專利名稱：選擇性抗癌嵌合肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肽毒素，一種新穎的靶向治療劑。
背景技術(shù)：
業(yè)內(nèi)對針對可用作抗癌藥的一種免疫毒素進行了廣泛的研究，這種免疫毒素中，抗癌細胞表面過表達蛋白的單克隆抗體或配體與植物毒素或細菌毒素偶聯(lián)(非專利文件1)。在臨床前期和臨床試驗中對多種免疫毒素進行了實驗，且白介素-2-白喉(interleukin-2-diphteria)毒素(IL2-DT ；Ontak )已得到批準用于治療慢性T淋巴細胞白血病(Chronic T Cell Lymphocytic Leukemia，CLL)(非專利文件2，非專利文件3)。此外，基于包括白介素-4-綠膿桿菌(interleukin-4-Pseudomonas)外毒素 (IL4 (38-37)-PE38KDEL)和白介素-13-綠膿桿菌(interleukin-lS-I^seudomonas)外毒素 (IL13-PE38QQR)的綠膿桿菌外毒素的免疫毒素已在臨床試驗中進行了實驗(非專利文件 4，非專利文件幻。白喉毒素與綠膿桿菌外毒素二者都在攝取進入溶酶體、激活并轉(zhuǎn)運進入胞質(zhì)后，通過催化使核糖體復(fù)合物中的延伸因子2(el0ngati0n factor幻蛋白失活而起作用。此作用機制使得免疫毒素有效地破壞休眠、非復(fù)制型的腫瘤細胞。盡管針對癌癥使用基于細菌毒素的免疫毒素的靶向方法有極大吸引力，但其使用限制在于由細菌毒素導(dǎo)致的肝毒性和由毒素蛋白造成的免疫原性(非專利文件2，非專利文件4，非專利文件6)。此外，免疫毒素的分子大小與化學(xué)化合物或片段抗體藥物相比通常較大，此可能妨礙藥物有效地滲透到人體內(nèi)的腫瘤中。為了解決這些問題，迫切需要采用改進方法的新一代免疫毒素。多年以來,表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)已成為重要的腫瘤特異性靶點(非專利文件7，非專利文件8)。EGFR在細胞生長、分化和遷移中扮演著重要的角色。發(fā)現(xiàn)其正向信號可使增殖增加、凋亡減少，并且提高腫瘤細胞的遷移和血管新生(非專利文件9)。EGFR過表達常見于廣譜上皮源性的人類腫瘤中，包括乳腺癌、 肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、胰腺癌和卵巢癌(非專利文件10)。所有這些發(fā)現(xiàn)都表明， EGFR作為靶點對于受體介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng)是重要的。近來，若干研究報導(dǎo)，通過篩選噬菌體展示庫可成功鑒定EGFR的肽配體，這暗示了可能的靶向EGFR的藥物遞送(非專利文件 11，非專利文件12)。治療性肽在多種應(yīng)用中的使用越來越受歡迎(例如，腫瘤疫苗(非專利文件13)、 抗菌療法(非專利文件14)和核酸給藥(非專利文件15))(非專利文件16)。此外，業(yè)內(nèi)已著手關(guān)于涉及肽類藥物的癌癥新療法的研究與開發(fā)(非專利文件17，非專利文件18)。業(yè)內(nèi)也公知，借助重組體或固相化學(xué)合成技術(shù)，可相對容易地發(fā)生肽治療，且與基于抗體的治療相比時成本較低。近年來，已報導(dǎo)，由含有D-和L-型亮氨酸和賴氨酸的15-氨基酸非對映異構(gòu)序列組成的新溶解型肽可破壞質(zhì)膜(非專利文件19)。與正常細胞相比，這種肽更容易殺傷腫瘤細胞，且以類似去垢劑的方式使細胞膜解體。這種細胞選擇性很可能是主要通過癌細胞壁上酸性成分或磷脂酰絲氨酸的水平增加決定的(非專利文件19)。非對映異構(gòu)序列在血清中且在蛋白水解酶存在下都保持活性(非專利文件20)。表明，肽的選擇性很可能主要受癌細胞壁上酸性成分或磷脂酰絲氨酸的水平增加影響(非專利文件19)。這種溶解肽在正常細胞與癌細胞之間具有選擇性細胞毒性，但仍以較低的濃度殺傷正常細胞， 因而不適合與具有靶向部分的肽組合。而且，文件17、19和20中所報道的肽不適于分子靶向，因為未觀察到通過EGFR靶向作用的細胞殺傷效應(yīng)提高。多種潛在的分子靶向抗癌上市藥物都抑制受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase)和腫瘤生長。在某些情況下，癌細胞中與激酶有關(guān)的信號分子基因的突變導(dǎo)致對酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine Kinase Inhibitor,TKI)藥物產(chǎn)生耐藥性。近來，研究人員發(fā)現(xiàn) k-ras突變明顯與患有非小細胞肺癌和晚期結(jié)直腸癌的患者體內(nèi)缺少對表皮生長因子受體的(EGFR)TKI和西妥昔(cetuximab)的響應(yīng)有關(guān)(非專利文件21)。為了解決這個關(guān)鍵問題，業(yè)內(nèi)需要開發(fā)研究直接殺傷癌細胞的新穎的分子靶向抗癌藥物，該抗癌藥物優(yōu)于信號通路阻斷劑。[現(xiàn)有技術(shù)文件][非專利文件]# 專禾Ij JC # 1 =Pastan I. Targeted therapy of cancer with recombinant immunotoxins. Biochim Biophys Acta 1997 ； 1333 :C1_6非專禾Ij 文件 2 =Kawakami K, Nakajima 0，Morishita R, Nagai R. Targeted anticancer immunotoxins and cytotoxic agents with direct killing moieties. The Sci World J 2006 ；6 :781-90非專利文件3 :Kreitman RJ. Immunotoxins for targeted cancer therapy. AAPS J 2006 ；8 :E532-51非專禾Ij 文件 4 :Rand Rff, Kreitman RJ, Patronas N, Varricchio F, Pastan I, Puri RK. Intratumoral administration of recombinant circularly permuted interleukin-4-Pseudomonas exotoxin in patients with high-grade glioma. Clin Cancer Res 2000 ；6 :2157-655 =Kunwar S, Prados MD, Chang SM ·入，Cintredekin Besudotox Intraparenchymal Study Group. Direct intracerebral delivery of cintredekin besudotox(IL13-PE38QQR)in recurrent malignant glioma:a report by the Cintredekin Besudotox Intraparenchymal Study Group. J Clin Oncol 2007 ；25 :837-44非專利文件 6 =Frankel AE, Kreitman RJ, Sausville EA. Targeted toxins. Clin Cancer Res 2000 ；6 :326-34非專禾|J 文 # 7 GrunwaId V, Hidalgo Μ. Developing inhibitors of the epidermal growth factor receptor for cancer treatment. J Natl Cancer Inst 2003 ； 95 :851-67
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的目的是提供一種具有新結(jié)構(gòu)的新藥(例如，抗癌劑)。解決問題的方法借助本發(fā)明人關(guān)于與EGFR結(jié)合的肽序列和溶解型肽序列的最近鑒定信息，本發(fā)明人開發(fā)研究了靶向EGFR-過表達癌細胞的新嵌合肽，發(fā)現(xiàn)包括受體結(jié)合肽和細胞毒素肽的嵌合肽可用作藥物，例如抗癌劑。此嵌合肽(本文中稱為EGFR-靶向的肽毒素)優(yōu)選地由受體結(jié)合肽(例如，EGFR-結(jié)合部分)和細胞毒素肽(例如，細胞膜-溶解部分)及間隔(例如，三個甘氨酸間隔)組成。這種嵌合肽的特征在于，與靶向肽組合時穩(wěn)定，且與原始溶解型肽相比對正常細胞系具有較低的毒性作用。在本發(fā)明中，本發(fā)明人披露了在7種得自乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌和腦瘤的人類癌細胞系中，由本發(fā)明的嵌合肽(例如， EGFR-靶向的肽毒素)誘導(dǎo)的體外細胞毒性和細胞死亡的選擇性。本發(fā)明人還對EGFR-靶向的肽毒素與癌細胞表面的相互作用，和肽毒素誘導(dǎo)的癌細胞死亡的作用模式進行了研究。 體內(nèi)實驗還顯示，本發(fā)明的嵌合肽呈現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性。此使得所述肽還可應(yīng)用于除作為實際的抗癌藥物外的可行領(lǐng)域，例如，篩選藥物或諸如此類的應(yīng)用，迄今為止此應(yīng)用尚屬未知。這是由于，可能采用篩選形式的應(yīng)用以發(fā)現(xiàn)與特定蛋白(例如受體)結(jié)合的肽序列，其中合成多種具有候選序列的嵌合肽和溶解肽且以體外細胞殺傷效應(yīng)作為指標。舉例而言，可使用氨基酸序列來實現(xiàn)篩選藥物/抗癌劑的方法，所述氨基酸序列靶向EGFR高表達的癌細胞中的EGFR和所述癌細胞的細胞膜。如上所述，常規(guī)技術(shù)中的溶解型肽在正常細胞與癌細胞之間具有選擇性細胞毒性，而本發(fā)明的肽對正常細胞具有降低的毒性。因而，已揭示本發(fā)明的肽適合與肽和靶向部分結(jié)合。此肽毒素是由靶結(jié)合肽和細胞毒性溶解肽部分組成的化學(xué)合成肽。作為一個實施例，表皮生長因子受體(EGFR)-結(jié)合肽與包括富含陽離子氨基酸的溶解型肽偶聯(lián)，此通過正電荷崩解細胞膜來殺傷癌細胞。在EGFR過表達的癌細胞系中，EGFR-靶向的肽毒素與單獨的溶解肽相比可誘導(dǎo)IC5tl(使對照細胞的增殖受到50%抑制的肽濃度)增加約3倍。相反，正常細胞系對EGFR靶向的肽毒素或單獨的溶解肽具有低敏感性。在正常細胞中，顯示 IC50比在癌細胞中高4-8倍。有趣的是，EGFR在細胞表面上的表達與靶向EGFR所致的肽毒素的細胞殺傷效應(yīng)的提高程度明顯相關(guān)，此表明存在特異性。令人驚奇地，EGFR靶向的肽毒素暴露不到10分鐘時，足以殺傷超過50%的癌細胞。而且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在提供有肽毒素的癌細胞中，聚半胱天冬酶的激活和Armexin V(膜連蛋白)陽性表達受到誘導(dǎo)，并提出細胞凋亡機制被誘導(dǎo)。綜上所述，靶向在癌細胞中高度表達蛋白的肽毒素可成為新穎的癌癥靶向治療的重要手段。因而，本發(fā)明包括下列內(nèi)容。在本發(fā)明的第一方面中，本發(fā)明提供一種包括受體結(jié)合肽和細胞毒素肽的嵌合肽。在一個實施例中，受體結(jié)合肽可為表皮生長因子(Epidermal Growth Factor, EGF)受體結(jié)合肽、白介素-4(IL-4)受體結(jié)合肽、白介素-13(IL-13)受體結(jié)合肽、神經(jīng)纖毛蛋白(Neuropil in，NRP)受體-結(jié)合肽、2型人類表皮生長因子受體(Human EGF Rec印tor，HER》-結(jié)合肽、血管內(nèi)皮生長因子受體(Vascular Epidermal Growth Factor Receptor, VEGFR)-結(jié)合肽、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin Receptor, TfR)-結(jié)合肽、酪氨酸蛋白激酶受體(印hrin)Bl(EphBl)-結(jié)合肽、印hrin B2 (EphB2)-結(jié)合肽、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (Glucose-regulated Protein 78，GRP78)-結(jié)合肽、前列腺特異性膜抗原 (Prostate-specific Membrane Antigen，PSMA)-結(jié)合月太或諸如此類。從另一觀點來論述，在本發(fā)明的主要方面中，本發(fā)明提供一種肽毒素，一種包括抗癌靶向肽和細胞膜-溶解肽部分的嵌合肽。本發(fā)明主要方面中的具體實施例包括(例如)使用與受體結(jié)合的肽的肽毒素，所述受體是(例如)表皮生長因子(EGF)、2型人類表皮生長因子受體(HER)、血管內(nèi)皮生長因子受體1 (VEGFRl)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)、白介素_4 (IL4)、白介素-13 (IL13)、神經(jīng)纖毛蛋白(NRP)、神經(jīng)纖毛蛋白I(NRPl)/血管內(nèi)皮生長因子受體2 (VEGFR2)、印hrin Bl (EphBl)、 ephrin B2 (EphB2)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP78)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)或諸如此類。下文為嵌合肽示例(本文所用的每個字母表示單字母氨基酸表示法)。EB-溶解YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLISLLKLLKKmSEQ ID NO 2)EB (H2R)-溶解 ARWYGYTPQNVIGGGKLLLKIJjgiLLKLLKKK (SEQ ID NO 14)HER2-溶解YCDGFYACYMDVGGGKLLLKLLISLLIiLLKKmSEQ ID NO :15)VEGFRl-溶解WHSDMEffffYLLGGGGKLLLKLLISLLKLLKKK (SEQ ID NO :16)TfR-溶解THRPPMWSPVWPGGGKLLLKLLISLLKLLKKK (SEQ ID NO :17)LyticL 肽KLLLKLLKKLLKLLKKK (SEQ ID NO :27)IL4-LyticL :KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO :18)IL13-LyticL :KDLLLHLKKLFREGQFNGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO :19)Sema3A-LyticU 與人類神經(jīng)纖毛蛋白-I 結(jié)合):NYQWVPYQGRVPYPRGGGKLLLKLLKK LLKLLKKK(SEQ ID NO :20)EGFbuf :YHWYGYTPQNVIGGGGGRLLRRLLRRLLRK(SEQ ID NO :21)在一個實施例中，本發(fā)明中所使用的細胞膜-溶解肽部分由具有正電荷的氨基酸 (K、R或(H))和疏水性氨基酸(L、A、F或諸如此類)組成，且具有10-至30-氨基酸序列及兩親性螺旋結(jié)構(gòu)。在一個實施例中，本發(fā)明中所使用的抗癌靶向肽具有與在癌細胞中高表達的受體特異性結(jié)合的序列，溶解肽部分具有癌細胞膜-溶解序列，且具有間隔。在一個實施例中，本發(fā)明中所使用的溶解肽部分由具有正電荷的氨基酸(K、R或 (H))和疏水性氨基酸(L、A、F或諸如此類)組成，且具有10-至30-氨基酸序列及兩親性螺旋結(jié)構(gòu)。在一個實施例中，本發(fā)明中所使用的間隔是由G和P組成的0-至5-氨基酸序列。在一個方面中，本發(fā)明提供一種包括EGF受體結(jié)合肽和細胞毒素肽或細胞溶解肽的嵌合肽。在一個實施例中，本發(fā)明中所使用的EGF受體結(jié)合肽具有氨基酸序列 YHWYGYTPQNVI (SEQ ID NO :7)，其中每個字母表示單字母氨基酸表示法，或其修飾的序列。在一個實施例中，本發(fā)明中所使用的EGF受體結(jié)合肽具有氨基酸序列 X1X2X3X4X5X6X7X8X9XioXiiXi2(SEQ ID N0:8)，其中&是Y或與Y類似的氨基酸；&是H或與H類似的氨基酸；
)(3是1或與W類似的氨基酸；&是Y或與Y類似的氨基酸；&是G或與G類似的氨基酸；&是Y或與Y類似的氨基酸；X7是T或與T類似的氨基酸；&是P或與P類似的氨基酸；X9是Q或與Q類似的氨基酸；X10是N或與N類似的氨基酸；X11是V或與V類似的氨基酸；且X12是I或與I類似的氨基酸。在優(yōu)選實施例中，X1是Y或具有OH基團或芳香基團的與Y類似的氨基酸；&是H或具有正電荷的與H類似的氨基酸；)(3是1或具有芳香基團的與W類似的氨基酸；X4是Y或具有OH基團的與Y類似的氨基酸；&是G或具有脂肪族側(cè)鏈的與G類似的氨基酸；&是Y或具有OH基團的與Y類似的氨基酸；X7是T或具有OH基團的與T類似的氨基酸；&是P或與P類似的亞氨基酸類氨基酸；知是Q或與Q類似的酰胺類氨基酸；X10是N或具有OH基團的與N類似的氨基酸；X11是V或具有脂肪側(cè)鏈的與V類似的氨基酸；且X12是I或具有脂肪側(cè)鏈的與I類似的氨基酸。在更為優(yōu)選的實施例中，&是Y或與Y類似的氨基酸S、H或F ；)(2是!1或與H類似的氨基酸R或K;)(3是1或與1類似的氨基酸￥、？或!1;)(4是￥或與Y類似的氨基酸S、H或F;&是G或與G類似的氨基酸A、V、I或L ；)(6是￥或與Y類似的氨基酸S、H或F;X7是T或與T類似的氨基酸S、H或F ；&是P或與P類似的氨基酸羥脯氨酸；X9是Q或與Q類似的氨基酸N ；Xltl是N或與N類似的氨基酸S、H或F;、是￥或與￥類似的氨基酸63、1^或1;且X12是I或與I類似的氨基酸G、A、V或L。在更為優(yōu)選實施例中，&是H或與H類似的氨基酸R或K。在更為優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的嵌合肽具有序列YRWYGYTPQNVI(SEQ ID NO 9) 或 YKffYGYTPQNVI(SEQ ID NO 10)。在一個實施例中，本發(fā)明中所使用的細胞毒素肽選自包含下列的組細胞膜-溶解肽、細胞膜電位-去穩(wěn)定化肽、細胞膜-溶解肽和線粒體膜-崩解肽。
在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明中所使用的細胞膜-溶解肽具有僅由K和L組成的10-至 20-氨基酸序列，且氨基酸是L-、D-或D，L-混合氨基酸。在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明中所使用的細胞膜-溶解肽是KLLLKLLKKLLKLLKKK (SEQ ID NO 48 ；特別地SEQ ID NO :1或27或諸如此類)，且氨基酸是L_、D-或D，L-混合氨基酸。在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明中所使用的細胞膜電位-去穩(wěn)定化肽是 FLKLLKKLAAKLF(SEQ ID NO :11)。在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明中所使用的細胞膜-溶解肽是 RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR(SEQ ID NO: 12)或 RLLRRLLRRLLRK(SEQ ID NO :13)。在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明中所使用的線粒體膜-崩解肽是KLAKLAKKLAKLAK (SEQ ID NO 4)。在一個實施例中，本發(fā)明中所使用的細胞毒素肽由具有正電荷的氨基酸(K、R或 (H))和疏水性氨基酸(L、A、F或諸如此類)組成，且具有10-至30-氨基酸序列及兩親性螺旋結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明中所使用的具有正電荷的氨基酸是K、R或H。在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明中所使用的疏水性氨基酸是I、L、V、A或F。在更為優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明中所使用的疏水性氨基酸是 KLLLKLLKKLLKLLKKK (SEQ ID NO 1)，其中每個氨基酸都是L-或D-氨基酸且加下劃線的字
母表示D-氨基酸。在一個實施例中，本發(fā)明中所使用的細胞毒素肽由具有正電荷的氨基酸(K、R或 (H))和疏水性氨基酸(L、A、F或諸如此類)組成且具有10-至30-氨基酸序列及兩親性螺旋結(jié)構(gòu)。在一個實施例中，本發(fā)明中所使用的具有正電荷的氨基酸是K、R或H。在一個實施例中，本發(fā)明中所使用的疏水性氨基酸是I、L、V、A或F。在一個實施例中，本發(fā)明中所使用的疏水性氨基酸是KLLLKLLKKLLKLLKKK (SEQ ID NO :1)，其中每個氨基酸都是L-或D-氨基酸且加下劃線的字母表示D-氨基酸。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽進一步含有間隔肽。在一個實施例中，本發(fā)明中所使用的間隔肽呈現(xiàn)連接有0至4個單獨的甘氨酸、單獨的脯氨酸或混合的甘氨酸與脯氨酸的序列，且優(yōu)選地為GGG。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽具有序列YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKii LKKLLKLLKKK(SEQ ID NO :2)。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽具有序列YRWYGYTPQNVIGGGKLLLKL· LKKLLKLLKKK (SEQ ID NO :43)，其中加下劃線的字母表示D-氨基酸。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽的受體結(jié)合肽是白介素-4(IL_4)受體結(jié)合肽， 且具有氨基酸序列KQLIRFLKRLDRN(SEQ ID NO :26)或其修飾的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽的受體結(jié)合肽是白介素-13(IL_13)受體結(jié)合肽，且具有氨基酸序列KDLLLHLKKLFREGQFN(SEQ ID NO :28)或其修飾的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽的受體結(jié)合肽是神經(jīng)纖毛蛋白受體結(jié)合肽，且具有氨基酸序列NYQWVPYQGRVPYPR(SEQ ID NO :29)或其修飾的序列。
在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽的受體結(jié)合肽是2型人類表皮生長因子受體(HER2)-結(jié)合肽，且具有氨基酸序列YCDGFYACYMDV(SEQ ID NO :30)、 LLGPYELffELSH (SEQ ID NO 52), ALVRYKDPLFVffGFL (SEQ ID NO 5 、KCCYSL (SEQ ID NO: 54) ,WTGffCLNPEESTffGFCTGSF (SEQ ID NO 55) ,DTDMCffffffSREFGffECAGAG (SEQ ID NO 56)或其修飾的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽的受體結(jié)合肽是血管內(nèi)皮生長因子受體I(VEGFRl)-結(jié)合肽，且具有氨基酸序列WHSDMEffffYLLG(SEQ ID NO :31)、 VEPNCDIHVMWEWECFERL-NH2(SEQ ID NO :3 )或GGNECDAIRMWETO CFERL(SEQ ID NO 33)或其修飾的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽的受體結(jié)合肽是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)-結(jié)合肽且具有氨基酸序列THRPPMWSPVWP (SEQ ID NO 34)或其修飾的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽的受體結(jié)合肽是成纖維細胞生長因子受體(Fibroblast Growth Factor Rec 印 tor，F(xiàn)GFR)-結(jié)合肽，且為 MQLPLAT (SEQ ID NO: 5)或AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO :6)；神經(jīng)纖毛蛋白1 (NRPl) /血管內(nèi)皮生長因子受體 2(VEGFR2)_ 結(jié)合肽，且為 ATffLPPR(SEQ ID NO 36) ；ephrinBl (EphBl)-結(jié)合肽，且為 EffLS (SEQ ID NO 37) ；ephrinB2 (EphB2)-結(jié)合肽，且為 SNEff (SEQ ID NO 38)；白介素-ll受體(ILllR)-結(jié)合肽，且為CGRRAGGSC(環(huán)狀)(SEQ ID NO 22)；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78(GRP78)_ 結(jié)合肽，且為 WDLAWMFRLPVG(SEQ ID NO 39)或 CTVALPGGYVRVC (環(huán)狀)(SEQ ID NO 40)；前列腺特異性膜抗原(PSMA)-結(jié)合肽，且為CQKHHNYLC (SEQ ID NO 35)；或其修飾的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽具有選自包含下列的組的序列SEQ ID NO :2、 14、21、42和43，或其修飾的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽具有SEQ ID NO 15中所闡明的序列或其修飾的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽具有SEQ ID NO 16中所闡明的序列或其修飾的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽具有SEQ ID NO 17中所闡明的序列或其修飾的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽具有SEQ ID NO 18或44中所闡明的序列或其修飾的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽具有SEQ ID NO 19中所闡明的序列或其修飾的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽具有SEQ ID NO :20、46或47中所闡明的序列或其修飾的序列。在一個方面中，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明嵌合肽的核酸。在另一方面中，本發(fā)明提供包括編碼本發(fā)明嵌合肽的核酸的載體。在另一方面中，本發(fā)明涉及包括編碼本發(fā)明嵌合肽的核酸的細胞。在另一方面中，本發(fā)明涉及一種藥物，優(yōu)選地涉及一種藥物組合物，其包括本發(fā)明的嵌合肽。
在另一方面中，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明嵌合肽的抗癌劑。在又一方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明嵌合肽用來制造藥物組合物的用途。在另一方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明嵌合肽用來制造抗癌劑的用途。在再一方面中，本發(fā)明涉及一種治療方法，其包括給藥本發(fā)明嵌合肽的步驟。在另一方面中，本發(fā)明涉及治療癌癥的方法，其包括給予本發(fā)明嵌合肽的步驟。在一個方面中，本發(fā)明涉及一種篩選藥物的方法，其使用由本發(fā)明EGF受體-結(jié)合肽靶向的氨基酸序列。在一個方面中，本發(fā)明涉及一種篩選抗癌劑的方法，其使用由本發(fā)明EGF受體-結(jié)合肽靶向的氨基酸序列。已對各種類型嵌合肽的制備進行了嘗試。與最新的現(xiàn)有技術(shù)(Ellerby HM, Arap W, Ellerby LM 等人，Nat Med 1999 ；5 :1032-8 ；PapoN, Shai Y. Biochemistry 2003 ；42 9346-54 ；禾口 Papo N, Braunstein A, Eshhar Z, Shai Y. Cancer Res 2004 ；64 :5779-86)比較而言，可了解，作為本發(fā)明嵌合化的結(jié)果，與癌細胞膜-單獨的溶解肽相比本發(fā)明獲得明顯的效果，在于其達成癌細胞靶向，和針對癌細胞的細胞殺傷效應(yīng)的提高和即刻性。確切地說，盡管另一最新的現(xiàn)有技術(shù)，針對癌癥利用基于細菌毒素的免疫毒素的靶向方法具有極大吸引力，但其使用限制在于由細菌毒素所致的肝毒性和由毒素蛋白所引起的免疫原性 (非專利文件2、4、6)。此外，免疫毒素的分子大小與化學(xué)化合物或片段抗體藥物相比通常較大，此可能妨礙藥物有效地滲透到人體內(nèi)的腫塊中(非專利文件2、4、6)。這些文件僅提出蛋白調(diào)配物(例如免疫毒素)的問題，但未提出解決問題的方式。為了解決這個問題，迫切需要采用改進方法的新一代免疫毒素。在所有這些方面中，應(yīng)了解，本文中所闡述的每一實施例都可應(yīng)用到其他方面中， 只要其適用即可。[本發(fā)明效果]本發(fā)明提供可用作抗癌劑或DDS的物質(zhì)，其具有細胞內(nèi)穩(wěn)定性，針對正常細胞能避免副作用以免功能紊亂，或者其具有瞬時效應(yīng)。


圖IA示出了各種人類癌細胞系中EGFR-結(jié)合(EB)-溶解嵌合肽或單獨的溶解肽的細胞殺傷效應(yīng)。將癌細胞系H322、BT-20、H460、U251、BxPC-3、SU. 86. 86或LNCaP與不同濃度(0至30 μ Μ)的EB-溶解嵌合肽或溶解肽一起培養(yǎng)72小時，并使用WST-8試劑檢測細胞毒性。結(jié)果以一式三份測量值的平均值士SD(bar) (SD Standard Deviation，標準差)表示。將此分析重復(fù)3次。黑色圓圈，EB-溶解嵌合肽；白色圓圈，溶解肽。圖IB示出了各種人類正常細胞系中EB-溶解嵌合肽或單獨的溶解肽的細胞殺傷效應(yīng)。將正常細胞系MRC-5、WI-38或HEK293與不同濃度(0至100 μ Μ)的肽一起培養(yǎng)72 小時，并檢測細胞毒性。結(jié)果以一式三份測量值的平均值士SD(bar)表示。將此分析重復(fù) 3次。黑色圓圈，EB-溶解嵌合肽；白色圓圈，溶解肽。圖IC示出了各種人類癌細胞和正常細胞中EB-原始溶解嵌合肽或單獨的原始溶解肽的細胞殺傷效應(yīng)。將癌細胞系H322和正常細胞系MRC-5與不同濃度(0至30 μ M)的 EB-原始溶解嵌合肽或單獨的原始溶解肽一起培養(yǎng)，并如上所述實施細胞毒性分析。黑色圓圈，EB-原始溶解嵌合肽；白色圓圈，原始溶解肽。圖ID示出了借助圓二色譜(Circular Dichroism Spectrum,CDif)分析新穎嵌合肽的設(shè)計結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)。上面示出了與由Papo和Siai報導(dǎo)的溶解肽(a)(原始溶解肽) 或與新設(shè)計的溶解肽(b)偶聯(lián)的EGFR-結(jié)合(EB)肽的khiffer Edmundson輪形投影。在肽序列中，加下劃線的斜體字母表示D-氨基酸。輪形線圖中的粗體字母表示親水性氨基酸 (主要是Lys)。箭頭表示這些肽的親水性表面的方向。顯示了在PC SUV或PC/PS(4 1) SUV存在下EB-原始溶解肽(c)和EB-溶解肽(d)的⑶譜。肽和脂質(zhì)的濃度分別為50 μ M 禾口 4mM。圖IE示出了 k-ras突變的癌細胞系對酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine Kinase Inhibitor, TKI)的抗性。將野生型k_ras癌細胞系(H322 (黑色圓圈)和BT-20 (黑色三角形))和突變的k-ras癌細胞系(MDA-MB-231 (白色圓圈)、HCT116 (白色三角形)、SW837 (白色菱形)和DLD-l(x))與不同濃度的埃羅替尼(erlotinib)(左；O至80μΜ)或抗EGFR抗體(右；O至20 μ Μ) —起培養(yǎng)72小時，并使用WST-8試劑檢測細胞毒性?？v軸表示相對于對照的細胞存活率(％)，且橫軸表示埃羅替尼(左)和抗EGFR抗體(右)的濃度。將該分析重復(fù)3次，且結(jié)果以一式三份測量值的平均值士SD (bar)表示。圖IF示出了野生型k-ras細胞系中TKI與EB-溶解嵌合肽間的細胞毒性比較。將癌細胞系(H322、BT-20和BxPC-3)和肺正常細胞系(MRC-5)與不同濃度的TKI (埃羅替尼 (白色圓圈)、吉非替尼(gefitinib)(白色三角形)和PD153035(白色菱形)；0至20 μ M) 或EB-溶解嵌合肽(黑色圓圈；0至20 μ Μ) 一起培養(yǎng)72小時，并使用WST-8試劑檢測細胞毒性。縱軸表示相對于對照的細胞存活率(％ )，且橫軸表示TKI和EB-溶解的濃度(μ Μ)。 將該分析重復(fù)3次，且結(jié)果以一式三份測量值的平均值士SD (bar)表示。圖IG示出了用EB-溶解嵌合肽處理對具有k-ras突變的TKI-抗性癌細胞系產(chǎn)生足夠的細胞毒性。將四種類型的突變k-ras癌細胞系(MDA-MB-231)與不同濃度的TKI (埃羅替尼(白色圓圈)、吉非替尼(白色三角形)和PD153035(白色菱形)；0至20μΜ)或 EB-溶解嵌合肽(黑色圓圈；0至20 μ Μ) 一起培養(yǎng)72小時，并使用WST-8試劑檢測細胞毒性?？v軸表示相對于對照的細胞存活率(％ )，且橫軸表示TKI和EB-溶解的濃度(μ Μ)。 將該分析重復(fù)3次，且結(jié)果以一式三份測量值的平均值士SD (bar)表示。圖2A示出了 EB-溶解嵌合肽的細胞殺傷效應(yīng)的提高取決于EGFR在細胞表面的表達。在7種癌細胞系和3種正常細胞系中，EGFR抗體結(jié)合的相對平均熒光強度與EB-溶解嵌合肽的IC5tl (左)、溶解肽的IC5tl (中間)、或溶解肽相對于EB-溶解嵌合肽的IC5tl比(右) 之間的關(guān)聯(lián)。圖2B示出了 EB-溶解嵌合肽對BxPC_3細胞的細胞殺傷效應(yīng)可通過添加EGFR抗體或EGF蛋白重組體得到抑制。在暴露于肽1小時前通過添加抗EGFR的多克隆抗體或EGF 蛋白重組體，來檢測對EB-溶解嵌合肽對BxPC-3的細胞殺傷效應(yīng)的抑制。乍< 0. 05, **P < 0. 01。圖3A示出了 EB-溶解嵌合肽和溶解肽與EGFR蛋白的結(jié)合特性。在傳感器表面上對梯度稀釋的EB-溶解嵌合肽(27 μ M至13 μ Μ)或溶解肽(Μ μ M至12 μ Μ)的樣品進行分析。圖;3Β示出了單獨的溶解肽與自Η322或MRC-5細胞提取的細胞表面膜蛋白結(jié)合的相互作用譜。在傳感器表面上對梯度稀釋的膜蛋白(0. lmg/ml至0. 025mg/ml)的樣品進行分析。圖3C示出了 EB-溶解嵌合肽與自H322或MRC-5細胞提取的細胞表面膜蛋白結(jié)合的相互作用譜。在傳感器表面上對梯度稀釋的膜蛋白(0. lmg/ml至0. 025mg/ml)的樣品進行分析。圖3D示出了 EB-溶解嵌合肽(黑色柱)或單獨的溶解肽(白色柱)與自H322、 BT-20或MRC-5細胞提取的細胞表面膜蛋白的相對Kd值。圖4A示出了 EB-溶解嵌合肽誘導(dǎo)癌細胞的迅速殺傷。H322和BT-20細胞用EB-溶解嵌合肽(黑色柱)或溶解肽(白色柱)處理10分鐘、30分鐘、1小時或48小時，且隨后用新鮮培養(yǎng)基替代含有肽的培養(yǎng)基，并再實施培養(yǎng)48小時。使用WST-8分析細胞的存活率。圖4B示出了 MDA-MB-231乳腺癌細胞中借由EB-溶解嵌合肽的細胞膜的通透。以最終濃度 ο μ M添加EB-溶解肽-TAMRA后，使細胞(3X IO4個細胞/ml)存于鈣黃綠素溶液中0分鐘、2分鐘、5分鐘、10分鐘和20分鐘。箭和箭頭分別表示透化的細胞和穿過膜的肽。圖4C示出了 MDA-MB-231乳腺癌細胞中借由溶解肽細胞膜的通透。以最終濃度 10 μ M添加溶解肽-TAMRA后，使細胞(3 X IO4個細胞/ml)存于鈣黃綠素溶液中0分鐘、2分鐘、5分鐘、10分鐘和20分鐘。圖4D示出了借由EB-溶解嵌合肽對細胞生長的抑制。將H322細胞在含有不同濃度(0至22.5 μ M)的EB-溶解嵌合肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天。用結(jié)晶紫染色后，給由至少50 個細胞組成的集落劃線，且結(jié)果基于集落數(shù)，處理的細胞相對于未經(jīng)處理細胞的百分比表示。未經(jīng)處理的細胞形成117士 10個集落。數(shù)據(jù)為一式兩份測量值的平均值；bar表示SD。圖5示出了 EB-溶解嵌合肽誘導(dǎo)癌細胞中半胱天冬酶(caspase)激活和Armexin V(膜連蛋白)-陽性表達。2小時后用雙色流式細胞儀對與EB-溶解嵌合肽(5μΜ) —起培育的ΒΤ-20細胞進行分析，所述雙色流式細胞儀在綠色通道中分析Armexin V標記(上圖) 或由DEVDase活性表示的半胱天冬酶活性(下圖)，并在紅色通道中分析PI染色。值表示各象限中細胞的百分比。圖6示出了 Η322肺癌細胞的體外細胞生長抑制。將Η322細胞在含有不同濃度(0 至22.5 μ Μ)的EB-嵌合肽或單獨的溶解肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天。用結(jié)晶紫染色后，給由至少50個細胞組成的集落劃線，且結(jié)果以集落數(shù)的百分比表示(100%，未經(jīng)處理的細胞)。 未經(jīng)處理的細胞形成117士 10個集落。數(shù)據(jù)是一式兩份測量值的平均值；bar表示SD。圖7A示出了 EGFR-結(jié)合序列突變肽和人類EGFR重組體的親和力經(jīng)BIAC0RE分析的結(jié)果。突變體是通過將野生型EGFR-結(jié)合肽序列中帶電荷的第二個H經(jīng)化學(xué)合成變成K 或R，使用BIAC0RE生物傳感器響應(yīng)的提高作為指標來檢測與EGFR的親和力。圖7B示出了在與EGFR具有高親和力的R-突變肽和癌細胞膜_單獨的溶解肽之間細胞殺傷效應(yīng)的比較結(jié)果。將人類肺癌細胞系H322與具有梯度稀釋濃度(0至30μΜ) 的兩種肽一起培養(yǎng)72小時，并使用WST-8試劑檢測細胞殺傷效應(yīng)。這些結(jié)果以一式三份測量值的平均值士 SD (bar)表示，且將該分析重復(fù)3次。三角形，EB-嵌合肽；黑色圓圈R_突變體EB-嵌合肽；白色圓圈，膜-溶解肽。圖8A示出了 IL4R-結(jié)合肽和擾頻序列肽與人類IL4R重組體的結(jié)合特性。在傳感器表面上對梯度稀釋的IL4R-結(jié)合肽09 μ M至7. 4 μ M)的樣品進行分析。圖8Β示出了在IL4R-靶向的癌細胞膜-溶解嵌合肽(IL4-LyticL ；四邊形)與癌細胞膜-單獨的溶解肽(LyticL ；菱形)間細胞殺傷效應(yīng)的比較結(jié)果。將人類乳腺癌細胞系MDA-MB-231 (左)和人類胰腺癌細胞系BxPC_3 (右)與具有梯度稀釋濃度(O至10 μ Μ) 的兩種肽一起培養(yǎng)72小時，并使用WST-8試劑檢測細胞殺傷效應(yīng)。將該分析重復(fù)3次，且結(jié)果以一式三份測量值的平均值士SD(bar)表示。圖8C示出了 IL4R-靶向的癌細胞膜-溶解嵌合肽(IL4-LyticL)誘導(dǎo)癌細胞的迅速殺傷。BxPC-3細胞用IOyM的IL4-LyticL(黑色柱)或LyticL(灰色柱)處理2分鐘、 5分鐘、10分鐘、30分鐘或1小時，且隨后用新鮮的培養(yǎng)基替代含肽的培養(yǎng)基，并再繼續(xù)培養(yǎng) 48小時。使用WST-8分析細胞的存活率。圖9A示出了 IL13R-結(jié)合肽和擾頻序列肽與人類IL13R重組體的結(jié)合特性。在傳感器表面上對梯度稀釋的IL13R-結(jié)合肽(Μ μ M至6. 0 μ M)的樣品進行分析。圖9Β示出了在IL13R-靶向的癌細胞膜-溶解嵌合肽(IL13-LyticL)與癌細胞膜-單獨的溶解肽(LyticL)間細胞殺傷效應(yīng)的比較結(jié)果。將人類腦腫瘤細胞系U251(左) 和人類頭和頸部癌細胞系HN-12(右)與具有梯度稀釋濃度(0至20μΜ)的兩種肽一起培養(yǎng)72小時，并使用WST-8試劑檢測細胞殺傷效應(yīng)。將該分析重復(fù)3次，且結(jié)果以一式三份測量值的平均值士SD(bar)表示。菱形，LyticL ；四邊形，IL13_LyticL。圖9C示出了 IL13R-靶向的癌細胞膜-溶解嵌合肽(IL13-LyticL)誘導(dǎo)癌細胞的迅速殺傷。U251細胞用IOyM的IL13-LyticL (黑色柱)或LyticL (灰色柱)處理2分鐘、 5分鐘、10分鐘、30分鐘、或1小時至M小時，且隨后用新鮮的培養(yǎng)基替代含肽的培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)48小時。使用WST-8分析細胞的存活率。圖IOA示出了神經(jīng)纖毛蛋白-1 (NRPl)-結(jié)合肽和擾頻序列肽與人類NRPl重組體的結(jié)合特性。在傳感器表面上對梯度稀釋的NRPl-結(jié)合肽(對4 11至6.(^11)樣品進行分析。圖IOB示出了在NRPl-靶向的癌細胞膜-溶解嵌合肽(kma3A-LytiCL ；黑色圓圈)和癌細胞膜-單獨的溶解肽(LyticL ；白色圓圈)間細胞殺傷效應(yīng)的比較結(jié)果。將人類胰腺癌細胞系SU8686 (左)和人類乳腺癌細胞系SKBR-3 (右)與具有梯度稀釋濃度(0至 10 μ M)的兩種肽一起培養(yǎng)72小時，并使用WST-8試劑檢測細胞殺傷效應(yīng)。將該分析重復(fù)3 次，且結(jié)果以一式三份測量值的平均值+SD (kir)表示。圖IlA示出了在細胞膜-溶解和核酸-結(jié)合序列(buf ；白色圓圈)與其EGFR-靶向的嵌合肽(EGFbuf ；黑色圓圈)間細胞殺傷效應(yīng)的比較結(jié)果。將人類肺癌細胞系H322(左) 和人類前列腺癌細胞系DU145(右)與具有梯度稀釋濃度(0至30μΜ)的兩種肽一起培養(yǎng) 72小時，并使用WST-8試劑檢測細胞殺傷效應(yīng)。結(jié)果以一式三份測量值的平均值士SD (bar) 表不。圖IlB示出了 EGFR-靶向的嵌合肽(EGFbuf)對肺癌細胞系H322 (白色圓圈)和肺正常細胞系MRC-5(黑色圓圈)的細胞殺傷效應(yīng)的比較結(jié)果。將兩種細胞與具有梯度稀釋濃度(0至20 μ Μ)的EGFbuf肽一起培養(yǎng)72小時，并使用WST-8試劑檢測細胞殺傷效應(yīng)。 結(jié)果以一式三份測量值的平均值士SD(bar)表示。圖12A和12B表示由癌細胞膜-單獨的溶解序列(D，L-混合；與實施例1中相同的序列)和3種與癌細胞中高表達的受體(her2，VEGF受體，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)結(jié)合的序列靶向的嵌合肽的細胞殺傷效應(yīng)的比較結(jié)果。將人類肺癌細胞系H322(圖12A)或人類肺正常細胞系MRC-5 (圖12B)與具有梯度稀釋濃度(0至80 μ Μ)的4種肽一起培養(yǎng)72小時，并使用WST-8試劑檢測細胞殺傷效應(yīng)。將該分析重復(fù)3次，且結(jié)果以一式三份測量值的平均值士SD (bar)表示。黑色三角形TfR-溶解；白色圓圈Her2_溶解；白色三角形=VEGFRl-溶解；黑色圓圈溶解。圖13示出了具有人類胰腺癌細胞系BxPC-3的小鼠模型中，與實施例1中相同的 EB-溶解嵌合肽的抗瘤作用。將人類胰腺癌細胞系BxPC-3皮下移植至裸鼠。移植5天后， 瘤內(nèi)給予肽，每周3次，持續(xù)3周。結(jié)果以每組4個小鼠的平均值士SD(bar)表示。白色圓圈是給予溶劑的組，白色三角形是給予0. :3mg/kgEB-溶解嵌合肽的組，且黑色圓圈是給予 lmg/kg EB-溶解嵌合肽的組。圖14示出了具有人類胰腺癌細胞系BxPC-3的小鼠模型中全身給予與實施例1 中相同的EB-溶解嵌合肽，檢測其抗瘤作用。將人類胰腺癌細胞系BxPC-3皮下移植至裸小鼠。移植5天后，經(jīng)靜脈內(nèi)給予肽，每周3次，持續(xù)3周。結(jié)果以每組三個小鼠的平均值士SD(bar)表示。白色圓圈是給予鹽水的組，白色三角形是給予lmg/kg EB-溶解嵌合肽的組，且黑色圓圈是給予5mg/kg EB-溶解嵌合肽的組。圖15A示出了具有人類胰腺癌細胞系BxPC-3的小鼠模型中(上面)和具有人類乳腺癌細胞系MDA-MB-231的小鼠模型中(下面)與實施例1中相同的EB-溶解嵌合肽的抗癌效果。將BxPC-3胰腺癌細胞或乳腺癌細胞皮下移植至無胸腺裸鼠。如箭頭所示，從第5 天起，經(jīng)靜脈內(nèi)給予鹽水(對照(白色圓圈))或EB-溶解肽Omg/kg(黑色四邊形)、5mg/ kg(白色四邊形)或10mg/kg(黑色三角形))。各組都由6個動物組成(n = 6)，且將實驗重復(fù)兩次。結(jié)果以平均值士SD表示。圖15Β示出了靜脈內(nèi)治療后，無胸腺裸鼠體內(nèi)MDA-MB-231腫瘤的減小。將 MDA-MB-231細胞經(jīng)背側(cè)移植至小鼠。移入后，經(jīng)靜脈內(nèi)注射鹽水(左圖)或EB-溶解肽(右圖)對小鼠進行治療。箭頭表示腫瘤的位置。圖15C示出了用與實施例1中相同的EB-溶解嵌合肽治療后MDA_MB_231腫瘤的組織學(xué)實驗。福爾馬林固定和石蠟包埋的腫瘤切片(得自用鹽水(左圖)或EB-溶解嵌合肽(右圖)治療的動物)用蘇木精染色，并用光學(xué)顯微鏡分析。圖16A示出了使用BIAC0RE系統(tǒng)的結(jié)合分析。圖16B示出了借助⑶譜對EB-溶解肽(虛線)和EB (H2R)-溶解肽(實線)的二級結(jié)構(gòu)分析。肽的濃度為50 μ Μ。圖16C示出了 ΒΤ20細胞中溶解肽(菱形)、ΕΒ_溶解肽(四邊形)和EB(H2R)_溶解肽(三角形)的細胞毒性。圖17A示出了對于提高對癌細胞的細胞毒性，新設(shè)計的溶解肽適合于嵌合肽。將癌細胞系 H322、BT-20、U251、BxPC-3、SU8686 和 LNCaP 與不同濃度(0 至 20 μ Μ)的 EB-溶解嵌合肽(黑色圓圈)或EB (H2R)-溶解嵌合肽(白色圓圈)一起培養(yǎng)，并使用WST-8試劑檢測細胞毒性。圖17Β示出了各種人類正常細胞系中EB(H2R)_溶解嵌合肽或EB-溶解肽的細胞毒性。將正常細胞系MRC-5和HEK293與不同濃度(0至20 μ Μ)的前述肽一起培養(yǎng)，檢測細胞毒性，并如上所述實施細胞毒性分析。白色圓圈，EB(H2R)_溶解肽；黑色圓圈，EB-溶解肽。圖18示出了 EB-溶解嵌合肽崩解細胞膜以誘導(dǎo)癌細胞的迅速殺傷。H322細胞用 10 μ M的EB-溶解嵌合肽(白色柱)或EB (H2R)-溶解嵌合肽(黑色柱)處理2分鐘、5分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時、2小時或M小時，且隨后用新鮮的培養(yǎng)基替代含肽的培養(yǎng)基。 細胞再繼續(xù)培養(yǎng)M小時。使用WST-8分析細胞存活率。結(jié)果以平均值士SD(bar)表示。圖19A示出了 H322肺癌細胞中借由溶解肽細胞膜的透化。其示出了，以最終濃度 10 μ M添加溶解肽后，在鈣黃綠素溶液中0分鐘、2分鐘、5分鐘、10分鐘和20分鐘時細胞的共聚焦顯微圖像。從上面開始，為單獨的溶解肽、EB-溶解肽和EB (H2R)-溶解肽的圖像。 這些圖像表明，對于單獨的溶解肽變綠(細胞膜崩解)的細胞數(shù)并未隨時間而變化，而對于 EB-溶解肽和EB (H2R)-溶解肽變綠的細胞數(shù)隨時間而增加，且經(jīng)EB (H2R)-溶解肽處理的變綠細胞數(shù)量增加的時間比EB-溶解肽短。圖19Β示出了培養(yǎng)基流入細胞的百分比隨時間的圖示，其由圖19Α的結(jié)果計算而得。由此圖形還可以看到，經(jīng)EB(H2R)_溶解肽處理(白色四邊形)的培養(yǎng)基流入細胞的百分比比EB-溶解肽(黑色四邊形)快。圖20A示出了癌細胞中EB(H2R)_溶解肽誘導(dǎo)Armexin V-陽性表達比EB-溶解肽強。在37°C下將人類乳腺癌細胞系BT20細胞與EB-溶解肽或EB(H2R)_溶解肽(各自都是 5 μ Μ) 一起培養(yǎng)2小時，并由雙色流式細胞儀分析Armexin V標記。圖20B示出了癌細胞中EB(H2R)_溶解肽誘導(dǎo)caspase3 & 7活性比EB-溶解肽強。在37°C下將人類乳腺癌細胞系BT20細胞與EB-溶解肽或EB(H2R)_溶解肽(各自都是5 μ M) —起培育2小時，并由羧基二乙酸熒光素FLICA聚半胱天冬酶分析來分析半胱天冬酶3 & 7活性。圖21示出了具有人類乳腺癌細胞系MDA-MB-231的小鼠模型中EB-溶解肽和 EB(H2R)-溶解嵌合肽的抗癌效果。將MDA-MB-231乳腺癌細胞皮下移植至無胸腺裸鼠，且如圖中箭頭所示，移植5天后，經(jīng)靜脈內(nèi)注射鹽水(對照黑色圓圈)、ΕΒ-溶解肽(lmg/kg ；四邊形)或EB(H2R)_溶解嵌合肽(lmg/kg ；三角形)。各組都由6個動物組成(n = 6)?？v軸表示腫瘤的體積(mm3)且橫軸表示乳腺癌細胞移植后的天數(shù)(天)。數(shù)據(jù)以平均值士SD 表示?？梢钥闯?，其中EB肽的第二個位置由H變成R的嵌合肽(EB(H2R)_溶解)具有比 EB-溶解嵌合肽(EB-溶解)高的活體內(nèi)抗癌效果。圖22A示出了對于提高對癌細胞的細胞毒性，TfR-溶解肽是適合的嵌合肽。將癌細胞系T47D、MDA-MB-231和SKBR-3與不同濃度(0至30 μ Μ)的TfR-溶解嵌合肽(白色四邊形)或溶解肽(黑色四邊形)一起培養(yǎng)72小時，并使用WST-8試劑檢測細胞毒性。圖22Β示出了各種正常細胞系中TfR-溶解嵌合肽的細胞毒性。將正常細胞系 MRC-5、PE和HC與不同濃度(0至100 μ Μ)的前述肽一起培養(yǎng)72小時，并檢測細胞毒性。將自未經(jīng)處理的細胞得到的絕對值定義為100%。黑色四邊形，TfR-溶解嵌合肽；白色四邊形，溶解肽。圖23示出了與通過添加TfR-溶解嵌合肽使細胞毒性提高有關(guān)的IC5tl值間的關(guān)聯(lián)。示出了 7種癌細胞系的TfR-溶解嵌合肽的IC5tl(A)和溶解肽的IC5tl(B)或溶解肽/ TfR-溶解嵌合肽的IC5tl比(C)與TfR單克隆抗體結(jié)合的平均熒光強度。
圖24A示出了 TfR-溶解肽崩解細胞膜以迅速殺傷T47D癌細胞。將T47D細胞暴露于TfR-溶解嵌合肽(黑色柱)或溶解肽(白色柱)不同的時間段(1至180分鐘)，且在暴露一定時間段后，用新鮮培養(yǎng)基代替含肽培養(yǎng)基。將細胞繼續(xù)培養(yǎng)72小時，并使用WST-8 分析細胞存活率。結(jié)果以平均值士SD(bar)表示。圖24B示出了 T47D乳腺癌細胞中經(jīng)由TfR-溶解嵌合肽的膜透化。其顯示以濃度 10 μ M添加TfR-溶解嵌合肽后在鈣黃綠素溶液中0分鐘、5分鐘、10分鐘和15分鐘的細胞。 箭頭表示透化的細胞和穿過膜的肽。圖25Α示出了借由TfR-溶解嵌合肽抑制癌細胞系的細胞存活率。在用肽(5 μ Μ) 處理之前，將T47D細胞與漸增濃度的抗-TfR單克隆抗體(黑色柱)或非特異性小鼠 IgGl (同型對照；白色柱)一起培育3小時。圖25Β示出了 siRNA或擾頻序列(scramble sequence，sc) RNA對癌細胞系的細胞毒性。用siRNA或scRNA轉(zhuǎn)染T47D細胞和MDA-MB-231細胞。轉(zhuǎn)染4天后，由流式細胞技術(shù)來分析細胞中靶基因的水平(數(shù)據(jù)未示出)，并使用WST-8試劑檢測抑制的百分比。將該分析重復(fù)3次，且結(jié)果以一式三份測量值的平均值士SD (bar)表示。圖26A示出了在癌細胞中TfR-溶解嵌合肽誘導(dǎo)Armexin V陽性表達。將T47D細胞和PE細胞與TfR-溶解嵌合肽(10 μ Μ)和溶解肽(10 μ Μ) 一起培育。2小時后，在綠色通道中針對Annexin V-陽性且在紅色通道中針對碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色實施雙色流式細胞分析。圖26B示出了在癌細胞中TfR-溶解嵌合肽誘導(dǎo)caspase激活。將"T47D細胞和PE 細胞分別與TfR-溶解嵌合肽(10 μ M)和溶解肽(10 μ Μ) —起培育。2小時后，在綠色通道中針對CaSpaSe3 & 7活性且在紅色通道中針對PI染色實施雙色流式細胞分析。圖沈(示出了癌細胞系中各種溶解肽的作用比較。用線粒體跨膜電位-依賴的熒光染料JC-I標記的T47D細胞未經(jīng)處理(未經(jīng)處理上面左圖)或經(jīng)星形孢菌素 (Staurosporine)(對照線粒體膜電位上面右圖)、溶解肽(下面左圖)或TfR-溶解嵌合肽(下面右圖)處理。2小時后，由流式細胞技術(shù)來分析指示跨膜電位的紅色熒光或綠色熒光明顯的變化比。圖26D示出了用各種溶解肽處理的細胞中對細胞色素c釋放的Western印記分析 (Western blot analysis)。將T47D細胞與星形孢菌素、TfR-溶解嵌合肽(10 μ M)和溶解肽(10 μ Μ) —起培養(yǎng)。2小時后，分離胞漿提取物，使用細胞色素c抗體通過Wfestern blot 來研究細胞色素c的釋放。圖27A示出了 TfR-溶解嵌合肽(瘤內(nèi)注射)的體內(nèi)抗瘤活性。將MDA_MB_231乳腺癌細胞皮下移植至無胸腺裸鼠。如箭頭所示，從第5天起，瘤內(nèi)注射鹽水(對照(黑色圓圈))或TfR-溶解肽(0. 3mg/kg (黑色菱形)、lmg/kg (白色三角形)或:3mg/kg (白色四邊形))。各組都由3個動物組成(n =幻。數(shù)據(jù)以平均值士SD表示。圖27Β示出了 TfR-溶解嵌合肽(靜脈內(nèi)注射)的體內(nèi)抗瘤活性。將MDA_MB_231 細胞皮下移植至無胸腺裸小鼠。如箭頭所示，從第5天起，經(jīng)靜脈內(nèi)注射鹽水(對照(黑色圓圈))或TfR-溶解肽(0. 5mg/kg(白色三角形)、lmg/kg(黑色菱形)、ang/kg(白色四邊形)或5mg/kg(白色圓圈))。各組都由3個動物組成(η = ； )。數(shù)據(jù)以平均值士 SD表示。圖觀示出了白介素_4(IL4)和白介素-4受體α螺旋(IL-4Ra)的三維復(fù)合結(jié)構(gòu)。(A)表示IL4和IL-4Ra的整個結(jié)構(gòu)。(B)表示IL4與IL-4Rα間界面位置的放大區(qū)域。對于IL4與IL-4Rci結(jié)合很重要的殘基由黑體字表示。圖四示出了與L，D-溶解肽偶聯(lián)的設(shè)計嵌合肽(IL4-溶解(L，D))在正常細胞與癌細胞間的選擇性毒性。將正常細胞系WI-38(A，B)和癌細胞系KCCT873(C，D)與不同濃度 (0至30μΜ)的IL4-溶解(L)嵌合肽、溶解(L)肽、IL-4-溶解(L，D)嵌合肽或溶解(L，D) 肽一起培養(yǎng)72小時。使用WST-8試劑檢測細胞毒性。白色四邊形，溶解(L)肽；黑色四邊形，IL4-溶解(L)肽；白色三角形，溶解(L，D)肽；黑色三角形，IL4-溶解(L，D)肽。圖30示出了檢測IL_4Ra在癌細胞系的細胞表面上的表達。將得自A172、BxPC_3 和正常細胞系HEK293的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后使用IL-4R a -特異性引物，由定量PCR 檢測。使用甘油酸-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH) 作為內(nèi)參。圖31示出了 IL4-溶解(L，D)嵌合肽迅速殺傷癌細胞。PE細胞(A)、KCCT873細胞和BxPC-3細胞⑶用IL4-溶解(L，D)嵌合肽(黑色柱)或溶解(L，D)肽(白色柱)處理2分鐘、5分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時或2小時。用新鮮培養(yǎng)基替代含肽的培養(yǎng)基，將細胞再繼續(xù)培養(yǎng)72小時。使用WST-8試劑測定細胞存活率。結(jié)果以平均值士SD(bar)表示。圖32示出了 IL4-溶解(L，D)嵌合肽誘導(dǎo)癌細胞的Armexin V-陽性表達。將PE 細胞(其為正常細胞，上面)和KCCT873細胞(其為癌細胞，下面)與IL4-溶解(L，D)嵌合肽或溶解(L，D)肽(ΙΟμΜ) —起培養(yǎng)2小時。隨后，在綠色通道中針對Armexin V標記， 且在紅色通道中針對PI染色進行雙色流式細胞技術(shù)分析。細胞的百分比顯示在各象限內(nèi)。圖33A示出了 IL4-溶解(L，D)嵌合肽(瘤內(nèi)注射)的體內(nèi)抗瘤活性。將 MDA-MB-231乳腺癌細胞皮下移植至無胸腺裸鼠。如箭頭所示，從第5天起，瘤內(nèi)注射鹽水 (NaCl ；對照(白色菱形))或IL4-溶解(L，D)肽(0. 5mg/kg (黑色四邊形)或ang/kg (黑色三角形))。各組都由3個動物組成(n = 3)。圖3 示出了 IL4-溶解(L，D)嵌合肽(靜脈內(nèi)注射)的體內(nèi)抗瘤活性。將 MDA-MB-231乳腺癌細胞皮下移植至無胸腺裸鼠。如箭頭所示，從第5天起，經(jīng)靜脈內(nèi)注射鹽水(對照(白色菱形))或IL4-溶解(L，D)肽Omg/kg (黑色四邊形)或5mg/kg(黑色圓圈))。各組都由3個動物組成(n =幻。數(shù)據(jù)以平均值士SD(bar)表示。圖34A示出了 kma3A-nLytiC對各種細胞系的細胞毒性。將胰腺細胞系與不同濃度(0至50μΜ)的kma3A-nLytiC肽或單獨的nLytic肽一起培養(yǎng)48小時，并使用 WST-8試劑檢測細胞毒性。菱形，nLytic肽；四邊形，Sema3A-nLytic (363-377)肽；三角形， Sema3A-nLytic (371-377)肽。圖34B示出了 kma3A-nLytiC對各種細胞系的細胞毒性。將乳腺癌細胞與不同濃度(0 至 20 μ M)的 kma3A-nLytic (371-377)或 kma3A-nLytic (363-377) — 起培養(yǎng)48小時，并使用WST-8試劑檢測細胞毒性。將該分析重復(fù)3次，且結(jié)果以一式三份測量值的平均值士SD (bar)表示。四邊形，Sema3A-nLytic (363-377)肽；三角形， Sema3A-nLytic (371-377)肽。圖34C示出了 kma3A_nLytic對各種細胞系的細胞毒性。將兩種細胞 (左=HuCCTl ；右:HEK293)與不同濃度(0 至 20 μ M)的 Sema3A_nLytic (363-377)或Sema3A-nLytic (371-377) —起培養(yǎng)48小時，并使用WST-8試劑檢測細胞毒性。將該分析重復(fù)3次，且結(jié)果以一式三份測量值的平均值士SD(bar)表示。四邊形， Sema3A-nLytic (363-377)肽；三角形，kma3A-nLytic (371-377)肽。圖35示出了通過BIAC0RE對神經(jīng)纖毛蛋白-I(NRPl)與kma3A野生型肽和某些突變型肽的相互作用進行分析。(A)示出Tkma3A野生型肽與NRPl蛋白的結(jié)合。在并聯(lián)傳感器表面上對梯度稀釋的不同濃度(1. 6 μ M, 13 μ M, 26 μ Μ)的kma3A野生型肽樣品進行分析。(B)示出了 kma3A野生型肽和突變型肽(R37I和R372K/R377K)與NRPl蛋白的結(jié)合。在并聯(lián)傳感器表面上對不同的梯度稀釋肽樣品Q6 μ M)進行分析。(C)示出了各種kma3A肽與NRPl蛋白結(jié)合能力的略圖。(D)示出了 kma3A野生型肽和突變型肽的肽序列。圖36示出了 NRPl在胰腺癌細胞系和乳腺癌細胞系中的表達。(A)示出了 NRPl 在某些胰腺癌細胞系(BxPC-3，CFPAC-I，Panc-I和SU8686)和胰腺上皮細胞中的表達，由 RT-PCR 分析來檢測。(B)示出了 NRPl 在乳腺癌細胞系(BT-20，MDA_MB_231，SKBR-3，TD47D 和ZR-75-1)中的表達，由RT-PCR分析來檢測。在所有RT-PCR分析中，使用β-肌動蛋白 (actin)作為陽性對照。圖37示出了癌細胞中kma3A-nLytic誘導(dǎo)Annexin V-陽性表達。在37°C下將 PE細胞(上圖)和BxPC-3細胞(下圖)與kma3A-nLytic肽(5 μ Μ) 一起培養(yǎng)3小時，且 6小時后，由雙色流式細胞技術(shù)分析Armexin V標記。圖38A示出了 kma3A(aa363-377)-kLytic或單獨的kLytic對癌細胞的細胞殺傷效應(yīng)的圖示。將4種胰腺癌細胞系((a)BxPC-3, (b)CFPAC-I, (c)Panc_l和(d) SU8686)與不同濃度的kma3A(aa363-377)-kLytiC (四邊形)或kLytic (三角形)一起培養(yǎng)48小時， 并使用WST-8試劑檢測細胞毒性?？v軸表示細胞存活率(％ )，橫軸表示肽濃度(μ M)。圖 38Β 示出了 kLytic (四邊形)或 kma3A (aa363_377)-kLytic (三角形)對正常細胞的細胞殺傷效應(yīng)的圖示。將3種正常細胞系((a)PE、(b)MRC-5和(c)人類正常肝細胞)與不同濃度的kma3A(aa363-377)-kLytic或kLytic —起培養(yǎng)48小時，并使用WST-8 試劑檢測細胞毒性?？v軸表示細胞存活率(％)，橫軸表示肽濃度(μΜ)。圖39Α示出了神經(jīng)纖毛蛋白-1在某些胰腺癌細胞系(BxPC-3、Panc-I、SU8686和 CFPAC-1)和胰腺上皮細胞中的表達，由RT-PCR分析來檢測。對于全部RT-PCR分析，都使用 GAPDH作為陽性對照。圖39B示出了借由實時PCR檢測神經(jīng)纖毛蛋白-1的表達。對于圖39A的圖示中所顯示的各種細胞，使用實時PCR檢測神經(jīng)纖毛蛋白-1的表達。所有對照都使用GAPDH來分析。圖40 示出了人類胰腺癌細胞系 SU8686 與 kma3A(363-377)-kLytic 肽(10 μ Μ) 在37°C下一起培養(yǎng)3小時，并針對Armexin V標記實施雙色流式細胞技術(shù)分析的結(jié)果。這些結(jié)果表明，Sema3A(363-377)-kLytic也誘導(dǎo)針對癌細胞的Annexin V-陽性表達。圖41示出了 VEGFR2-溶解肽對癌細胞和正常細胞的細胞毒性。將5種癌細胞系(0E19(白色三角形)、T47D (黑色三角形)、Bxpc3(白色菱形)、U937 (黑色菱形)和 LNCaP(χ))和2種正常細胞系(ΗΕΚ293 (白色圓圈)和MRC-5 (黑色圓圈))與不同濃度(0 至20 μ Μ)的VEGFR2-溶解肽一起培養(yǎng)72小時，并使用WST-8試劑檢測細胞毒性?？v軸表示細胞存活率(％)，橫軸表示肽濃度(μ M)。將該分析重復(fù)3次，且結(jié)果以一式三份測量值的平均值士SD(bar)表示?？梢钥闯?，VEGFR2-溶解肽對癌細胞具有特異的細胞毒性。
具體實施例方式關(guān)于本發(fā)明，將在下文中解釋本發(fā)明的實施例。應(yīng)了解，在本發(fā)明整個說明書中， 除非特別提及，否則單數(shù)表達(用其他語言表示的相應(yīng)的物件、形容詞及諸如此類，例如用英語表示的“一(a)、一(an)”和“所述(the)”)還包含復(fù)數(shù)形式的概念。此外，應(yīng)了解，本文所使用的術(shù)語以本領(lǐng)域中通常所使用的含義來使用，除非特別提及。因而，除非另有定義，否則本文所使用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)技術(shù)術(shù)語都具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所了解的含義相同的含義。在出現(xiàn)沖突的情況下，以本發(fā)明說明書(包括定義)為優(yōu)先。(術(shù)語的定義)下文列示本文中具體所使用的術(shù)語的定義。本文所用“表皮生長因子(Epidermal Growth Factor, EGF) ”是指屬于EGF超家族的生長因子。從歷史角度來講，EGF的代表性例子是分子量約6，000且由53個氨基酸組成的多肽，已報導(dǎo)該肽作為藥理活性物質(zhì)出現(xiàn)在雄性小鼠的頌下腺中，分子中具有由6個半胱氨酸組成的3個二硫鍵。人們開始認為EGF特異地影響表皮細胞的生長，但其也影響非表皮細胞，呈現(xiàn)出不同的生物活性。作為EGF，可包括具有下列GenBank登錄號等的基因作為代表例子GenBank#NM_001963(人類(human))或 Entrez Gene ID 1950。本文所用“表皮生長因子受體”和“EGF受體” (EGFR)可互換使用，指配體是EGF的受體。業(yè)內(nèi)已發(fā)現(xiàn)EGF受體v-erbB，這是一種出現(xiàn)在鳥類骨髓成紅細胞增多癥病毒(Avian Erythroblastosis Virus,AEV)的基因組中的病毒癌基因。人類基因組中出現(xiàn)的對應(yīng)基因 c-erbBl是一種EGFR基因。其結(jié)構(gòu)如下文所述。具體而言，EGF受體由單一多肽組成。N-端延伸形成具有配體結(jié)合位點的胞外區(qū)， 并形成單次跨膜區(qū)。C-端形成具有酪氨酸激酶活性的胞內(nèi)區(qū)。受體經(jīng)由與配體結(jié)合，致使酪氨酸激酶激活。人類EGF受體是分子質(zhì)量約170kDa的跨膜糖蛋白，其中以配體依賴性方式結(jié)合受體的胞外區(qū)是約95kDa的糖蛋白(Ogiso H等人，2002，Cell, 110 :775-87)。EGF 或TGF-α與EGFR的結(jié)合激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以促使細胞生長。EGFR分子的二聚化、高階結(jié)構(gòu)改變和內(nèi)化的作用是轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞內(nèi)信號，以控制細胞生長(G. Carpenter和S. Cohen, 1979， Ann. Rev. Biochem. ,48 :193-216)?；蚋淖?其對生長因子受體的控制產(chǎn)生影響)的作用于或者促使過表達受體及/或配體，從而促使細胞生長(M. -J. Oh等人，2000, Clin. Cancer Res.，6 :4760-4763)匪_0052沘(人類)。此外，作為 EGFR，可具有以下 GenBank 登錄號或諸如此類的基因作為代表性實施例=Entrez Gene ID 1956。本文所用“靶向結(jié)合”肽或“靶向結(jié)合”序列是指與靶點(例如，EGF受體或其他靶點)結(jié)合的肽或序列。舉例而言，對在癌細胞中高表達的受體特異的結(jié)合序列可作為其實施例。本文所用“對在癌細胞中高表達的受體特異的結(jié)合序列”是指與在癌細胞中高表達的受體特異性結(jié)合的序列。如下文所特別定義的，在癌細胞中高表達的受體包括分別特異性結(jié)合與細胞生長有關(guān)的生長因子受體、與血管生成有關(guān)的受體、細胞因子/趨化因子受體及諸如此類的肽序列?？赏ㄟ^噬菌體展示技術(shù)、三維結(jié)構(gòu)分析或諸如此類，發(fā)現(xiàn)特異性結(jié)合序列。本文所用“EGF受體結(jié)合肽(EB肽)，，或“EGF受體-結(jié)合序列(EB序列)，，是指與 EGF受體結(jié)合的肽或序列。通常，可納入下列作為EGF受體-結(jié)合序列的實施例。1) YHWYGYTPQNVI (SEQ ID NO :7 ；其中H可被R或K取代)。這些修飾的序列是通過噬菌體展示技術(shù)從肽庫中篩選出來的序列，且迄今為止從未在突變分析或諸如此類中公布。它們是具有正電荷的H被R或K取代的突變體，同時注意帶有電荷的氨基酸被認為對受體-配體鍵結(jié)很重要，且在本發(fā)明中預(yù)期具有重要作用。本文中，當未特別提及時，“溶解肽部分”、“細胞毒素肽”和“細胞毒性序列”與“細胞溶解肽(序列)”或“細胞膜-溶解肽(序列)”可互換使用。其含有可溶解細胞膜的肽。 典型地，其實施例包括那些由具有正電荷的氨基酸(K、R或(H))和疏水性氨基酸(L、A、F或諸如此類)組成且具有10-至30-氨基酸序列，及兩親性螺旋結(jié)構(gòu)的肽(序列)。代表性肽序列闡述于下文中，如那些作用于癌細胞膜并呈現(xiàn)細胞殺傷效應(yīng)和特別地可用于本發(fā)明中的肽序列KLLLKLLKKLLKLLKKK (SEQ ID NO 48 ；特別地 SEQ ID NO 1、27 或諸如此類) 細胞膜-溶解，F(xiàn)LKLLKKLAAKLF (SEQ ID NO 11):抗菌肽衍生物、細胞膜電位-崩解， RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR(SEQ ID NO :1 和 RLLRRLLRRLLRK(SEQ ID NO 13)抗菌肽衍生物、 細胞膜-溶解和核酸-結(jié)合，KLAKLAKKLAKLAK(SEQ ID NO 4)線粒體膜崩解。因而，從此信息來看，可了解代表性細胞毒素肽是由具有正電荷的氨基酸(K、R或 (H))和疏水性氨基酸(L、A、F或諸如此類)組成的10-至30-氨基酸序列，且具有兩親性螺旋結(jié)構(gòu)。根據(jù)以下觀點顯示，與稱為原始序列的LKLLKIiLLEKLIlLL-NH2 (SEQ ID NO :41 ；加下劃線的字母表示D-氨基酸)比較而言，使用KLLLKLLEKLLKLLKKK(SEQ ID N0:1;加下劃線的字母表示D-氨基酸)獲得效果顯著舉例而言，其顯示在該序列前組合EGFR-結(jié)合序列可以癌細胞特異性方式使細胞殺傷活性產(chǎn)生協(xié)同作用。其也顯示，可實現(xiàn)對正常細胞的更大選擇性?？膳c各種靶蛋白雜交。因而，可進一步靶向癌細胞。此外，被稱為nLytic的肽(LI1LLKKLLKKLLKL ；SEQ ID NO 45 ；加下劃線的字母表示D-氨基酸)在以下幾點獲得效果顯著可以發(fā)現(xiàn)，實現(xiàn)了對正常細胞的選擇性，認為其毒性較低。還可以發(fā)現(xiàn)，與％ma3A肽組合可以癌細胞特異性方式使細胞殺傷活性產(chǎn)生協(xié)同作用。因而，可進一步靶向癌細胞。本文所用“間隔(spacer)，，是指在鏈大分子的分子間形成化學(xué)鍵的部分，如橋鍵。 間隔的代表性實施例包括由G和P組成的0-至5-氨基酸序列。本文中，具體而言，間隔可介于溶解肽與EGF受體結(jié)合肽之間且可于其間鍵結(jié)。此間隔的例子包括(例如)GGG、GG、 G、PP和GPG。間隔并非關(guān)鍵且可不存在，但在本發(fā)明中，優(yōu)選包括此間隔。本文所用“肽毒素”是指具有細胞毒性和細胞殺傷能力的抗癌-靶向肽。本發(fā)明肽毒素可包括通過將對應(yīng)于爆炸(explosive)部分的細胞毒性部分與對應(yīng)于彈頭(warhead) 部分的對癌細胞有特異性的指定部分組合在一起而形成的肽(例如，與在癌細胞中高度表達的受體特異性結(jié)合的肽/序列)。實際情況下，就“爆炸部分”而言優(yōu)選細胞膜-溶解序列，就“彈頭部分”而言可為與在癌細胞中高表達的蛋白(具體而言為受體)特異性結(jié)合的
24任何序列。舉例而言，“癌細胞膜-溶解肽毒素”可作為代表性實施例，其由對在癌細胞中高表達的受體特異的結(jié)合序列、間隔和癌細胞膜-溶解序列組成?！鞍┘毎?溶解肽毒素”的制備和使用方法闡述于下文中，其由對在癌細胞中高表達的受體特異的結(jié)合序列、間隔和癌細胞膜-溶解序列組成。本文中，對在癌細胞中高表達的受體特異的任何結(jié)合序列、任何間隔和任何癌細胞膜-溶解序列可任意組合。其制備和使用方法具體地闡述于下文中。(制備方法)對于由多個彈頭和爆炸序列組合形成的肽毒素(其允許早期個性化治療癌癥)而言，能在較短時間內(nèi)提供這些的化學(xué)合成是適宜的，但也可以是其中肽毒素通過基因重組強制表達且隨后純化的方法。(使用方法)就要處理的癌細胞而言，對細胞表面高表達的蛋白和對殺傷癌細胞的針對爆炸肽的敏感性進行研究。根據(jù)結(jié)果，選擇彈頭和爆炸部分，并設(shè)計對癌細胞最佳的肽毒素。視需要而定，將通過化學(xué)合成或諸如此類所獲得的特制肽毒素與藥物遞送系統(tǒng)(DDS，Drug Delivery System)(例如去端肽膠原(atelocollagen))組合在一起，局部或全身給藥治療。當本發(fā)明人所使用的細胞膜-溶解序列單獨使用時，需要接觸較長時間才呈現(xiàn)對癌細胞的殺傷效應(yīng)，且細胞殺傷效應(yīng)也較溫和。然而，當細胞膜-溶解序列與要嵌合的癌細胞-靶向序列偶聯(lián)時，所產(chǎn)生的序列優(yōu)選地與該序列的靶分子高表達的癌細胞結(jié)合。因而， 可減少接觸時間，并也提高細胞殺傷效應(yīng)。實際上，結(jié)合序列(例如IL4受體、her2或諸如此類)嵌合時，細胞殺傷效應(yīng)的提高和接觸時間的減少已得到證實。因此，可理性地預(yù)期， 甚至其他類似的嵌合序列也可獲得類似的效果細胞殺傷效應(yīng)提高和接觸時間減少。關(guān)于在早期允許此個性化治療的肽毒素，彈頭和爆炸部分的組合可成為癌癥患者的重要治療手段。因而，本發(fā)明的新概念肽毒素的重要性在于其為癌癥患者提供最大益處。應(yīng)注意本發(fā)明的嵌合肽或肽毒素，因為作為嵌合的結(jié)果，與單獨的細胞膜-溶解肽相比，甚至在各種類型的嵌合肽被授權(quán)專利的最新的現(xiàn)有技術(shù)相比，其針對癌細胞獲得了癌細胞靶向、細胞殺傷效應(yīng)的提高和瞬時細胞殺傷效應(yīng)。指定用于細胞膜通透性且本文可使用的部分序列如下文所述。共同的特征包括 (例如)含有大量帶電荷的氨基酸。本文所用“細胞穿膜肽(cell permeable ρ印tide) ”是指能穿過細胞膜以侵入細胞內(nèi)部的肽。某肽是否是“細胞穿膜肽”，可由下列實驗進行檢測。具體而言，本文中，關(guān)于 Antp (如習(xí)知方法中所闡述(參見 Derossi 等人，J. Biol. Chem. 1996，271，18188-18193))， 可將生物素化的Antp肽添加到細胞中，隨后添加經(jīng)鏈霉親和素化學(xué)標記的化合物，并使用熒光顯微鏡確定Antp肽在細胞中的定位?；蛘?，對于與鏈霉親和素-結(jié)合抗體反應(yīng)且隨后以相同方式化學(xué)標記的抗體，可使用熒光顯微鏡類似地確定其定位，從而證實侵入到細胞內(nèi)部。細胞穿膜肽的實施例可包括(例如)RQIKIQFQNRRMKffKK (Antp ；SEQ ID NO 58)(其是觸角足(Antennapedia)同源異型盒序列)、YGRKKRRQRRR (TAT ；SEQ ID NO 23)、RRRRRRRRRRR(SEQ ID NO :24)及諸如此類。通常，其結(jié)構(gòu)可包括(例如)Gene ID155871 (TAT蛋白本身)。此外，作為細胞穿膜肽，具有下列GenBank登錄號或諸如此類的基因可成為代表性實施例NP_057853 ；Tat (人類免疫缺陷病毒1，氨基酸序列)MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFIT KALGISYGRK KRRQRRRAHQ NSQTHQASLS KQPTSQPRGD PTGPKE 1(SEQ ID NO :57)。細胞質(zhì)中用于特異性抑制癌細胞生長且本文中可使用的部分序列的實施例包括 KAYARIGNSYFK (TPR ；SEQ ID NO :59)，該序列是 HSP90 TPR 域-結(jié)合肽，及諸如此類。本文中所使用的代表性細胞毒素肽可包括細胞膜-溶解肽、細胞膜電位-去穩(wěn)定化肽、細胞膜-溶解與核酸-結(jié)合肽和線粒體膜-崩解肽。本文所用“細胞膜-溶解肽”是指由具有正電荷的氨基酸(K、R或(H))和疏水性氨基酸(L、A、F或諸如此類)組成，且具有10-至30-氨基酸序列及兩親性螺旋結(jié)構(gòu)的肽，其從外部崩解細胞膜以呈現(xiàn)細胞殺傷效應(yīng)。代表性具體實施例包括具有僅由K 和L組成的10-至20-氨基酸序列的肽，其中氨基酸是L-、D-或D，L-混合氨基酸，例如 KLLLKLLKKLLKLLKK(SEQ ID NO 48 ；特別地 SEQ ID NO :1、27 或諸如此類)。本文所用“細胞膜電位-去穩(wěn)定化肽”是指由具有正電荷的氨基酸(K、R或(H)) 和疏水性氨基酸(L、A、F或諸如此類)組成且具有10-至30-氨基酸序列的肽，其從外部在細胞膜上形成孔，使細胞膜電位不穩(wěn)定，崩解細胞膜，并呈現(xiàn)細胞殺傷效應(yīng)。代表性具體實施例包括FLKLLKKLAAKLF (SEQ ID NO: 11)及諸如此類。本文所用“細胞膜-溶解和核酸-結(jié)合肽”是指由具有正電荷的氨基酸(K、R或 (H))和疏水性氨基酸(L、A、F或諸如此類)組成且具有10-至30-氨基酸序列及兩親性螺旋結(jié)構(gòu)的肽，其從外部崩解細胞膜，侵入到細胞內(nèi)部，與核酸結(jié)合并誘導(dǎo)細胞死亡。代表性具體實施例包括具有僅由K和L組成的10-至20-氨基酸序列的肽，其中氨基酸是L-、 D-或 D，L-混合氨基酸，例如 RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR (SEQ ID NO 12), RLLRRLLRRLLRK (SEQ ID NO 13)及諸如此類。本文所用“線粒體膜-崩解肽”是指由具有正電荷的氨基酸(K、R或(H))和疏水性氨基酸(L、A、F或諸如此類)組成且具有10-至30-氨基酸序列及兩親性螺旋結(jié)構(gòu)的肽，其僅在成功侵入細胞內(nèi)部后才崩解線粒體膜以誘導(dǎo)細胞死亡。代表性具體實施例包括 KLAKLAKKLAKLAK (SEQ ID NO 4)及諸如此類。細胞毒素肽的優(yōu)選實施例包括由具有正電荷的氨基酸(K、R或(H))和疏水性氨基酸(L、A、F或諸如此類)組成且具有10-至30-氨基酸序列及兩親性螺旋結(jié)構(gòu)的肽。優(yōu)選地，具有正電荷的氨基酸可為K、R或H，且疏水性氨基酸可為I、L、V、A或F。本發(fā)明中所使用的疏水性氨基酸是KLLLKLLKKLLKLLKKK,其中每一氨基酸都是 L-或D-氨基酸，且加下劃線的字母表示D-氨基酸。作為由本發(fā)明所闡釋的事項，其顯示其中與受體結(jié)合肽(例如EGFR)偶聯(lián)的嵌合肽具有兩親性螺旋結(jié)構(gòu)是有利的，優(yōu)選為α-螺旋結(jié)構(gòu)。因而，在構(gòu)建包括其他受體結(jié)合肽和細胞毒素肽的嵌合肽的情況下，有利地，此肽也具有兩親性螺旋結(jié)構(gòu)，且優(yōu)選地為α -螺旋結(jié)構(gòu)。應(yīng)了解，這些事項也可由圖ID中所示的結(jié)果推斷出來。具體而言，已證實EB-溶解肽與由磷脂酰膽堿(Ph0SphatidylCh0line，PC)(其是正常細胞膜表面上的主要脂質(zhì)物) 組成的單層小泡囊(Small Unilamellar Vesicle, SUV)結(jié)合較弱，且與PC脂質(zhì)體不能很好的構(gòu)建；但此EB-溶解肽能與含有磷酸酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)(其特異地暴露在癌細胞膜上)的SUV結(jié)合，且符合特征為雙重最小值在209-210和222nm的部分螺旋結(jié)構(gòu)。已發(fā)現(xiàn)，EB-原始的溶解肽能與PC和PC/PS脂質(zhì)體二者強結(jié)合，且符合螺旋結(jié)構(gòu) (圖ID(C))。這表明，本發(fā)明中新設(shè)計的嵌合肽對含PS的膜具有選擇性且符合螺旋結(jié)構(gòu)， 所述螺旋結(jié)構(gòu)被認為對在細胞表面上形成孔是至關(guān)重要的(Papo，N.& Shai，Y. New Lytic peptides based on the D, L-amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells. Biochemistry 42,9346-9354(2003)) 因而，這些數(shù)據(jù)可作為參考且有助于設(shè)計其他形式的溶解肽。此實施例包括選自包含SEQ ID NO :2、14、21、42和43的序列或其修飾序列的組。 此處，修飾的序列包括以下序列包括對這里所具體闡述的序列經(jīng)一個或多個氨基酸取代、 添加或缺失、優(yōu)選地保守性取代的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽具有SEQ ID NO 15中所闡明的序列或其修飾的序列。此處，修飾的序列包括以下序列包括對這里具體所闡述的序列經(jīng)一個或多個氨基酸取代、添加或缺失、優(yōu)選地保守性取代的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽具有SEQ ID NO 16中所闡明的序列或其修飾的序列。此處，修飾的序列包括以下序列包括對這里具體所闡述的序列經(jīng)一個或多個氨基酸取代、添加或缺失、優(yōu)選地保守性取代的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽具有SEQ ID NO 17中所闡明的序列或其修飾的序列。此處，修飾的序列包括以下序列包括對這里具體所闡述的序列經(jīng)一個或多個氨基酸取代、添加或缺失、優(yōu)選地保守性取代的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽具有SEQ ID NO 18或44中所闡明的序列或其修飾的序列。此處，修飾的序列包括以下序列包括對這里具體所闡述的序列經(jīng)一個或多個氨基酸取代、添加或缺失、優(yōu)選地保守性取代的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽具有SEQ ID NO 19中所闡明的序列或其修飾的序列。此處，修飾的序列包括以下序列包括對這里具體所闡述的序列的經(jīng)一個或多個氨基酸取代、添加或缺失、優(yōu)選地保守性取代的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的嵌合肽具有SEQ ID NO :20、46或47中所闡明的序列或其修飾的序列。此處，修飾的序列包括以下序列包括對這里具體所闡述的序列經(jīng)一個或多個氨基酸取代、添加或缺失、優(yōu)選地保守性取代的序列。就其修飾的序列而言，根據(jù)本文描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可做出改變，以使序列具有優(yōu)選的兩親性(α)螺旋結(jié)構(gòu)。此外，例如，就一個氨基酸取代而言，已證實與EGF-R有關(guān)的嵌合肽中仍保留兩親性(α )螺旋結(jié)構(gòu)。應(yīng)了解，也可預(yù)期其他嵌合肽仍保留兩親性(α ) 螺旋結(jié)構(gòu)。進一步，應(yīng)了解，本領(lǐng)域的技術(shù)人員參照實施例中的描述可適當?shù)刈龀銎渌淖?，例如多個氨基酸的取代，及諸如此類。在另一優(yōu)選實施例中，作為在細胞內(nèi)起作用的癌細胞生長-抑制肽，使用具有序列 RQIKIQFQNRRMKWKKKAYARIGNSYFK(SEQ ID NO :25)的肽。或者，也可使用稱為 TAT 的肽 (YGRKKRRQRRR) (SEQ ID NO 23)。已知，其中連接有 11 個 R 的序列 RRRRRRRRRRR(SEQ ID NO 24)可穿過細胞，因此也可使用此序列。而且，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可適當?shù)卮_定細胞穿膜肽與IPR域-結(jié)合肽的優(yōu)選組合。優(yōu)選地，可使用采用與Antp的組合。本文所用“嵌合肽”是指由兩個或兩個以上的具有不同基因型的部分(肽)構(gòu)成的肽，也被稱為融合蛋白，用來研究某一蛋白結(jié)構(gòu)域的作用或檢測所感興趣蛋白的表達。本文所用“類似的氨基酸”是指具有保守性取代關(guān)系的氨基酸，且對應(yīng)以下氨基酸A:G、I、V、LC :M (含S的氨基酸)D :N、Q 或 EE:Q、N 或 DF :Y、A或諸如此類G :ΑH :W、R、K或諸如此類I :A、L、V、(G)K:R、HL :A、I、V、(G)M :S或諸如此類N:D、E 或 QP :HyPQ:E、N 或 DR:K、HS:T、YT:S、YV:I、L、A、(G)W :HY:F、S、T。本文中將這些氨基酸間的取代稱為“保守性取代”。本文中，經(jīng)常見于EGF受體結(jié)合肽中的氨基酸是指那些經(jīng)常見于各種EGF受體結(jié)合肽中的氨基酸。通常，包括具有保守性取代關(guān)系的氨基酸?；蛘撸瑢?yīng)以下氨基酸具有氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11X12 (SEQ ID NO 8)的肽，其中&是Y或與Y類似的氨基酸；&是H或與H類似的氨基酸；&是W或與W類似的氨基酸；&是Y或與Y類似的氨基酸；&是G或與G類似的氨基酸；&是Y或與Y類似的氨基酸；X7是T或與T類似的氨基酸；&是P或與P類似的氨基酸；X9是Q或與Q類似的氨基酸；X10是N或與N類似的氨基酸；X11是V或與V類似的氨基酸；且X12是I或與I類似的氨基酸。
優(yōu)選地，&是Y或具有OH基團或芳香基團的與Y類似的氨基酸；&是H或具有正電荷的與H類似的氨基酸；&是W或具有芳香基團的與W類似的氨基酸；X4是Y或具有OH基團的與Y類似的氨基酸；&是G或具有脂肪側(cè)鏈的與G類似的氨基酸；&是Y或具有OH基團的與Y類似的氨基酸；X7是T或具有OH基團的與T類似的氨基酸；&是P或與P類似的亞氨基酸類氨基酸；X9是Q或與Q類似的酰胺類氨基酸；X10是N或具有OH基團的與N類似的氨基酸；X11是V或具有脂肪側(cè)鏈的與V類似的氨基酸；且X12是I或具有脂肪側(cè)鏈的與I類似的氨基酸。更為優(yōu)選地，&是Y或與Y類似的氨基酸S、H或F ；&是H或與H類似的氨基酸R或K ；)(3是1或與1類似的氨基酸￥、？或!1;&是Y或與Y類似的氨基酸S、H或F ；&是G或與G類似的氨基酸A、V、I或L ；&是Y或與Y類似的氨基酸S、H或F ；X7是T或與T類似的氨基酸S、H或F ；&是P或與P類似的氨基酸羥脯氨酸；X9是Q或與Q類似的氨基酸N ；Xltl是N或與N類似的氨基酸S、H或F;&1是￥或與￥類似的氨基酸6、4、1^或1;且X12是I或與I類似的氨基酸G、A、V或L。優(yōu)選X2是H或與H類似的氨基酸R或K (例如，YRffYGYTPQNVI (SEQ ID NO 9)或 YKffYGYTPQNVI (SEQ ID NO :10))的序列，因為發(fā)現(xiàn)這樣的序列可提高活性。本文中，當所使用的受體結(jié)合肽是白介素4(IL_4)受體結(jié)合肽時，可使用氨基酸序列KQLIRFLKRLDRN(SEQ ID NO :26)或其修飾的序列。此處，修飾的序列可以與EGFR-結(jié)合肽相同的方式進行修飾。該修飾，可參照Thorsten Hage等人，Cell. 1999，vol. 97，No. 2， pp. 271-81。該文獻以引用方式并入本文中。本文中，當所使用的受體結(jié)合肽是白介素13(IL_13)受體結(jié)合肽時，可使用氨基酸序列KDLLLHLKKLFREGQFN(SEQ ID NO :28)或其修飾的序列。此處，修飾的序列可以與EGFR-結(jié)合肽相同的方式進行修飾。該修飾，可參照Yuichiro Yoshida等人，Biochem Biophys Res Commun. 2007，vol. ；358，No. 1，pp. 292-297。此文獻以引用方式并入本文中。本文中，當所使用的受體結(jié)合肽是神經(jīng)纖毛蛋白(neuropilin)受體結(jié)合肽時，可使用氨基酸序列NYQWVPYQGRVPYPR(SEQ ID NO :29)或其修飾的序列。此處，修飾的序列可以與EGFR-結(jié)合肽相同的方式進行修飾。該修飾，可參照Alexander Antipenko等人， Neuron. 2003，vol. 39，No. 4，pp. 589-598。此文獻以引用方式并入本文中。這些文獻僅提出蛋白制劑(例如免疫毒素)中的問題，但未提供如本發(fā)明中的嵌合肽。
本文中，當所使用的受體結(jié)合肽是2型人類表皮生長因子受體(Human Epidermal Growth Factor Rec印tor Type 2，HER2)-結(jié)合肽時，可使用氨基酸序列 YCDGFYACYMDV(SEQ ID NO 30),LLGPYELffELSH(SEQ ID NO 52),ALVRYKDPLFVffGFL(SEQ ID NO :5 、KCCYSL(SEQ ID NO 54)、WTGffCLNPEESTffGFCTGSF (SEQ ID NO :55)、DTDMCffffffSREFGffECAGAG (SEQ ID NO 56)或其修飾的序列。此處，修飾的序列可以與EGFR-結(jié)合肽相同的方式進行修飾。該修飾，可參照 Valeria R. Fantin 等人，Cancer Res. 2005，vol. 65，No. 15，pp. 6891-6900。此文獻以引用方式并入本文中。本文中，當所使用的受體結(jié)合肽是血管內(nèi)皮生長因子受體KVascular Endothelial Growth factor 1，VEGFRl)-結(jié)合肽時，可使用氨基酸序列 WHSDMEffffYLL(SEQ ID NO 31)或其修飾的序列。此處，修飾的序列可以與EGFR-結(jié)合肽相同的方式進行修飾。 IMM^, nT#M Kimberly J. Peterson ^A, Analytical Biochemistry 2008, vol. 378, No. 1，pp. 8-14(關(guān)于 VEPNCDIHVMWEWECFERL-NH2 (SEQ ID NO :32))和 Borlan Pan 等人， J. Mol. Biol. 2002，vol. 316，No. 3，pp. 769-787(關(guān)于 GGNECDAIRMWEWECFERL(SEQ ID NO 33))。這些文獻以引用方式并入本文中。本文中，當所使用的受體結(jié)合肽是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin Receptor, TfR)-結(jié)合肽時，可使用氨基酸序列THRPPMWSPVWP (SEQ ID NO 34)或其修飾的序列。此處， 修飾的序列可以與EGFR-結(jié)合肽相同的方式進行修飾。該修飾，可參照Jae H. Lee等人， Eur. J. Biochem. 2001，vol. 268，pp. 2004-2012。此文獻以引用方式并入本文中。此外，受體結(jié)合肽可以是成纖維細胞生長因子受體(Fibroblast Growth Factor Rec 印 tor，F(xiàn)GFR)-結(jié)合肽，其是 MQLPLAT (SEQ ID NO :5)或 AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 6)；神經(jīng)纖毛蛋白I(NRPl)/血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)_結(jié)合肽，其是ATWLPHUSEQ ID NO 36) ；ephrin Bl (EphBl)-結(jié)合肽，其是EWLS(SEQ ID NO 37) ；ephrin B2(EphB2)-結(jié)合肽，其是SNEW(SEQ ID NO :38)；白介素-11受體(ILllR)-結(jié)合肽，其是CGRRAGGSC(環(huán)狀)(SEQ ID NO 22)；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78 (Glucose-Regulating Protein，GRP78)-結(jié)合肽， 其是 WDLAWMFRLPVG (SEQ ID NO 39)或 CTVALPGGYVRVC (環(huán)狀)(SEQ ID NO 40)；前列腺特異性膜抗原(Prostate-Specific Membrane Antigen，PSMA)-結(jié)合肽，其是 CQKHHNYLC (SEQ ID NO 35)；或其修飾的序列。此處，修飾的序列可以與EGFR-結(jié)合肽相同的方式進行修飾。該修飾,可參照以下文獻對于FGFR(MQLPLAT (SEQ ID NO 5)), Fukuto Maruta等人， Cancer Gene Therapy. 2002，vol. 9，pp. 543-552 ；對于 FGFR(AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO :6)), Akiko Komi 等人，Exp. Cell Res. 2003，vol. 283，No. 1，pp. 91-100 ；對于 NRPl/ VEGFR2(ATWLPPR(SEQ ID NO :36))，Loraine Tirand 等人，J.Control Release. 2006， vol. 111，pp. 153-164 ；對于 EphBl 和 EphB2，Mitchell Koolpe 等人，J. Biol. Chem. 2005， vol. 280，No. 17，pp. 17301-11 ；對于 ILl 1R，Amado J. Zurita 等人，Cancer Res. 2004， vol. 64, pp. 435-439 ；對于 GRP78 (WDLAWMFRLPVG (SEQ ID NO :39))，Marco A. Arap 等人， Cancer Cell. 2004，vol. 6，pp. 275-284 ；對于 GRP78 (CTVALPGGYVRVC (SEQ ID NO :40)及諸如此類),Ying Liu 等人，Mol. Pharmaceutics. 2007，vol. 4，No. 3，pp. 435-447，Hardy B 等人，Therapeutic angiogenesis of mouse hind limb ischemia by novel peptide activating GRP78 receptor on endothelial cells. Biochemical Pharmacology 75, 891-899,2008 ；且對于 PSMA，Kaushal Rege 等人，Cancer Res. 2007，vol. 67，No. 13，pp. 6368-6375。這些文獻以引用方式并入本文中。這些取代可單獨使用或通過一個以上的組合使用。應(yīng)了解，這些優(yōu)選取代的任何組合都可有效，因為作為這些取代的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)效果得到提高。應(yīng)了解，可引入這些突變中的一種或多種。這是由于，盡管不希望受限于理論，但應(yīng)了解當容許突變時，應(yīng)了解原始活性類型的三維結(jié)構(gòu)及與生物靶點相互作用的活性及諸如此類應(yīng)得到保留或提高，從而預(yù)期其多個取代的組合也具有類似效應(yīng)。在本發(fā)明情況下，對取代1個氨基酸而使活性改變而言，預(yù)期與其伴侶蛋白的相互作用受到影響，但從本發(fā)明的最終目的即抗癌活性來看，活性得到保留。因而，可預(yù)期即使在這些氨基酸取代組合的情況下也可獲得類似效應(yīng)。本文所用“蛋白”、“多肽”、“寡肽”和“肽”在本說明書中以相同含義使用，且是指具有任一長度的氨基酸聚合物。此聚合物可為直鏈、支鏈或環(huán)狀。氨基酸可以是天然存在或非天然存在的氨基酸，且可以是修飾的氨基酸。這些術(shù)語可涵蓋那些與具有多個多肽鏈的復(fù)合物組合者。這些術(shù)語進一步涵蓋天然存在或人工修飾的氨基酸聚合物。此修飾的實施例包括(例如)二硫鍵的形成、糖基化、脂質(zhì)化、乙?；?、磷?；蛉魏纹渌僮骰蛐揎?例如，與標記成分偶聯(lián))。所述定義也涵蓋(例如)包括一種或以上的氨基酸(包括，例如人造氨基酸及諸如此類)類似物的多肽、擬肽化合物(例如，類肽)和本領(lǐng)域中習(xí)知的其他修飾形式。本文所用“氨基酸”可為天然存在或非天然存在的氨基酸，只要其滿足本發(fā)明目的即可。本文所用“核酸”可與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互換使用。特定的核酸序列也涵蓋“剪接變異體”。類似地，由核酸編碼的特定蛋白無疑地涵蓋由該核酸的剪接變異體編碼的任何蛋白。如由名稱所表明，“剪接變體”是基因選擇性剪接的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄后， 可剪接第一核酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以使不同(其他)的核酸剪接產(chǎn)物編碼不同的多肽。改變剪接變體的產(chǎn)生機制，且納入外顯子的選擇性剪接。在此定義中也涵蓋通過通讀轉(zhuǎn)錄由同一核酸衍生的其他多肽。在此定義中涵蓋剪接反應(yīng)的任何產(chǎn)物(包括重組體形式的剪接產(chǎn)物)。 或者，也可將等位基因突變體納入此范圍中。本文所用“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”以相同含義使用，且是指具有任一長度的核苷酸聚合物。這些術(shù)語可涵蓋“寡核苷酸衍生物”或“多核苷酸衍生物”?！肮押塑账嵫苌铩被颉岸嗪塑账嵫苌铩笔侵赴ê塑账嵫苌锘蚱渲泻塑账衢g的鍵與平常不同的寡核苷酸或多核苷酸，且這些術(shù)語可互換使用。該寡核苷酸的具體實施例包括(例如)2’-0_甲基-核糖核苷酸、通過將寡核苷酸中的磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)化為硫代磷酸酯鍵而獲得的寡核苷酸衍生物、通過將寡核苷酸中的磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)化為N3' -P5'磷酰胺酯鍵而獲得的寡核苷酸衍生物、通過將寡核苷酸中的核糖和磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)化為肽核酸鍵而獲得的寡核苷酸衍生物、通過用C-5丙炔尿嘧啶取代寡核苷酸中的尿嘧啶而獲得的寡核苷酸衍生物、通過用C-5 噻唑尿嘧啶取代寡核苷酸中的尿嘧啶而獲得的寡核苷酸衍生物、通過用C-5丙炔胞嘧啶取代寡核苷酸中的胞嘧啶而獲得的寡核苷酸衍生物、通過用吩惡嗪修飾的胞嘧啶取代寡核苷酸中的胞嘧啶而獲得的寡核苷酸衍生物、通過用2' -0-丙基核糖取代DNA中的核糖而獲得的寡核苷酸衍生物、通過用2'-甲氧基乙氧基核糖取代寡核苷酸中的核糖而獲得的寡核苷酸衍生物、及諸如此類。除非另外指明，否則特定核酸序列涵蓋明確闡述的序列和其經(jīng)保守修飾的變體(例如，用簡并密碼子取代的變體)和互補序列。具體而言，用簡并密碼子取代的變體可通過產(chǎn)生其中一個或多個所選(或全部)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基及/ 或脫氧次黃苷殘基取代的序列來達成(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19 :5081(1991)； Ohtsuka 等人，J. Biol. ChemJ60 :2605-2608(1985) ；Rossolini 等人，Mol. Cell. Probes 8 91-98(1994))。本文所用“核苷酸”可以是天然存在或非天然存在的核苷酸，只要仍保留所需功能即可。本文所用“搜索”是指通過電子或生物方法或其他方法，利用核酸堿基序列來發(fā)現(xiàn)具有特定功能及/或特性的其他核酸堿基序列。電子搜索包括(但不限于)包括(但不限于)BLAST (Altschul 等人，J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1990) )、FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 85 :2444-2448 (1988))、Smith 和 Waterman 方法(Smith 和 Waterman, J. Mol. Biol. 147 :195-197 (1981))、和 Needleman 與 Wunsch 方法(Needleman 和 Wunsch, J. Mol. Biol. 48 :443-453 (1970))。生物搜索包括(但不限于)嚴格雜交、通過將基因組DNA粘附在尼龍膜上所形成的微陣列(microarray)或諸如此類、通過將基因組DNA粘附到玻璃板所形成的微陣列(微陣列分析)、PCR、原位雜交(in situ hybridization)及諸如此類。本文中，本發(fā)明中所使用的基因(例如，HSP90或諸如此類)應(yīng)包括由此電子搜索或生物搜索所確定的相應(yīng)基因。本文中，也可使用與特定基因序列雜交的核酸序列，只要其起作用即可。此處，雜交的“嚴格條件”是指在所述條件下，具有與靶序列相似或同源性的核酸鏈的互補鏈優(yōu)選地與靶序列雜交，而不具相似或同源性的核酸鏈的互補鏈基本上不雜交。核酸序列的“互補鏈”是指基于核酸堿基之間的氫鍵配對的核酸序列(例如，T對A和C對G)。嚴格條件有序列依賴性，且在不同情況下有所變化。具體而言較長的序列在較高溫度下雜交。通常， 在確定的離子強度和PH下，特定序列的嚴格條件選定比熱解鏈溫度(Tm)低約5°C。1是指在確定的離子強度、PH和核酸濃度下，與靶序列互補的核苷酸的50%與靶序列雜交的平衡狀態(tài)的溫度?！皣栏駰l件”有序列依賴性，且視不同的環(huán)境參數(shù)而有所不同。核酸雜交的一般指導(dǎo)原則見于 Tijssen (Tijssen (1993)，LaboratoryTechniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I,Chapter 2， “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay，，，Elsevier, New York) 0通常，嚴格條件是在所述條件下鹽濃度低于約1. OM Na+。通常，在pH 7. O至8. 3時 Na+濃度(或其他鹽)為約0. 01至1. OM,且對于短核苷酸(例如，10至50個核苷酸)溫度至少約30°C，且對于長核苷酸(例如，多于50個核苷酸)溫度至少約60°C。嚴格條件也可通過添加去穩(wěn)定劑(例如甲酰胺)達成。在本發(fā)明說明書中，嚴格條件的實施例包括在緩沖液(50% 甲酰胺，IM NaCl, 1% SDS) (37°C)中雜交，并在60°C下于0. 1 XSSC(Saline-sodium citrate，鹽水-檸檬酸鈉)中洗滌。本文所用“嚴格條件下的多核苷酸雜交”是指本領(lǐng)域中常用的眾所周知的條件。通過使用選自本發(fā)明多核苷酸的多核苷酸作為探針，且通過使用菌落雜交技術(shù)、噬菌斑雜交技術(shù)或Southern印跡法(Southern blot)雜交技術(shù)或諸如此類，可得到所述多核苷酸。具體而言，所述術(shù)語指可通過下列鑒定的多核苷酸使用固定有菌落或來自噬菌斑的DNA的濾紙，在65°C，存在0. 7至1. OM NaCl下雜交；隨后使用0. 1至2倍濃度的SSC溶液(1倍濃
32度的SSC溶液的組成是150mM氯化鈉和15mM檸檬酸鈉)在65°C洗滌濾紙。雜交可根據(jù)實驗教科書中所闡述的方法進行，例如Molecular Cloning，第2版，Current Protocols in Molecular Biology,增干丨J1-38,DNA Cloning 1 :CoreTechniques,A Practical Approach, 第2版，OxfordUniversity Press (1995)。此處，優(yōu)選地，將只包含A堿基或只包含T堿基的序列排除在嚴格條件下雜交的序列之外?！翱呻s交多核苷酸”是指在前述雜交條件下能與其他多核苷酸雜交的多核苷酸?？呻s交多核苷酸的實施例，具體而言包括與DNA的堿基序列(編碼具有本發(fā)明中具體所闡述的氨基酸序列的多肽)至少有60%同源性的多核苷酸， 優(yōu)選地具有80%或80%以上同源性的多核苷酸，或具有90%或90%以上同源性的多核苷酸，且更為優(yōu)選地，具有95%或95%以上同源性的多核苷酸。氨基酸在本文中可以如通常所習(xí)知的三字母密碼或者由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(Biochemical Nomenclature Commission)所推薦的單字母密碼表示。核苷酸也可以如通常所了解的單字母密碼提及。本文所用基因的“同源性”是指兩個或兩個以上的基因序列間相互一致的程度。因而，兩基因的同源性越高，序列的一致性或相似性越高。兩基因是否具有同源性，可通過直接比較序列來研究，或?qū)τ诤怂岫?，通過在嚴格條件下雜交來研究，或諸如此類。在直接比較兩基因序列的情況下，當DNA序列在基因序列間典型地具有至少50%—致性、優(yōu)選地至少70%—致性、更為優(yōu)選地至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%—致性時，所述基因具有同源性。本文中，氨基酸序列和堿基序列的相似性、一致性和同源性的比較是使用缺省參數(shù)的BLAST(—種用于序列分析的工具)計算而得。一致性搜索可通過使用NCBI BLAST 2. 2. 9(2004年5月12日公布)進行。本文所闡述的一致性的值通常是指在對齊情況下，于缺省條件下進行BLAST的值。然而，當通過改變參數(shù)給出較高值時，則使用最高值作為一致性的值。當在多個區(qū)域中檢測一致性時，使用其最高值作為一致性的值。本文所用的“相應(yīng)”基因是指在某一物種中具有或預(yù)期具有與作為比較基礎(chǔ)的指定物種基因類似作用的基因。當具有該作用的多個基因存在時，“相應(yīng)”基因是指具有進化上同源的基因。因而，與某一基因(例如，EGFR)相應(yīng)的基因可以是所述基因的直系同源。 因而，與某一人類基因相應(yīng)的基因也可見于其他動物(例如小鼠、大鼠、豬、兔、豚鼠、牛和羊)中。該相應(yīng)基因可使用本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)鑒定。因此，舉例而言，可通過使用相應(yīng)基因基礎(chǔ)的基因序列作為查詢序列，在動物(例如，小鼠、大鼠、豬、兔、豚鼠、牛、羊或諸如此類)的序列數(shù)據(jù)庫中進行搜索，進而發(fā)現(xiàn)動物的相應(yīng)基因。本文所用“片段”是指相對于全長多肽或多核苷酸(長度n)序列中，序列長度長達1至n-1的多肽或多核苷酸。片段的長度視目的而定，可適當?shù)刈兓?。長度的下限實施例包括3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50個和更多個氨基酸。此處未具體列示的整數(shù)所表示的長度(例如，11)也可適當?shù)刈鳛橄孪?。而且，在多核苷酸的情況下，下限的實施例包括5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100個和更多個核苷酸，且此處未具體列示的整數(shù)所表示的長度(例如，11)也可適當?shù)刈鳛橄孪?。本文中，多肽和多核苷酸的長度可分別由氨基酸和核酸的數(shù)量表示，如上文所述。前述數(shù)字并非絕對的。前述作為上限或下限的數(shù)字也包括比前述數(shù)字多或少一些(或者，例如多或少10% )的數(shù)字，只要具有相同功能即可。為了表達此意向，本文中，數(shù)字可用附在數(shù)字之前的“約”來表達。然而，應(yīng)了解，本文中“約”的存在或不存在不影響對數(shù)值的詮釋。本文中，視作為片段基礎(chǔ)的全長蛋白(其是片段的基礎(chǔ))是否保留至少一種功能而定，可確定有用片段的長度。本文所用“變體”、“修飾的序列”或“類似物”是指相對于原始物質(zhì)(例如多肽或多核苷酸)其包括部分變化，其優(yōu)選地基本上仍保留原始多肽或多核苷酸的至少一種功能。 此變體的實施例包括取代變體、添加變體、缺失變體、截短變體、等位基因突變體及諸如此類。等位基因是指位于相同基因位點的一對不同基因變體的一個成員。因此，“等位基因突變體”是指與某基因的等位基因有一定關(guān)系的變體?！拔锓N同源或同源”是指在氨基酸或核苷酸水平上與某一物種的給定基因具有同源性(優(yōu)選地60%或60%以上的同源性，且更為優(yōu)選地80%或80%以上、85%或85%以上、90%或90%以上、和95%或95%以上的同源性)。由本說明書的描述可明了獲得此物種同源的方法。在本說明書中，為了制備功能相當?shù)亩嚯?，除氨基酸取代以外也可實施氨基酸添加、缺失或修飾。氨基酸取代是指用一個或多個(例如，1至10個、優(yōu)選地1至5個、且更為優(yōu)選地1至3個)氨基酸替代原始肽的氨基酸。氨基酸添加是指給原始肽添加一個或多個 (例如，1至10個、優(yōu)選地1至5個、且更為優(yōu)選地1至3個)氨基酸。氨基酸缺失是指從原始肽缺失一個或多個(例如，1至10個、優(yōu)選地1至5個、且更為優(yōu)選地1至3個)氨基酸。氨基酸修飾包括(但不限于)酰胺化、羧基化、硫酸化、商化、烷基化、磷酸化、羥基化、 ?；?例如，乙酰化)及諸如此類。欲取代或添加的氨基酸可為天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或氨基酸類似物。優(yōu)選天然存在的氨基酸。所述核酸可通過眾所周知的PCR技術(shù)獲得，且也可用化學(xué)方法合成。舉例而言，定點突變技術(shù)、雜交技術(shù)或諸如此類可與此方法組合。本文所用多肽或多核苷酸的“取代、添加及/或缺失”是指原始多肽或多核苷酸中氨基酸或其取代物、或核苷酸或其取代物的取代、添加或去除。此取代、添加及/或缺失技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知，包括(例如)定點突變技術(shù)。在作為基礎(chǔ)的核酸分子或多肽中，這些變化可發(fā)生在核酸分子的5'或3'末端、發(fā)生在代表此多肽的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端，或者可發(fā)生在這些末端之間的任何地方，并在作為基礎(chǔ)的序列中的殘基間單獨擴展，只要仍保留所需的功能即可(例如，與IPR域結(jié)合)?？蛇M行任何數(shù)目的取代、添加或缺失，只要所述數(shù)目是一個或多個即可?？稍龃蟠藬?shù)目，只要所需的功能(例如，與TPR 域結(jié)合)仍保留在具有此取代、添加或缺失的變體中即可。舉例而言，所述數(shù)目可以是一個或數(shù)個，且優(yōu)選地可以是全長的20%或20%以下、15%或15%以下、10%或10%以下或5% 或5%以下，或者150個或150個以下、100個或100個以下、50個或50個以下、25個或25 個以下或諸如此類。(肽的制備和分析)本發(fā)明肽(例如，嵌合肽)可通過本領(lǐng)域中眾所周知的方法(例如，下文所論述的化學(xué)合成和通用工業(yè)技術(shù))獲得或制備。舉例而言，與包括所需區(qū)域或域的一部分肽對應(yīng)的肽，或在體外介導(dǎo)期望活性的肽，可使用肽合成儀來合成。肽也可由親水性分析來分析， 所述親水性分析可用來確定肽的疏水性和親水性區(qū)域(參見，例如，Hopp and Woods, 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 :3824-3828)，從而有助于設(shè)計供實驗操作(例如，結(jié)合實驗或抗體合成)的物質(zhì)。也可實施二級結(jié)構(gòu)分析，以便確定建立特定結(jié)構(gòu)模體(motif)的肽的區(qū)域(參見，例如，Chou and Fasman，1974，Biochem. 13 :222-223)。操縱、翻譯、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、親水性和疏水性圖、開放讀取框的預(yù)測和繪制、序列同源性的確定，都可使用本領(lǐng)域中可利用的計算機軟件程序來達成。用于結(jié)構(gòu)分析的其他方法的實施例包括χ-射線結(jié)晶分析(參見，例如，Engstrom, 1974. Biochem. Exp. Biol. 11 :7-13)；質(zhì)譜法和氣相色譜法 (參見，例如，METHODS IN PROTEIN SCIENCE, 1997. J. Wiley and Sons, New York, NY)。也可使用計算機模擬技術(shù)(參見,例如,Fletterick*hller編輯，1986. Computer Graphics and Molecular Modeling :CURRENT COMMUNICATION IN MOLECULAR BIOLOGY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。本發(fā)明進一步涉及編碼含有L-氨基酸的本發(fā)明肽的核酸。編碼本發(fā)明肽的核酸的適當源包括人類基因組序列。其他源，包括大鼠基因組序列。蛋白質(zhì)序列對應(yīng)見于 GenBank，且其全部以引用方式并入本文中。編碼肽的核酸可由本領(lǐng)域中所習(xí)知的任何方法 (例如，使用可與序列的3'-和5'-末端雜交的合成引物經(jīng)PCR擴增，及/或使用cDNA 特異性的寡核苷酸序列或預(yù)設(shè)的基因序列自基因組文庫中克隆)得到。對于肽重組體的表達，可將包括全部或部分編碼所述肽的核酸序列的核酸插入到適當?shù)谋磉_載體中(即，包括插入的肽編碼序列進行轉(zhuǎn)錄和翻譯所需元件的載體)。在某些實施例中，調(diào)控元件有異源性(即，非原生的基因啟動子)?；蛘撸匦璧霓D(zhuǎn)錄信號和翻譯信號由基因原生的啟動子及/或與其鄰近的區(qū)域提供。各種宿主載體系統(tǒng)可用于編碼肽序列的表達。其包括(但不限于)(i)受痘苗病毒、腺病毒或諸如此類感染的哺乳動物細胞系統(tǒng)；( )受桿狀病毒或諸如此類感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；(iii)含有酵母載體的酵母；或 (iv)經(jīng)噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細菌。根據(jù)所使用的宿主細胞系統(tǒng)，可使用多種適宜的轉(zhuǎn)錄元件和翻譯元件中的任何一種。作為表達載體中的啟動子/增強子序列，可使用本發(fā)明中所提供的植物、動物、昆蟲或霉菌調(diào)節(jié)序列。舉例而言，可使用得自酵母和其他霉菌的啟動子/增強子元件(例如， GAL4啟動子、醇脫氫酶啟動子、磷酸甘油激酶啟動子、堿性磷酸酶啟動子)。表達載體或其衍生物的實施例包括人類或動物病毒(例如，痘苗病毒或腺病毒)；昆蟲病毒(例如，桿狀病毒)；酵母載體；噬菌體載體(例如，λ噬菌體)；質(zhì)粒載體和粘粒載體。作為宿主細胞系，可對插入的所需序列的表達進行調(diào)節(jié)，或者可通過特定的期望方式對由所述序列編碼的表達肽進行修飾、處理或選擇。此外，在選定宿主細胞系中，在特定誘導(dǎo)物存在下可提高來自特定啟動子的表達，從而有助于控制普通設(shè)計肽的表達。而且， 不同的宿主細胞針對表達肽的翻譯和翻譯后加工及修飾(例如，糖基化、磷酸化或諸如此類)具有特定的特征機制。因而，可選擇適當?shù)募毎祷蛩拗骷毎到y(tǒng)，以保證外源肽達成期望的修飾和加工。舉例而言，可使用在細菌系統(tǒng)中表達的肽來產(chǎn)生非糖基化的核心肽。另一方面，在哺乳動物細胞中表達保證異源性肽的“原生”糖基化。本發(fā)明包括肽的衍生物、片段、同源物、類似物和突變體，及編碼這些肽的核酸。就核酸而言，本文所提供的衍生物、片段和類似物定義為至少六個(連續(xù)的)的核酸序列，且具有足以進行特異性雜交的長度。就氨基酸而言，本文所提供的衍生物、片段和類似物定義為至少四個(連續(xù)的)的氨基酸序列，且具有足以進行特異性識別的長度。在設(shè)計變體時，根據(jù)下列文件中所闡述的其他受體的序列信息及諸如此類， 可設(shè)計類似的受體結(jié)合肽對于IL-13，Yuichiro Yoshida等人，Biochem Biophys Res Commun. 2007, vol. 358, No. 1, pp. 292-7 ；對于 IL-4，Thorsten Hage 等人，Cell. 1999，vol. 97，No. 2，pp. 271-81 ；對于神經(jīng)纖毛蛋白 _1，Alexander Antipenko 等人，Neuron. 2003，vol. 39，No. 4，pp. 589-98 ；對于轉(zhuǎn)鐵蛋白，R，Jae H. Lee 等人，Eur. J.Biochem. 2001，vol. 268，pp. 2004-2012 ；對于 VEGFRl(WHSDMEWWYLLG(SEQ ID NO 31))，Ping AN 等人，2004，Int. J. Cancer, vol. Ill, pp. 165-173 ；對于 HER-2, Valeria R. Fantin 等)κ, Cancer Res. 2005, vol. 65, No. 15, pp. 6891-6900, Stephanie C. Pero 等人，Int J Cancer. 2004, vol. 111，pp. 951—960，Beihai Jiang 等人，J Biol Chem. 2006， vol. 280，No. 6，pp. 4656-4662 ；對于 VEGFRl (VEPNCDIHVMWEWECFERL-NH2 (SEQ ID NO :32))， Kimberly J. Peterson 等人，Analytical Biochemistry 2008, vol. 378, No. 1，pp. 8-14 于 VEGFRl (GGNECDAIRMWETOCFERL (SEQ ID NO :33))，Borlan Pan 等人，J. Mol. Biol. 2002， vol. 316，No. 3,pp. 769-87 ；對于抗菌肽(Buforin)，Hyun Soo Lee等人，Cancer Lett. 2008， vol.271, No. 1, pp. 47-55 ；對于 FGFR(MQLPLAT(SEQ ID NO :5))，F(xiàn)ukuto Maruta 等人， Cancer Gene Therapy. 2002，vol. 9，pp. 543-552 ；對于 FGFR(AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO :6)), Akiko Komi 等人，Exp. Cell Res. 2003，vol. 283，No. 1，pp. 91-100 ；對于 NRPl/ VEGFR2(ATWLPPR(SEQ ID NO :36))，Loraine Tirand 等人，J.Control Release. 2006， vol. Ill, pp. 153-164 ；對于 EphBl 和 EphB2，Mitchell Koolpe 等人，J Biol. Chem. 2005， vol. 280，No. 17，pp. 17301-11 ；對于 ILl 1R，Amado J. Zurita 等人，Cancer Res. 2004， vol. 64, pp. 435-439 ；對于 GRP78 (WDLAWMFRLPVG (SEQ ID NO :39))，Marco A. Arap 等人， Cancer Cell. 2004，vol. 6，pp. 275-284 ；對于GRP78(CTVALPGGYVRVC(SEQ ID NO :40)) ,Ying Liu 等人，Mol. Pharmaceutics. 2007, vol. 4，No. 3, pp. 435-447 ；對于 PSMA，Kaushal Rege 等人，Cancer Res. 2007，vol. 67, No. 13，pp. 6368-6375 (這些文件以引用方式并入本文中)。 此修飾包括(但不限于)保守性取代。此處，IL4-結(jié)合序列、IL13-結(jié)合序列和神經(jīng)纖毛蛋白-1-結(jié)合序列是根據(jù)三維結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果來設(shè)計。在本說明書中，對于HER2、VEGFR和 TfR，在那些使用了前述文件本身所闡述的結(jié)合序列信息者中，以及EGFR中發(fā)現(xiàn)活性。此外，對穿膜肽的修飾，可參照常識并根據(jù)本文描述來進行修飾。舉例而言， Daniele Derossi 等人，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 271，No. 30，7 月 26 日發(fā)行，PP. 18188-18193，1996提供了與Antp的機制和通過加入部分突變所獲得的其變體有關(guān)的知識。該文件闡述對細胞穿透很重要的位點，且在制備本發(fā)明變體或類似物時可作為參照。該文件的整個內(nèi)容以引用方式并入本文中。gftkf 牛，Genevie Ave Dom ·入，Nucleic Acids Research, 2003, vol. 31, No. 2,556-561 ；Wenyi Zhang 禾口 Steven 0. Smith, Biochemistry 2005，44，10110—10118 ; ISABELLE LE Roux 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 90，pp. 9120-9124，1993 年 10 月， 提供了與跨膜機制和突變有關(guān)的信息。這些文件也可作為制備本發(fā)明變體或類似物時的參照。這些文件的整個內(nèi)容以引用方式并入本文中。(藥物)本發(fā)明的化合物或其制藥上可接受的鹽可單獨給藥，但優(yōu)選地通常作為各種藥物制劑提供。而且，此等藥物制劑用于動物和人類。優(yōu)選地使用治療最為有效的給藥路徑。給藥路徑的實施例包括經(jīng)口路徑或非腸道路徑，例如直腸內(nèi)路徑、頰內(nèi)路徑、皮下路徑、肌內(nèi)路徑、靜脈內(nèi)路徑及諸如此類。給藥形式的實施例包括膠囊、錠劑、顆粒劑、粉劑、糖漿劑、乳液、栓劑、注射劑及諸如此類。適合口服的液體制劑(例如乳液和糖漿劑)可使用水、糖類(例如蔗糖、山梨醇、果糖及諸如此類)、 二醇類(例如聚乙二醇、丙二醇及諸如此類)、油類(例如芝麻油、橄欖油、大豆油及諸如此類)、防腐劑(例如對羥基苯甲酸酯)、矯味劑(例如草莓矯味劑、薄荷及諸如此類)來制備。此外，膠囊、錠劑、粉劑、顆粒劑及諸如此類可使用賦形劑(例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇及諸如此類)、崩解劑(例如淀粉、蘇打海藻酸鹽及諸如此類)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石粉及諸如此類)、粘合劑(例如聚乙烯醇、羥基丙基纖維素、明膠及諸如此類)、去垢劑(例如脂肪酸酯及諸如此類)和增塑劑(例如甘油及諸如此類)來制備。適合非經(jīng)腸給藥的制劑優(yōu)選地由含有對接受者的血液等滲的活性化合物的無菌含水制劑組成。舉例而言，注射時，使用由鹽溶液、葡萄糖溶液或鹽水和葡萄糖溶液的混合物所形成的載劑來制備注射用溶液。局部制劑是通過將活性化合物溶于或懸浮于一種或以上的溶劑(例如，礦物油、 石油、多元醇或局部藥物制劑中所使用的其他基質(zhì))中來制備。用于腸內(nèi)給藥的制劑是使用平常載劑(例如，可可脂、氫化酯、氫化脂肪羧酸及諸如此類)來制備，且作為栓劑提供。在本發(fā)明中，在非經(jīng)腸制劑中也使用一種或以上的輔助組分，其選自與經(jīng)口制劑有關(guān)的示例二醇類、油類、矯味劑、防腐劑(包括抗氧化劑)、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、粘合劑、去垢劑、增塑劑及諸如此類。根據(jù)給藥形式、患者的年齡和體重、欲治療癥狀的性質(zhì)和嚴重程度及諸如此類，本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽給藥的有效劑量和次數(shù)有所不同。通常，劑量為0.01至 1000毫克/人/天，優(yōu)選地5至500毫克/人。關(guān)于給藥次數(shù)，優(yōu)選地每天給藥一次或分別給藥。本發(fā)明還涉及一種用來制備本發(fā)明藥物組合物的系統(tǒng)、裝置和試劑盒。應(yīng)了解，可使用本領(lǐng)域中所習(xí)知的元件作為此系統(tǒng)、裝置和試劑盒的元件，此可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員適當?shù)卦O(shè)計。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽或前藥(例如其水合物) 的系統(tǒng)、裝置和試劑盒。應(yīng)了解，可使用本領(lǐng)域中所習(xí)知的元件作為此系統(tǒng)、裝置和試劑盒的元件，此可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員適當?shù)卦O(shè)計。(DDS)本文所用“遞送制劑”或“遞送介質(zhì)”是指介導(dǎo)感興趣物質(zhì)遞送的載劑(媒劑)。 若欲遞送的物質(zhì)是藥物，則其被稱為“藥物遞送介質(zhì)”?？蓪⑺幬镞f送系統(tǒng)(Drug Delivery System, DDS)劃分為吸收-控制DDS、釋放-控制DDS和靶向DDS0理想的DDS是將“必需劑量”的藥物遞送到“身體必需的位點”持續(xù)“必需時間”的系統(tǒng)。靶向DDS劃分為被動靶向DDS和主動靶向DDS。前者是利用載劑(藥物載劑或藥物媒劑)的物理化學(xué)特性(例如粒徑和親水性)來控制身體內(nèi)行為的方法。后者是向其中加入特殊機制，以主動控制靶向組織的方向性的方法。舉例而言，所述方法使用與抗體偶聯(lián)的載劑，所述抗體對組成靶組織的特定細胞上的靶分子具有特異性分子識別功能(例如，本發(fā)明TPR-結(jié)合肽)，也可將其稱為“導(dǎo)彈藥物”。本文所用“藥物遞送介質(zhì)”是指遞送所需藥物的媒劑。本文所用“感興趣的物質(zhì)”尤其是指期望遞送到細胞中的物質(zhì)。本文所用“脂質(zhì)體”通常是指由以膜形態(tài)聚集的脂質(zhì)層和內(nèi)部水層組成的封閉型泡囊。除通常所使用的磷脂以外，也可并入膽固醇、糖脂及諸如此類。由于脂質(zhì)體是內(nèi)部含水的封閉型泡囊，因此也可將水溶性藥物或諸如此類保留在泡囊內(nèi)。因此，此脂質(zhì)體用來遞送不能通過細胞膜進入細胞的藥物或基因。此外，由于良好的生物相容性，明顯地預(yù)期脂質(zhì)體可作為DDS的納米粒子載劑的材料。在本發(fā)明中，為了可選地使用連接體、交聯(lián)劑或諸如此類加入修飾基團，脂質(zhì)體可作為具有官能團以提供酯鍵的結(jié)構(gòu)單元(例如，糖脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、磷脂酰甘油或諸如此類)，或具有官能團以得到肽鍵的結(jié)構(gòu)單元(例如，磷脂酰乙醇胺)。脂質(zhì)體可由本領(lǐng)域中所習(xí)知的任何方法來制備。舉例而言，在習(xí)知方法中，包括由膽酸透析的方法。在膽酸透析中，通過下面的過程進行制備a)制備脂質(zhì)和去垢劑的混合膠粒，和b)透析所述混合膠粒。接著，就本發(fā)明中所使用的糖鏈脂質(zhì)體而言，在優(yōu)選實施例中，優(yōu)選地使用蛋白作為連接體，且其中糖鏈已與蛋白結(jié)合的糖蛋白與脂質(zhì)體的偶合可通過以下兩步驟反應(yīng)進行a)脂質(zhì)體膜上神經(jīng)節(jié)苷脂部分的高碘酸鹽氧化，和b)通過還原胺化反應(yīng)，糖蛋白與氧化脂質(zhì)體偶合。通過此方法，可使包括所需糖鏈的糖蛋白與脂質(zhì)體結(jié)合，從而獲得具有所需糖鏈的各種糖蛋白-脂質(zhì)體偶聯(lián)物。為了觀察脂質(zhì)體的純度和穩(wěn)定性，對粒徑分布進行研究極為重要。為此，作為一種方法，可使用凝膠滲透色譜法(Gel Permeation Chromatography, GPC)、掃描電子顯微鏡(Scanning Electric Microscope, SEM)、動態(tài)光散射(Dynamic Light Scattering, DLS)及諸如此類。本文所用“連接體”是指介導(dǎo)表面結(jié)合分子(例如，TRP-結(jié)合肽)和其他分子(例如，脂質(zhì)體表面)結(jié)合的分子。在本發(fā)明中所使用的糖鏈修飾的脂質(zhì)體中，肽可經(jīng)由連接體與脂質(zhì)體表面結(jié)合。連接體可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員適當?shù)剡x擇，但優(yōu)選地生物相容的，且更為優(yōu)選地，藥學(xué)上可接受的連接體。本文所用“連接體蛋白”是指在連接體分子中的蛋白、 肽、氨基酸聚合物。本文所用“連接體(蛋白)基團”是當連接體(蛋白)與其他基團結(jié)合時所給出的名稱。連接體(蛋白)基團是指一價或二價基團，視情況而定。其實施例包括哺乳動物衍生的蛋白基團、人類衍生的蛋白基團、人類血清蛋白基團和血清白蛋白基團。連接體(蛋白)基團優(yōu)選地衍生自“人類”，因為認為在對人類給藥時其具有高生物相容性。此外，優(yōu)選不具免疫原性的蛋白。本文所用“交聯(lián)基團”是指在鏈大分子的分子間形成化學(xué)鍵(如橋鍵)的基團。因而，此術(shù)語作為一種概念與“連接體”部分重疊。通常，此術(shù)語是指該基團在大分子(例如脂質(zhì)、蛋白、肽、糖鏈及諸如此類)與其他分子(例如脂質(zhì)、蛋白、肽和糖鏈)之間起作用以形成共價鍵，將分子中或分子之間缺少共價鍵的部分連接起來的基團。在本發(fā)明說明書中， 交聯(lián)基團根據(jù)欲交聯(lián)的靶點而有所不同，其實施例包括(但不限于)醛(例如戊二醛)、碳二亞胺、亞胺酯及諸如此類。當含有氨基的物質(zhì)交聯(lián)時，可使用含有醛的基團，例如戊二醛。本文所用“生物相容性”是指具有與生物體組織或器官相容，且不會引起毒性、免疫應(yīng)答、損傷及諸如此類的特性。生物相容性緩沖液的實施例包括(但不限于)磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS)、鹽水、三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液、碳酸鹽緩沖液(Carbonate buffer solution, CBS)、三(羥基甲基)甲基氨基丙磺酸鹽(TAPS)緩沖液、2-[4-(2_羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸鹽(HEPES)、其他Good' s緩沖液(例如，2-嗎啉基乙磺酸一水合物(MES)、雙(2-羥基乙基)亞胺基三(羥基甲基)甲烷(Bis-tris)、N-(2-乙酰胺)亞胺基乙酰乙酸(ADA)、1，3-雙[三(羥基甲基)甲基氨基]丙烷(Bis-tris 丙烷)、哌嗪-1，4-雙O-乙磺酸)(PIPES)、N-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)、可拉明(coramine)氯化物、N，N-雙(2-羥基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3_嗎啉基丙磺酸 (MOPS)、N-三(羥基甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、N-(2-羥基乙基)哌嗪-N' -3-丙磺酸(HEPPS)、N-[三(羥基甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、氨基乙酰胺(甘氨酰胺)、N， N-雙(2-羥基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸(CAPS))及諸如此類。如上文所述，本發(fā)明提供用來將感興趣的物質(zhì)遞送到癌細胞的遞送劑，該遞送劑包含受體結(jié)合肽，例如EGFR域-結(jié)合肽。感興趣的物質(zhì)可與受體結(jié)合肽(例如EGFR域-結(jié)合肽)偶聯(lián)或者不與其偶聯(lián)。當偶聯(lián)時，所述物質(zhì)變成融合物質(zhì)，如果是肽，將此肽稱為嵌合肽。也可將本發(fā)明的嵌合肽視為此實施例。就此物質(zhì)而言，可使用介質(zhì)(媒劑)形成偶聯(lián)劑。對于此介質(zhì)，可使用脂質(zhì)體，且感興趣的物質(zhì)可在脂質(zhì)體的外部或者納入其內(nèi)部。(篩選)本文所用“篩選”是指通過特定的操縱/檢測方法，從包括主體的群中選擇靶，例如具有特定感興趣特性的生物體或物質(zhì)。對于篩選，可使用本發(fā)明的特定部分。舉例而言，也可將本文所用的，借助免疫應(yīng)答實施的篩選稱為“免疫表型”。在此情況下，本發(fā)明的肽可用于細胞系和生物樣品的分類。本發(fā)明可用作細胞特異性標記，或者更具體而言，用作在特定細胞類型的分化及/或成熟的各個階段特異性表達不同的細胞標記。針對特異性表位或表位組合的單克隆抗體可以篩選表達某一標記的細胞群?？赏ㄟ^使用單克隆抗體，使用各種技術(shù)來篩選表達該標記的細胞群。此技術(shù)的實施例包括使用由抗體包被的磁珠進行磁性分離、使用附著在固體基質(zhì)(即，板)上的抗體進行“淘選 (panning) ”和流式細胞技術(shù)(參見，例如，美國專利號5，985，660和Morrison等人，Cell， 96 :737-49(1999))。舉例而言，所述篩選可用來篩選包括未分化細胞(例如，胚胎干細胞、組織干細胞及諸如此類)的細胞群，例如可出現(xiàn)細胞生長及/或分化(此可見于人類臍帶血中)的細胞群，或其中已對未處理狀態(tài)實施修飾處理的細胞群。本文中所引用的參考文獻，例如科學(xué)論文、專利、專利申請或諸如此類的全部內(nèi)容都以引用方式并入本文中，其引用程度與以特定方式分別闡述一樣。在下文中，將根據(jù)實施例闡述本發(fā)明。下文所闡述的實施例僅出于闡釋之目的而提供。因而，本發(fā)明范圍既不受前述實施例限制也不受下文實施例限制，但其僅受限于隨附其后的權(quán)利要求書。[實施例]在下文中，將以實施例方式更詳細地闡述本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不受此等實施例限制。除非特別說明，否則下文所闡述實施例中所使用的試劑可得自Nakalai Tesque, Sigma-Aldrich, Wako Pure Chemical Industries 有限公司或諸如此類。根據(jù)由京都大學(xué)(Kyoto University)確定的標準并根據(jù)動物保護精神實施動物實驗。(實施例1:EGFR_靶向的嵌合肽)[材料和方法](細胞系)
人類乳腺癌(BT-20和T47D)、肺癌(H322和H460)、胰腺癌(SU. 86. 86)、前列腺癌 (LNCaP)、腦瘤(U251)和肺成纖維細胞(MRC-5和WI-38)細胞系都購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection,(馬納薩斯(Manassas)，美弗吉尼亞洲(VA))。 人類胰腺癌細胞系(BxPC-3)和結(jié)腸癌細胞系(HCT116和DLD-1)購自歐洲細胞保藏中心 (European Collection of Cell Cultures，ECACC ；索爾茲伯里(&ilisbury)，威爾特郡 (Wiltshire), UK)。人類胚腎細胞系(HEI^93)購自 RIKEN 細胞文庫(RIKEN Cell Bank) (筑波(Tsukuba)，日本(Japan))。細胞在含有 10% FBS (Bio West，邁阿密(Miami)，弗羅里達州(FL) ),100 μ g/ml 青霉素和 100 μ g/ml 鏈霉素(Nakalai Tesque，京都(Kyoto)，日本(Japan))的 RPMI1640(BT-20、T47D、H322、H460、SU. 86. 86、LNCaP、U251、BxPC-3、DLD-1 和 SW837)、MEM (MRC-5 和 WI-38)、McCoy ‘ s 5a(HCT116)或 D-MEM (HEK293)中培養(yǎng)。(肽)以下肽購自Invitrogen，卡爾斯巴德(CarlslDad)J^H (CA)1.癌細胞膜-溶解肽KLLLKLL腿LLKLLKKK (SEQ ID NO :1 ；加下劃線的字母表示 D-氨基酸)；2. EGFR 結(jié)合(EB)-癌細胞膜-溶解嵌合肽:YHWYGYTPQNVIGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK (SEQ ID NO 2)；3.原始溶解肽LKLLMLLPLLIiLL-NH2 (SEQ ID NO 41)；禾口4. EB-原始溶解嵌合肽:YHWYGYTPQNVIGGGLKLLKKLLKKLLKLL-NH2 (SEQ ID NO :42)。所述肽是使用固相化學(xué)法進行化學(xué)合成得到，并由高效液相色譜法純化直至其變得均勻(即純度高于90%)為止，并由質(zhì)譜法檢測。將肽溶于水中，并緩沖至PH 7.4。每次僅在使用之前新制備肽溶液，以防止重復(fù)使用。(藥物)吉非替尼(Gefinitib)和埃羅替尼(Erlotinib)購自 ^Toronto Research Chemicals (安大略省(Ontario)，加拿大(Canada))?？笶GFR的小鼠單克隆抗體(克隆 225)和 PD153035 購自 Calbiochem(拉由拉(La Jolla)，加州(CA))。(單層小泡囊(SUV)的制備)單層小泡囊(SmallUnilamilar Vesicle, SUV)如前文所述來制備(Matsuzaki， K. & Horikiri,C. Interactions of Amiloid β -月太(1-40)with Ganglioside-containing membranes. Biochemistry 38，4137-4142 (1999))。簡言之，將具有期望組成的脂質(zhì)膜分散于水或Tris緩沖液(IOmM Tris/150mM NaCl/lmM EDTA, pH7. 4)中。使所產(chǎn)生的MLV經(jīng)受 5次凍-融循環(huán)，且隨后使用探針型超聲破碎器(Tomy UD-201)在冰冷水中，于氮氣環(huán)境中超聲處理15分鐘。來自探針鈦尖的金屬屑通過離心除去。通過磷分析，一式三份測定脂質(zhì)濃度(Bartlett, G. R. Phosphorus assay in column chromatography. J. Biol. Chem. 234, 466-468(1959))。(CD 譜)⑶譜是在Jasco J-820中，使用Imm光程長度的石英比色池來測量，以最大程度減少因緩沖液組分所造成的吸收。對于每一個樣品，測定8次掃描的平均值。減去平均的空白譜(小泡囊懸浮液或溶劑)。肽和脂質(zhì)的濃度分別為50 μ M和4mM。月莫 il jf ti 白勺 πΤ it (Iraura Y. ， Choda, N. ， & Matsuzaki， K. Magainin 2inaction :distinct modes of membrane permeabilization in living bacterial and mammalian cells. Biophys. J. 95，5757-5765 (2008))。在玻璃底平皿中以最終濃度 2 μ M 將鈣黃綠素(一種可溶性的熒光分子)添加至MDA-MB-231細胞中。將小份的經(jīng)標記的肽、 EB-溶解-TAMRA-OH或溶解-TAMRA-OH (Invitrogen) (15 μ 1)以最終濃度10 μ M直接添加至平皿中。使用Olympus FV1000共聚焦激光掃描顯微鏡(Olympus)，獲取共聚焦圖像。(細胞活性分析)將3X IO3個細胞/孔接種在96-孔板中，在含有10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)M小時，并在37°C下與100 μ 1漸增濃度的肽一起培養(yǎng)48至72小時。用WST-8溶液(Cell Count Reagent SF ；Nakalai Tesque)檢測細胞活性。(免疫熒光染色)使IxlO5個細胞與偶聯(lián)有異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC) 的EGFR的人單克隆抗體(Santa Cruz) 一起孵育，通過流式細胞技術(shù)檢測EGFR的表達。 所有染色都在室溫下實施40分鐘。細胞熒光通過流式細胞儀(FACSCalibur，Becton Dickinson，圣荷西(San Jose)，加州(CA))檢測。EGFR-陽性細胞的平均熒光強度(Means Fluorescence Intensity, MFI)使用 CellQuest 軟件(Becton Dickinson)石角定。(Annexin V分析和半胱天冬酶(caspase)分析)BT-20細胞在37°C下，用5 μ M EB-溶解嵌合肽處理2小時或者不使用EB-溶解嵌合肽而處理2小時。對于半胱天冬酶激活或Armexin V(膜連蛋白)-陽性表達的測定， 使用羧基熒光素于FLICA半胱天冬酶3&7分析(Immunochemistry Technologies，布盧明頓(Bloomington)，明尼蘇達州(MN))同時對經(jīng)肽處理的培養(yǎng)物進行半胱天冬酶活性和碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色分析，或者，作為選擇通過多參數(shù)的流式細胞技術(shù)進行 Annexin V標記和PI染色分析。此外，根據(jù)制造商的說明書，使用共聚焦激光掃描顯微鏡， 借由MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct (MBL)實施末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶-dUTP缺口末端標記(TUNEL)分析。(生物分子相互作用)表面等離子共振(SurfacePlasmon Resonance, SPR)實驗，用 BIAC0RE 生物傳感器系統(tǒng)3000(BIAC0RE公司，烏普薩拉(Uppsala)，瑞典(Sweden))進行。通過N-羥基琥珀酰亞胺和N-乙基-N' _( 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺激活化學(xué)法，將約5000RU的鏈霉親和素(Sigma)固定在CM5傳感器芯片的表面，且隨后在經(jīng)鏈霉親和素固定的傳感器芯片上注射2000-3000RU與生物素偶聯(lián)的肽。作為非特異性結(jié)合的對照，用乙醇胺封閉未固定鏈霉親和素的傳感器芯片上未反應(yīng)的羧甲基集團。作為分析物，在25°C，以20 μ Ι/min的流速將細胞表面蛋白(使用Mem-PER真核膜蛋白提取試劑盒(Pierce)制備)注射在流動池上。 為了防止在分析期間非特異性結(jié)合，使用HBS緩沖液(0. OlM HEPES、0. 15M NaCl.O. 005% Tween 20、3mM EDTA (pH 7. 4))作為電泳緩沖液。人類 EGF 受體重組體(recombinant human EGF receptor, rhEGFR)與EB-溶解嵌合肽的相互作用分析如下實施如上文所述將約 5000RU的rhEGFR(SEQ ID NO 3)固定在CM5傳感器芯片上，且隨后在此傳感器芯片上注射多種濃度的肽。這些實驗中所使用的全部蛋白濃度都由Bradford方法測定(Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976 ；72 248-54)。使用BIA檢測軟件3. 2版本(BIAC0RE)進行數(shù)據(jù)分析。(集落-形成分析)針對H322細胞，溶解肽或嵌合肽的體外細胞毒性，由集落-形成分析測定。將細胞接種在6厘米平皿中，所述平皿含有3ml含10% FBS的RPMI 1640，并使其貼壁。設(shè)定細胞/平皿的數(shù)量，以便在對照組中獲得> 100個集落。細胞接種M小時后，將細胞暴露于不同濃度的溶解肽或EB-溶解嵌合肽(0至22. 5 μ Μ)并培養(yǎng)10天。用磷酸鹽緩沖液沖洗平皿，并用結(jié)晶紫(0.25%于25%乙醇中)染色。由對照和處理組中所形成的集落數(shù)確定集落存活的百分比。[結(jié)果](基于二級結(jié)構(gòu)設(shè)計新穎的嵌合肽)先前，Papo和Smi報導(dǎo)了由含有D-和L-亮氨酸和賴氨酸的15-氨基酸非對映異構(gòu)序列組成的新穎溶解Jft (Papo, N. & Shai，Y. New Lytic peptides based on the D, L-amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells. Biochemistry 42,9346-9354(2003))。在本研究中，根據(jù)二級結(jié)構(gòu)的兩親性，本發(fā)明人設(shè)計了適合與EGFR-結(jié)合(EB)肽組合的新穎溶解肽。如圖ID中所示，與EB-溶解肽相比，新設(shè)計的溶解肽中，帶正電荷的氨基酸(Lys)簇的位置在與EB肽組合后仍保留(圖ID a和b)。CD譜分析證實，EB-溶解肽與由磷脂酰膽堿(PC)(其是正常細胞膜表面的主要脂質(zhì)物)組成的單層小泡囊(SUV)結(jié)合較弱，且與PC脂質(zhì)體組成的結(jié)構(gòu)不甚良好，但此EB-溶解肽能與含有磷酸酰絲氨酸(PQ (其特異地暴露在癌細胞膜上)的SUV結(jié)合，且符合特征為雙重最小值在209-210和222nm的部分螺旋結(jié)構(gòu)(圖lD(d))。另一方面，EB-原始溶解肽能與PC和PC/PS脂質(zhì)體二者強結(jié)合，且符合螺旋結(jié)構(gòu)(圖lD(c))。這些結(jié)果表明，本研究中新設(shè)計的嵌合肽對含PS的膜具有選擇性，且符合螺旋結(jié)構(gòu)，所述螺旋結(jié)構(gòu)被認為對在細胞表面上形成孑L是至關(guān)重要的(Papo, N. & Shai，Y. New Lytic peptides based on the D,L-amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells. Biochemistry 42，9346—9354(2003))。(在EGFR-表達的癌細胞中，EGFR靶向提高溶解肽的細胞毒性作用)針對7種EGFR表達的癌細胞系，將溶解肽的細胞毒性與EGFR-靶向的肽毒素(一種EGFR-結(jié)合-溶解嵌合肽)相比較。如圖IA中所示，在所實驗的所有癌細胞系中采用溶解肽或嵌合肽處理可產(chǎn)生濃度依賴性的細胞毒性。當與單獨的溶解肽相比時，證明嵌合肽對癌細胞的細胞毒性得到了相當大的提高。在所有細胞系中，15至20 μ M濃度的嵌合肽足以誘導(dǎo)超過80%的細胞死亡。相比之下，相同濃度的單獨溶解肽不能誘導(dǎo)足夠的癌細胞殺傷效果。如表1中所示，通過EGFR靶向，溶解肽將癌細胞的IC5tl (產(chǎn)生對照細胞生長50% 抑制的肽濃度)提高1. 6至3. 1倍，表明與單獨的溶解肽相比EGFR靶向提高了癌細胞對 EB-溶解嵌合肽的敏感性。隨后，本發(fā)明人檢測了三種正常細胞系中EB-溶解嵌合肽和單獨溶解肽的細胞毒性。如圖IB中所示，包括MRC-5、WI-38和ΗΕΚ293的三種正常細胞系對溶解肽的敏感性較低，表明與癌細胞系細胞相比毒性較小。正常細胞系中，嵌合肽的IC5tl比癌細胞中高3. 6至8倍(表1)。EB-溶解嵌合肽也提高對正常細胞的細胞毒性，此與癌細胞中的現(xiàn)象類似。這些發(fā)現(xiàn)表明，溶解肽在癌細胞中的細胞毒性比在正常細胞中強，且EGFR-靶向的肽毒素對高EGFR表達的癌細胞具有優(yōu)良的細胞毒性。令人感興趣地，與原始溶解肽組
42合的EB肽未顯示出細胞毒性提高，且此外EB-原始溶解肽甚至在肽濃度較低時仍殺傷正常細胞系(MRC-5)，表明原始溶解肽不適合與EB肽嵌合化(圖1C)。(采用EB-溶解嵌合肽處理，對具有酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine Kineaselnhibitor，TKI)抗性的癌細胞產(chǎn)生足夠的細胞毒性)在具有或不具有k-ras突變的癌細胞中，比較EB-溶解肽和TKI的細胞毒性。(檢測k-ras突變的癌細胞對TKI的敏感性)對在k-ras突變存在和不存在時，各種癌細胞對埃羅替尼或抗EGFR抗體的敏感性進行研究。以3X IO3個細胞 / 孔，將 k-ras 野生型(Wild-type，WT)癌細胞系(H322 和 BT-20) 和k-ras突變的癌細胞系(MDA-MB-231、HCT116、SW837和DLD-1)接種在96-孔板中，并在含有10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)M小時。將這些細胞與不同濃度的埃羅替尼(0至80μΜ) 或抗EGFR抗體(右0至20 μ g/ml) 一起培養(yǎng)72小時，并使用WST-8試劑檢測細胞毒性 (Cell Count Reagent SF ；Nakalai Tesque)。k-ras WT癌細胞系(H322和BT-20)對埃羅替尼和抗EGFR抗體敏感，但k_ras突變的癌細胞系(MDA-MB-231、HCT116、SW837和DLD-1)對埃羅替尼和抗EGFR抗體二者都有抗性(圖1E)。(k-ras野生型細胞中TKI或EB-溶解的細胞毒性)研究TKI或EB-溶解嵌合肽對沒有k_ras突變的癌細胞和正常細胞的細胞毒性。以3X IO3個細胞/孔，將3種k-ras野生型(WT)癌細胞系(H322、BT_20和BxPC-3) 和肺正常細胞系(MRC-5)接種在96-孔板中，并在含10% FBS的培養(yǎng)基中培育M小時。將這些細胞與不同濃度的TKI (埃羅替尼、吉非替尼和PD153035 ；0至20 μ M)或EB-溶解嵌合肽(0 M 20 μ Μ) 一起培養(yǎng)72小時，使用WST-8試劑檢測細胞毒性(Cell Count Reagent SF ；Nakalai Tesque)。采用三種TKI (埃羅替尼、吉非替尼和PD153035)的處理于k-ras WT癌細胞系 (H322、BT-20和BxPC-3)中產(chǎn)生濃度依賴性的生長抑制，但細胞毒性不足。另一方面，采用 EB-溶解肽處理對這些癌細胞系呈現(xiàn)出足夠的細胞毒性，但對肺正常細胞系MRC-5未呈現(xiàn)細胞毒性(圖1F)。(EB-溶解對具有k-ras突變的抗TKI的癌細胞系的細胞毒性)研究EB-溶解嵌合肽對具有k-ras突變的抗TKI的癌細胞的細胞毒性。以3X103個細胞/孔，將四種k-ras突變的癌細胞系(MDA-MB_231、HCT116、SW837 和DLD-1)接種在96-孔板中，并在含10% FBS的培養(yǎng)基中培育M小時。將這些細胞與不同濃度的TKI (埃羅替尼、吉非替尼和PD153035 ;0至20μΜ)或EB-溶解嵌合肽(0至20 μ Μ) 一起培養(yǎng)72小時，并使用WST-8試劑檢測細胞毒性。k-ras突變的癌細胞系(MDA_MB_231、HCT116、SW837和DLD-1)對埃羅替尼、吉非替尼和PD153035有抗性，但采用EB-溶解嵌合肽處理對具有k_ras突變的抗TKI的癌細胞系呈現(xiàn)出足夠的細胞毒性(圖1G)。因而，說明EB-溶解嵌合肽呈現(xiàn)對k-ras突變的癌細胞系特異的細胞毒性。(由EB-溶解嵌合肽誘導(dǎo)的細胞毒性的提高程度，視EGFR在細胞表面的表達水平而定)
本發(fā)明人接著檢測了 EB-溶解嵌合肽的細胞毒性增加是否與EGFR在細胞表面的表達水平有關(guān)。通過流式細胞技術(shù)，使用FITC-偶聯(lián)的抗EGFR多克隆抗體來檢測七種癌細胞系和三種正常細胞系中EGFR的表達水平。如圖2A和表1中所示，EGFR的表達水平與 EB-溶解嵌合肽或溶解肽的IC5tl無關(guān)(對于嵌合肽r = -0. 37 (圖2A，左)，且對于溶解肽r =-0. 14(圖2A，中間))。然而，EGFR的表達水平與溶解肽與EB-溶解嵌合肽的IC5tl比顯著相關(guān)，表明與單獨的溶解肽情況相比，EB-溶解嵌合肽對細胞毒性的提高程度，視EGFR在細胞表面的表達水平而定(r = 0. 89 ；圖2A，右)。為了進一步確認EB-溶解嵌合肽對EGFR的特異性，在暴露于EB-溶解嵌合肽1小時前將抗EGFR多克隆抗體(Ab)或人類EGF重組體添加至BxPC-3培養(yǎng)物中，檢測對細胞的細胞毒性。如圖2B中所示，EGF蛋白與EGFR-Ab 二者都能阻斷EB-溶解嵌合肽的細胞毒性， 顯示出由EGF配體得到27%的抑制，由EGFR-Ab得到23%抑制。這些結(jié)果表明EB-溶解嵌合肽與細胞的結(jié)合視EGFR在細胞表面上的表達水平而定。(EB-溶解嵌合肽與EGFR蛋白和細胞表面膜蛋白結(jié)合的相互作用譜)為了解肽與EGFR的結(jié)合特性，將EGFR蛋白固定在傳感器芯片上，并使用BIAC0RE 來分析其與EB-溶解嵌合肽或單獨溶解肽的相互作用譜。如圖3A中所示，共振信號強度隨 EB-溶解嵌合肽的濃度增加而增大，表明與EGFR蛋白結(jié)合的EB-溶解嵌合肽的量與EB-溶解嵌合肽的濃度增加成比例。相比之下，單獨溶解肽的共振信號強度隨濃度增加很少。與 EGFR蛋白結(jié)合的EB-溶解嵌合肽的Kd值為2. 6X KT5(M)。接著，為了解肽與細胞的結(jié)合特性，將EB-溶解嵌合肽或單獨的溶解肽固定在傳感器芯片上，并使用BIAC0RE對與自H322、 BT-20或MRC-5提取的細胞表面膜蛋白的相互作用譜進行分析。如圖:3B和3C中所示，共振信號強度隨細胞膜蛋白的濃度增加而增大，表明與肽結(jié)合的細胞膜蛋白的量與細胞膜蛋白的濃度增加成比例。細胞膜蛋白與單獨溶解肽的相互作用證實，隨著肽含量的增加各細胞系中的結(jié)合常數(shù)相似。另一方面，EB-溶解嵌合肽與H322或BT-20癌細胞膜蛋白的結(jié)合常數(shù)比單獨溶解肽高出4. 2倍0132 或4.4倍出1~-20)(圖；^、3(和30)。相比之下，與 MRC-5正常細胞膜蛋白的結(jié)合常數(shù)，EB-溶解嵌合肽與單獨的溶解肽相比沒有明顯變化(圖 3D)。這些結(jié)果與自WST分析所獲得的數(shù)據(jù)一致(圖1)，表明EB-溶解嵌合肽的細胞毒性與對細胞膜的親和性密切相關(guān)。(EB-溶解嵌合肽誘導(dǎo)癌細胞的迅速殺傷)為了檢測EB-嵌合肽殺傷癌細胞的適當?shù)臅r間長度，H322或BT-20細胞用EB-嵌合肽或單獨的溶解肽處理10分鐘、30分鐘、1小時或48小時。如圖4中所示，用單獨的溶解肽處理的H322或BT-20細胞使得存活率以時間依賴性方式降低。相比之下，H322或BT-20 細胞暴露于EB-嵌合肽(ΙΟμΜ)僅10分鐘時，足以殺傷癌細胞，且呈現(xiàn)出超過70%的細胞殺傷效應(yīng)。共聚焦顯微鏡分析也證實，該嵌合肽穿過細胞膜而在癌細胞表面上形成孔。20 分鐘內(nèi)觀察到經(jīng)鈣黃綠素標記的培養(yǎng)基流入癌細胞的細胞質(zhì)(圖4Β)。然而，在單獨溶解肽的情況下沒有觀察到此快速穿過(圖4C)。這些結(jié)果表明，與單獨的溶解肽相比EB-嵌合肽相當迅速地殺傷癌細胞。體外集落-形成分析也證實，此嵌合肽以濃度依賴性方式抑制 Η322癌細胞的細胞生長(圖4D)。(在癌細胞中，EB-嵌合肽誘導(dǎo)半胱天冬酶激活和ArmexinV-陽性表達)為了研究由EB-嵌合肽引起的細胞死亡的作用機制，使用多參數(shù)的流式細胞技術(shù)分析來實施Armexin V分析和半胱天冬酶分析。如圖5A中所示，BT-20乳腺癌細胞暴露于 EB-溶解嵌合肽(5 μ M) 2小時即誘導(dǎo)半胱天冬酶激活和Armexin V-陽性表達。由這些結(jié)果標明，EB-溶解嵌合肽崩解癌細胞的質(zhì)膜，且從而很明顯的嵌合肽通過細胞凋亡機制誘導(dǎo)癌細胞的細胞死亡。(H322癌細胞生長的體外抑制)為了進一步確認EB-溶解嵌合肽對H322癌細胞的細胞毒性，實施集落_形成分 析(Kawakami K, Kawakami M, Leland P, Puri RK. Internalization property of interleukin-4 receptor alpha chain increases cytotoxic effect of interleukin-4 receptor-targeted cytotoxin in cancer cells. Clin Cancer Res 2002 ；8 :258-66 ； Kawakami K, Joshi BH, Puri RK. Sensitization of cancer cells to interleukin 13-pseudomonas exotoxin-induced cell death by gene transfer of interleukin 13receptor alpha chain. Hum Gene Ther 2000;11:1829-35)。如圖 6 中所示，盡管 H322 細胞對單獨的溶解肽敏感(IC5tl，14.2 μ M)，但細胞對嵌合肽的敏感性高至少2倍(IC5tl < 7. 5 μ Μ)。通過集落-形成分析得到的兩種肽的IC5tl值與由WST分析所測定的IC5tl值相關(guān)。[表 1]表1.肽對各種細胞系的細胞毒性及EGFR表達
權(quán)利要求
1.一種嵌合肽，其特征在于，包括受體結(jié)合肽和細胞毒素肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受體結(jié)合肽選自包括下列的組 EGF受體結(jié)合肽、白介素-4(IL-4)受體結(jié)合肽、白介素-13(IL-13)受體結(jié)合肽、神經(jīng)纖毛蛋白受體結(jié)合肽、2型人類表皮生長因子受體(HER2)-結(jié)合肽、血管內(nèi)皮生長因子受體 (VEGFR)-結(jié)合肽和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)-結(jié)合肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，包括EGF受體結(jié)合肽和細胞毒素肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受體結(jié)合肽是EGF受體結(jié)合肽，且具有氨基酸序列YHWYGYTPQNVI (SEQ ID NO 7)，其中每個字母表示單字母氨基酸表示法，或其修飾的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受體結(jié)合肽是EGF受體結(jié)合肽，且具有氨基酸序列 X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11X12(SEQ ID N0:8)，其中&是Y或與Y類似的氨基酸； )(2是11或與H類似的氨基酸； )(3是1或與W類似的氨基酸； )(4是￥或與Y類似的氨基酸； )(5是6或與G類似的氨基酸； )(6是￥或與Y類似的氨基酸； X7是T或與T類似的氨基酸； &是卩或與P類似的氨基酸； X9是Q或與Q類似的氨基酸； Xltl是N或與N類似的氨基酸； X11是V或與V類似的氨基酸；且 X12是I或與I類似的氨基酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受體結(jié)合肽是EGF受體結(jié)合肽且具有氨基酸序列 X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11X12 (SEQ ID N0:8)，其中&是Y或具有OH基團或芳香基團的與Y類似的氨基酸；&是H或具有正電荷的與H類似的氨基酸；&是W或具有芳香基團的與W類似的氨基酸；&是Y或具有OH基團的與Y類似的氨基酸；&是G或具有脂肪側(cè)鏈的與G類似的氨基酸；&是Y或具有OH基團的與Y類似的氨基酸；X7是τ或具有OH基團的與T類似的氨基酸；&是P或與P類似的亞氨基酸類氨基酸；X9是Q或與Q類似的酰胺類氨基酸；X10是N或具有OH基團的與N類似的氨基酸；X11是V或具有脂肪側(cè)鏈的與V類似的氨基酸；且X12是I或具有脂肪側(cè)鏈的與I類似的氨基酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受體結(jié)合肽是EGF受體結(jié)合肽且具有氨基酸序列 X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11X12 (SEQ ID N0:8)，其中&是￥或與￥類似的氨基酸3、!1或？； )(2是H或與H類似的氨基酸R或K; &是W或與W類似的氨基酸Y、F或H ； )(4是Y或與Y類似的氨基酸S、H或F; &是G或與G類似的氨基酸A、V、I或L ； )(6是Y或與Y類似的氨基酸S、H或F; X7是T或與T類似的氨基酸S、H或F ； &是P或與P類似的氨基酸羥脯氨酸； X9是Q或與Q類似的氨基酸N; X10是N或與類似的氨基酸S、H或F ； X11是V或與V類似的氨基酸G、A、L或I ；且 X12是I或與I類似的氨基酸G、A、V或L。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的嵌合肽，其特征在于，所述序列中的&是H或與H類似的氨基酸R或K。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的嵌合肽，其特征在于，所述EGF受體結(jié)合肽具有 YRffYGYTPQNVI(SEQ ID NO 9)或 YKWYGYTPQNVI(SEQ ID NO: 10)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述細胞毒素肽選自包含下列的組 細胞膜-溶解肽、細胞膜電位-去穩(wěn)定化肽、細胞膜-溶解和核酸-結(jié)合肽以及線粒體膜-崩解肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的嵌合肽，其特征在于，所述細胞膜-溶解肽具有僅由K與L 組成的10-至20-氨基酸序列，且所述氨基酸是L-、D-或D，L-混合氨基酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的嵌合肽，其特征在于，所述細胞膜-溶解肽是 KLLLKLLKKLLKLLKKK (SEQ ID NO 48)，所述氨基酸是 L_、D-或 D，L-混合氨基酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的嵌合肽，其特征在于，所述細胞膜電位-去穩(wěn)定化肽是 FLKLLKKLAAKLF(SEQ ID NO :11)。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的嵌合肽，其特征在于，所述細胞膜-溶解和核酸-結(jié)合肽是 RLLRRLLRRLLRRLLRRLLR(SEQ ID NO: 12)或 RLLRRLLRRLLRK(SEQ ID NO :13)。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的嵌合肽，其特征在于，所述線粒體膜-崩解肽是 KLAKLAKKLAKLAK(SEQ ID NO 4)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述細胞毒素肽由具有正電荷的氨基酸和疏水性氨基酸組成，且具有10-至30-氨基酸序列及兩親性螺旋結(jié)構(gòu)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的嵌合肽，其特征在于，所述具有正電荷的氨基酸是K、R或 H，且所述疏水性氨基酸是I、L、V、A或F。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的嵌合肽，其特征在于，所述細胞毒素肽是 KLLLKLLKKLLKLLKKK (SEQ ID NO :1)，其中每個氨基酸都是L-或D-氨基酸，加下劃線的字母表示D-氨基酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽進一步包括間隔肽。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的嵌合肽，其特征在于，所述間隔肽是連接有0至5個甘氨酸、脯氨酸或甘氨酸和脯氨酸混合物的序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的嵌合肽，其特征在于，所述間隔肽是GGG。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有序列YHWYGYTPQNVIGG GKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO :2)，其中加下劃線的字母表示D-氨基酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有序列YRWYGYTPQNVIGG GKLLLKLLKKLLKLLKKK (SEQ ID NO :43)，其中加下劃線的字母表示D-氨基酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受體結(jié)合肽是白介素-4(IL-4)受體結(jié)合肽，且具有氨基酸序列KQLIRFLKRLDRN(SEQ ID NO :26)或其修飾的序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受體結(jié)合肽是白介素-13(IL-13) 受體結(jié)合肽，且具有氨基酸序列KDLLLHLKKLFREGQFN(SEQ ID NO :28)或其修飾的序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受體結(jié)合肽是神經(jīng)纖毛蛋白受體結(jié)合肽，且具有氨基酸序列NYQWVPYQGRVPYPR(SEQ ID NO :29)或其修飾的序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受體結(jié)合肽是2型人類表皮生長因子受體(HER2)-結(jié)合肽，且具有氨基酸序列TCDGFYACYMDV(SEQ ID NO :30)或其修飾的序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受體結(jié)合肽是血管內(nèi)皮生長因子受體I(VEGFRl)-結(jié)合肽，且具有氨基酸序列WHSDMEffffYLLG(SEQ ID NO :31)、 VEPNCDIHVMWEWECFERL-NH2 (SEQ ID NO 32)或GGNECDAIRMWEWECFERL(SEQ ID NO 33)或其修飾的序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受體結(jié)合肽是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 (TfR)-結(jié)合肽且具有氨基酸序列THRPPMWSPVWP (SEQ ID NO 34)或其修飾的序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述受體結(jié)合肽是成纖維細胞生長因子受體(FGFR)-結(jié)合肽，且是 MQLPLAT (SEQ ID NO :5)、AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO 6)； 神經(jīng)纖毛蛋白I(NRPl)/血管內(nèi)皮生長因子受體2 (VEGFR2)-結(jié)合肽，且是ATWLPI3R (SEQ ID NO 36)；酪氨酸蛋白激酶受體Bl (EphBl)-結(jié)合肽，且是EWLS (SEQ ID NO 37)；酪氨酸蛋白激酶受體B2(EphB2-結(jié)合肽，且是SNEW(SEQ ID NO :38)；白介素-11受體(ILllR)-結(jié)合肽，且是CGRRAGGSC (環(huán)狀)(SEQ ID NO 22)；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (GRP78)-結(jié)合肽，且是 WDLAWMFRLPVG (SEQ ID NO 39)或 CTVALPGGYVRVC (環(huán)狀)(SEQ ID NO 40)；前列腺特異性膜抗原(PSMA)-結(jié)合肽，且是CQKHHNYLC (SEQ ID NO 35)；或其修飾的序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有選自包含下列的組的序列SEQ ID NO :2、14、21、42、43和21，或其修飾的序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有SEQID N0:15中所闡明的序列或其修飾的序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有SEQID N0:16中所闡明的序列或其修飾的序列。
34.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有SEQID N0:17中所闡明的序列或其修飾的序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有SEQID N0:18或44 中所闡明的序列或其修飾的序列。
36.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有SEQID N0:19中所闡明的序列或其修飾的序列。
37.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，所述嵌合肽具有SEQID N0:20、46或 47中所闡明的序列或其修飾的序列。
38.一種核酸，其特征在于，編碼根據(jù)權(quán)利要求1至37中任一項所述的嵌合肽。
39.一種載體，其特征在于，包括編碼根據(jù)權(quán)利要求1至37中任一項所述嵌合肽的核酸。
40.一種細胞，其特征在于，包括編碼根據(jù)權(quán)利要求1至37中任一項所述的嵌合肽的核酸。
41.一種藥物組合物，其特征在于，包括根據(jù)權(quán)利要求1至37中任一項所述的嵌合肽。
42.一種抗癌劑，其特征在于，包括根據(jù)權(quán)利要求1至37中任一項所述的嵌合肽。
43.一種根據(jù)權(quán)利要求1至37中任一項所述的嵌合肽的用途，其特征在于，用來制造藥物組合物。
44.一種根據(jù)權(quán)利要求1至37中任一項所述的嵌合肽的用途，其特征在于，用來制造抗癌劑。
45.一種治療方法，其特征在于，包括給予根據(jù)權(quán)利要求1至37中任一項所述的嵌合肽的步驟。
46.一種治療癌癥的方法，其特征在于，包括給予根據(jù)權(quán)利要求1至37中任一項所述的嵌合肽的步驟。
47.一種篩選藥物的方法，其特征在于，使用由EGF受體結(jié)合肽靶向的氨基酸序列。
48.一種篩選抗癌劑的方法，其特征在于，使用由EGF受體結(jié)合肽靶向的氨基酸序列。
49.一種肽毒素，其特征在于，是靶向性嵌合肽，包括靶-結(jié)合肽部分和細胞毒性溶解肽部分。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的肽毒素，其特征在于，所述靶-結(jié)合肽具有與在癌細胞中高表達的受體特異性結(jié)合的序列，且所述溶解肽部分具有癌細胞膜-溶解序列，且具有間隔。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的肽毒素，其特征在于，所述溶解肽部分由具有正電荷的氨基酸和疏水性氨基酸組成，且具有10-至30-氨基酸序列及兩親性螺旋結(jié)構(gòu)。
52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的肽毒素，其特征在于，所述具有正電荷的氨基酸是K、R或 H，且所述疏水性氨基酸是I、L、V、A或F。
53.根據(jù)權(quán)利要求50所述的肽毒素，其特征在于，所述間隔是連接有0至5個甘氨酸或脯氨酸或甘氨酸和脯氨酸的混合物的序列。
54.一種篩選藥物的方法，其特征在于，所述方法使用靶向高EGFR表達的癌細胞中的 EGFR和高EGFR表達的癌細胞的癌細胞膜的氨基酸序列。
55.根據(jù)權(quán)利要求M所述的篩選方法，其特征在于，所述藥物是抗癌劑。
56.根據(jù)權(quán)利要求M所述的篩選方法，其特征在于，所述氨基酸序列是YHWYGYTPQNVIG GGKLLLKLLKKLLKLLKKK(SEQ ID NO :2)。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種可用作抗癌劑或DDS的物質(zhì)，該物質(zhì)具有細胞內(nèi)穩(wěn)定性，該物質(zhì)針對正常細胞能避免副作用以免功能紊亂，或者該物質(zhì)具有瞬時效應(yīng)。本發(fā)明人研究開發(fā)了一種新穎的嵌合肽，該嵌合肽通過結(jié)合肽序列(例如與EGFR結(jié)合的肽序列)和溶解肽序列靶向過表達EGFR或諸如此類的癌細胞，從而達到此目的。具體而言，通過使用包括EGF受體結(jié)合肽或諸如此類以及細胞毒素肽的嵌合肽，從而達到此目的。
文檔編號C07K14/71GK102238965SQ200980148716
公開日2011年11月9日 申請日期2009年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月3日
發(fā)明者中島央美, 原本真里, 堀部智久, 川上浩司, 楊麗英, 河野雅之 申請人:優(yōu)普音芬尼迪株式會社