(fā)明分子的3-D模型以及在所引用的Lovejoy等[同上]與HoIton和Alber[同上]的研究中描述的晶體學結構，都是在規(guī)則的間隔層中具有規(guī)則堆積的核心殘基的真正的卷曲型螺旋結構。這將它們與常規(guī)的三螺旋束相區(qū)分。三鏈反向平行卷曲型螺旋結構不與常規(guī)的三螺旋束相混淆不是規(guī)則卷曲型螺旋的三個α-螺旋的締合體(束)存在大量實例。α-螺旋束能夠在大量主要由α-螺旋構成的蛋白中觀察到，并且在這種蛋白中常常能夠辨別出三個相互作用的螺旋的束。三鏈卷曲型螺旋明顯也是三個α-螺旋的束，但是為了使3-螺旋束成為卷曲型螺旋，需要滿足許多附加條件。首先，需要所有的三個螺旋彼此相互作用，這排除了其中三個可能的螺旋對中只有兩個彼此接觸的拓撲結構(不粘聚拓撲結構)。其次，必須存在適度的超螺旋(即螺旋彼此纏繞)。超螺旋的首要決定因素是每對螺旋之間的角度(螺旋間角、螺旋-螺旋相互作用角、交叉角)。對于平行α-螺旋來說，該角度可以從“右手”超螺旋的典型在約-10度至O度范圍內(nèi)的小的負值，到“左手”超螺旋的典型在約20度到O度范圍內(nèi)的正值。對于反向平行α-螺旋來說，從所述值中減去180度。具有太高角度的拓撲結構，當后者被設定為絕對值為40度時，不被當作卷曲型螺旋。第三，在每個相互作用的α-螺旋內(nèi)必須存在可辨別的七殘基重復序列(如上文所定義)。真正的卷曲型螺旋在每個α-螺旋中包含至少2個、優(yōu)選至少3個七殘基重復序列。第四，α-螺旋必須通過其側鏈相互作用以孔包節(jié)方式彼此緊密堆積，正如在Harbury等[Nature1994,371:80-83]中對平行二聚、三聚和四聚卷曲型螺旋以及在Lovejoy等[Science1993,259=1288-1293]中對反向平行三聚卷曲型螺旋所描述的。Walshaw等[JStructBiol2003，144:；349_361]描述了區(qū)別真正卷曲型螺旋與多螺旋組裝體的更精密復雜的規(guī)則和方法。1除了上述之外，本發(fā)明的蛋白分子作為分離的蛋白存在，并且與“CC+卷曲型螺旋數(shù)據(jù)庫”fhttp//CoiledcoiIs.chm.bris.ac.uk/ccplus/search/periodictablel中歹丨J出的某些類型的復雜卷曲型螺旋組裝體不同，不需要附加的結合性α-螺旋(或其他蛋白片段)用于它們在溶液中的穩(wěn)定折疊。此外，本發(fā)明的卷曲型螺旋結構在其七殘基重復序列中不含不規(guī)則處(即結巴(stammer)或口吃(stutter))，意味著它們沿著序列在相鄰的核心殘基(在常規(guī)七殘基的“a”和“d”位置)之間具有標準的3-4個間隔。只要有可能測量(即如果能夠獲得3-D結構)，本發(fā)明的分子也具有高度結構對稱性，即它們在存在于反向平行卷曲型螺旋折疊中的兩個平行的α-螺旋內(nèi)，具有重復的、規(guī)則間隔的核心“a”殘基(a_層)和核心“d”殘基(d-層)的層。因為核心殘基形成了折疊類型的主要決定因素，因此也能辨別出結構對稱性，甚至在氨基酸序列的基礎上、即通過適合地選擇核心氨基酸殘基強加結構對稱性。這樣的結構對稱性對于開發(fā)非天然(設計的)卷曲型螺旋分子來說是重要的，因為它賦予設計任務以可管理性(不規(guī)則的結構不能從頭設計)。此外，通過在核心殘基的水平上導入對稱性以產(chǎn)生結構對稱性，顯著增加了折疊成高度穩(wěn)定、規(guī)則的卷曲型螺旋的可能性。確保形成規(guī)則a_和d-層的一種可能性是避免在核心位置處選擇龐大的芳香族殘基(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)和小殘基(甘氨酸、丙氨酸)。促進規(guī)則a-和d-層的另一種方式是選擇中等尺寸的疏水核心殘基例如異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸。獲得規(guī)則a-和d-層的另一種方式是在核心的相鄰層中選擇相同的氨基酸殘基(例如在所有a-層位置選擇異亮氨酸)。獲得規(guī)則核心層的另一種方式是在相鄰的α-螺旋中的等價核心位置處選擇相同氨基酸殘基(例如在第一和第三個α-螺旋兩者中第一個七殘基的a-位置處選擇異亮氨酸，這些螺旋形成卷曲型螺旋結構的平行螺旋)。一般來說，核心位置處氨基酸序列的對稱性越高，所設計的分子按照需要折疊的機會越高。因此，本發(fā)明的分子包括至少一定的、優(yōu)選相當?shù)?、最?yōu)選高度的序列對稱性以及因此形成的結構對稱性。對稱形式的存在或不存在，在本發(fā)明的分子與不形成本發(fā)明的實施方案的已知的3-螺旋束之間形成了足夠的辨別信號。本質(zhì)上說，高度對稱的卷曲型螺旋只作為寡聚體而從未作為單鏈分子觀察到。(這種觀察之下潛在的原因復雜有趣，但是在本文中不重要)。相反，天然的單鏈3-螺旋束不僅非常罕見(它們通常作為較大蛋白或復合物中的小的反向平行結構域出現(xiàn))，而且它們明顯缺少內(nèi)部對稱性?，F(xiàn)有技術中關于反向平行3-螺旋束的最接近的實例之一發(fā)現(xiàn)在人類GGAlGAT結構域的PDB結構中[Zhu等，EMBOJ2004，23:3909-3917;PDB編號1X79]。GGAlGAT結構域的210-302位殘基形成反向平行的三螺旋束基序，其可能與本發(fā)明的反向平行卷曲型螺旋結構混淆。該束中的第一個α-螺旋大部分與第三個螺旋平行，而第二個螺旋的取向與它們反向平行。堆積相對緊密，并以孔包節(jié)方式發(fā)生。然而，兩個平行的螺旋不具有堆積對稱性，正如可以從結構中不存在和d-層所觀察到的，并且在螺旋1和3的氨基酸序列中不存在結構相似的七殘基核心殘基大的(1精氨酸、1酪氨酸)和小的O丙氨酸)指狀物間具有脂肪族核心殘基的混合物(纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸)。此外，晶體檢測器沒有將GAT結構域指示為卷曲型螺旋(而是3-螺旋束)，盡管它們將結合的rabaptin5配體分類為(二聚)卷曲型螺旋。非卷曲型螺旋3-螺旋束的其他實例包括葡萄球菌蛋白A中的B、E和Z結構域和絨毛蛋白頂部的三級結構。本發(fā)明的形成卷曲型螺旋的分子的具體類型和格式在自然界中沒有觀察到，這也是它們優(yōu)選被稱為“非天然的”原因之一。本發(fā)明主要涉及、并且本發(fā)明的優(yōu)選實施方案包括了由式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3所表示的分離的單鏈蛋白，其中HRS1、Li、HRS2、L2和HRS3表示共價互連的氨基酸序列片段，并且其中a)HRSl、HRS2和HRS3各自獨立地是七殘基重復序列，其由a-b-c-d-e-f-g所表示的重復的7殘基氨基酸序列模式構成，并且b)Ll和L2各自獨立地是由1至30個氨基酸殘基構成的連接物；并且其中所述蛋白在水性溶液中通過HRS1、HRS2和HRS3片段自發(fā)折疊形成三鏈反向平行的α-螺旋卷曲型螺旋結構。用更明確的方式陳述，本發(fā)明主要涉及、并且本發(fā)明的優(yōu)選實施方案包括了分離的非天然的由式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3所示的單鏈蛋白，其中HRS1、Li、HRS2、L2和HRS3表示共價互連的氨基酸序列片段，所述蛋白在水性溶液中通過HRS1、HRS2和HRS3片段自發(fā)折疊形成三鏈反向平行的α-螺旋卷曲型螺旋結構，并且其中a)HRSUHRS2和HRS3各自獨立地是七殘基重復序列，其特征為由(a-b-C-d-e-f-g-)n或(d-e-f-g-a-b-C-)n所表示的η次重復的7殘基氨基酸類型序列模式，其中序列模式的元件“a”到“g”表示所述氨基酸類型所處的常規(guī)七殘基位置，并且η是等于或大于2的數(shù)字，并且b)常規(guī)七殘基位置“a”和“d”主要被疏水氨基酸類型占據(jù)，常規(guī)七殘基位置“b”、“c”、“e”、“f”和“g”主要被親水氨基酸類型占據(jù)，得到的疏水和親水氨基酸類型之間的分布能夠鑒定所述七殘基重復序列，并且c)Ll和L2各自獨立地是由1至30個氨基酸殘基構成的連接物，該連接物包括不能明確指派給七殘基重復序列的任何氨基酸殘基；所述蛋白在后文中被稱為“單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白”。上述的性質(zhì)“分離的”主要是指要求本發(fā)明的蛋白形成穩(wěn)定結構，其不需要與配體(例如其他蛋白、肽類、核酸、糖離子等)進一步結合，或包埋在更大的蛋白背景中(即在融合構建物中或作為結構域)，正如上文也解釋過的。上面提到的性質(zhì)“非天然的”主要是指要求本發(fā)明的蛋白沒有在自然界中作為天然蛋白或作為天然存在的蛋白結構域被觀察到。為了將它們與天然蛋白或結構域相區(qū)分，氨基酸序列同一性百分數(shù)合計優(yōu)選低于90%、更優(yōu)選低于80%、最優(yōu)選低于70%。術語“非天然的”也指蛋白是優(yōu)選由人類在合理的基礎上設計或設想的。上述的性質(zhì)“單鏈”主要是指本發(fā)明的蛋白由單一氨基酸鏈(多肽鏈)制成而不是寡聚(二聚、三聚)組裝體這一事實。這暗示了它們能夠在溶液中作為單體分離。然而，后者并不排除它們能夠在體外或體內(nèi)與其他分子、生物實體或非生物材料相互作用(締合、形成復合物、結合)的可能性。上述的性質(zhì)“蛋白”主要是指由氨基酸(氨基酸殘基，任選的非天然或衍生的氨基酸)構成的多肽，所述氨基酸排列成線性鏈，并在溶液(水性溶液、富含水的介質(zhì))中折疊成球狀形式。上面提到的術語“自發(fā)地”主要是指在合理的(非極端)的時間內(nèi)、在合理的條件下由自身執(zhí)行。上面提到的術語“折疊”主要是指球狀(密實的、“球形的”)折疊的形成，這種形成的特征為鏈內(nèi)原子間的相互作用并由其驅(qū)動。上面提到的術語“三鏈”、“反向平行”、“卷曲型螺旋結構”、“七殘基重復序列”、“序列模式”、“常規(guī)七殘基位置”、“主要被…占據(jù)”、“疏水氨基酸類型”、“親水氨基酸類型”、“連接物”和“不能明確指派為七殘基重復序列”，具有與本文件別處所解釋的相同的意義。它們被選擇為與本
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的通用術語最大程度相符。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)所述蛋白的方法。這樣的方法需要例如將所述蛋白在細菌宿主中表達，如實施例5中所述?？蛇x地，所述蛋白的表達可以在真核系統(tǒng)例如酵母或昆蟲細胞中進行。可選地，小尺寸的所述蛋白可以通過化學合成，使用本
技術領域：
公知的方法步驟來生產(chǎn)。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案涉及單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白，其中至少50%、優(yōu)選至少70%、至少90%或其中100%(所有的)常規(guī)七殘基位置“a”和“d”被選自纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸的氨基酸或其非天然衍生物所占據(jù)。所述常規(guī)七殘基位置處所述氨基酸的優(yōu)選百分率取決于人們在所述蛋白的設計中準備承擔的風險水平。低于50%的百分率被認為對于折疊的正確性來說形成了太高風險。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白，其中至少50^^70^^90%或其中100%的常規(guī)七殘基位置“a”和“d”被選自纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸的氨基酸或其非天然衍生物所占據(jù)。因為后面的氨基酸對應于更標準的(更經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的)卷曲型螺旋核心殘基，本實施方案比前一實施方案更加優(yōu)選。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白，其中至少50^^70^^90%或其中100%的常規(guī)七殘基位置“a”和“d”被異亮氨酸占據(jù)。因為最初發(fā)現(xiàn)的所述單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白由在常規(guī)七殘基位置“a”和“d”處具有異亮氨酸殘基的構建物制成，因此本實施方案比前面的更加優(yōu)選。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白，其中至少50%,70^^90%或其中100%的常規(guī)七殘基位置“13”、“(3”、“6”、“產(chǎn)和、”被選自甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸，賴氨酸、精氨酸的氨基酸或其非天然衍生物所占據(jù)。所述常規(guī)七殘基位置處所述氨基酸的優(yōu)選百分率取決于人們在所述蛋白的設計中準備承擔的風險水平。低于50%的百分率被認為對于折疊的正確性和蛋白的溶解性來說形成了太高風險。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白，其中Ll和L2的氨基酸組成包含至少50%、70%、90%或包含100%的選自甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸的氨基酸或其非天然衍生物。連接物中所述氨基酸的優(yōu)選百分率取決于人們在所述蛋白的設計中準備承擔的風險水平。低于50%的百分率被認為對于折疊的正確性、蛋白的溶解性及其可能的功能(例如與給定靶的特異性結合)來說形成了太高風險。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白，其中Ll和L2的氨基酸組成包含至少50%、70%、90%或包含100%的選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸的氨基酸或其非天然衍生物。因為后面的氨基酸對應于更標準的(更經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的)連接物殘基，因此本實施方案比前面的實施方案更加優(yōu)選。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白，其中Ll和L2的氨基酸組成包含至少50%、70%、90%或包含100%的甘氨酸和/或絲氨酸。因為后面的氨基酸對應于最標準的(最經(jīng)常選擇的)連接物殘基，因此本實施方案比前面的實施方案更加優(yōu)選。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白，其中每個Ll和L2的氨基酸殘基數(shù)量合計小于相應的Ll或L2之前的七殘基重復序列的氨基酸殘基數(shù)的一半。遵守這一規(guī)則大大降低了不想要的折疊(例如作為平行卷曲型螺旋)的風險，正如前面所解釋的。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白，其中鄰近Ll和/或L2末端的氨基酸殘基使卷曲型螺旋結構的α-螺旋末端穩(wěn)定。選擇這種氨基酸的可能性在文獻中已有很好的記載，并通常被稱為“螺旋封端氨基酸或螺旋封端基序”。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白，其中鄰近Ll和/或L2末端的氨基酸殘基促進了結構中局部轉角的形成。選擇這種氨基酸的可能性包括例如選擇中斷螺旋的氨基酸例如甘氨酸和脯氨酸，或引發(fā)螺旋的氨基酸例如絲氨酸或天冬氨酸。某些螺旋封端基序也可用于同樣目的?？蛇x地，可以使用螺旋-環(huán)-螺旋基序，正如在文獻中記載的或在蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB)中觀察到的。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白，其中常規(guī)七殘基位置“e”和“g”被谷氨酰胺占據(jù)。本發(fā)明的反向平行卷曲型螺旋分子的計算機模擬表明，所述位置中的谷氨酰胺對可以在反向平行螺旋之間形成準理想的相互作用(即能量上有利的氫鍵)，從而增加折疊的總體穩(wěn)定性。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白，其中常規(guī)七殘基位置“b”、“c”和“f”是極性的、促進溶解的氨基酸。因為這些位置是最暴露于溶劑的位置，因此在這些位置處專門選擇極性并且優(yōu)選帶電荷的氨基酸，可以顯著增加所述蛋白的溶解性。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白，其在pH介于1至13之間、或2至12之間、或3至11之間、或4至10之間或5至9之間的水性溶液中折疊。蛋白在其中保持折疊的PH范圍是其可應用性的重要決定因素。例如，對極端pH條件不敏感(耐受)可以使其適合于其中蛋白需要通過胃腸道或在胃腸道中起作用的治療應用。此外，PH不敏感性蛋白可能對胞吞后溶酶體途徑的酸性條件具有抗性。因此，本發(fā)明的蛋白優(yōu)選在5-9的pH范圍內(nèi)，更優(yōu)選在4-10、3-11、2-12、最優(yōu)選在1_13的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白，其在溫度介于0°C至100°C之間、或0°C至80°C之間或0°C至60°C之間的水性溶液中折疊。熱穩(wěn)定性是總體穩(wěn)定性(包括蛋白水解穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性或“貨架壽命”)、因此也是功能保護的重要決定因素。本發(fā)明的蛋白優(yōu)選在0-60°C、更優(yōu)選在0-80°C、最優(yōu)選在0-100°C的溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白，其在離子強度介于0至1.0摩爾之間的水性溶液中折疊。生理條件需要在約150毫摩爾的離子強度(主要對應于鹽濃度)下穩(wěn)定折疊并保存功能。本發(fā)明的蛋白優(yōu)選在較寬的離子強度范圍、最優(yōu)選在0-1摩爾的范圍內(nèi)穩(wěn)定(并有功能活性)。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白，其用作支架。正如上文所解釋的，本發(fā)明的蛋白分子作為支架非常有用。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及如圖15中所示的單鏈反向平行卷曲型螺旋蛋白。本發(fā)明的蛋白可使用本
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的知識進行大量修飾，包括(多個)氨基酸取代、導入非天然氨基酸、連接特定化學部分、肽延伸、標記、通過自身串聯(lián)增加親和力、串聯(lián)成融合蛋白等，而不損失(改變、破壞)蛋白的卷曲型螺旋折疊。這里，可以規(guī)劃許多這樣的修飾以說明蛋白經(jīng)受高級工程化步驟的內(nèi)在潛力。具體來說，本發(fā)明人考慮到了下列工程化構建物，其全都包括具有其指定特征的本發(fā)明的蛋白·本發(fā)明的任何蛋白可以在其氨基酸序列上進行修飾，從而產(chǎn)生其一個或多個衍生物；·任何蛋白或衍生物可以被修飾以例如增強其穩(wěn)定性；·任何蛋白或衍生物可以被修飾以例如增加其折疊動力學；·任何蛋白或衍生物可以被修飾以例如增加其折疊狀態(tài)的正確性；·任何蛋白或衍生物可以被修飾以例如增加其與靶化合物的結合親和性；·任何蛋白或衍生物可以被修飾以例如增加其對靶化合物的結合特異性；·任何蛋白或衍生物可以被修飾以例如增加其溶解性；·任何蛋白或衍生物可以通過其N-或C-末端或通過其一個或多個側鏈與任何其他蛋白或蛋白類分子共價連接；任何蛋白或衍生物可以與相同蛋白或衍生物的其他拷貝共價連接以例如增加親和力；·任何蛋白或衍生物可以與具有不同結合性質(zhì)的任何蛋白或衍生物共價連接，以例如提供雙或多特異性；任何蛋白或衍生物可以與任何現(xiàn)有的與本發(fā)明無關的天然或非天然蛋白或蛋白結構域或肽、包括但不限于Fc結構域、Fc受體、血清白蛋白、熒光蛋白、另一類型的蛋白分子等共價連接；·任何蛋白或衍生物可以與一個或多個檢測標簽共價連接；·任何蛋白或衍生物可以與一個或多個純化標簽共價連接；任何蛋白或衍生物可以通過與一個或多個蛋白側鏈部分的化學反應與有機化合物共價連接；·任何蛋白或衍生物可以被糖基化；·任何蛋白或衍生物可以被PEG化。由于本發(fā)明的蛋白及其衍生物形成穩(wěn)定密實結構的事實，它們原則上可以通過適用于蛋白的所有技術來構建或操作。本發(fā)明的蛋白分子可以按照本
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公知的技術合成制造，或使用本
技術領域：
公知的技術通過遺傳工程來產(chǎn)生。當使用遺傳工程技術制造時，本發(fā)明的蛋白分子由多核苷酸(在本文中也稱為核酸)、優(yōu)選為DNA或RNA編碼。本發(fā)明的蛋白分子可以由符合制造蛋白分子的宿主生物體的遺傳密碼簡并性的任何核酸編碼。本發(fā)明的多核苷酸(在本文中也稱為核酸)可以摻入到重組載體例如克隆或表達載體中。術語“載體”包括表達載體、轉化載體和穿梭載體。術語“表達載體”是指能夠在體內(nèi)或體外表達的構建物。術語“轉化載體”是指能夠從一個實體轉移到另一個實體——其可以是同一物種或可以是不同物種——的構建物。如果構建物能夠從一個物種轉移到另一個物種，例如從病毒載體例如MMLV或FIV轉移到人類或哺乳動物原始細胞或細胞系中，那么轉化載體有時被稱為“穿梭載體”。大量各種表達系統(tǒng)可用于不同宿主中。例如，游離體、染色體和病毒來源的系統(tǒng)(例如源自于細菌質(zhì)粒、噬菌體、乳多空病毒例如SV40、痘苗病毒、腺病毒和反轉錄病毒的載體)。DNA序列可以通過各種技術插入到載體中。一般來說，通過本
技術領域：
已知并被視為在本
技術領域：
的專業(yè)人員的技術范圍內(nèi)的程序，將DNA序列插入到適合的限制性內(nèi)切酶位點中。表達載體中的DNA序列與指導mRNA合成的適合的控制序列(即啟動子)可操作連接。本發(fā)明的載體可以轉化到如下所述的適合的宿主細胞中，以提供本發(fā)明的蛋白分子的表達。因此，另一方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的蛋白分子的方法，所述方法包含將用上述的表達載體轉化或轉染的宿主細胞，在為編碼蛋白分子的編碼序列的載體提供表達的條件下培養(yǎng)，并回收所表達的蛋白分子。載體可以是例如質(zhì)粒、病毒或噬菌體載體，其提供有復制原點、任選的用于多核苷酸表達的啟動子和任選的啟動子調(diào)控子。本發(fā)明的載體可以含有一個或多個可選擇標志物基因。最適合用于工業(yè)微生物的選擇系統(tǒng)是由不需要宿主生物體中的突變的選擇標記物組形成的系統(tǒng)。真菌選擇標志物的實例是乙酰胺酶(amdS)、ATP合成酶、亞基9(oliC)、乳清苷-5’-磷酸-脫羧酶(pvrA)、腐草毒素和苯菌靈抗性(benA)基因。非真菌選擇性標記物的實例是細菌G418抗性基因(它也可以用于哺乳動物細胞、酵母中，但是不能用于絲狀真菌)、氨芐青霉素抗性基因(大腸桿菌)、新霉素抗性基因(哺乳動物細胞)和編碼葡糖醛酸酶(GUS)的大腸桿菌UidA基因。載體可以在體外使用例如用于產(chǎn)生RNA，或者用于轉染或轉化宿主細胞。因此，本發(fā)明的多核苷酸或核酸可以摻入到重組載體(典型為可復制載體)、例如克隆或表達載體中。載體可用于在相容的宿主細胞中復制核酸。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過將本發(fā)明的多核苷酸導入可復制載體，將載體導入相容的宿主細胞，并在產(chǎn)生載體復制的條件下生長宿主細胞，來制造本發(fā)明的多核苷酸的方法。載體可以從宿主細胞回收。適合的宿主細胞在下文結合表達載體一起描述。術語“宿主細胞”對于本發(fā)明而言，包括了能夠包含為本發(fā)明的重組蛋白編碼的核苷酸序列和/或從其獲得的產(chǎn)物的任何細胞，其中啟動子當存在于宿主細胞中時，能夠允許本發(fā)明的核苷酸序列表達。因此，本發(fā)明的另一個實施方案提供了用本發(fā)明的多核苷酸轉化或轉染的宿主細胞。優(yōu)選情況下，所述多核苷酸攜帶在用于所述多核苷酸的復制和表達的載體中。選擇與所述載體相容的細胞，并且其可以是例如原核的(例如細菌細胞)或真核的(即哺乳動物、真菌、昆蟲和酵母細胞)。將多核苷酸導入宿主細胞可以通過在Sambrook等主編，(1989)，《分子克隆實驗指南》(MolecularCloningALaboratoryManual),ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,NY,USA中描述的方法來實現(xiàn)。這些方法包括但不限于磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、陽離子性脂類介導的轉染、電穿孔、轉位、微注射、轉導、劃痕負載和轟擊導入。代表性的宿主的實例包括細菌細胞(例如大腸桿菌、鏈霉菌)、真菌細胞例如酵母細胞和曲霉(Aspergillus)、昆蟲細胞例如果蠅(Drosophila)S2和夜蛾(Spodoptera)SF9細胞、動物細胞例如CH0、COS、HEK、HeLa和3T3細胞。適合宿主的選擇被視為在本
技術領域：
的專業(yè)人員技術范圍內(nèi)。取決于編碼本發(fā)明的蛋白分子的多核苷酸的性質(zhì)和/或?qū)λ磉_蛋白進一步加工的需要性，真核宿主例如酵母或其他真菌可能是優(yōu)選的。一般來說，酵母細胞比真菌細胞更加優(yōu)選，因為它們更容易操作。本發(fā)明范圍內(nèi)的適合的表達宿主的實例是真菌例如曲霉屬(Aspergillus)物種和木霉屬(Trichoderma)物種、細菌例如埃希式桿菌屬Escherichia)物種、鏈霉菌屬(Sti^ptomyces)物種和假單胞菌屬(I^seudomonas)物種以及酵母例如克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)物種和酵母菌屬(Saccharomyces)物種。例如，典型的表達宿主可以選自黑曲霉(Aspergillusniger)、黑曲霉tubigenis變種(Aspergillusnigervar.tubigenis)、黑曲霉awamori變禾中(Aspergillusnigervar.awamori)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatis)、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)、米曲霉(Aspergillusorvzae)、里氏木霉(Trichodermareesei)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、粟酒裂殖酵母(Schizpsaccharomycespombe)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)0適合的宿主細胞例如哺乳動物、酵母、昆蟲和真菌宿主細胞的使用，可以提供翻譯后修飾(例如肉豆蔻?；⑻腔?、截短和酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)，其可能為賦予本發(fā)明的重組表達產(chǎn)物以最適生物活性所需。正如所指出的，宿主細胞可以是原核或真核細胞。適合的原核宿主的實例是大腸桿菌。關于原核宿主的轉化的教導在本
技術領域：
中已充分記載，例如參見Sambrook等(《分子克隆實驗指南》第二片反(MolecularCloning:ALaboratoryManual，2ndedition)，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,NY,USA)和Ausubel等(《分子生物學現(xiàn)代方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),(1995)，JohnWiley&Sons，Inc.)。在優(yōu)選實施方案中，被轉化的宿主是哺乳動物細胞或例如昆蟲細胞，其中將多核苷酸導入所述宿主細胞可以通過在例如Sambrook等(《分子克隆實驗指南》第二版(MolecularCloningALaboratoryManual,2ndedition),1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,NY,USA)中描述的方法來實現(xiàn)。這些方法包括但不限于磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、陽離子性脂類介導的轉染、電穿孔、轉位、微注射、轉導、劃痕負載和轟擊導入。在另一個實施方案中，轉基因生物體可以是酵母。就此而言，酵母已廣泛用作異源基因表達的載體。物種釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)已有很長的工業(yè)應用、包括其用于異源基因表達的歷史。異源基因在釀酒酵母中的表達已被Goodey等(1987，《酵母生物技術》(YeastBiotechnology)，D.R.Berry等主編，pp401—429，Alien禾口Unwin，London)禾口King等(1989，《酵母的分子和細胞生物學》(MolecularandCellBiologyofYeasts),E.F.Walton和G.T.Yarronton主編，pp107-133，Blackie,Glasgow)綜述。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的蛋白分子的生產(chǎn)可以通過將已用本發(fā)明的一種或多種多核苷酸轉化的真核或原核表達宿主，在常規(guī)的營養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)來實現(xiàn)。適合的培養(yǎng)基可以根據(jù)表達宿主的選擇和/或根據(jù)表達構建物的調(diào)控要求進行選擇。這些培養(yǎng)基對于本
技術領域：
的專業(yè)人員來說是公知的。如果需要，培養(yǎng)基可以含有對轉化的表達宿主比對其他潛在污染微生物更加有利的附加組分。實施例棚列1、‘捕心雙_心@胃白始成歹丨丨本實施例提供了與本發(fā)明相關的特定多肽的氨基酸序列。氨基酸序列AIAAIQKQIAAIQKQIAAIQKQIA，用單字母表示法呈現(xiàn)，其中A表示丙氨酸、I表示異亮氨酸、Q表示谷氨酰胺、K表示賴氨酸。具有該氨基酸序列的肽，通過它們的異亮氨酸和亮氨酸殘基形成疏水核心(中心、內(nèi)部)而其他殘基朝向溶劑取向而形成三鏈α-螺旋卷曲型螺旋復合物。人工肽包含三個七殘基重復序列，其在圖1中標為“HR1”、“HR2”和“HR3”。圖1是人工肽的氨基酸序列的示意圖，其包含七殘基重復序列(HRx)、核心殘基(黑色框)、非核心殘基(灰色框)和側翼區(qū)域(白色框)。肽還包含標記為“t”的C-端七殘基核心殘基。肽還包含分別標記為“N”和“C”的N-端和C-端側翼片段。每個七殘基重復序列殘基進一步用指數(shù)“a”到“g”和對應于七殘基重復序列個數(shù)的數(shù)字標注。核心殘基位于a-和d-位置。三個完整的七殘基重復序列的所有6個核心殘基都是異亮氨酸。標為“a4”的異亮氨酸殘基屬于部分七殘基重復序列“t”。七殘基重復序列HR1、HR2和HR3以及部分七殘基重復序列“t”合在一起組成七殘基重復序列，其從核心殘基al開始，并終止于核心殘基a4。棚列2、Ξ車α-如圖2中所示，七殘基核心殘基被屏蔽在三鏈α-螺旋卷曲型螺旋復合物中免受溶劑影響。相接觸的核心殘基(圖2中的位置A和D)之間的非共價相互作用為肽采取這種折疊提供了主要熱力學驅(qū)動力。圖2是三鏈α-螺旋卷曲型螺旋結構的螺旋輪狀表示。左圖顯示了平行卷曲型螺旋的頂視圖。右圖顯示了反向平行卷曲型螺旋的頂視圖。中圖顯示了七殘基重復序列位置的線性序列。為了清楚的原因，只顯示了一個七殘基重復序列。不同的陰影用于指示特定的拓撲結構位置。核心殘基(位置A和D)完全埋藏在復合物中，不能被溶劑接近。非核心殘基(位置B、C、E、F和G)是至少部分溶劑可接近的(位置E、G低于B、C，位置B、C低于F)并對氨基酸取代敏感，與復合物的穩(wěn)定性沒有(重要)牽連。實施例3、α-螺旋結構和可逆折疊/解折疊肽類α-螺旋卷曲型螺旋不形成本發(fā)明的主題，因為它們不折疊成單鏈蛋白。然而，本發(fā)明的單鏈蛋白包含三聚卷曲型螺旋區(qū)域。顯然，通過連接物片段連接N-和C-端末端能夠(將)影響折疊動力學，但是“切下的”卷曲型螺旋肽的基本物理性質(zhì)預計一般將得到保留。因此，肽類卷曲型螺旋可以用作研究系統(tǒng)。為了證實參比人工肽在溶液中定量形成α-螺旋二級結構，本發(fā)明人合成了具有氨基酸序列Ac-MSIEEIQKQQAAIQKQIAAIQKQIYRMTP-NH2的肽，并記錄了圓二色性(CD)譜。氨基酸序列用單字母編碼給出；Ac-和-NH2表示肽分別是乙?；鹗己王０方Y束的。該肽應該被當作由三個七殘基重復序列(IAAIQKQ)3構成的參比肽的衍生物，其在氨基(N-)和羧基(C-)末端具有修飾，以增加末端的α-螺旋性質(zhì)(通常稱為加帽)。更具體來說，側翼殘基Ac-MS-連接到N-端，并與參比序列的第一個七殘基中兩個連續(xù)的谷氨酸殘基(EE)取代兩個丙氨酸殘基(AA)相組合。此外，側翼殘基IYRMTP-NH2連接到C-端，使得氨基酸異亮氨酸(I)和甲硫氨酸(M)位于常規(guī)七殘基的a_和d-位置，允許該側翼序列形成額外的、盡管不完整的七殘基。酪氨酸(Y)被導入朝向溶劑的b-位置，以確保通過分光光度法測定濃度。導入精氨酸(R)、蘇氨酸(T)和脯氨酸(Ρ-Μ)殘基以改進C-末端螺旋加帽。此外，第二個七殘基的a-位置處的異亮氨酸(I)被谷氨酰胺(Q)殘基代替，以迫使卷曲的卷曲形成肽以正確的(所打算的)方式結合，即確保形成三聚復合物并避免可能的七殘基疊合偏移[Eckert等，JMolBiol1998,284:859-865]。所述合成肽以292mM的濃度溶解在20mM磷酸緩沖液(PBQ，150mMNaCl，pH7.2中。在5°C和90°C下，在200到250nM之間測量了⑶譜(圖3)。5°C下的譜圖表明另外高的α-螺旋二級結構含量，與所有七殘基區(qū)域但不是所有側翼殘基將組裝成α-螺旋卷曲型螺旋的預期相一致。90攝氏度下的譜圖顯示出在高溫下α-螺旋結構顯著但是沒有完全喪失。為了分析螺旋與非螺旋狀態(tài)之間溫度誘導的轉變是否是可逆的，通過以約1攝氏度每分鐘的掃描速率記錄222ηΜ下的CD信號隨溫度的變化，對相同樣品進行了向上(上)和向下(下)熱掃描(圖4)。觀察到了上下掃描幾乎完全一致，從而證實了樣品中肽的定量解折疊和重新折疊。進一步分析了圖4的熱解折疊曲線是否與描述了三分子游離(單體)肽與折疊(三聚)復合物的一個實體之間的平衡折疊/解折疊反應的熱力學方程相符。該反應一般被寫成3個肽<=>肽3其中“<=>”表示化學平衡，“肽”表示溶液中的單體肽，“肽3”表示處于折疊(組裝的、結合的)狀態(tài)的三聚實體。將該熱解折疊曲線擬合于理論方程(\.ττ)Uιιτ~τ、+3F2V427^[2V427H-·■*——I代Γ)=4(Γ)+的.(Γ)-禮(Γψ.+fVν'Jιν“y^J其中(ahAC,,expj~^f(l~777:.)-^(r-7;-rIniTjTl)j4并且T=樣品的溫度，單位為開氏度θ⑴^⑶信號[θJ222nm作為T的函數(shù)，單位為度cm2dmorθM(T)Ξ100%游離(單體)肽的⑶信號作為T的函數(shù)θτ(Τ)^100%結合(三聚)肽的⑶信號作為T的函數(shù)Tt=50%的總肽濃度結合時的轉變溫度AHtε單體和三聚狀態(tài)之間的焓差，單位為kj每摩爾肽ACpε單體和三聚狀態(tài)之間的熱容量差，單位為JHlor1IT1R三理想(通用)氣體常數(shù)三8.31JHior1K-1該擬合運算的結果顯示在圖5中。發(fā)現(xiàn)在整個溫度范圍內(nèi)理論曲線幾乎與實驗曲線完全一致，從而證實了肽的三聚結合。圖5顯示了將三聚體結合的理論方程擬合于實驗數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)從圖4標記為“上”的曲線獲得。使用的理論方程如上所列出。擬合參數(shù)(擬合結果)列于圖5的右側?！稗D變T”對應于Tt，但是用攝氏度表示。參數(shù)“ΔC/保持恒定在3.OkJmorl·1。參數(shù)“θM(T)”和“θT(T)”作為T的線性函數(shù)進行處理，產(chǎn)生了由圖的右側標出的相應偏移和斜率所描述的點狀直線?！癛MSResid.”表示實驗和理論數(shù)據(jù)點之間的差的均方根。擬合(理論)曲線本身在圖中用白色作圖，并在整個溫度范圍內(nèi)與用黑色顯示的實驗數(shù)據(jù)點一致。實施例4、全異亮氨酸核心殘基的使用為了分析在實施例3的參比肽中第二個七殘基的位置a處的谷氨酰胺對于正確(所打算的)折疊成三聚卷曲型螺旋是否需要，將該殘基用異亮氨酸替換，產(chǎn)生了在所有核心位置處具有異亮氨酸(除了C-端側翼片段中的甲硫氨酸之外)序列的命名為“Qhl”的肽。為此目的，合成了具有下述序列的肽Ac-MSIEEIQKQIAAIQKQIAAIQKQIYRMTP-NH2。圖6顯示了在與實施例3相同的條件下Q2al肽的樣品制備物的熱變性曲線。總的CD信號略微低于預期，這可能是由于儀器偏差、濃度測定誤差、較低的純度或低于預期的α-螺旋含量。然而，本實驗的主要目的是檢測谷氨酰胺到異亮氨酸的突變對復合物穩(wěn)定性的影響。因此，有趣的是發(fā)現(xiàn)該變體顯示出對熱變性的極高抗性，即它是極為熱穩(wěn)定的。估計的轉變溫度在97攝氏度左右，盡管由于轉變的不完全性后者難以測量。此外，下掃描顯示出CD信號的完全恢復，表明了完全的可逆性。為了證實組裝的復合物具有對三聚體所預計的正確分子量(MW)，將Q2al肽以約lmg/ml的濃度在25000rpm下進行分析性沉降平衡超離心。圖7顯示了線性化光密度(OD)曲線與單體、二聚和三聚復合物的理論曲線的比較。發(fā)現(xiàn)實驗數(shù)據(jù)點與三聚模型曲線符合得非常良好。從線性回歸線的斜率，得出10500Da的表觀分子量，與理論值10M2Da(單體漏3414Da的3倍)符合良好。為了進一步證實三聚復合物的形成，還通過靜態(tài)光散射對同樣的Q2al肽進行分析。將200微升在PBS中濃度為lmg/ml的肽置于與紫外(UV)、折射率(RI)和靜態(tài)光散射(SLS)檢測器相連的Superdex7510/300GL凝膠過濾柱上。圖8顯示了結果。來自三種不同檢測器的信號(曲線)被相應標出。觀察到了形狀良好的光散射峰，與UV和RI峰相符。從UV峰得出的表觀分子量是12530士1510Da，也與預期值良好符合。由此得出結論，全異亮氨酸核心殘基的使用對肽組裝成三聚體沒有不利效應，正如能夠在關于潛在(意料之外的)七殘基疊合偏移的理論考慮的基礎上所預期的。相反，所有試驗表明正確并專門折疊成具有正確(預計的)分子量的三聚體。此外，這種全異亮氨酸核心肽具有非常高的熱穩(wěn)定性，因為它在高達95攝氏度的溫度下也不定量解折疊。因此，該肽可以被當作優(yōu)選的形成三聚卷曲型螺旋的肽。實施例5、單鏈卷曲型螺旋支架構建物為了研究通過使用結構撓性的連接物片段將各個七殘基重復序列(HRQ的末端相連是否能夠從肽類卷曲型螺旋產(chǎn)生單鏈卷曲型螺旋支架，設計、產(chǎn)生并測試了三種具有不同連接物長度的構建物。具體來說，構建了具有圖9中列出的氨基酸序列的單鏈卷曲型螺旋支架分子。這些支架源自于實施例4的肽類三聚卷曲型螺旋支架O^al)。測試了長度為8和16個氨基酸的富含GlyAer的連接物。這些構建物在本文中分別被稱為“scQ2aI_L8”和“SCQ^iI_L16”。由于七殘基重復序列的定義(在上文中提供)開始和終止于核心殘基，因此相應的N-和C-端加帽殘基甲硫氨酸-絲氨酸(“MS”)和蘇氨酸(“T”)在形式上包含在連接物中，并且序列“MGHHHHHHHHHHSSGHIEGRHMS”和“TP”被當作側翼序列。N-端側翼序列(前導序列)包含IO-His標簽(HHHHHHHHHH)，隨后是“因子fe”切割位點(IEGRH)。構建物按照下述方法產(chǎn)生。檢索編碼構建物的基因。將核苷酸序列進行優(yōu)化以匹配密碼子用法，用于在大腸桿菌中表達。將基因提供在PCR4T0P0質(zhì)粒中，并附上3’-NdeI和5’-XhoI限制性位點，用于隨后亞克隆在pET16b載體(Novagen)中。將后者轉化到大腸桿菌BL21(DE3)/pLysE菌株中，并進行小規(guī)模表達試驗。簡單來說，將25ml含有適合抗生素的培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基+50μg/ml氨芐青霉素+25μg/ml氯霉素)用0/N培養(yǎng)物(稀釋l/150x)接種，并將細胞在37°C下生長直至0D600達到約0.65。然后通過加入0.4mMIPTG來誘導靶蛋白的表達，并將細胞在37°C或30°C下繼續(xù)生長。在3.5小時(tl，37°C)和5.5小時(t2，37°C和t2’，30°C)后取培養(yǎng)物等份試樣，并與誘導前(tO)樣品一起在SDS-PAGE凝膠(10%丙烯酰胺，考馬斯染色)上分析。對于所有構建物來說，在誘導后，在預期MW附近出現(xiàn)條帶。為了從可溶級份分離蛋白，將約1.3升培養(yǎng)物在30°C誘導5.5小時。收獲細胞，重新懸浮在50mMTris,150mMNaCl,pH7.8的緩沖液中，然后通過細胞裂化器進行破碎。通過離心回收可溶級份，并上樣到裝有Ni2+的5ml柱子上，用于靶蛋白的基于IMAC的分離。用10倍柱體積的含有20mM咪唑的緩沖液洗柱，并將20至600mM咪唑的梯度用于洗脫步驟。將含蛋白的級份合并，并從15濃縮至6ml(VivaspinMWCO5kDa，^OOrpm)。將蛋白在制備型凝膠過濾柱上進一步純化(Superdex7516/90；50mMTris,150mMNaCl,pH7.8作為運行緩沖液；運行兩次；3ml上樣量/運行)。蛋白在約130ml處洗脫；將相關級份合并并濃縮至終體積IOml(VivaspinMWCO5kDa，^OOrpm)。計算的可溶表達水平在每升細胞培養(yǎng)物10_15mg的范圍內(nèi)。圖10顯示了在20mMPBS,150mMNaCl，pH7.2中的scQ2aI_L16構建物的CD熱掃描圖。熱掃描圖表明在高達90攝氏度下不存在熱解折疊。這顯示了所述構建物的高熱穩(wěn)定性，其轉變溫度超過100攝氏度。為了能夠觀察完整的轉變，隨后在存在6M鹽酸胍(GuHCl)的情況下進行了熱解折疊實驗。圖11顯示了在222nm處通過CD記錄的6MGuHCl中的scQ2aI_L16和scQ2aI_L8的熱變性掃描。在同樣的PBS緩沖液中，蛋白濃度約為30μM。將掃描擬合于雙穩(wěn)態(tài)轉變模型并轉變成部分折疊蛋白。發(fā)現(xiàn)scQ2aI_L8構建物的轉變溫度比scQ2aI_L16構建物高7攝氏度。該結果沒有預料到，因為只有L16構建物提供有長得足以橋接平行取向(“上手連接”)中螺旋末端之間的距離的連接物。正如上文所述，連接物中的殘基數(shù)必須至少為卷曲型螺旋的螺旋中的殘基數(shù)的一半。事實上，8個殘基的GlyAer-連接物少于理論上所需的雄=14個殘基，即使加帽殘基被當作連接物的一部分(即忽略了它們需要允許鏈方向的改變，這也需要至少一個或兩個殘基這一事實)。因此，可以得出結論，scQ2aI_L8構建物的較高的熱穩(wěn)定性與平行卷曲型螺旋結構相矛盾。還考慮到了太短的連接物可能誘導一個或多個螺旋末端的局部解折疊，并因此仍在平行取向中允許上手閉合。這一假說被認為是不可能的，因為這種現(xiàn)象在邏輯上將產(chǎn)生穩(wěn)定性更低的構建物而不是觀察到的更高的穩(wěn)定性。然而，為了排除后一種可能性，制造了一系列“短”構建物，其在每個α-螺旋中少包含一個七殘基。具體來說，新構建物的七殘基重復序列由序列IEEIQKQIAAIQKQIYRM構成(代替IEEIQKQIAAIQKQIAAIQKQIYRM)，具有相同的側翼區(qū)段和式(GGSG)nGG的Gly/Ser連接物，其中η=1、2、3、4，產(chǎn)生的相應構建物被命名為“短_L6”、“短_L10”、“短_L14”和“短_L18”。根據(jù)推理，如果具有太短連接物的構建物(理論上，L6和LlO構建物)發(fā)生局部解折疊，這將肯定降低其熱穩(wěn)定性。因此，通過CD熱掃描對這些構建物在不同的GuHCl濃度下進行了試驗，并測定它們的轉變溫度。圖12顯示了結果。發(fā)現(xiàn)在同樣的GuHCl濃度下，所有四種短構建物都不如參比的scQ2aI_L16穩(wěn)定，轉變溫度低約40攝氏度，由于卷曲型螺旋尺寸的減小，這一結果是合乎預期的。在所有測試條件下，四種短構建物的相對穩(wěn)定性非常相似。在最高的GuHCl濃度(4M)下，具有最短連接物的構建物(短L6)再一次比其他構建物更穩(wěn)定一些。因此得出結論，局部螺旋解開的假說不適用，因此，最可能的是所有構建物不是平行的，而是反向平行的。實施例6、NMR實驗為了進一步提供前一實施例的參比卷曲型螺旋序列反向平行折疊的證據(jù)，對構建物scQ2aI_L16和scQ2aI_L8記錄了1N1HHSQCNMR波譜。圖13顯示了分別標為“L16”和“L8”的波譜圖。側鏈和骨架酰胺分別在右上和左下象限中近似成簇，并且更撓性的連接物骨架酰胺在左上象限成簇。觀察到兩個譜圖高度相似，其表明折疊類型不依賴于連接物長度。因為L8連接物在結構上與平行折疊不相容，因此從這些結果得出結論，二者最可能是反向平行的。為了提供其他證據(jù)，制造了scQ2aI_L16衍生物，其中將色氨酸(W)導入到第二個螺旋的N-端附近，將半胱氨酸(C)導入到第三個螺旋的C-端附近。完整的氨基酸序列是MGHHHHHHHHHHSSGHIEGRHMS-IEEIQKQIAAIQKQIAAIQKQIYRM-TGGSGGGSGGGSGGGSGWS-IEEIQKQIAAIQKQIAAIQKQIYRM-TGGSGGGSGGGSGGGSGMS-IEEIQKQIAAIQKQIAAIQ￡QIYRM-TP(對突變進行了強調(diào))。如果該序列折疊成單鏈反向平行卷曲型螺旋，那么兩個突變位置將在空間上鄰近。后者可以通過將半胱氨酸與自旋標記物偶聯(lián)并監(jiān)測自旋標記物對色氨酸側鏈NHε的共振的影響來檢查。如果標記的半胱氨酸與色氨酸近鄰(即優(yōu)選小于約15A)，那么NHε色氨酸信號將顯著降低。用維生素C處理還原了NO'自由基，從而恢復(或增加)了ΝΗε信號。圖14顯示了所述突變構建物的所述色氨酸NHε的NMR共振。在本實驗中使用的自旋標記物是3-(2-碘乙酰胺基)-proxy1[即3-(2-碘乙酰胺基)_2，2，5，5四甲基-1-吡咯烷基氧化物，自由基，來自AcrosOrganics,目錄號224980250]。當對未處理和維生素C處理的樣品(在圖14中相應標出)的信號進行比較時，觀察到帶有自由基自旋標記物的未處理樣品的信號，與具有還原標記物的對照樣品相比，事實上顯著降低了。這證明了色氨酸與半胱氨酸近鄰，由于卷曲型螺旋結構的維度(長度約40A)，其只可能處于反向平行折疊中。實施例7、平行和反向平行單鏈卷曲型螺旋的分子模擬圖15顯示了具有構建物scQ2aI_L16(不含N-端標簽)的氨基酸序列的平行(左圖)和反向平行(右圖)的三鏈單鏈卷曲型螺旋的3-D分子模型。由HRS1、HRS2和HRS3構成的α-螺旋分別命名為A、B和C。兩個連接物片段分別標為Ll和L2。平行模型通過從PDB結構IGCM開始進行同源性模擬來構建。反向平行模型通過反轉平行模型中的B螺旋取向，然后將它沿著其螺旋軸移動直到所有側鏈都不具有原子重疊來構建。后者在沒有修改核心側鏈的構象異構體結構的情況下完成。連接物片段通過圍繞主鏈二面角交互旋轉、分子動力學模擬和能量最小化的組合，并同時限制α-螺旋區(qū)段來模擬。已經(jīng)產(chǎn)生了用于檢測反向平行取向在結構上是否可行的模型。因為所有形成核心的側鏈可以置于其最松弛的構象異構體構象中，沒有留下斷續(xù)的空腔，并產(chǎn)生了每個七殘基層的可信的堆積，因此得出結論，反向平行取向在結構上是可能的，至少在所顯示的模型中是可能的。表權利要求1.由式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3所示的分離的單鏈蛋白，其中HRS1、Li、HRS2、L2和HRS3表示共價互連的氨基酸序列片段，并且其中a)HRSUHRS2和HRS3各自獨立地是七殘基重復序列，所述七殘基重復序列由a-b-c-d-e-f-g所示的重復的7殘基氨基酸序列模式構成，并且b)Ll和L2各自獨立地是由1至30個氨基酸殘基構成的連接物；并且其中所述蛋白在水性溶液中通過HRS1、HRS2和HRS3片段自發(fā)折疊形成三鏈反向平行的α-螺旋卷曲型螺旋結構。2.由式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3所示的分離的單鏈蛋白，其中HRS1、Li、HRS2、L2和HRS3表示共價互連的氨基酸序列片段，所述蛋白在水性溶液中通過HRS1、HRS2和HRS3片段自發(fā)折疊形成三鏈反向平行的α-螺旋卷曲型螺旋結構，并且其中a)HRSl、HRS2和HRS3各自獨立地是七殘基重復序列，其特征為由(a-b-C-d-e-f-g-)n或(d-e-f-g-a-b-c-)n所示的η次重復的7殘基氨基酸類型的序列模式，其中序列模式的元件“a”到“g”表示所述氨基酸類型所處的常規(guī)七殘基位置，并且η是等于或大于2的數(shù)字，并且b)常規(guī)七殘基位置“a”和“d”主要被疏水氨基酸類型占據(jù)，常規(guī)七殘基位置“b”、“c”、“e”、“f”和“g”主要被親水氨基酸類型占據(jù)，得到的疏水和親水氨基酸類型之間的分布能夠鑒定所述七殘基重復序列，并且c)Ll和L2各自獨立地是由1至30個氨基酸殘基構成的連接物，該連接物包括不能明確指派給七殘基重復序列的任何氨基酸殘基。3.權利要求1或2任一項的分離的蛋白，其是非天然蛋白。4.權利要求1到3任一項的分離的蛋白，其中至少50%,70^^90%或其中100%的常規(guī)七殘基位置“a”和“d”被選自纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸的氨基酸或其非天然衍生物所占據(jù)。5.權利要求1到4任一項的分離的蛋白，其中至少50%,70^^90%或其中100%的常規(guī)七殘基位置“a”和“d”被選自纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸的氨基酸或其非天然衍生物所占據(jù)。6.權利要求1到5任一項的分離的蛋白，其中至少50%、70%、90%或其中100%的常規(guī)七殘基位置“a”和“d”被異亮氨酸占據(jù)。7.權利要求1到6任一項的分離的蛋白，其中至少50%,70^^90%或其中100%的常規(guī)七殘基位置“b”、“C”、“e”、“f”和“g”被選自甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸的氨基酸或其非天然衍生物所占據(jù)。8.權利要求1到7任一項的分離的蛋白，其中Ll和L2所具有的氨基酸組成包含至少50%、70%、90%或包含100%的選自甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸的氨基酸或其非天然衍生物。9.權利要求1到8任一項的分離的蛋白，其中Ll和L2所具有的氨基酸組成包含至少50%、70%、90%或包含100%的選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸的氨基酸或其非天然衍生物。10.權利要求1到9任一項的分離的蛋白，其中Ll和L2所具有的氨基酸組成包含至少50%、70%、90%或包含100%的甘氨酸和/或絲氨酸。11.權利要求1到10任一項的分離的蛋白，其中每個Ll和L2的氨基酸殘基數(shù)量合計少于相應的Ll或L2之前的七殘基重復序列的氨基酸殘基數(shù)量的一半。12.權利要求1到11任一項的分離的蛋白，其中接近Ll和/或L2末端的氨基酸殘基使卷曲型螺旋結構的α-螺旋末端穩(wěn)定。13.權利要求1到12任一項的分離的蛋白，其中接近Ll和/或L2末端的氨基酸殘基促進結構中局部轉角的形成。14.權利要求1到13任一項的分離的蛋白，其中常規(guī)七殘基位置“e”和“g”被谷氨酰胺占據(jù)。15.權利要求1到14任一項的分離的蛋白，其中常規(guī)七殘基位置“b”、“c”和“f”是極性的、促進溶解性的氨基酸。16.權利要求1到15任一項的分離的蛋白，其在pH介于1至13之間、或2至12之間、或3至11之間、或4至10之間或5至9之間的水性溶液中折疊。17.權利要求1到16任一項的分離的蛋白，其在溫度介于0°C至100°C之間、或0°C至80V之間或0°C至60V之間的水性溶液中折疊。18.權利要求1到17任一項的分離的蛋白，其在離子強度介于0至1.0摩爾之間的水性溶液中折疊。19.權利要求1到18任一項的分離的蛋白，其用作支架。20.權利要求1或2任一項的分離的蛋白，為如圖15中所示的反向平行取向。21.一種核酸，其編碼權利要求1到20任一項的蛋白。22.—種載體，其包含權利要求21的核酸。23.一種宿主細胞，其包含權利要求21或22的核酸或載體。24.用于生產(chǎn)權利要求1到20任一項的蛋白的方法，所述方法包含將核酸或載體導入宿主細胞，將所述宿主細胞在表達核酸和產(chǎn)生蛋白的條件下培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，以及從所述宿主細胞和/或所述培養(yǎng)基分離蛋白。全文摘要本發(fā)明涉及式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的單鏈蛋白，其中HRS1、HRS2和HRS3是七殘基重復序列，L1和L2是結構撓性的連接物序列，并且HRS1、HRS2和HRS3在水性溶液中形成熱力學穩(wěn)定的三鏈反向平行的α-螺旋卷曲型螺旋結構。本發(fā)明還涉及氨基酸序列變體、獲得這些蛋白和變體的條件和方法以及它們的應用，特別是作為支架和治療用藥品的應用。文檔編號C07K1/00GK102245623SQ200980149343公開日2011年11月16日申請日期2009年12月8日優(yōu)先權日2008年12月8日發(fā)明者伊格賴斯·萊斯特斯,斯特凡·納夫瑞斯,約翰·德斯麥特申請人:康普里斯有限公司