專利名稱：針對(duì)非洲馬疫病毒的疫苗的制作方法
針對(duì)非洲馬疫病毒的疫苗通過(guò)引用并入本申請(qǐng)要求提交于2008年10月M日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/108，075及提交于 2009年3月26日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/163，517的權(quán)利。將前述申請(qǐng)，及該文或它們的審查期間引用的全部文獻(xiàn)(“appln引用的文獻(xiàn)”)及 appln引用的文獻(xiàn)中全部引用的文獻(xiàn)或參考文獻(xiàn)，及本文中引用的或參考的全部文獻(xiàn)(“本文中引用的文獻(xiàn)”)，及本文中引用的文獻(xiàn)中引用的或參考的全部文獻(xiàn)，伴隨本文提及的或本文中通過(guò)引用合并的任何文獻(xiàn)中的任何產(chǎn)品的任何生產(chǎn)商的使用說(shuō)明，說(shuō)明書(shū)，產(chǎn)品說(shuō)明，及產(chǎn)品單通過(guò)引用合并到本文中，及可在本發(fā)明的實(shí)踐中采用。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗接種針對(duì)非洲馬疫病毒(AHSV)的受試者。尤其是，本發(fā)明涉及含及在宿主中表達(dá)一種或多種非洲馬疫病毒的免疫原性蛋白的重組載體的構(gòu)建及使用。本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)針對(duì)非洲馬疫病毒的免疫應(yīng)答的免疫學(xué)組合物或疫苗。本發(fā)明還涉及賦予對(duì)抗被非洲馬疫病毒感染的保護(hù)性免疫的組合物或疫苗。本申請(qǐng)中參考多個(gè)出版物。這些文獻(xiàn)的全部索引見(jiàn)于說(shuō)明書(shū)末，權(quán)利要求之前， 和/或文獻(xiàn)的引用處。這些文獻(xiàn)屬于本發(fā)明的領(lǐng)域；及，將本申請(qǐng)中引用的或參考的各文獻(xiàn) (“本文中引用的文獻(xiàn)”)，及各在本文中引用的文獻(xiàn)中引用的或參考的文獻(xiàn)均通過(guò)引用合并到本文中。
背景技術(shù)：
非洲馬疫(AiB)是馬及騾的嚴(yán)重的，常致死的，節(jié)肢動(dòng)物來(lái)源的病毒疾病(非洲馬疫，The Merck獸醫(yī)學(xué)手冊(cè))。在此疾病的一些形式中死亡率可高達(dá)95%。無(wú)癥狀的或弱的感染可在馬，以及斑馬及驢發(fā)生，尤其之前經(jīng)不同的病毒血清型感染的馬。感染的動(dòng)物或載體可將病毒攜帶到無(wú)AHS區(qū).一些作者描述，氣候變化可增加節(jié)肢動(dòng)物來(lái)源疾病(例如非洲馬疫)的擴(kuò)展的風(fēng)險(xiǎn)，如最近已在相關(guān)的藍(lán)舌病毒中發(fā)生的(Wilson A等人，Parasitol. Res. 2008 ；103 :69-77)。擬蚊庫(kù)蠓(Culicoides imicola)(此疾病的主要載體)，已襲擊北非及南歐。潛在的節(jié)肢動(dòng)物載體也貫穿實(shí)際上世界的全部地區(qū)存在，包括得美國(guó)及多數(shù)美洲其余地區(qū)。非洲馬疫由非洲馬疫病毒(呼腸病毒科(Reoviridae)中的一個(gè)屬-環(huán)狀病毒屬) 感染所致。至今，已知9種非洲馬疫病毒的血清型。第9血清型非洲馬疫病毒廣布于各地區(qū)，而第1 8血清型主要見(jiàn)于有限的地區(qū)。第9血清型造成在非洲之外的地區(qū)的大部分非洲馬疫蔓延。第4血清型在1987年和1990年之間西班牙及葡萄牙的蔓延一次(Lubroth J.，Equine Pract. 1988 ；10 :26-33)。對(duì)非洲馬疫病毒的初始研究導(dǎo)致1930年代對(duì)非洲馬疫病毒的小鼠大腦衰減的修飾的活病毒疫苗的開(kāi)發(fā)。優(yōu)化這些疫苗及導(dǎo)致I960年代組織培養(yǎng)衰減的修飾的活病毒 (MLV)疫苗的開(kāi)發(fā)。
盡管此疫苗的功效，其具有一些固有限制，包括個(gè)體動(dòng)物中的疫苗反應(yīng)(包括死亡)，個(gè)體動(dòng)物中改變的免疫應(yīng)答，用被動(dòng)母源免疫免疫幼小動(dòng)物的困難，疫苗病毒的毒力逆轉(zhuǎn)的可能性，及用可能的毒力逆轉(zhuǎn)疫苗接種后的疫苗株重組(du Plessis M. et al. 1998，Onderstepoort Journal of Veterinary Research 65 :321-329)。也有與使用 MLV疫苗的社會(huì)經(jīng)濟(jì)學(xué)牽連。南非有允許其出口馬到歐盟及許多其他國(guó)家的流程。此流程也使得來(lái)自其他國(guó)家的馬進(jìn)入南非以在各活動(dòng)中競(jìng)賽或臨時(shí)作為種畜的可能。流程基于確保馬對(duì)抗非洲馬疫病毒充分疫苗接種。獸醫(yī)局知道使用MLV疫苗的可能的危險(xiǎn)。多數(shù)這些問(wèn)題將通過(guò)交替開(kāi)發(fā)非洲馬疫病毒疫苗大大降低。非洲馬疫病毒基因組由10個(gè)雙鏈RNA段組成(0eHermann, R. A. et al.，1970 ； Bremer, C. W. et al.，1976)，其編碼至少10種病毒蛋白?；蚪M段以它們?cè)赑AGE種遷移的順序編號(hào)1 10。病毒蛋白中的7種是結(jié)構(gòu)性的，且形成雙殼病毒粒子。外部殼體由2 種主要病毒蛋白，VP2及VP5組成，其決定非洲馬疫病毒的抗原性存活力，而內(nèi)部殼體包括 2種大的(VP3及VP7)的及3種小的(VP1，VP4及VP6)病毒蛋白(Lewis SA and Grubman MJ, 1991) ； (Martinez-Torrecuadrada JL 等人，1994) ； (Bremer, Cff, et al. 1990 ；Grubman, M. J.& Lewis, S. Α.，1992)。VP3 及 VP7 在 9 種血清型之中高度保守(Oel Iermann 等人，1970 ； Bremer等人，1990)。已鑒定至少3種非結(jié)構(gòu)蛋白，NS1，NS2及NS3 (Huismans，H. & Els, H. J.，1979 ；vanStaden, V. & Huismans，H.，1991 ；Mizukoshi，N.等人，1992)。已開(kāi)發(fā)源于衰減的病毒的重組金絲雀痘病毒作為異源病毒基因表達(dá)的載體。許多這些金絲雀痘病毒構(gòu)建體已在許多國(guó)家(包括南非，歐盟及美國(guó))被許可作為用于馬(Minke JM，等人，200 及 b ;Minke JM，等人，2007 ;Siger L，等人 2006)及其他物種 (Poulet H，等人，2003)的疫苗。這些疫苗僅含目的生物的基因的事實(shí)使它們遺傳上安全(Minke JM，等人， 2004b)。此外，可檢測(cè)的中和抗體的起始甚至在單劑量的疫苗后也快速(Minke JM等人， 2004b)。所述疫苗的遺傳安全性及中和抗體的開(kāi)發(fā)的性質(zhì)使所述疫苗尤其有吸引力用于動(dòng)物流行病(Minke JM等人，20(Ma)。之前研究顯示，當(dāng)馬用外源地表達(dá)的VP2及適當(dāng)?shù)淖魟┙臃N時(shí)發(fā)展針對(duì)AHS的中和抗體(kanlen M，等人，200 。羊中的研究顯示，應(yīng)答藍(lán)舌病毒的中和抗體可通過(guò)將羊用 VP2及VP5共表達(dá)的病毒樣粒子接種來(lái)增強(qiáng)(Pearson LD, Roy P，1993)。共表達(dá)編碼藍(lán)舌病毒的VP2及VP5外部殼蛋白的基因的重組金絲雀痘病毒疫苗最近顯示在羊中誘導(dǎo)高水平的保護(hù)(Boone JD，等人，2007)。未顯示馬當(dāng)用含及共表達(dá)AHSV VP2及VP5的載體疫苗接種時(shí)發(fā)展針對(duì)非洲馬疫病毒的中和抗體。因此說(shuō)明，本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域中的需要，通過(guò)提供重組痘病毒(包括由其的組合物及產(chǎn)品)，尤其基于ALVAC的重組體及由其的組合物及產(chǎn)品，尤其表達(dá)AHSV VP 2及5的重組體或任何它們的組合及由其的組合物及產(chǎn)品。本申請(qǐng)中的文獻(xiàn)的引用或任何的鑒定不代表承認(rèn)所述文獻(xiàn)可作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。發(fā)明概述本發(fā)明的對(duì)象可為提供的重組載體或病毒以及制備所述重組載體或病毒的方法， 及提供組合物和/或疫苗以及治療及預(yù)防被非洲馬疫病毒的感染的方法的任何之一或全部。本發(fā)明提供包括及表達(dá)至少一種外源核酸分子的重組載體(例如重組病毒(例如重組痘病毒))，其中所述至少一種外源核酸分子可包括編碼來(lái)自非洲馬疫病毒的免疫原或目的表位(尤其病毒蛋白或非洲馬疫病毒的部分)的核酸分子。本發(fā)明還提供重組載體，其中所述非洲馬疫病毒株是1，2，4，或9。本發(fā)明還提供包括所述病毒或所述病毒的表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)(或免疫原性)，或疫苗組合物。本發(fā)明還提供誘導(dǎo)對(duì)抗非洲馬疫病毒的免疫學(xué)(或免疫原性)或保護(hù)應(yīng)答的方法，以及的方法預(yù)防或治療非洲馬疫病毒或由非洲馬疫病毒所致的疾病狀態(tài)，包括施用病毒或病毒的表達(dá)產(chǎn)物，或包括病毒的組合物，或包括病毒的表達(dá)產(chǎn)物的組合物。本發(fā)明也涵蓋來(lái)自病毒的表達(dá)產(chǎn)物，以及從表達(dá)產(chǎn)物或其體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生的抗體， 及所述產(chǎn)物及抗體的使用，例如在診斷性應(yīng)用中。本發(fā)明還提供AHSV VP2及VP5多肽及編碼AHSV VP2及VP5多肽的多核苷酸。本發(fā)明也提供新AHS株AHSV4-Jane。這些及其他實(shí)施方式描述于以下詳述，或從以下詳述中顯而易見(jiàn)，及被以下詳述
冷至
口 JnL。

以下詳述，通過(guò)實(shí)施例給出，但不旨在限制本發(fā)明僅到描述的特定實(shí)施方式，可伴隨附圖最佳理解，其中圖1提供pLHD3460. 4(產(chǎn)生表達(dá)合成的AHSV-4-VP2(SEQ ID NO :1)及合成的 AHSV-4-VP5 (SEQ ID NO 2)蛋白的ALVAC重組體的C3供體質(zhì)粒)的構(gòu)建方案。圖 2 提供 pLHD3460. 4 (pC3 H6p 合成的 AHSV_4_VP2/42Kp 合成的 AHSV-4-VP5)的 map 及相關(guān) SEQ ID NO。pLHD3460. 4 = SEQ ID NO 6 ；AHSV-4 VP2 DNA (pLHD3460. 4) -SEQ ID NO 4 ；AHSV-4 VP5 DNA(pLHD3460. 4)-SEQ ID NO 5 ；AHSV-4 VP2 PRT(pLHD3460. 4)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列-SEQ ID NO 1 ；AHSV-4 VP5 PRT (pLHD3460. 4)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列=SEQ ID NO :2。圖 3 提供 vCP2377 (ALVAC C3 H6p-合成的 AHSV-4_VP2/42Kp-合成的 AHSV-4-VP5) 的體外重組方案。圖4提供Vector NTI中創(chuàng)建的基因組DNA的理論限制酶凝膠。圖5提供來(lái)自VCP2377.6. 1. 1的P3濃儲(chǔ)物的基因組DNA提取的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，然后是用BamHI，HindIII或I^stI消化。圖6提供使用AHSV-4-VP2探針的vCP2377. 6. 1. 1的DNA印跡分析。圖7提供指示AHSV-4-VP5蛋白的表達(dá)的重組vCP2377的分析的蛋白印跡結(jié)果。圖8提供指示以1 100的稀釋使用第9代小鼠抗-AHSV VP5 mAb 10AE12的 VCP2377. 6. 1. 1群的100%同質(zhì)性的免疫噬斑結(jié)果。圖9提供用于擴(kuò)增重組VCP2377. 6. 1. 1序列的C3R-AHSV插入子-C3L片段及SEQ ID索引的引物圖譜(SEQ ID N0:17 21)。圖 10 顯示 pCXL2415. 1 (SEQ ID NO 22)(用于表達(dá) AHSV9-VP2 (SEQ ID NO 20)及AHSV9-VP5 (SEQ ID NO 21)蛋白的ALVAC重組體產(chǎn)生的C3供體質(zhì)粒)的構(gòu)建方案。圖 11 提供 pCXL2415. l(pALVAC C3 AHSV-9 H6 VP2 42K VP5)的圖譜及相關(guān) SEQ ID NO(18-21)。圖 12 提供 vCP2383(ALVAC C3 H6_ 合成的 AHSV9 VP2/42K-合成的 AHSV9 VP5)的
體外重組方案。圖13提供在Vector NTI中創(chuàng)建的基因組DNA的理論限制酶凝膠。圖 14 提供從用 BamH I，HindIII 或 XbaI 消化的 vCP2383. 3. 1. 1. 1 及 VCP2383. 9. 1. 1. 1基因組DNA提取的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖15提供使用AHSV-4-VP5探針的vCP2383的DNA印跡分析。圖16提供表明AHSV9 VP5蛋白的表達(dá)的重組vCP2383的分析的蛋白印跡結(jié)果。圖17提供指示以1 100的稀釋使用第9代小鼠抗-AHSV VP5 mAb 10AE12的 VCP2383. 3. 1. 1. 1群的100%同質(zhì)性的免疫噬斑結(jié)果。圖18提供用于擴(kuò)增重組VCP2383序列的整個(gè)C3L-H6 AHSV9 VP2-42K AHSV9 VP5-C3R片段及相關(guān)SEQ ID辣7 31)的引物的圖譜。圖19提供來(lái)自感染的CEF細(xì)胞的抗-VP2及抗_VP5 IFI的免疫熒光結(jié)果。圖20 A&B顯示使用抗-VP2㈧及抗_VP5 (B)與感染的及轉(zhuǎn)染的CEF的蛋白印跡的結(jié)果。圖21給出使用cpAHSV-4 (vCP2377)疫苗接種的6匹馬的針對(duì)AHSV-4的血清病毒中和測(cè)試的結(jié)果。顯示第0，28，及42天的結(jié)果。圖22顯示pJSY2M7. 2 (用于表達(dá)AHSV5-VP2及VP5蛋白的ALVAC重組體的產(chǎn)生的C3供體質(zhì)粒)的構(gòu)建方案。圖 23 提供 pJSY2247· 2 (pALVAC C3 AHSV5 H6 VP2 42K VP5)序列的圖譜及相關(guān) SEQ ID NO。圖 24 提供 vCP2398 (ALVAC C3 H6-合成的 AHSV5 VP2/42K-合成的 AHSV5 VP5)的
體外重組方案。圖25提供在Vector NTI中創(chuàng)建的基因組vCP2398 DNA的理論限制酶凝膠。圖洸提供用BamHI,HindIII或PstI消化的來(lái)自vCP2398. 2. 1. 1及3. 1. 1的基因組DNA提取的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖27提供使用AHSV5 VP2特異性探針的vCP2398的DNA印跡分柝。圖28提供表明AHSV5 VP5蛋白的表達(dá)的重組vCP2398的分析的蛋白印跡結(jié)果。圖四提供指示以1 100的稀釋使用小鼠抗-AHSV VP5 mAb 10AE12代的 VCP2383. 2. 1. 1群的100%同質(zhì)性的免疫噬斑結(jié)果。圖 30 提供用于擴(kuò)增重組 VCP2398 的整個(gè) C3L-H6 AHSV5 VP2-42K AHSV5 VP5-C3R 片段的引物的圖譜。圖31提供來(lái)自用VCP2377免疫的8匹(部分如SEQ ID NO 17所示)及用EIV-CP 免疫的對(duì)照馬的AHSV攻擊結(jié)果的3個(gè)亞圖。亞圖A 編碼AHSV NS2及VP7蛋白的基因的qRT_PCR，s的循環(huán)閾值(顯示的NS2 及VP7特征的平均值)。如果熒光在最大40個(gè)循環(huán)內(nèi)超過(guò)0. 1的閾值，通過(guò)用分類為陽(yáng)性的樣品檢測(cè)編碼AHSV的VP7及NS2蛋白的個(gè)體基因的qRT-PCR測(cè)定測(cè)定馬血中有AHSV。
亞圖B:體溫，IDEM亞圖C 用AHSV第4血清型.IDEM的強(qiáng)毒野外株攻擊后，用vCP2377免疫接種的8 匹及未免疫接種的對(duì)照馬的血小板計(jì)數(shù)。圖32提供總結(jié)序列表中存在的SEQ ID NO的表。圖 33 提供 AHSV-4/5/9VP2 蛋白(SEQ ID NO :1,44,30)的 ClustalW 比對(duì)。圖 34 提供 AHSV-4/5/9 VP5 蛋白(SEQ ID NO :2,45,31)的 Clustalff 比對(duì)。圖35提供合成的AHSV-4-VP2蛋白(SEQ ID NO 1)對(duì)比野外分離的AHSV4 Jane 株(SEQ ID NO 49)的ClustalW比對(duì)。也顯示百分率同一性。圖36提供合成的AHSV-4-VP5蛋白(SEQ ID NO 2)對(duì)比野外分離AHSV4 Jane株 (SEQ ID NO 51)的ClustalW比對(duì)。也顯示百分率同一性。圖37提供合成的AHSV-4-VP2蛋白(SEQ ID NO 1)對(duì)比多種沉淀的AHSV-4-VP2 蛋白(SEQ ID N0:59 63)的ClustalW比對(duì)。提供百分率同一性表。圖38提供合成的AHSV-4-VP5蛋白(SEQ ID NO 2)對(duì)比多種沉淀的AHSV-4-VP5 蛋白(SEQ ID N0:52 58)的ClustalW比對(duì)。提供百分率同一性表。圖39提供密碼子優(yōu)化的AHSV4-VP2(SEQ ID NO :04)對(duì)比野外分離AHSV4-VP2 (SEQ ID NO 48)的ClustalW比對(duì)。提供百分率同一性。圖40提供密碼子優(yōu)化的AHSV4-VP5(SEQ ID NO :05)對(duì)比野外分離AHSV4-VP5 (SEQ ID NO 50)的ClustalW比對(duì)。提供百分率同一性。發(fā)明詳述注意，在此公開(kāi)及尤其在權(quán)利要求和/或段落中，術(shù)語(yǔ)例如“包括(comprises) ”， “包括(comprised)”，“包括(comprising) ”等可具有美國(guó)專利法中規(guī)定的含義；例如它們可表示“包括(includes)”，“包括(included) ”，“包括(including) ”等；及術(shù)語(yǔ)例如“基本上由構(gòu)成”及“基本上由構(gòu)成”具有美國(guó)專利法中規(guī)定的含義，例如它們?cè)试S不隱含敘述的成分，但排除見(jiàn)于現(xiàn)有技術(shù)或影響本發(fā)明的基本或新特征的成分。除非另有指明，根據(jù)常規(guī)利用使用技術(shù)術(shù)語(yǔ)。分子生物學(xué)中通常術(shù)語(yǔ)的定義可見(jiàn)于 Benjamin Lewin，基因 V.由 Oxford 大學(xué)出版社公開(kāi)，1994(ISBN 0-19-854287-9); Kendrew 等人(eds. ), TheEncyclopedia of Molecular Biology,被 Blackwell Science Ltd.公開(kāi)，1994 (ISBN 0-632-02182-9)；及 Robert A. Meyers (ed.) ,MolecularBiology and Biotechnology :a Comprehensive Desk Reference，由 VCH 出片反Jf， Inc. , 1995 (ISBN 1-56081-569-8)。單數(shù)術(shù)語(yǔ)“a，” "an, ”及“the”包括復(fù)數(shù)個(gè)對(duì)象，除非上下文明顯表示別的。類似地，詞語(yǔ)“或”旨在包括“及”，除非上下文明顯表示別的。詞語(yǔ)“或”指特定列表中的任一成員及也包括成員列表的任何組合。靶物種或受試者(宿主)包括動(dòng)物及人。本文所用的動(dòng)物可選自馬科動(dòng)物(例如馬)，犬科動(dòng)物(例如狗，狼，狐貍，山狗，豺狗)，貓科動(dòng)物(例如獅，虎，家貓，野生貓，其他大貓，及其他貓科動(dòng)物包括獵豹及山貓)，羊科動(dòng)物(例如羊)，牛科動(dòng)物(例如牛)，豬科動(dòng)物(例如豬)，禽類(例如雞，鴨，鵝，火雞，鵪鶉，雉雞，鸚鵡，雀，鷹，烏鴉，鴕鳥(niǎo)，鴯鹋及鶴鴕)，靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如狐猴，跗猴，猴，長(zhǎng)臂猿，人猿)，及魚(yú)。術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”也包括在發(fā)展的全部階段中的個(gè)體動(dòng)物，包括胚胎及胎兒階段。
術(shù)語(yǔ)“多肽”及“蛋白”在本文中互換使用，指連續(xù)氨基酸殘基的聚合物。術(shù)語(yǔ)“核酸”，“核苷酸”，及“多核苷酸”指RNA或DNA及其衍生物，例如含修飾的主鏈的那些。需知，本發(fā)明提供包括互補(bǔ)于本文所述的那些的序列的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以不同的方式制備(例如通過(guò)化學(xué)合成，通過(guò)基因克隆等)及可取各形式(例如線性或分支的，單鏈或雙鏈，或其雜交體，引物，探針等)。術(shù)語(yǔ)“基因”廣泛地使用，指與生物學(xué)功能相關(guān)的多核苷酸的任何段。由此，基因或多核苷酸包括內(nèi)含子及外顯子，如在基因組序列中，或僅編碼序列如在cDNA中，例如開(kāi)放閱讀框(ORF)，從開(kāi)始密碼子(甲硫氨酸密碼子)開(kāi)始及在終止信號(hào)(終止密碼子)終止?；蚣岸嗪塑账嵋部砂ㄕ{(diào)節(jié)它們的表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄起始，翻譯及轉(zhuǎn)錄終止)的區(qū)。 由此，也包括的是啟動(dòng)子及核糖體結(jié)合區(qū)(一般而言這些調(diào)控元件位于編碼序列或基因的開(kāi)始密碼子的上游的大致60和250個(gè)核苷酸之間；Doree SM等人；Pandher K等人；Chung JY等人)，轉(zhuǎn)錄終止子(一般而言終止子位于編碼序列或基因的終止密碼子下游的約50個(gè)核苷酸之內(nèi)；Ward CK等人)。基因或多核苷酸也指表達(dá)mRNA或有功能的RNA，或編碼特異性蛋白，及包括調(diào)控序列的核酸片段。本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性多肽”或“免疫原性片段”指包括等位基因特異性基序， 表位或其他序列的多肽或多肽的片段，以至于多肽或片段將結(jié)合MHC分子及誘導(dǎo)細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞(“CTL”)應(yīng)答，和/或B細(xì)胞應(yīng)答(例如，抗體產(chǎn)生)，和/或T輔助細(xì)胞淋巴細(xì)胞應(yīng)答，和/或?qū)ρ苌雒庖咴远嚯幕蛎庖咴云蔚目乖难舆t的類型超敏反應(yīng) (DTH)應(yīng)答。DTH應(yīng)答是免疫反應(yīng)，其中T細(xì)胞依賴性巨噬細(xì)胞活化及發(fā)炎導(dǎo)致組織損傷。 對(duì)抗原的皮下注射的DTH反應(yīng)常用作細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的測(cè)定。通過(guò)定義，表位是一旦施用于宿主免疫學(xué)活躍的抗原決定簇，其能引發(fā)體液(B細(xì)胞)和/或細(xì)胞類型(T細(xì)胞)的免疫應(yīng)答。這些分子上的有抗原性的特定化學(xué)基團(tuán)或肽序列?？贵w特異性結(jié)合多肽上的特定抗原性表位。特異性地，表位的非限制性實(shí)施例包括多肽中的四 五肽序列，多糖中的三 五個(gè)糖苷序列。在動(dòng)物中，多數(shù)抗原將同時(shí)存在幾種或甚至許多抗原決定簇。所述多肽也可定性為免疫原性多肽及表位可在下文中進(jìn)一步鑒定。本文所用的術(shù)語(yǔ)“純化的”不要求絕對(duì)純度；旨在表示相對(duì)純度。由此，例如，純化的多肽制劑是多肽相比多肽在其天然的環(huán)境中更富含的多肽制劑。多肽制劑基本上純化的，以至于多肽代表制劑的總多肽含量的至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少 95%，或至少98%的幾個(gè)實(shí)施方式。多核苷酸也相同。本文中公開(kāi)的多肽可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何手段純化。重組多核苷酸是指不是天然存在的或具有通過(guò)序列的2種別樣分離的段的人工的組合制備的序列的序列的多核苷酸。此人工組合常通過(guò)化學(xué)合成或，更通常，通過(guò)核酸的分離的段的人工操作，例如，通過(guò)遺傳加工技術(shù)實(shí)現(xiàn)。在一實(shí)施方式中，重組多核苷酸編碼融合蛋白。一方面，本發(fā)明提供來(lái)自非洲馬疫病毒的多肽。另一方面，本發(fā)明提供具有如SEQ ID NO :1，2，20，21，30，31，35，36，44，45，49，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62 或 63
所示的序列的多肽，及其變體或片段。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“非洲馬疫病毒蛋白或非洲馬疫病毒多肽(AHSV VP)”可包括 AHSV VPl, VP2，VP3，VP4，NSl, VP5，VP6，VP7，NS2, NS3，及它們的同源物，片段及變體。
來(lái)自非洲馬疫病毒的病毒蛋白的同源物旨在在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“同源物”包括直系同原物，類似物及旁系同原物。術(shù)語(yǔ)“類似物”指2種多核苷酸或多肽具有相同的或類似功能，但在不相關(guān)的生物中獨(dú)立地進(jìn)化。術(shù)語(yǔ)“直系同原物”指2種多核苷酸或多肽來(lái)自不同的物種，但通過(guò)物種形成進(jìn)化自的共同的祖先基因。正常情況下，直系同原物編碼具有相同的或類似功能的多肽。術(shù)語(yǔ)“旁系同原物”指2種多核苷酸或多肽通過(guò)在基因組之內(nèi)復(fù)制而相關(guān)。旁系同原物通常具有不同的功能，但這些功能可相關(guān)。野生型非洲馬疫病毒多肽的類似物，直系同原物，及旁系同原物可在翻譯后修飾，在氨基酸序列差異，或在兩者上不同于野生型非洲馬疫病毒多肽。尤其是，本發(fā)明的同源物將通常與全部或部分野生型非洲馬疫病毒多肽或多核苷酸序列呈現(xiàn)至少80 85%，85 90%，90 95%，或95%，96%，97%，98%，99%序列同一性，及將呈現(xiàn)類似功能。另一方面，本發(fā)明提供與具有如SEQ ID NO 1，2，20，21，30，31，35，36，44，45，49， 51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62或63所示的序列的多肽具有至少70%,至少 75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的 AHSV VP。在另一方面，本發(fā)明提供以上鑒定的AHSV VP的片段及變體(SEQ ID NO :1,2,20, 21，30，31，35，36，44，45，49，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，或 63)，其可由本領(lǐng)
于技術(shù)人員之一使用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)容易制備。變體是具有與如SEQ ID NO 1，2，20，21，30，31，35，36，44，45，49，50，51，52，53， 54，55，56，57，58，59，60，61，62，或 63 所示的氨基酸序列具有至少 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95%，96%，97%，98%，或99%同一性的氨基酸序列的同源AHSV VP。變體包括等位變體。術(shù)語(yǔ)"等位變體"指含導(dǎo)致蛋白的氨基酸序列變化及在天然的群(例如病毒物種或變種)之內(nèi)存在的多態(tài)性的多核苷酸或多肽。所述天然的等位基因變化可一般在多核苷酸或多肽中導(dǎo)致1 5%變異。等位變體可通過(guò)在許多不同的物種中測(cè)序目的核酸序列來(lái)鑒定，其可通過(guò)使用在那些物種中鑒定相同的基因遺傳座位的雜交探針輕易進(jìn)行。是天然的等位基因變異及不改變基因的功能活性(如果感興趣)的結(jié)果的任何及全部所述核酸變化及得到的氨基酸多態(tài)性或變化旨在在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。變體是任何來(lái)自非洲馬疫病毒的多肽，能在用此多肽特異性免疫接種的動(dòng)物(例如馬科動(dòng)物)中誘導(dǎo)以用非洲馬疫病毒刺激之后分泌干擾素Y(IFN-Y)為特征的基于細(xì)胞的免疫應(yīng)答。所述IFN-γ分泌可使用體外方法(i.e.來(lái)自的R&D SYSTEMS Inc.的 QUANTIKINE 免疫測(cè)定(貨號(hào) #CAIF00) ；Djoba Siawaya JF 等人)展示。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"衍生物"或“變體”指多肽，或編碼多肽的核酸，其具有一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸變化或其他小的修飾，以至于(1)相應(yīng)多肽相比野生型多肽具有基本上相當(dāng)?shù)墓δ芑? 針對(duì)多肽產(chǎn)生的抗體與野生型多肽是免疫反應(yīng)性的。這些變體或衍生物包括具有非洲馬疫病毒的多肽一級(jí)氨基酸序列的可產(chǎn)生相比未修飾的多肽具有基本上相當(dāng)?shù)幕钚缘碾牡男〉男揎椀亩嚯摹Ｋ鲂揎椏蔀榫?xì)的，如通過(guò)定點(diǎn)誘變，或可自發(fā)。術(shù)語(yǔ) “變體”還涵蓋序列的缺失，添加及取代，只要多肽發(fā)揮功能而產(chǎn)生本文定義的免疫學(xué)應(yīng)答。非洲馬疫病毒多肽的免疫原性片段包括具有如SEQ ID NO =1,2,20,21,30,31,35, 36，44，45，49，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，或其變體所示的序列的非洲馬疫病毒的多肽的至少8，10，15，或20個(gè)連續(xù)氨基酸，至少21個(gè)氨基酸，至少23個(gè)氨基酸，至少25個(gè)氨基酸，或至少30個(gè)氨基酸。在另一實(shí)施方式中，非洲馬疫病毒的片段包括見(jiàn)于全長(zhǎng)非洲馬疫病毒多肽的特異性抗原性表位。測(cè)定多肽及表位的片段的方法例如，產(chǎn)生重疊肽庫(kù)(Hemmer B.等人)， Pepscan (Geysen H. M.等人，1984 ;Geysen H. Μ.等人，1985 ;Van der Zee R.等人；Geysen H. Μ.)及算法(De Groot Α.等人；Hoop Τ.等人；Parker K.等人)可用于本發(fā)明的實(shí)踐， 無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。一般而言，抗體特異性地結(jié)合特定抗原性表位。特異性地，表位的非限制性實(shí)施例在多肽中包括四 五肽序列，在多糖中包括三 五糖苷序列。在動(dòng)物中，多數(shù)抗原將同時(shí)存在幾個(gè)或甚至許多抗原決定簇。優(yōu)選其中所述表位是更大分子的蛋白片段，其將與總蛋白具有基本上相同的免疫學(xué)活性。另一方面，本發(fā)明提供編碼AHSV VP的多核苷酸，例如編碼具有如SEQ ID NO 1, 2，20，21，30，31，35，36，44，45，49，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63 所示的序列的AHSV VP的多核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供多核苷酸編碼與具有如SEQ ID NO =1,2,20, 21，30，31，35，36，44，45，49，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63 所示的序列的多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98% 或99%序列同一性的多肽，或包括這些多肽之一的至少8或至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的保守變體，等位變體，同源物或免疫原性片段，或這些多肽的組合。另一方面，本發(fā)明提供具有如SEQ ID NO :3，4，5，6，17，18，19，22，27，28，29，32， 33，34，41，42，43，48，50所示的核苷酸序列的多核苷酸，或其變體。在另一方面，本發(fā)明提供與具有如 SEQ ID NO :3,4,5,6,17，18，19，22，27，28，29，32，33，34，41，42，43，48，50 所示的序列的多核苷酸之一具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少 95 %，至少95 %，96 %，97 %，98 %或99 %序列同一性的多核苷酸，或其變體。這些多核苷酸可包括編碼AHSV VP的DNA，cDNA,及RNA序列。應(yīng)知，編碼非洲馬疫病毒多肽的全部多核苷酸也包括的本文中，只要它們編碼具有可識(shí)別的活性(例如結(jié)合到識(shí)別多肽的抗體，針對(duì)多肽的免疫應(yīng)答誘導(dǎo)，或當(dāng)施用于暴露于非洲馬疫病毒或經(jīng)歷非洲馬疫的體征或癥狀的降低的受試者時(shí)對(duì)非洲馬疫的存活的效應(yīng))的多肽。本公開(kāi)的多核苷酸包括作為遺傳密碼的結(jié)果簡(jiǎn)并的序列，例如對(duì)特異性宿主的優(yōu)化的密碼子利用。如本文所用，“優(yōu)化的”指經(jīng)遺傳加工以增加其在給定物種中表達(dá)的多核苷酸。為提供編碼非洲馬疫多肽的優(yōu)化的多核苷酸，可將非洲馬疫病毒蛋白基因的DNA序列修飾為(1)包括在特定物種中高度表達(dá)的基因中優(yōu)選的密碼子；( 包括基本上見(jiàn)于所述物種的核苷酸堿基成分的A+T或G+C含量；C3)形成所述物種的起始序列；或(4)消除導(dǎo)致去穩(wěn)定，不適當(dāng)?shù)亩嗑巯佘账峄?，RNA的降解及終止，或形成二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)卡或RNA剪接位點(diǎn)的序列。非洲馬疫蛋白在所述物種中的增加的表達(dá)可通過(guò)利用真核生物及原核生物，或特定物種中密碼子利用的分布頻度實(shí)現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)“優(yōu)選的密碼子利用的頻度”指由特異性宿主細(xì)胞在指定給定氨基酸的核苷酸密碼子的利用中呈現(xiàn)的偏好。有20種天然氨基酸，多數(shù)被多于一種密碼子指定。因此，全部簡(jiǎn)并核苷酸序列包括在本公開(kāi)中，只要由核苷酸序列編碼的非洲馬疫病毒多肽的氨基酸序列在功能性未變。2個(gè)氨基酸序列之間的序列同一性可建立通過(guò)NCBI (美國(guó)生物技術(shù)信息中心)配對(duì)blast和blosum62矩陣，使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)(見(jiàn)，例如在〃美國(guó)生物技術(shù)信息中心〃(NCBI， Bethesda,Md.，美國(guó))服務(wù)器上可用的BLAST或BLASTX算法，以及Altschul等人；及由此，此文獻(xiàn)說(shuō)道通過(guò)術(shù)語(yǔ)“blasts”使用算法或BLAST或BLASTX及BL0SUM62矩陣)。也可使用Myers和Miller的“比對(duì)”程序(及在NCBI可用)以及經(jīng)hternet在其上的網(wǎng)站(例如NCBI網(wǎng)站)可用的相同的或其他程序測(cè)定2個(gè)核苷酸序列之間的序列同一性(“線性空間中的最佳比對(duì)”，CABIOS 4,11 ~ 17，1988)。另外，術(shù)語(yǔ)“同一性”，例如，關(guān)于核苷酸或氨基酸序列的同一性，可表示2個(gè)序列之間的同源性的定量測(cè)量。百分比序列同源性可計(jì)算為=(Nref^dif)女100/Nref，其中 是比對(duì)時(shí)2個(gè)序列中的非同一殘基總數(shù)，并且其中是是序列之一的殘基的數(shù)。因此，DNA 序列AGTCAGTC將與序列AATCAATC具有75%序列同一性(Nref = 8 ；Ndif = 2)。另外，關(guān)于序列的“同一性”可指相同的核苷酸或氨基酸除以2個(gè)序列的較短者中核苷酸或氨基酸數(shù)的位置的數(shù)，其中2序列的比對(duì)可根據(jù)Wilbur及Lipman算法測(cè)定(Wilbur及Lipman)，例如，使用20個(gè)核苷酸的窗尺寸，4個(gè)核苷酸的字長(zhǎng)，及4的空位罰分，及計(jì)算機(jī)輔助分析及序列數(shù)據(jù)(包括比對(duì))的解釋可使用可商購(gòu)的程序(例如 Intelligenetics Suite, Intelligenetics Inc. CA)方便地進(jìn)行。當(dāng) RNA 序列類似，或與 DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性，DNA序列中的胸苷(T)認(rèn)為是等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。由此，RNA序列在本發(fā)明的范圍之內(nèi)及可源于DNA序列，通過(guò)將DNA序列中的胸苷(T)考慮為等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。2個(gè)氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或2個(gè)核苷酸序列之間的序列同一性可使用 Vector NTI 軟件套裝測(cè)定 Gnvitrogen，1600 Faraday Ave.，Carlsbad, CA)。以下文獻(xiàn)提供比較序列的相對(duì)同一性或同源性的算法，及附加地或替代性地關(guān)于前述，這些參考文獻(xiàn)中的教導(dǎo)可用于確定百分比同源性或同一性=Needleman SB及^msch CD ；Smith TF R Waterman MS ；Smith TF, Waterman MS^ Sadler JR ；Feng DF^Dolittle RF ；Higgins DG 及 Sharp PM ；Thompson JD, Higgins DG 及 Gibson TJ -,]^, Devereux J, Haeberlie P及Smithies 0.及，無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可借助許多確定百分比同源性的其他程序或參考文獻(xiàn)。將非洲馬疫病毒多核苷酸可包括合入載體的重組DNA，進(jìn)入自主復(fù)制質(zhì)?；虿《?， 或進(jìn)入原核生物或真核生物的基因組DNA，或作為(例如，cDNA)獨(dú)立于其他序列的獨(dú)立的分子存在。本文中公開(kāi)的重組載體可包括編碼多肽，其變體或其片段的多核苷酸。重組載體可包括質(zhì)粒及病毒載體，及可用于體外或體內(nèi)表達(dá)。重組載體還可包括信號(hào)肽。信號(hào)肽是引導(dǎo)蛋白(胞質(zhì)溶膠中合成的)翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)到某些細(xì)胞器例如細(xì)胞核，線粒體基質(zhì)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)， 葉綠體，離質(zhì)體及過(guò)氧化物酶體的短肽鏈(3 60個(gè)氨基酸長(zhǎng))。信號(hào)序列可為來(lái)自非洲馬疫病毒蛋白的天然的序列或來(lái)自分泌的蛋白的肽信號(hào)，例如來(lái)自組織纖溶酶原活化物蛋白 (tPA)的信號(hào)肽，尤其是人 tPA (S. Friezner Degen 等人；R. Rickles 等人；D. Berg.等人)， 或來(lái)自胰島素樣生長(zhǎng)因子1 (IGFl)的信號(hào)肽，尤其是馬IGFl (K. Otte等人)，狗IGFl (P. Delafontaine 等人)，貓 IGFl (W003/022886)，牛 IGFl (S. Lien 等人)，豬 IGFl (M. Muller 等人)，雞 IGFl (Y. Kajimoto 等人)，火雞 IGFl (GenBank 登錄號(hào) AF074980)。來(lái)自 IGFl 的信號(hào)肽可為天然的或優(yōu)化的，其可通過(guò)去除隱含的剪接位點(diǎn)和/或通過(guò)適應(yīng)密碼子利用來(lái)實(shí)現(xiàn)。翻譯之后，可在切割位點(diǎn)切割未處理的多肽，以產(chǎn)生成熟的多肽。切割位點(diǎn)可使用Von Heijne的方法(1986)預(yù)測(cè)。
質(zhì)粒可包括DNA轉(zhuǎn)錄單元，例如允許其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，例如復(fù)制原點(diǎn)(原核或真核生物)。質(zhì)粒也可包括一個(gè)或多個(gè)可選擇的標(biāo)記物基因及本領(lǐng)域中已知的其他遺傳元件。本公開(kāi)內(nèi)容中含蓋環(huán)形及線性形式的質(zhì)粒。在其他方面，本發(fā)明涉及用于在用組合物接種的宿主動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫學(xué)或保護(hù)應(yīng)答的疫苗組合物或藥物組合物。組合物包括載質(zhì)或稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，及重組載體，例如重組病毒。重組病毒可為修飾的重組病毒；例如，滅活的病毒的重組體(例如分裂的或缺失的)病毒編碼的遺傳功能。修飾的重組病毒可為滅活病毒編碼的非必要的遺傳功能；例如，從而重組病毒具有衰減的毒力及增強(qiáng)的安全性。本發(fā)明的組合物中使用的病毒有利地是痘病毒，例如痘苗病毒或浣熊痘病毒或優(yōu)選禽痘病毒，例如雞痘病毒或更優(yōu)選金絲雀痘病毒；及更有利地，ALVAC病毒。重組載體或重組病毒不在哺乳動(dòng)物物種中復(fù)制而具有表達(dá)是有利的。另一方面，本發(fā)明涉及包括至少一種編碼一種或多種非洲馬疫病毒(AHSV) 抗原的核酸分子的重組載體。其還涉及包括對(duì)在受試者中引起保護(hù)免疫應(yīng)答來(lái)說(shuō)有效量的包括至少一種編碼一種或多種非洲馬疫病毒(AHSV)抗原的核酸分子的重組禽痘病毒載體的疫苗或免疫原性組合物。其還涉及針對(duì)非洲馬疫病毒相應(yīng)疫苗接種受試者的方法。使用的藥學(xué)可接受的媒質(zhì)或賦形劑是常規(guī)的。E. W. Martin，Mack Publishing Co. , Easton, PA, 15th Edition 的 Remington'sPharmaceutical Sciences (1975)描述了適宜于本文中公開(kāi)的多肽，質(zhì)粒，病毒載體的藥學(xué)遞送的組合物及制劑。一般而言，媒質(zhì)或賦形劑的性質(zhì)將取決于采用的特定施用模式。例如，腸胃外制劑通常包括包含藥學(xué)及生理學(xué)可接受的流體(例如水，生理鹽水，平衡的鹽溶液，含水右旋糖，甘油等)的可注射的流體作為媒質(zhì)。作為固體組合物(例如，凍干的錠劑，粉末，丸劑，片劑，或膠囊形式)，常規(guī)非毒性固體媒質(zhì)或賦形劑可包括，例如，藥學(xué)級(jí)甘露糖醇，乳糖，淀粉，或硬脂酸鎂。除了生物學(xué)中性媒質(zhì)或賦形劑之外，待施用的免疫原性組合物可含少量的非毒性助劑物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或乳化劑，防腐劑，及PH緩沖劑等，例如乙酸鈉或山梨糖醇酐單月桂酸酯。根據(jù)本發(fā)明的組合物或疫苗可包括包含如上所述的本發(fā)明的編碼一種或多種 AHSV VP的一或多種多核苷酸的載體?？稍谙嗤妮d體中使用不同的插入位點(diǎn)或使用相同的插入位點(diǎn)進(jìn)行多個(gè)插入。當(dāng)使用相同的插入位點(diǎn)時(shí)，可將各多核苷酸插入子(其可為前述本發(fā)明的任何多核苷酸)在相同的和/或不同的啟動(dòng)子的控制下插入。插入可尾尾，頭頭，尾頭，或頭尾進(jìn)行。IRES元件(內(nèi)部Ribosome Entry位點(diǎn)，見(jiàn)EP 0803573)也可用于分離及，以表達(dá)可操作連接到相同的和/或不同的啟動(dòng)子的多個(gè)插入子。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包括一或多種前述核苷酸的表達(dá)載體。表達(dá)載體可為體內(nèi)表達(dá)載體，或體外表達(dá)載體。在一實(shí)施方式中，重組載體或病毒可包括編碼一種或多種非洲馬疫病毒(AHSV) 抗原，免疫原的一種或多種異源核酸分子，包括表位或其片段。重組載體或修飾的重組病毒可包括，例如在病毒基因組之內(nèi)，例如病毒基因組的非必需區(qū)之內(nèi)，編碼免疫原性蛋白的異源DNA序列，例如源于非洲馬疫病毒蛋白的，例如AHSV VPl, VP2，VP3，VP4，NSl, VP5，VP6， VP7，NS2，NS3或任何它們的組合，優(yōu)選AHSV VP2及5，(其中所述免疫原性蛋白可為目的表位,例如來(lái)自由 AHSV VPl, VP2, VP3, VP4, NSl, VP5, VP6, VP7, NS2, NS3 的任何一種或多種表達(dá)的蛋白的目的表位，例如來(lái)自AHSV VP2和/或5的目的表位)。載體或病毒有利地是痘病毒，例如痘苗病毒或優(yōu)選禽痘病毒，例如雞痘病毒或更優(yōu)選金絲雀痘病毒；及更有利地， ALVAC病毒。在另一實(shí)施方式中，編碼一種或多種非洲馬疫病毒(AHSV)抗原，免疫原，包括表位或片段其的異源核酸分子，例如源于非洲馬疫病毒蛋白的，例如AHSV VP1，VP2，VP3，VP4， NSl, VP5，VP6，VP7，NS2, NS3或任何它們的組合，優(yōu)選AHSV VP2及5，(其中所述免疫原性蛋白可為目的表位，例如來(lái)自由AHSV VP1，VP2，VP3，VP4，NSl, VP5, VP6，VP7，NS2,或NS3的任何一種或多種表達(dá)的蛋白的目的表位，例如來(lái)自AHSV VP2和/或5的目的表位)可操作連接到啟動(dòng)子序列及任選連接到增強(qiáng)子。在有利的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子序列選自H6牛痘病毒啟動(dòng)子，I3L牛痘病毒啟動(dòng)子，4 (痘病毒啟動(dòng)子，7. 牛痘病毒啟動(dòng)子，及π牛痘病毒啟動(dòng)子。更有利地，啟動(dòng)子序列是Η6牛痘病毒啟動(dòng)子或4 (痘病毒啟動(dòng)子。更優(yōu)選地，VP2 可操作連接到H6牛痘病毒啟動(dòng)子，并且VP5可操作連接到4 痘病毒啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方式中，將編碼一種或多種非洲馬疫病毒(AHSV)抗原，免疫原，包括表位或其片段，例如源于非洲馬疫病毒蛋白的，例如AHSV VPl，VP2，VP3，VP4，NSl，VP5，VP6， VP7, NS2, NS3，或任何它們的組合，優(yōu)選AHSV VP2及5，(其中所述免疫原性蛋白可為目的表位，例如來(lái)自由 AHSV VPl，VP2，VP3，VP4，NSl，VP5，VP6，VP7，NS2，或 NS3 的任何一種或多種表達(dá)的蛋白的目的表位，例如來(lái)自AHSV VP2和/或5的目的表位)的異源核酸分子插入包括插入座位的載體，其中所述座位包括C5和/或C6和/或C3，且其中所述C6，C5和/ 或C3插入座位的側(cè)翼序列促進(jìn)有同源的插入座位的非洲馬疫病毒抗原的同源重組。在另一實(shí)施方式中，將編碼一種或多種非洲馬疫病毒(AHSV)抗原，免疫原，包括表位或其片段，例如源于非洲馬疫病毒蛋白的，例如AHSV VPl，VP2，VP3，VP4，NSl，VP5，VP6， VP7, NS2, NS3，或任何它們的組合，優(yōu)選AHSV VP2及5，(其中所述免疫原性蛋白可為目的表位，例如來(lái)自由 AHSV VPl，VP2，VP3，VP4，NSl，VP5，VP6，VP7，NS2，或 NS3 的任何一種或多種表達(dá)的蛋白的目的表位，例如來(lái)自AHSV VP2和/或5的目的表位)的異源核酸分子插入包括插入座位的載體中，其中所述座位包括C5和/或C6和/或C3，并且其中所述C6，C5 和/或C3插入座位的側(cè)翼序列促進(jìn)有同源插入座位的非洲馬疫病毒抗原的同源重組，且其中所述側(cè)翼序列包括禽痘病毒的C3L及C3R開(kāi)放閱讀框。在另一實(shí)施方式中，禽痘病毒載體是VCP2377或vCP2383或vCP2398。本發(fā)明的實(shí)施將采用，除非另有說(shuō)明，分子生物學(xué)，微生物學(xué)，細(xì)菌學(xué)，重組DNA技術(shù)，及免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，它們?cè)诒绢I(lǐng)于技術(shù)人員之內(nèi)。文獻(xiàn)中完全解釋技術(shù)所述(見(jiàn)，例 tU Sambrook, et al. 1989 ；1985 ；M. J. Gait ed. 1984 ；B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984 ； R. K. Freshney ed. 1986 ；IRL press, 1986 ；Perbal,B.，1984 ；及D. M. Weir及C. C. Blackwell eds.，1986)。一方面，本發(fā)明提供重組載體，例如病毒，例如其中含來(lái)自非洲馬疫病毒的DNA序列的，例如在病毒(例如痘病毒)基因組，有利地病毒的非必需區(qū)，例如痘病毒基因組的重組痘病毒。痘病毒可為痘苗病毒，例如NYVAC或基于NYVAC的病毒；及痘病毒有利地是禽痘病毒，例如雞痘病毒，尤其衰減的雞痘病毒，例如TR0VAC，或金絲雀痘病毒，優(yōu)選衰減的金絲雀痘病毒，例如ALVAC。但是，本發(fā)明中的載體可為任何適宜重組病毒或病毒載體，例如痘病毒(例如痘苗病毒，禽痘病毒，金絲雀痘病毒，雞痘病毒，浣熊痘病毒，豬痘病毒等)，腺病毒 (例如犬腺病毒)，皰疹病毒，桿狀病毒，反轉(zhuǎn)錄病毒等(如在通過(guò)引用合并到本文中的文獻(xiàn)
14中)；或載體可為質(zhì)粒。重組病毒可為修飾的重組病毒；例如，已滅活(例如分裂的或缺失的)病毒編碼的遺傳功能的病毒的重組。修飾的重組病毒可滅活了病毒編碼的非必需遺傳功能；例如， 從而重組病毒具有衰減的毒力及增強(qiáng)的安全性。本發(fā)明的組合物中使用的病毒有利地是痘病毒，例如痘苗病毒或優(yōu)選禽痘病毒，例如雞痘病毒或更優(yōu)選金絲雀痘病毒；及更有利地， ALVAC病毒。重組載體或重組病毒無(wú)需在哺乳動(dòng)物物種中復(fù)制而具有表達(dá)是有利的。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，病毒載體是痘病毒，例如痘苗病毒或衰減的痘苗病毒， (例如，MVA, Ankara疫苗株在雞胚胎成纖維細(xì)胞上多于570代后得到的修飾的Ankara株； 見(jiàn) Stickl & Hochstein-Mintzel, Munch. Med. ffschr. , 1971,113,1149-1153 ；Sutter et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，1992，89，10847-10851 ；作為 ATCC VR-1508 可用的；或 NYVAC，見(jiàn)U. S.專利No. 5，494，807，例如，討論NYVAC構(gòu)建的U. S.專利No. 5，494，807的實(shí)施例1 6及et seq,以及有額外的ORF從Copenhagen株痘苗病毒基因組缺失的NYVAC的變化，以及異源編碼核酸分子插入此重組位點(diǎn)，而且，使用匹配的啟動(dòng)子；也見(jiàn)W096/40241)， 禽痘病毒或衰減的禽痘病毒(例如金絲雀痘病毒，雞痘病毒，鴿痘病毒，鴿痘病毒，鵪鶉痘病毒，ALVAC或TROVAC ；見(jiàn)，例如U. S.專利No. 5，505, 941，5，494，807)，豬痘病毒，浣熊痘， 駱駝痘病毒，或多發(fā)性黏液瘤病毒病毒。重組痘病毒可在本領(lǐng)域中已知的及類似于創(chuàng)建合成的痘病毒(例如描述于美國(guó)專利 No. 4，769，330 ;4，722，848 ;4，603，112 ;5，110，587 ;5，174，993 ;5，494，807 ； 5，942，235，及5，505，941(將它們的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文)的痘苗病毒及禽痘病毒)的重組體的方法的2步驟中構(gòu)建?；蛘撸苽浜?或施用用于本發(fā)明的基因的基因產(chǎn)物的體內(nèi)或體外表達(dá)的載體或重組體或質(zhì)粒的方法可為任何期望的方法，例如通過(guò)或類似于下列中公開(kāi)于，或公開(kāi)于下列中引用的文獻(xiàn)的方法的方法美國(guó)專利
Nc 6,L30, 066,5, 494，807,5, 514，375,5, 744，140,5, 744，141,5，756，103,5762938，5，766，5 9 9 j 5 j990，091,6，004，777,6，130，066,6，497，883,6，464，984,6，451，770，6，391314,6,387，376,6，376，473,6，368，603,6，348，196,6,306，400,6，228，846，6，221362,6,217，883,6，207，166,6,207，165,6,159，477,6，153，199,6,090，393，6，074649,6，045，803,6，033，670,6，485，729,6，103，526,6，224，882,6，312，682，6，312683,6，348，450,4，603，112 ；4,769，330 ；5，174，993 ；5，505，941 ；5，338，683 ；5，494807 ；4,394，448 ；4，722，848 ；4，745，051 ；4，769，331 ；5，591，639 ；5，589，466 ；
4，945，050 ；5，677，178 ；5，591，439 ；5，552，143 ；5，580，859 ；WO 94/16716 ；WO 96/39491 ； W091/11525 ；WO 98/33510 ；WO 90/01543 ；EP 0 370 573 ；EP 265785 ； (Paoletti 1996)； (Moss 1996) ；Richardson(Ed 1995) ； (Smith,Summers et al. 1983) ； (Pennock,Shoemaker et al. 1984) ； (Roizman 1996) ； (Andreansky, He et al. 1996) ； (Robertson, Ooka et al.1996) ； (Frolov,Hoffmanet al. 1996) ； (Kitson,Burke et al. 1991) ； (Ballay,Levrero et al. 1985) ；(Graham 1990) ；(Prevec, Schneider et al. 1989) ；(Feigner, Kumaret al.1994) ； (Ulmer, Donnelly et al. 1993) ； (McClements, Armstronget al. 1996) ； (Ju, Edelstein et al. 1998)；及(Robinson 及 Torres 1997)。 在本發(fā)明的載體中有利地存在用于多核苷酸的表達(dá)的元件。以最小方式，此包括， 基本上由，或由起始密碼子(ATG)，終止密碼子及啟動(dòng)子，及任選也多聚腺苷酸化序列(對(duì)于某些載體(例如質(zhì)粒及某些病毒載體(例如不同于痘病毒的病毒載體))構(gòu)成。當(dāng)多核苷酸編碼蛋白片段，例如有利地，在載體中，ATG放置在閱讀框的5'及終止密碼子放置在 3'。其他用于控制表達(dá)的元件可存在，例如增強(qiáng)子序列，穩(wěn)定序列及允許蛋白的分泌的信號(hào)序列。專利申請(qǐng)WO 90/11092，WO 93/19183，WO 94/21797 及 WO 95/20660 已利用最近開(kāi)發(fā)的多核苷酸疫苗的技術(shù)。已知這些疫苗使用能在宿主細(xì)胞中表達(dá)插入到質(zhì)粒的抗原的質(zhì)粒。推薦全部施用途徑(腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，經(jīng)皮，真皮內(nèi)，粘膜及如)。也可使用疫苗接種的各手段，例如DNA沉積在金粒子的表面及投射穿過(guò)動(dòng)物皮膚(Tang等人，1992) 及使可能轉(zhuǎn)染皮膚，肌肉，脂肪組織以及乳腺組織的液體推注器(Furth等人，199 .(也見(jiàn) U. S. Pat. Nos. 5，846，946，5，620，896，5，643，578，5，580，589，5，589，466，5，693，622， 及 5，703，055 ；Ulmer, J. B.，等人，1993 ；Robinson 等人，1997 ；Luke 等人 1997 ；Normanet al. 1997 ；Bourne等人，1996 ；及，注意，通常用于疫苗或免疫學(xué)組合物的質(zhì)?？砂―NA編碼抗原可操作連接于調(diào)控序列(其控制抗原從宿主細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的表達(dá)或表達(dá)及分泌；例如，從上游到下游，用于啟動(dòng)子的DNA，用于分泌的用于真核前導(dǎo)肽的DNA，用于抗原的DNA，及編碼終止子的DNA)。根據(jù)另一本發(fā)明的實(shí)施方式，痘病毒載體是金絲雀痘病毒或雞痘病毒載體，有利地衰減的金絲雀痘病毒或雞痘病毒。對(duì)此，參照以登錄號(hào)VR-Ill獲自ATCC的金絲雀痘病毒。衰減的金絲雀痘病毒描述于美國(guó)專利No. 5，756，103 (ALVAC)及W001/05934。多種雞痘病毒疫苗接種株也可用，例如由MERIAL銷售的DIFTOSEC CT株及由INTERVET銷售的NOBILIS VARI0LE疫苗；及，也參照美國(guó)專利No. 5，766，599，其涉及衰減的雞痘病毒株 TROVAC0當(dāng)表達(dá)載體是痘苗病毒，對(duì)于待表達(dá)的多核苷酸的插入位點(diǎn)可在胸苷激酶(TK) 基因或插入位點(diǎn)，血凝素(HA)基因或插入位點(diǎn)，編碼A型包含體(ATI)的區(qū)；也見(jiàn)本文中引用的文獻(xiàn)，尤其涉及痘苗病毒的那些。金絲雀痘病毒的情況中，插入位點(diǎn)可為ORF C3，C5和 /或C6 ；也見(jiàn)本文中引用的文獻(xiàn)，尤其涉及金絲雀痘病毒的那些。雞痘病毒的情況中，插入位點(diǎn)可為ORF F7和/或F8 ；也見(jiàn)本文中引用的文獻(xiàn)，尤其涉及雞痘病毒的那些。對(duì)于MVA 病毒區(qū)的插入位點(diǎn)可如在各出版物中，包括Carroll Μ. W. et al.，Vaccine，1997，15 (4)， 387-394 ；Stittelaar K. J. et al. , J. Virol.,2000,74(9),4236-4243；Sutter G. et al.， 1994，Vaccine, 12 (11)，1032-1040 ；及，此情況中，應(yīng)注意，完全MVA基因組描述于Antoine G.，Virology, 1998, 244, 365 396，其能使本領(lǐng)域技術(shù)人員使用其他插入位點(diǎn)或其他啟動(dòng)子。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，待表達(dá)的多核苷酸在特異性痘病毒啟動(dòng)子的控制下插入，尤其是例如牛痘病毒啟動(dòng)子7. 5kDa(Cochran等人，J. Virology，1985，54，30 35)，牛痘病毒啟動(dòng)子 I3L (Riviere 等人，J. Virology，1992，66，3424-3434)，牛痘病毒啟動(dòng)子 HA(Shida，Virology, 1986,150,451 457)，牛痘啟動(dòng)子 ATI (Funahashi 等人，J. Gen. Virol.，1988，69，；35 47)，牛痘病毒啟動(dòng)子 H6 (Taylor J.等人，疫苗，1988，6，504 508 ；Guo P. et al. J. Virol. , 1989,63,4189-4198 ；Perkus M.等人，J. Virol.，1989，63， 3829-3836)。在另一實(shí)施方式中，病毒載體是腺病毒，例如人腺病毒(HAV)或犬腺病毒(CAV)。
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可將基于重組病毒載體的疫苗組合與fMLP(N_甲基-甲硫氨酰基-亮氨?；?苯丙氨酸；美國(guó)6，017, 537)和/或卡波姆佐劑(Pharmeuropa Vol)。在另一實(shí)施方式中，病毒載體可為，但不限于，人，豬，綿羊，牛，或禽類的腺病毒。對(duì)于人腺病毒，尤其是由于缺失病毒基因組的El區(qū)，尤其是從約核苷酸459 約核苷酸3510(通過(guò)引用以登錄號(hào)M73260的序列公開(kāi)于GenBank的hAd5及在參照的出版物 J. Chroboczek et al Virol。1992，186,280 沘5中)而無(wú)法復(fù)制的第5血清型腺病毒。 缺失的腺病毒在表達(dá) El 的 293 (F. Graham et al J. Gen. Virol. 1977，36，59 72)或 PER 細(xì)胞，尤其是PER. C6中繁殖(F. Fallouxet al人基因治療1998，9，1909-1917)。人腺病毒可在E3區(qū)缺失，尤其是從約核苷酸觀592 約核苷酸30470。El區(qū)的缺失可與E3區(qū)中的缺失進(jìn)行組合(見(jiàn)，例如 J. Shriver et al. Nature, 2002,415, 331-335, F. Graham et al Methods in Molecular Biology Vol. 7 :Gene Transferand Expression Protocols Edited by E. Murray, The Human Press Inc,1991, ρ 109-128 ；Y. Ilan et al Proc. Natl. Acad. Sci.1997,94,2587-2592 ；US6, 133, 028 ；US6, 692, 956 ；S.Tripathy et al Proc.Natl. Acad.Sci.1994，91，11557-11561 ；B.Tapnell Adv.Drug Deliv.Rev. 1993，12，185-199 ； X. Danthinne et al Gene Therapy 2000,7,1707-1714 ；K.Berkner Bio Techniques 1988, 6,616-629 ；K.Berkneret al Nucl. Acid Res. 1983,11,6003-6020 ；C.Chavier et al J. Virol. 1996，70，4805-4810)。插入位點(diǎn)可為最終El和/或E3區(qū)的部分或完全缺失后的 El和/或E3座位(區(qū))。當(dāng)表達(dá)載體是腺病毒時(shí)，可將待表達(dá)的多核苷酸在真核細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子控制下插入，例如強(qiáng)啟動(dòng)子，例如巨細(xì)胞病毒立即早期基因啟動(dòng)子(CMV-IE 啟動(dòng)子)，尤其是M. Boshart et al Cell 1985，41，521-530中的從約核苷酸_7；34 約核苷酸+7的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)或來(lái)自來(lái)自！Iomega Corp的pCI載體的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)。 CMV-IE啟動(dòng)子有利地是鼠或人來(lái)源的。也可使用延伸因子Ia的啟動(dòng)子。也可使用肌肉特異性啟動(dòng)子(X.Li et al Nat. Biotechnol. 1999，17，241 M5)。本文中與質(zhì)粒載體相關(guān)也討論強(qiáng)啟動(dòng)子。在一實(shí)施方式中，剪接序列可位于增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)的下游。例如，內(nèi)含子 1 分離自 CMV-IE 基因(R. Stenberg et al J. Virol. 1984，49，190)，內(nèi)含子分離自兔或人珠蛋白基因，尤其是來(lái)自珠蛋白基因的內(nèi)含子2，內(nèi)含子分離自免疫球蛋白基因，來(lái)自SV40早期基因的剪接序列或分離自來(lái)自!Iomega Corp.的pCI載體的嵌合內(nèi)含子序列，其包括融合到小鼠免疫球蛋白受體序列的人β-珠蛋白基因供體序列(在Genbank 中以登錄號(hào)CVU47120的從約核苷酸890 約核苷酸1022)?？蓪⒕?A)序列及終止子序列插入待表達(dá)的多核苷酸下游，例如牛生長(zhǎng)激素釋放激素基因，尤其是在Genbank中以登錄號(hào)B0VGHRH(AF242855)的從約核苷酸2339 約核苷酸2550，兔β -珠蛋白基因或SV40晚期基因多聚腺苷酸化信號(hào)。在另一實(shí)施方式中，病毒載體是犬腺病毒，尤其是CAV_2(見(jiàn)，例如L.Fischer et al. Vaccine,2002，20，3485—3497 ；U. S. Patent No. 5，529，780 ；U. S. Patent No. 5，688，920 ； PCT申請(qǐng)No. W095/14102)。對(duì)于CAV而言，插入位點(diǎn)可在E3區(qū)中和/或在位于E4區(qū)和右 ITR區(qū)之間的區(qū)內(nèi)(見(jiàn)U. S.專利No. 6，090，393 ；U. S.專利No. 6，156，567)。在一實(shí)施方式中，插入子在啟動(dòng)子的控制下，例如巨細(xì)胞病毒立即早期基因啟動(dòng)子(CMV-IE啟動(dòng)子)或已對(duì)于人腺病毒載體描述的啟動(dòng)子?？蓪⒕?A)序列及終止子序列插入待表達(dá)的多核苷酸下游，例如牛生長(zhǎng)激素基因或兔珠蛋白基因多聚腺苷酸化信號(hào)。
在另一特定實(shí)施方式中，病毒載體是皰疹病毒，例如馬皰疹病毒(EHV1-5)，豬皰疹病毒(PRV)，犬皰疹病毒(CHV)或貓皰疹病毒(FHV)。插入位點(diǎn)可在胸苷激酶基因內(nèi)，0RF3 內(nèi)或UL43 ORF內(nèi)(對(duì)于CHV，見(jiàn)U. S.專利No. 6，159，477)。在一實(shí)施方式中，待表達(dá)的多核苷酸在真核細(xì)胞內(nèi)有功能的啟動(dòng)子控制下插入，有利地CMV-IE啟動(dòng)子(鼠或人)。聚(A) 序列及終止子序列可插入待表達(dá)的多核苷酸下游，例如牛生長(zhǎng)激素或兔珠蛋白基因多聚腺苷酸化信號(hào)。更一般而言，本發(fā)明含蓋包括含及在宿主中體內(nèi)表達(dá)非洲馬疫病毒多肽，其變體或片段的多核苷酸或基因，及必要于其體內(nèi)表達(dá)的元件的任何質(zhì)粒的體內(nèi)表達(dá)載體 (ΕΡ-Α2-1001025 ；Chaudhuri P.)。根據(jù)進(jìn)一步本發(fā)明的實(shí)施方式，表達(dá)載體是質(zhì)粒載體或DNA質(zhì)粒載體，尤其是體內(nèi)表達(dá)載體。特別地，非限制性實(shí)施例，可將PVR1020或1012質(zhì)粒(VICAL Inc. ；Luke C. et al. , Journal ofInfectious Diseases,1997,175,91-97 ；Hartikka J. et al. , Human GeneTherapy，1996，7，1205-1217，see, e. g.，U. S. Patent Nos. 5，846，946 and6, 451，769) 用作插入多核苷酸序列的載體。PVR1020質(zhì)粒源于pVR1012及含人tPA信號(hào)序列。在一實(shí)施方式中，人tPA信號(hào)包括在Genbank中以登錄號(hào)HUMTPA14的從氨基酸M(I)到氨基酸S(23)。在另一特殊的，非限制性實(shí)施例中，用作用于多核苷酸序列插入的載體的質(zhì)?？珊贕enbank中以登錄號(hào)U28070的從氨基酸W24)到氨基酸M48)的馬IGFl的信號(hào)肽序列。發(fā)現(xiàn)了可在實(shí)踐中商討或采用的對(duì)于DNA質(zhì)粒的附加信息，例如，在美國(guó)專利 No. 6，852，705 ；6，818，628 ；6，586，412 ；6，576，243 ；6，558，674 ；6，464，984 ；6，451，770 ； 6，376，473 及 6，221，362 中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！笨砂òū景l(fā)明的多核苷酸及必要于其在期望的宿主或靶細(xì)胞內(nèi)體內(nèi)表達(dá)的元件的任何DNA轉(zhuǎn)錄單元；及，關(guān)于此，注意到，超螺旋的或非超螺旋的，環(huán)形質(zhì)粒，以及線性形式，旨在在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。質(zhì)粒也可包括其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件例如，內(nèi)含子類型的穩(wěn)定序列。在幾個(gè)實(shí)施方式中，質(zhì)?？砂–MV-IE (W0 89/01036)的第一內(nèi)含子，兔β-珠蛋白基因(van Ooyen等人)的內(nèi)含子II，由組織纖溶酶原活化物編碼的蛋白的信號(hào)序列(tPA ；Montgomery等人)，和/或多聚腺苷酸化信號(hào)(多聚A)，尤其是牛生長(zhǎng)激素(bGH)基因(美國(guó)5，122，458)的多聚A或兔β -珠蛋白基因的或SV40病毒的多聚Α。各質(zhì)粒包括或含或基本上由下列構(gòu)成，除了編碼AHSV抗原，表位或免疫原的多核苷酸之外，任選與異源肽序列，變體，類似物或片段融合，可操作連接到啟動(dòng)子或在啟動(dòng)子的控制下或依賴于啟動(dòng)子。一般而言，采用在真核細(xì)胞中有功能的強(qiáng)啟動(dòng)子有利。優(yōu)選的強(qiáng)啟動(dòng)子是人或鼠來(lái)源的立即早期巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV-IE)，或任選具有另一來(lái)源，例如大鼠或豚鼠。CMV-IE啟動(dòng)子可包括實(shí)際啟動(dòng)子部分，其可或可不相關(guān)于增強(qiáng)子部分?？蓞⒖?ΕΡ-Α-260 148，ΕΡ-Α-323 597，U. S.專利 Nos. 5，168，062，5，385，839，及 4，968，615，以及參考 PCT 申請(qǐng)No W087/03905。CMV-IE 啟動(dòng)子有利地是人CMV-IE(Boshart M. et al. ,Cell.， 1985,41,521-530)或鼠CMV-IE?？稍诒景l(fā)明的實(shí)踐中有用地采用的強(qiáng)細(xì)胞啟動(dòng)子是細(xì)胞骨架基因啟動(dòng)子，例如結(jié)蛋白啟動(dòng)子(Kwissa M.等人)，或肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Miyazaki J.等人)。這些啟動(dòng)子的有功能的亞片段，即維持足夠的啟動(dòng)子活性的這些啟動(dòng)子的部分， 包括在本發(fā)明中，例如根據(jù)WO 98/00166或US6，156，567的截短的CMV-IE啟動(dòng)子及可用于本發(fā)明的實(shí)踐。結(jié)果，本發(fā)明的實(shí)踐中有用的啟動(dòng)子可包括維持足夠的啟動(dòng)子活性及因此發(fā)揮啟動(dòng)子的作用的全長(zhǎng)啟動(dòng)子的衍生物和/或亞片段，及其可有利地具有基本上類似于衍生出衍生物或亞片段的實(shí)際或全長(zhǎng)啟動(dòng)子的啟動(dòng)子活性，例如相比全長(zhǎng)CMV-IE啟動(dòng)子的活性，類似于美國(guó)6，156，567的截短的CMV-IE啟動(dòng)子的活性。由此，本發(fā)明的實(shí)踐中的 CMV-IE啟動(dòng)子可包括全長(zhǎng)啟動(dòng)子的啟動(dòng)子部分和/或全長(zhǎng)啟動(dòng)子的增強(qiáng)子部分，以及其衍生物和/或亞片段，或由或基本上由它們構(gòu)成。在更通用的術(shù)語(yǔ)中，啟動(dòng)子具有病毒或細(xì)胞來(lái)源?？稍诒景l(fā)明的實(shí)踐中有用地采用的不同于CMV-IE的強(qiáng)病毒啟動(dòng)子是SV40病毒的早期/晚期啟動(dòng)子或勞斯肉瘤病毒的LTR啟動(dòng)子?？稍诒景l(fā)明的實(shí)踐中有用地采用的強(qiáng)細(xì)胞啟動(dòng)子是細(xì)胞骨架基因的啟動(dòng)子，例如結(jié)蛋白啟動(dòng)子(Kwissa M.等人，疫苗，2000，18,2337-2344)，或肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子 (Miyazaki J.等人，基因，1989，79，269 277)。這些啟動(dòng)子的有功能的亞片段，即維持足夠的啟動(dòng)活性的這些啟動(dòng)子的部分，包括在本發(fā)明中，例如根據(jù)PCT申請(qǐng)No. W098/00166或美國(guó)專利No. 6，156，567的截短的 CMV-IE啟動(dòng)子可用于本發(fā)明的實(shí)踐。本發(fā)明的實(shí)踐中的啟動(dòng)子因此包括維持足夠的啟動(dòng)活性及因此發(fā)揮啟動(dòng)子的作用的全長(zhǎng)啟動(dòng)子的衍生物及亞片段(優(yōu)選基本上類似于衍生出衍生物或亞片段的實(shí)際的或全長(zhǎng)啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性，例如對(duì)于全長(zhǎng)CMV-IE啟動(dòng)子的活性類似于美國(guó)專利No. 6，156，567的截短的CMV-IE啟動(dòng)子的活性。由此，本發(fā)明的實(shí)踐中的 CMV-IE啟動(dòng)子可包括全長(zhǎng)啟動(dòng)子的啟動(dòng)子部分和/或全長(zhǎng)啟動(dòng)子的增強(qiáng)子部分，以及衍生物及亞片段，或由或基本上由其構(gòu)成。優(yōu)選地，質(zhì)粒包括其他表達(dá)控制元件或基本上由其構(gòu)成。其尤其有利于合并穩(wěn)定序列，例如內(nèi)含子序列，優(yōu)選hCMV-IE(PCT申請(qǐng)No.W089/01036)的第一內(nèi)含子，兔β -珠蛋白基因(van Ooyen 等人，Science，1979，206，337 344)的內(nèi)含子 II。至于不同于痘病毒的質(zhì)粒及病毒載體的多聚腺苷酸化信號(hào)(多聚A)，可再使用牛生長(zhǎng)激素(bGH)基因的聚(A)信號(hào)(見(jiàn)U. S.專利No. 5，122，458)，或兔β -珠蛋白基因的聚㈧信號(hào)或SV40病毒的聚㈧信號(hào)。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，表達(dá)載體是用于蛋白在適當(dāng)?shù)募?xì)胞系統(tǒng)中的體外表達(dá)的表達(dá)載體。表達(dá)的蛋白可在分泌后或非分泌后在或從培養(yǎng)上清收獲(如果無(wú)分泌，細(xì)胞裂解一般發(fā)生或進(jìn)行)，任選通過(guò)濃縮方法(例如超濾)濃縮和/或通過(guò)純化手段純化， 例如親和性，離子交換或凝膠過(guò)濾型層析方法。重組表達(dá)的多肽的分離及純化可通過(guò)常規(guī)手段進(jìn)行，包括制備層析(例如，大小排阻，離子交換，親和性)，選擇性沉淀及超濾。可使用的現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)的實(shí)施例(但不限于)可見(jiàn)于“蛋白純化應(yīng)用”，第二版，由Simon Roe編輯及可在Oxford大學(xué)出版社得到。所述重組表達(dá)的多肽是部分本公開(kāi)內(nèi)容。也含蓋如上所述的本發(fā)明的任何多肽的產(chǎn)生方法，尤其是使用包括本公開(kāi)的多核苷酸及宿主細(xì)胞的重組表達(dá)載體。含本發(fā)明的重組病毒載體的疫苗可有利地用穩(wěn)定劑凍干。凍干可根據(jù)熟知的標(biāo)準(zhǔn)凍干過(guò)程進(jìn)行。藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的穩(wěn)定劑可為碳水化合物(例如山梨糖醇，甘露糖醇， 乳糖，蔗糖，葡萄糖，葡聚糖，海藻糖)，谷氨酸鈉(Tsvetkov T等人；Israeli E等人)，蛋白例如胨，白蛋白，乳請(qǐng)蛋白或酪蛋白，含試劑(例如脫脂乳(Mills CK等人;Wolff E等人) 及緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液，堿性金屬磷酸鹽緩沖液))的蛋白。佐劑可用于制備可溶性
19凍干的制劑。本發(fā)明的任何組合物或疫苗也可有利地含一種或多種佐劑?；谫|(zhì)粒的疫苗可用陽(yáng)離子脂質(zhì)，有利地用DMRIE(N-(2_羥基乙基)-N，N-二甲基-2，3-雙(十四氧基)-1-丙基銨；W096/34109)，或結(jié)合中性脂質(zhì)，例如DOPE ( 二油酰磷脂酰-乙醇胺；Behr J.P.)配制以形成DMRIE-D0PE。在一實(shí)施方式中，混合物即時(shí)制備，及在其施用之前，等待約10分鐘 約60分鐘，例如，約30分鐘，對(duì)于混合物的適當(dāng)?shù)慕j(luò)合有利。當(dāng)使用DOPE時(shí)，DMRIE/D0PE的摩爾比可從95/5 5/95及有利地是1/1。重量比質(zhì)粒 /DMRIE 或 DMRIE-D0PE 佐劑是，例如，50/1 1/10，10/1 1/5 或 1/1 1/2。任選可將細(xì)胞因子加入組合物，尤其GM-CSF或誘導(dǎo)Thl的細(xì)胞因子(例如IL12)。 可將這些細(xì)胞因子加入組合物作為編碼細(xì)胞因子蛋白的質(zhì)粒。在一實(shí)施方式中，細(xì)胞因子來(lái)自犬來(lái)源，例如犬GM-CSF，其基因序列已保藏在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)S49738)。此序列可用于以類似于WO 00/77210中的制備方式創(chuàng)建所述質(zhì)粒?！八拗骷?xì)胞”表示已通過(guò)外源多核苷酸(例如重組質(zhì)?；蜉d體)的施用遺傳改變的，或能遺傳改變的原核生物或真核細(xì)胞。當(dāng)說(shuō)道遺傳改變的細(xì)胞時(shí)，術(shù)語(yǔ)指原本改變的細(xì)胞及其后代。有利宿主細(xì)胞包括，但不限于，幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞，結(jié)腸癌(Caco-2)細(xì)胞， C0S7 細(xì)胞，MCF-7 細(xì)胞，MCF-10A 細(xì)胞，Madin-Darby 犬腎(MDCK)系，水貂肺(MvlLu)細(xì)胞， MRC-5細(xì)胞，U937細(xì)胞及VERO細(xì)胞?？蓪ㄆ谕男蛄械亩嗪塑账岵迦脒m宜克隆或表達(dá)載體，及載體反過(guò)來(lái)可導(dǎo)入適宜宿主細(xì)胞用于復(fù)制及擴(kuò)增?？蓪⒍嗪塑账嵬ㄟ^(guò)本領(lǐng)域中已知的任何手段導(dǎo)入宿主細(xì)胞?？蓪⒑康亩嗪塑账岬妮d體通過(guò)許多適當(dāng)?shù)氖侄沃魏螌?dǎo)入宿主細(xì)胞，包括直接攝取，胞吞，轉(zhuǎn)染，f"雜交，電穿孔，采用氯化鈣轉(zhuǎn)染，氯化銣，磷酸鈣，DEAE-葡聚糖，或其他物質(zhì)；微投射轟擊；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；及感染(其中載體是感染性的， 例如，反轉(zhuǎn)錄病毒載體)。導(dǎo)入載體或多核苷酸的選擇將常取決于宿主細(xì)胞的特征。多核苷酸疫苗可使用裸DNA及在例如脂質(zhì)體或陽(yáng)離子脂質(zhì)內(nèi)或用CpG’ s配制的 DNA。由于遺傳密碼簡(jiǎn)并不同于天然的非洲馬疫病毒核酸的核酸也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，許多氨基酸由多于一種三聯(lián)體指定。指定相同的氨基酸的密碼子，或同義密碼子 (例如，CAU及CAC是組氨酸的同義密碼子)可導(dǎo)致"沉默"不影響蛋白的氨基酸序列的突變。導(dǎo)致由本發(fā)明的重組載體編碼的受試者非洲馬疫病毒蛋白的氨基酸序列變化的DNA序列變化也被本發(fā)明含蓋。任何及全部所述核苷酸變化及得到的氨基酸變化在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。也可能修飾由本發(fā)明的重組載體編碼的受試者非洲馬疫病毒多肽的結(jié)構(gòu)，所述目的為增強(qiáng)治療性或預(yù)防功效(例如增加多肽的免疫原性)。當(dāng)設(shè)計(jì)為保留天然存在形式的蛋白的至少一種活性時(shí)，所述修飾的多肽認(rèn)為是本文中更詳細(xì)描述的非洲馬疫病毒多肽的有功能的相當(dāng)體。所述修飾的多肽可，例如，通過(guò)氨基酸置換，缺失，或添加產(chǎn)生。例如，可合理地預(yù)期，例如，亮氨酸用異亮氨酸或纈氨酸的的分離的取代，天冬氨酸用谷氨酸，蘇氨酸用絲氨酸，或用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸的氨基酸的類似取代(即保守突變)將不對(duì)得到的分子的生物學(xué)活性具有主要效應(yīng)。保守取代是發(fā)生在側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸的家族之內(nèi)的取代。遺傳編碼的氨基酸可分為4個(gè)家族(1)酸性=天冬氨酸，谷氨酸； (2)堿性的=賴氨酸，精氨酸，組氨酸；C3)非極性=丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯
20氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；及(4)不帶電的極性=甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸，及酪氨酸有時(shí)共同分類為芳族氨基酸。 以類似方式，氨基酸庫(kù)可分組為(1)酸性=天冬氨酸，谷氨酸；( 堿性的=賴氨酸，精氨酸組氨酸，( 脂肪族=甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，絲氨酸及蘇氨酸任選被獨(dú)立地分組為脂肪族羥基；(4)芳族=苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸；(5)酰胺 =天冬酰胺，谷氨酰胺；及(6)含硫=半胱氨酸及甲硫氨酸(見(jiàn)，例如，Biochemistry, 2nd ed.，Ed. by L. Stryer,ff. H. Freeman and Co.，1981)。多肽的氨基酸序列是否變化導(dǎo)致有功能的同源物可通過(guò)評(píng)定變體多肽以類似于野生型蛋白的方式在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)答的能力輕易測(cè)定。至于目的表位，參考Kendrew，THE ENCYCLOPEDIA 0FM0LECULAR BIOLOGY (Blackwell Science Ltd.，1995)及 Sambrook，et al. 1982。目的表位是免疫原或其免疫學(xué)活躍的片段的免疫學(xué)相關(guān)區(qū)，例如來(lái)自獸醫(yī)學(xué)或人利益的病原體或毒素的，例如非洲馬疫病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可測(cè)定肽或多肽的表位或免疫顯性的區(qū)，及因此，無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)而確定來(lái)自肽或多肽的氨基酸及相應(yīng)DNA序列的知識(shí)，以及來(lái)自特定氨基酸的性質(zhì) (例如尺寸，帶電性，等)及密碼子表的編碼DNA。DNA序列優(yōu)選編碼產(chǎn)生抗體應(yīng)答或T細(xì)胞應(yīng)答的肽的至少區(qū)。測(cè)定T及B細(xì)胞表位的一種方法涉及表位定位。目的蛋白在短重疊肽(PEPSCAN)中合成。然后測(cè)試個(gè)體肽的結(jié)合由天然的蛋白引起的抗體或誘導(dǎo)T細(xì)胞或B細(xì)胞活化的能力。Janis Kuby, (1992)。另一確定目的表位的方法旨在選擇親水的蛋白的區(qū)。親水殘基常在蛋白的表面及因此常是可接近抗體的蛋白的區(qū)。Janis Kuby, (1992)。選擇可產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答的目的表位的另一方法旨在從蛋白序列鑒定已知可能結(jié)合MHC分子的肽序列的潛在HLA錨點(diǎn)結(jié)合基序。是推定的目的表位的肽，產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答，應(yīng)在MHC復(fù)合物中呈遞。肽優(yōu)選含用于結(jié)合MHC分子的適當(dāng)?shù)腻^點(diǎn)基序，及應(yīng)以足夠高的親和性結(jié)合以產(chǎn)生免疫應(yīng)答。一些確定是否蛋白是將刺激T細(xì)胞應(yīng)答的目的表位的準(zhǔn)則，包括肽長(zhǎng)度一肽應(yīng)至少8或9個(gè)氨基酸長(zhǎng)，以適合I類MHC復(fù)合物，及至少13 25個(gè)氨基酸長(zhǎng)以適合II類 MHC復(fù)合物。此長(zhǎng)度是肽結(jié)合MHC復(fù)合物的最小長(zhǎng)度。肽長(zhǎng)于這些長(zhǎng)度是優(yōu)選的，因?yàn)榧?xì)胞可切割表達(dá)的肽。肽應(yīng)含將致使其以高度足夠的特異性結(jié)合各I類或II類分子以產(chǎn)生免疫應(yīng)答的適當(dāng)?shù)腻^基序(見(jiàn)BoCChia，M. et al, ；Englehard, VH, (1994))。此可通過(guò)比較目的蛋白的序列與和MHC分子相關(guān)的肽的公開(kāi)結(jié)構(gòu)而無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)地進(jìn)行。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)比較蛋白序列與列于蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的序列來(lái)確定目的表位。甚至而且，另一方法是簡(jiǎn)單產(chǎn)生或表達(dá)目的蛋白的部分，產(chǎn)生針對(duì)目的蛋白的那些部分的單克隆抗體，及然后確定是否那些抗體抑制衍生蛋白的病原體的體外生長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用其他此公開(kāi)及本領(lǐng)域中所示的產(chǎn)生或表達(dá)目的蛋白的部分的用于分析是否抗體抑制體外生長(zhǎng)的準(zhǔn)則。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括編碼一種或多種非洲馬疫病毒蛋白，例如已經(jīng)從其天然的形式修飾以克服免疫顯性的非中和表位的VP2及或VP5的一種或多種核酸的重組載體。免疫顯性的非中和表位，例如，通過(guò)引導(dǎo)免疫應(yīng)答離開(kāi)中和表位而發(fā)揮對(duì)抗中和表位的誘餌的作用。免疫顯性的非中和表位可見(jiàn)于病原體(例如非洲馬疫病毒)的免疫原性蛋白。本發(fā)明含蓋包括編碼一種或多種已經(jīng)從它們的天然的形式修飾(例如通過(guò)天然的序列中氨基酸殘基的缺失和/或插入和/或置換)的非洲馬疫病毒蛋白的核酸的重組載體及修飾的重組病毒。至于“免疫原性組合物”，“免疫學(xué)組合物”及“疫苗”，含載體(或其表達(dá)產(chǎn)物)的免疫學(xué)組合物引起局部或全身性的免疫學(xué)應(yīng)答。應(yīng)答可，但非必保護(hù)性的。含本發(fā)明的重組體或載體(或其表達(dá)產(chǎn)物)的免疫原性組合物同樣引起局部或全身性免疫學(xué)應(yīng)答，其可，但非必是保護(hù)性的。疫苗組合物引起局部或全身性保護(hù)應(yīng)答。因此，術(shù)語(yǔ)"免疫學(xué)組合物" 及"免疫原性組合物"包括"疫苗組合物"(如2之前的術(shù)語(yǔ)可為保護(hù)性組合物)。本發(fā)明涵蓋免疫學(xué)，免疫原性或疫苗組合物。根據(jù)本發(fā)明，重組載體，例如病毒例如痘病毒，表達(dá)外源非洲馬疫病毒基因或核酸分子的基因產(chǎn)物。將非洲馬疫病毒的特異性病毒蛋白或編碼來(lái)自特異性非洲馬疫病毒蛋白的表位的特異性核酸分子插入重組載體例如病毒例如痘病毒載體，及得到的載體，例如重組病毒例如痘病毒，用于感染動(dòng)物或體外表達(dá)用于施用給動(dòng)物的產(chǎn)物。非洲馬疫病毒基因產(chǎn)物的動(dòng)物中的表達(dá)導(dǎo)致動(dòng)物對(duì)非洲馬疫病毒的免疫應(yīng)答。由此，重組載體，例如病毒例如本發(fā)明的重組痘病毒可用于免疫學(xué)組合物或疫苗，以提供誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的手段。重組載體，例如重組病毒例如重組痘病毒-AHSV或其表達(dá)產(chǎn)物，以及本發(fā)明的組合物例如免疫學(xué)或疫苗組合物或治療性組合物(例如含重組載體或重組病毒例如痘病毒或其表達(dá)產(chǎn)物的組合物)的施用方法，可為經(jīng)腸胃外途徑(真皮內(nèi)，肌內(nèi)或皮下)。所述施用能使全身性免疫應(yīng)答，或體液或細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答?？蓪⑤d體或重組病毒-AHSV，例如痘病毒-AHSV，或其表達(dá)產(chǎn)物，或含所述表達(dá)產(chǎn)物和/或載體或病毒的組合物，施用于任何年齡或性別的馬；例如，以引起針對(duì)非洲馬疫病毒的免疫學(xué)應(yīng)答，例如以由此預(yù)防非洲馬疫病毒和/或其他與非洲馬疫病毒相關(guān)的病理學(xué)后遺癥。有利地，將載體或重組病毒-AHSV，例如痘病毒-AHSV，或其表達(dá)產(chǎn)物，或含所述表達(dá)產(chǎn)物和/或載體或病毒的組合物，施用于馬，包括新生馬和/或懷孕的馬，以通過(guò)母體抗體在孕育和/或被動(dòng)免疫期間對(duì)新生馬賦予活躍的免疫。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用包括來(lái)自非洲馬疫病毒的免疫原或來(lái)自所述免疫原(例如來(lái)自AHSV VP2和/或VP5和/ 或由這些VP或VP的組合的任何一種或多種表達(dá)的目的表位的免疫原)的目的表位的組合物，和/或用表達(dá)所述免疫原或目的表位的載體接種雌性馬(例如母馬)?？稍诮慌渲? 和/或服務(wù)之前；和/或孕育(或懷孕)期間，和/或圍產(chǎn)期之前；和/或一生重復(fù)多次接種。有利地，服務(wù)之前進(jìn)行至少一次接種。也有利地是在孕育期間然后進(jìn)行接種，例如在約孕育中期(在約5 6個(gè)月的孕育)和/或孕育末(或在孕育的約10 11個(gè)月)。由此， 有利方案是服務(wù)之前接種及孕育期間加強(qiáng)接種。然后，在各服務(wù)之前和/或孕育期間，在約孕育中期(在孕育的約5 6個(gè)月)和/或孕育末(或在孕育的約10 11個(gè)月)可有再接種。優(yōu)選地，再接種可僅在孕育期間。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，駒，例如來(lái)自免疫接種的雌性的駒的駒(例如如本文中討論接種的)，在生命的第一個(gè)月內(nèi)接種，例如在生命的3 和/或4，和/或4和/或5，及5和/或6及6個(gè)月接種。甚至更有利，所述駒然后在2 8周后追加(第一接種后)。由此，可給兩個(gè)后代，以及雌性馬(例如母馬)施用本發(fā)明的組合物和/或可為本發(fā)明的方法的表現(xiàn)的受試者。接種可在如本文所述的劑量?jī)?nèi)。關(guān)于痘病毒或病毒組合物的施用及母體免疫，參照美國(guó)專利No. 5，338，683。關(guān)于劑量，施用途徑，制劑，佐劑，及重組病毒及其表達(dá)產(chǎn)物的用途，本發(fā)明的組合物可用于腸胃外或粘膜施用，優(yōu)選通過(guò)真皮內(nèi)，皮下或肌內(nèi)途徑。當(dāng)使用粘膜施用，可使用經(jīng)口，經(jīng)眼或經(jīng)鼻途徑。本發(fā)明在其他方面涉及本發(fā)明的重組體或載體的表達(dá)產(chǎn)物，例如病毒，例如，重組痘病毒，及由此的用途，例如以形成免疫學(xué)或疫苗組合物用于治療，預(yù)防，診斷或測(cè)試；及，來(lái)自重組的或發(fā)明的病毒，例如痘病毒的DNA，其在構(gòu)建DNA探針及PCR引物中有用。本發(fā)明的重組載體或病毒-AHSV (例如痘病毒-AHSV重組體)免疫學(xué)或疫苗組合物或治療性組合物，可根據(jù)藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。所述組合物可以劑量及通過(guò)獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)考慮所述因素，如年齡，性別，重量，及施用途徑來(lái)施用。組合物可單獨(dú)施用，或可與組合物共施用或依次施用，例如與"其他"免疫學(xué)組合物，或衰減的，滅活的，重組疫苗或治療性組合物，由此提供多價(jià)劑或"混合劑"或本發(fā)明的組合組合物及采用它們的方法。組合物可含下列的組合非洲馬疫病毒成分(例如重組載體(例如表達(dá)非洲馬疫病毒免疫原或目的表位和/或非洲馬疫病毒免疫原或目的表位的質(zhì)?；虿《净蚨徊《?和一種或多種不相關(guān)的馬病原體疫苗(例如目的表位，免疫原和/或重組載體或病毒例如重組病毒，例如表達(dá)所述表位或免疫原的重組痘病毒)例如來(lái)自一種或多種馬細(xì)菌和/或病毒病原體的一種或多種免疫原或目的表位，例如來(lái)自下列之一種或多種的目的表位或免疫原馬皰疹病毒(EHV)，馬流感病毒(EIV)，馬的西尼羅病毒 (WNV)，東方馬腦炎(EEE)，西方馬腦炎(WEE)，及委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE)，破傷風(fēng)，狂犬病，及 Potomac馬熱+EPM。再次，成分及方式(連續(xù)施用的或共施用)，以及劑量可考慮所述因素如年齡，性別，重量，及，施用途徑來(lái)測(cè)定。對(duì)此，參照美國(guó)專利No. 5，843，456，通過(guò)引用合并到本文中，及針對(duì)狂犬病組合物及組合組合物及其使用。本發(fā)明的組合物的實(shí)施例包括用于粘膜施用的液體制劑，例如經(jīng)口，鼻，眼，等，施用，例如懸浮液及，用于腸胃外，皮下，真皮內(nèi)，肌內(nèi)(例如可注射的施用)的制劑，例如無(wú)菌懸浮液或乳液。在所述組合物中，重組痘病毒或免疫原可與適宜載質(zhì)，稀釋劑，或賦形劑 (例如無(wú)菌水，生理鹽水等)混合。也可將組合物冷凍干燥或冷凍。組合物可含助劑物質(zhì)例如潤(rùn)濕劑或乳化劑，PH緩沖劑，佐劑，防腐劑等，依賴于期望的施用途徑及制劑。組合物可含至少一種佐劑化合物，其選自氫氧化鋁，可代謝油，包括萜烯烴及聚氧基乙烯-聚氧基丙烯嵌段共聚物，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，蘋(píng)果酸酐和烯基衍生物的共聚物及包括QUIL A，膽留醇，抗原，和/或磷脂的糖苷的免疫刺激復(fù)合物基質(zhì)(ISCOM)。優(yōu)選的佐劑化合物是尤其與糖或多元醇的多烯基醚交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。這些化合物被知為卡波姆(Pharmeuropa Vol. 8，No. 2，1996年6月)。本領(lǐng)于技術(shù)人員也可參考美國(guó)專利No. 2，909，462 (通過(guò)引用并入本文中)，其描述所述丙烯酸聚合物與具有至少3個(gè)羥基，優(yōu)選不多于8個(gè)(至少3個(gè)羥基的氫原子被具有至少2個(gè)碳原子的不飽和的脂肪族基取代)的聚羥基化的化合物交聯(lián)。優(yōu)選的基團(tuán)是含2 4個(gè)碳原子的基團(tuán)，例如乙烯基，烯丙基及其他乙烯型不飽和基團(tuán)。不飽和的基可本身含其他取代基， 例如甲基。以名稱卡波泊爾 銷售的產(chǎn)品(BF Goodrich, Ohio，美國(guó))是尤其適當(dāng)?shù)?。它們與烯丙基蔗糖或與烯丙基季戊四醇交聯(lián)。它們之中，卡波泊爾 974P，934P及971P可被提及。蘋(píng)果酸酐及烯基衍生物的共聚物之中，優(yōu)選例如與二乙烯醚交聯(lián)的線性或交聯(lián)的共聚物EMA (Monsanto)(其為蘋(píng)果酸酐和乙烯的共聚物)?？蓞⒖糐. Fields et al., 1960，通過(guò)引用并入本文中。從它們的結(jié)構(gòu)的觀點(diǎn)來(lái)看，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及共聚物EMA 優(yōu)選由以下式的堿性單元形成
權(quán)利要求
1.藥物組合物，其包括(a)表達(dá)載體，其中所述載體包括編碼選自AHSVVP, AHSV VP的變體或片段及其混合物的一或多種多肽的一或多種多核苷酸；以及(b)藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的媒質(zhì)，稀釋劑或賦形劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述表達(dá)載體是體內(nèi)或體外表達(dá)載體。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多核苷酸編碼AHSVVP2或VP5。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述載體包括編碼AHSVVP2及AHSV VP5的2種多核苷酸。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多核苷酸編碼與具有如SEQIDNO =1,2,20,21,30, 31，35，36，44，45，49，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62 或 63 所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的多肽。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多核苷酸與編碼具有如SEQIDNO =1,2,20,21,30, 31，35，36，44，45，49，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62 或 63 所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少70%序列同一性。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多核苷酸與具有如SEQID NO 3,4, 5,6,17,18,19, 22，27，28，29，32，33，34，41，42，43，48或50所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述載體選自vCP2377(SEQID NO 17), vCP2383 (SEQ ID NO 27)，vCP2398 (SEQ ID NO :41)，及它們的混合物。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的媒質(zhì)，稀釋劑或賦形劑是卡波泊爾。
10.表達(dá)載體，其包括編碼選自AHSVVP, AHSV VP的變體或片段及其混合物的一或多種多肽的一或多種多核苷酸。
11.權(quán)利要求10的載體，其中所述多核苷酸選自(a)編碼與具有如SEQ ID NO :1，2，20，21，30，31，35，36，44，45，49，51，52，53，54，55， 56，57，58，59，60，61，62或63所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的多肽的多核苷酸；(b)與編碼具有如SEQ ID NO :1，2，20，21，30，31，35，36，44，45，49，51，52，53，54，55， 56，57，58，59，60，61，62或63所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；以及(c)與具有如SEQ ID NO :3，4，5，6，17，18，19，22，27，28，29，32，33，34，41，42，43，48 或 50所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；其中所述載體是體內(nèi)表達(dá)載體或體外表達(dá)載體。
12.權(quán)利要求11的載體，其中所述載體是病毒載體，并且其中所述病毒載體是禽痘病毒，金絲雀痘病毒或雞痘病毒載體。
13.權(quán)利要求12的載體，其中所述載體包括2種多核苷酸，并且其中所述2種多核苷酸編碼與選自SEQ ID NO 4,42及18的多肽具有至少80%序列同一性的AHSV VP2，及與選自SEQ ID NO :5，43，及19的多肽具有至少80%序列同一性的AHSV VP5。
14.權(quán)利要求13的載體，其中所述多核苷酸可操作連接到選自H6牛痘病毒啟動(dòng)子，I3L 牛痘病毒啟動(dòng)子，4 (痘病毒啟動(dòng)子，7. 牛痘病毒啟動(dòng)子，及π牛痘病毒啟動(dòng)子的啟動(dòng)子。
15.權(quán)利要求14的載體，其中所述編碼AHSVVP2的多核苷酸可操作連接到Η6牛痘病毒啟動(dòng)子，并且編碼AHSV VP5的多核苷酸可操作連接到4 痘病毒啟動(dòng)子。
16.宿主細(xì)胞，其經(jīng)權(quán)利要求10的載體轉(zhuǎn)化。
17.在動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫學(xué)應(yīng)答的方法，包括給宿主施用有效量的權(quán)利要求1的組合物。
18.疫苗接種易患非洲馬疫的動(dòng)物的方法，包括施用至少一個(gè)劑量的權(quán)利要求1的組合物。
19.權(quán)利要求18的方法，還包括施用至少第二劑量的權(quán)利要求1的組合物。
20.分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(a)與具有如SEQID NO :48或50所示的序列的多核苷酸具有至少80%序列同一性的核苷酸序列；(b)編碼與具有如SEQID NO :49或51所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的多肽的核苷酸序列；或者(c)與編碼具有如SEQID NO :49或51所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少70%序列同一性的核苷酸序列。
21.基本上純化的AHSVVP，其中所述AHSV VP包括(a)與具有如SEQID NO :49或51所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；(b)如SEQID NO 49或51所示的氨基酸序列的保守變體；(c)包括如SEQID NO 49或51所示的氨基酸序列的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段，其和與如SEQ ID NO :49或51所示的氨基酸序列特異性結(jié)合的抗體特異性結(jié)合；或者(d)如SEQID NO 49或51所示的氨基酸序列，并且其中給受試者施用多肽產(chǎn)生針對(duì)AHSV的免疫應(yīng)答。
22.分離的非洲馬疫病毒AHSV4-Jane株。
全文摘要
本發(fā)明提供含及體內(nèi)表達(dá)編碼非洲馬疫病毒的VP2及VP5或其在對(duì)抗非洲馬疫病毒的馬中引起免疫應(yīng)答的表位的基因的載體，包括所述載體的組合物，對(duì)抗非洲馬疫病毒的疫苗接種的方法，及用于所述方法及組合物的試劑盒。
文檔編號(hào)C07K14/14GK102245627SQ200980149209
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2009年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者A·J·古瑟里, J·M·明克, J·姚, J-C·奧堂奈特, N·J·馬科拉克蘭 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì), 梅里亞有限公司, 比勒陀利亞大學(xué)