專利名稱：：抗狂犬病病毒單克隆抗體及其制備方法、應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明抗狂犬病病毒單克隆抗體及其制備方法、應(yīng)用涉及的是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種能識(shí)別狂犬病病毒的單克隆抗體的制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：狂犬病是由狂犬病病毒(Rabiesvirus)引起的世界性人獸共患傳染病。人和動(dòng)物一旦發(fā)病死亡率高達(dá)100%。全球每年約有55，000人死于狂犬病，主要集中在亞非拉發(fā)展中國家。人類患者多因病畜咬傷而感染，出現(xiàn)以恐水、畏光、吞咽困難、狂躁等為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染疾病。該病流行廣、宿主多，幾乎所有溫血?jiǎng)游锒寄鼙桓腥荆愿鞣N哺乳動(dòng)物為主要宿主，是一種危害非常嚴(yán)重的人畜共患急性傳染病，是迄今為止人類病死率最高的急性傳染病，也是人類尚未能有效控制的疫病之一?？袢《緦儆趶棤畈《究?Rhabdoviridae)狂犬病病毒屬。病毒顆粒由外殼和核心兩部分組成。外殼為一緊密完整的脂蛋白雙層包膜，表面嵌有數(shù)量眾多的由病毒糖蛋白構(gòu)成的槌狀包膜突起，它覆蓋了除平端外的整個(gè)病毒表面，是病毒主要的表面抗原，也是病毒惟一的糖基化蛋白。病毒包膜內(nèi)側(cè)主要是膜蛋白，亦稱基質(zhì)蛋白。膜蛋白內(nèi)側(cè)為病毒核心，即一個(gè)直徑為40nm,的核衣殼，由核酸和緊密8包在它外面的核蛋白所構(gòu)成，呈緊密的連續(xù)性螺旋形式，有3035個(gè)巻曲，另外2種核衣殼核心的蛋白為大轉(zhuǎn)錄酶蛋白或稱RNA多聚酶和磷酸化蛋白。目前，對(duì)于狂犬病病毒檢測的方法主要有病毒形態(tài)學(xué)觀察、組織病理學(xué)檢測、小鼠顱內(nèi)接種分離狂犬病病毒法等，但操作較為繁瑣，或需要使用電鏡等設(shè)備。近年來從動(dòng)物和人類唾液中檢測狂犬病毒抗原的方法也有較大發(fā)展，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和間接免疫熒光技術(shù)(IFA)，具有快速、特異敏感、不受標(biāo)本量限制、節(jié)約試劑和試驗(yàn)成本費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn)。Kohler和Milstein于1975年創(chuàng)立的B淋巴細(xì)胞雜交瘤單克隆抗體(monoclonalantibodies,McAb)技術(shù)，作為一類用于基礎(chǔ)研究，實(shí)驗(yàn)室診斷，臨床治療和預(yù)防的新型產(chǎn)物，其應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)前景已獲得普遍的肯定。而目前在我國流行的狂犬病病毒株主要有CNX、CGX、CVS、PG、CTN株等。明平剛(2006)等從系統(tǒng)進(jìn)化樹上分析表明，CTN株與我國街毒株的抗原關(guān)系比其它毒株近。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)上述檢測方法操作較為繁瑣，或需要使用電鏡等設(shè)備不足之處，提供一種抗狂犬病病毒單克隆抗體及其制備方法、應(yīng)用，是一種能識(shí)別狂犬病病毒的鼠源性單克隆抗體，該抗體對(duì)狂犬病病毒的選擇性強(qiáng)。本發(fā)明公開的能識(shí)別狂犬病病毒的鼠源單克隆抗體是一種以與我國街毒株的抗原關(guān)系比其它毒株近的CTN株滅活病毒為抗原，同時(shí)用該病毒包被ELISA板，對(duì)得到的抗體進(jìn)行篩選而獲得的抗狂犬病病毒的單克隆抗體。本發(fā)明抗狂犬病病毒的單克隆抗體，是由保藏號(hào)為CGMCCNo.3014的抗狂犬病病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2C5所分泌的?？箍袢〔《締慰寺】贵w的雜交瘤細(xì)胞株2C5己于2009年04月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCCNo.3014。該鼠源雜交瘤細(xì)胞株2C5也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。抗狂犬病病毒的單克隆抗體的制備方法1、免疫原準(zhǔn)備與免疫免疫原的制備采用滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒(純度99%以上，武漢病毒所張愛華惠贈(zèng))。動(dòng)物免疫將上述滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒經(jīng)測定蛋白濃度為0.67mg/mL，按1:1加入弗氏完全佐劑混合，振蕩乳化半小時(shí)，皮下按lOOug(O.3mL/只)免疫BALB/c小鼠；2周后，改用弗氏不完全佐劑乳化抗原，以同樣方法進(jìn)行再次免疫；二免后2周，腹腔注射200yg純化抗原加強(qiáng)免疫，三天后融合。2、雜交瘤細(xì)胞的融合按常規(guī)方法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的融合。在融合前摘眼球法取陽性血備用。取脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長期的SP2/0細(xì)胞用PEG-2000融合。同時(shí)，分別從BALB/c免疫小鼠、提供飼養(yǎng)細(xì)胞的ICR小鼠采血，作為篩選單抗時(shí)對(duì)照用的陽性、陰性血清。融合后的細(xì)胞用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝96孔板，置37r，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，5-7d換加新鮮HAT，經(jīng)常觀察，適時(shí)換液和檢測。3、雜交瘤細(xì)胞的檢測酶標(biāo)板的包被在酶標(biāo)板上，做方陣試驗(yàn)，即以滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒為抗原，橫向用PBS倍比稀釋包被ELISA板，以陽性血清為一抗，縱向以100倍、200倍、400倍、800倍稀釋，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果選擇包被濃度。酶標(biāo)板的包被簡述如下取純化的抗原蛋白，以碳酸鹽緩沖液，即0.2mol/LNa2C038mL，0.2mol/LNaHC0317mL，加去離子水至100mL，pH9.6，稀釋至包被濃度，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照；以100uL/孔加入ELISA板中，37°C，3小時(shí);PBST，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+0.5%Tween-20，洗滌3次，5分鐘/次;加PBS/FCS，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+10%FCS或1%BSA，200uL/孔，37。C封閉3小時(shí)或4。C過夜；PBST洗3次，5分鐘/次，晾干，一20。C或4。C存放備用。雜交瘤細(xì)胞的檢測用上述包被的ELISA板，常規(guī)間接ELISA法檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，以待檢雜交瘤細(xì)胞上清和滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒反應(yīng)的值，以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照，P/N>2.l為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)常規(guī)ELISA檢測，根據(jù)所設(shè)的判定標(biāo)準(zhǔn)，得到七個(gè)陽性反應(yīng)的細(xì)胞株，分別經(jīng)過三次亞克隆后發(fā)現(xiàn)其中三株陽性反應(yīng)丟失，棄去；其余四株雜交瘤細(xì)胞株仍保持了分泌抗狂犬病病毒抗體的能力，其中一株命名為2C5。4、細(xì)胞株的建立與腹水制備、純化細(xì)胞株的建立按上述判定標(biāo)準(zhǔn)，將篩選得到的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，取分泌抗體穩(wěn)定的和四次亞克隆后細(xì)胞形態(tài)良好，生長旺盛的強(qiáng)陽性單克隆細(xì)胞，命名建株并擴(kuò)大培養(yǎng)，一部分液氮凍存，一部分用于單抗腹水制備。腹水制備每只BALB/c小鼠注射0.5mL降植垸與弗氏不完全佐劑的等體積混合物，7天后腹腔分別注射2C5、2G4、3C7和5E11株的雜交瘤細(xì)胞，接種量為5倍105個(gè)細(xì)胞，約經(jīng)過一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取上清，等量加入PH7.2巴比妥緩沖鹽水，即VBS:0.004mol/L巴比妥，0.15mol/LNaCl，0.8聽1/LMg2+，0.3麵1/LC^+稀釋;然后以每10ml腹水中加150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鐘，不時(shí)搖動(dòng)；2000g離心20分鐘，脂質(zhì)等通過該法除去，即可得澄清得腹水。腹水0.22um微孔濾膜過濾，備用?？贵w純化用結(jié)合緩沖液，即20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0，平衡HiTrapProteinGHP層析柱。用結(jié)合緩沖液稀釋樣品后通過層析株。待蛋白峰下降后，用0.1M甘氨酸緩沖液，pH2.7，洗脫層析柱，收集洗脫液。用lMTris，pH9.0調(diào)節(jié)pH至7，PBS透析，純化的抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用ELISA檢測抗體效價(jià)。結(jié)果表明，獲得純化抗體10mg。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，在還12原劑的作用下，抗體分解為兩個(gè)片段，分別為約50KD的重鏈和約25KD的輕鏈，結(jié)果附圖l。5、單克隆抗體的鑒定單克隆抗體亞類鑒定使用捕獲ELISA試劑盒檢測單克隆抗體的亞類..1)將表位特征性抗體IgA，IgGl，IgG2b，IgG2a，IgG3，IgM分別用PBS進(jìn)行l(wèi):1000稀釋，100ul/孔包被，每種特征性抗體包被兩孔，37"C孵育1小時(shí)。2)用洗滌液PBST洗滌3次，5分鐘/次。3)每孔加入100ul待檢測的單抗上清，37。C孵育1小時(shí)。4)用洗滌液洗滌3次，5分鐘/次。5)用PBST將辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體進(jìn)行1:1000稀釋，每孔lOOul,37"C孵育30分鐘。6)用洗滌液洗滌三次，5分鐘/次。7)每孔加入新鮮配置的底物溶液100u1，37。C避光孵育20分鐘。8)每孔加入50ul2MH2S04終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上讀取OD柳的值，以O(shè)D值明顯高于其他各個(gè)孔的表位特征性抗體判為其單抗亞類。間接ELISA滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒以5ug/mL的濃度100u1/孔包被ELISA板，37。C濕盒作用2.5小時(shí)，PBST洗3次，5分鐘/次；拍干后用含5%小牛血清的PBS封閉，37。C濕盒作用2.5小時(shí)，PBST洗3次，5分鐘/次，拍干后加入100倍、200倍、400倍、800倍稀釋、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍、25600、51200稀釋的本研究制備的單抗腹水，37"C濕盒作用90分鐘，PBST洗3次，5分鐘/次，拍干后加入1:1000稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，37'C濕盒作用90分鐘，以TMB顯色，設(shè)正常ICR小鼠的血清為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，本研究制備的單抗腹水與滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒的反應(yīng)為陽性，與正常ICR小鼠的陰性血清的反應(yīng)為陰性，表l和附圖2。斑點(diǎn)ELISA(Dot-ELISA)將滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒，稀釋至濃度為5yg/mL，分別滴加于硝酸纖維素膜上，2化/點(diǎn)，37。C溫箱烘干，用含1%BSA的PBS溶液37。C封閉2小時(shí)，PBS洗三次，5分鐘/次，然后將其浸入1:1000稀釋的2C5、2G4、3C7和5E11株雜交瘤細(xì)胞的單抗腹水，37。C作用60分鐘，漂洗后浸入1:1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，37'C作用60分鐘，PBS洗三次，5分鐘/次，以DAB顯色，蒸餾水終止反應(yīng)。以SP2/0培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照。四株單克隆抗體的腹水、陽性血清均能與滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒為抗原的點(diǎn)顯色為陽性；而以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清與之顯色為陰性，結(jié)果見附圖3。免疫印跡(Western-blot)檢測單克隆抗體的特異性分別以滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒、GST融合表達(dá)的狂犬病糖蛋白的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的GST-RVG蛋白和pGEX-6p-1的誘導(dǎo)裂解物為電泳樣品進(jìn)行SDS-PAGE，按常規(guī)方法將蛋白轉(zhuǎn)印于NC膜上。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，取出硝酸纖維素膜，作好標(biāo)記，放入平皿中，用PBST(含5%脫脂奶粉)室溫封閉過夜，將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移到封閉液稀釋的雜交瘤上清中，室溫作用2小時(shí)之后，用PBS洗膜3次，每次10分鐘。再分別將膜轉(zhuǎn)移入用封閉液1:100倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體中，室溫作用2小時(shí)后，再用PBS洗3遍，每次10分鐘，DAB進(jìn)行顯色。免疫印跡結(jié)果表明此四株單克隆抗體均能與狂犬病CTN株病毒反應(yīng)，其中2C5株還能與融合表達(dá)的狂犬病糖蛋白GST-RVG(另文報(bào)道)反應(yīng)，而與GST載體菌蛋白不反應(yīng)，表明此單克隆抗體針對(duì)的是狂犬病糖蛋白的，見圖4。單克隆抗體腹水的ELISA效價(jià)測定滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒以5yg/mL的濃度包被ELISA板，100uL/孔，腹水以PBS倍比稀釋，做間接ELISA反應(yīng)，以P/N》2.1為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。目前，檢測狂犬病毒中和抗體的方法主要有小鼠中和試驗(yàn)(MNT)、快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)等。MNT法實(shí)驗(yàn)費(fèi)用高，操作繁瑣且周期長，同時(shí)由于影響動(dòng)物試驗(yàn)的因素較多，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差較大，重復(fù)性較低。RFFIT法周期短，準(zhǔn)確率較高，但操作較為復(fù)雜，成本相對(duì)較高，且對(duì)基礎(chǔ)設(shè)施有較高的要求，不利于推廣。ELISA法操作簡單、快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)并且適用于批量處理，是蛋白多肽藥代動(dòng)力學(xué)研究的常用方法。本發(fā)明利用單克隆抗體技術(shù)，制備了抗狂犬病病毒的抗體，并制備了單抗腹水，對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定，并建立了Dot-ELISA、間接ELISA等狂犬病病毒檢測方法，從檢測方法的結(jié)果看，Dot-ELISA和間接ELISA法操作簡單，結(jié)果易于判斷且比較準(zhǔn)確。目前在我國流行的狂犬病病毒株主要有CNX、CGX、CVS、PG、CTN株等。明平剛(2006)等從系統(tǒng)進(jìn)化樹上分析表明，CTN株與我國街毒株的抗原關(guān)系比其它毒株近。本發(fā)明在制備抗狂犬病病毒單克隆抗體時(shí)，選擇了與我國街毒株的抗原關(guān)系比其它毒株近的CTN株滅活病毒為抗原，同時(shí)用該病毒包被ELISA板，對(duì)得到的抗體進(jìn)行篩選而獲得的抗狂犬病病毒的單克隆抗體。以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。圖1為單克隆抗體的純化的SDS-PAGE。圖2為用間接ELISA方法檢測制備的四株單抗腹水與病毒的結(jié)合。圖3為用Dot-ELISA方法檢測制備的四株單抗腹水與病毒的結(jié)合。圖4為2C5株單抗與病毒的免疫印跡。具體實(shí)施例方式抗狂犬病病毒單克隆抗體其制備方法、應(yīng)用實(shí)施例1免疫原準(zhǔn)備與免疫免疫原的制備采用滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒(純度99y。以上，武漢病毒所張愛華惠贈(zèng))。動(dòng)物免疫將上述滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒，測定蛋白濃度為0.67mg/mL，按1:1加入弗氏完全佐劑混合，振蕩乳化半小時(shí)，皮下按100ug免疫BALB/c小鼠；2周后，改用弗氏不完全佐劑乳化抗原，以同樣方法進(jìn)行再次免疫；二免后2周，腹腔注射200ug純化抗原加強(qiáng)免疫，三天后融合。實(shí)施例2雜交瘤細(xì)胞的融合按常規(guī)方法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的融合。在融合前摘眼球法取陽性血備用。取脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長期的SP2/0細(xì)胞用PEG-2000融合。同時(shí)，分別從BALB/c免疫小鼠、提供飼養(yǎng)細(xì)胞的ICR小鼠采血，作為篩選單抗時(shí)對(duì)照用的陽性、陰性血清。融合后的細(xì)胞用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝96孔板，置37。C，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，5-7d換加新鮮HAT，經(jīng)常觀察，適時(shí)換液和檢測。實(shí)施例3雜交瘤細(xì)胞的檢測酶標(biāo)板的包被在酶標(biāo)板上，做方陣試驗(yàn)，即以滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒為抗原，橫向用PBS倍比稀釋包被ELISA板，以陽性血清為一抗，縱向以100倍、200倍、400倍、800倍稀釋，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果選擇最佳包被濃度(5ug/mL)。酶標(biāo)板的包被簡述如下取純化的抗原蛋白，以碳酸鹽緩沖液，即0.2mol/LNa2C038mL，0.2mol/LNa跳17mL，加去離子水至100mL，pH9.6，稀釋至包被濃度，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照；以100uL/孔加入ELISA板中，37°C，3小時(shí)；PBST，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+0.5%Tween—20，洗滌3次，5分鐘/次；加PBS/FCS，即O.01mol/L，pH7.3，PBS+10%FCS或淺BSA，200uL/孔，37"C封閉3小時(shí)或4'C過夜;PBST洗3次，5分鐘/次，晾干，一20。C或4。C存放備用。雜交瘤細(xì)胞的檢測用上述包被的ELISA板，常規(guī)間接ELISA法檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，以待檢雜交瘤細(xì)胞上清和滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒反應(yīng)的值，以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照，P/N》2.l為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)常規(guī)ELISA檢測，根據(jù)所設(shè)的判定標(biāo)準(zhǔn)，得到七個(gè)陽性反應(yīng)的細(xì)胞株，分別經(jīng)過三次亞克隆后發(fā)現(xiàn)其中三株陽性反應(yīng)丟失，棄去；其余四株雜交瘤細(xì)胞株仍保持了分泌抗狂犬病病毒抗體的能力，其中一株命名為2C5。實(shí)施例4細(xì)胞株的建立與腹水制備、純化細(xì)胞株的建立按上述判定標(biāo)準(zhǔn)，將篩選得到的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，取分泌抗體穩(wěn)定的和四次亞克隆后細(xì)胞形態(tài)良好，生長旺盛的強(qiáng)陽性單克隆細(xì)胞，命名建株并擴(kuò)大培養(yǎng)，一部分液氮凍存，一部分用于單抗腹水制備。腹水制備每只BALB/c小鼠注射0.5mL降植烷與弗氏不完全佐劑的等體積混合物，7天后腹腔分別注射2C5、2G4、3C7和5E11株的雜交瘤細(xì)胞，接種量為5X105個(gè)細(xì)胞，約經(jīng)過一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取上清，等量加入^7.2巴比妥緩沖鹽水，即..VBS;0.004mol/L巴比妥,0.15mol/LNaCl，0.8mmol/LMg2+，0.3mmol/LCa1希釋;然后以每10ml腹水中力口150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鐘，不時(shí)搖動(dòng)；2000g離心20分鐘，脂質(zhì)等通過該法除去，即可得澄清得腹水。腹水0.22ym微孔濾膜過濾，備用?？贵w純化用結(jié)合緩沖液，即20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0，平衡HiTmpProteinGHP層析住。用結(jié)合緩沖液稀釋樣品后通過層析株。待蛋白峰下降后，用0.1M甘氨酸緩沖液pH2.7，洗(脫層析柱，收集洗脫液。用lMTris，pH9.0,調(diào)節(jié)pH至7，PBS透析，純化的抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用ELISA檢測抗體效價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，獲得純化抗體10mg。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，在還原劑的作用下，抗體分解為兩個(gè)片段，分別為約50KD的重鏈和約25KD的輕鏈，結(jié)果附圖l。實(shí)施例5單克隆抗體的鑒定單克隆抗體亞類鑒定使用捕獲ELISA試劑盒檢測單克隆抗體的亞類(1)將表位特征性抗體IgA，IgGl，IgG2b，IgG2a，IgG3，IgM分別用PBS進(jìn)行l(wèi):1000稀釋，100ul/孔包被，每種特征性抗體包被兩孔，37。C孵育1小時(shí)。(2)用洗滌液PBST洗滌3次，5分鐘/次。(3)每孔加入100ul待檢測的單抗上清，37。C孵育l小時(shí)。(4)用洗滌液洗漆3次，5分鐘/次。(5)用PBST將辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(Fab片段)進(jìn)行l(wèi):1000稀釋，每孔100ul，37。C孵育30分鐘。(6)用洗滌液洗滌三次，5分鐘/次。(7)每孔加入新鮮配置的底物溶液100ul，37。C避光孵育20分鐘。(8)每孔加入50ul2MH2S04終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上讀取0D490的值，以O(shè)D值明顯高于其他各個(gè)孔的表位特征性抗體判為其單抗亞類。鑒定結(jié)果表明，本發(fā)明制備的抗狂犬病病毒單克隆抗體2C5株產(chǎn)生的抗體亞類為IgG2a。間接ELISA滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒以5pg/mL的濃度100u1/孔包被ELISA板，37'C濕盒作用2.5小時(shí)，PBST洗3次，5分鐘/次；拍干后用含5%小牛血清的PBS封閉，37。C濕盒作用2.5小時(shí)，PBST洗3次，5分鐘/次，拍干后加入100、200倍、400倍、800倍稀釋、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍、25600、51200稀釋的本研究制備的單抗腹水，37"C濕盒作用90分鐘，PBST洗3次，5分鐘/次，拍干后加入1:1000稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，37'C濕盒作用90分鐘，以TMB顯色，設(shè)正常ICR小鼠的血清為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，本研究制備的單抗腹水與滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒的反應(yīng)為陽性，與正常ICR小鼠的陰性血清的反應(yīng)為陰性，表1和附圖2。表l間接ELISA結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>斑點(diǎn)ELISA(Dot-ELISA)將滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒，稀釋至濃度為5Pg/mL，分別滴加于硝酸纖維素膜上，2化/點(diǎn)，37。C溫箱烘干，用含1%BSA的PBS溶液37。C封閉2小時(shí)，PBS洗三次，5分鐘/次，然后將其浸入1:1000稀釋的2C5、2G4、3C7和5E11株雜交瘤細(xì)胞的單抗腹水，37。C作用60分鐘，漂洗后浸入1:1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，37"C作用60分鐘，PBS洗三次，5分鐘/次，以DAB顯色，蒸餾水終止反應(yīng)。以SP2/0培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照。四株單克隆抗體的腹水、陽性血清均能與滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒為抗原的點(diǎn)顯色為陽性；而以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清與之顯色為陰性，結(jié)果見附圖3。免疫印跡(Western-blot)檢測單克隆抗體的特異性分別以滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒、GST融合表達(dá)的狂犬病糖蛋白的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的GST-RVG蛋白和pGEX-6p-l的誘導(dǎo)裂解物為電泳樣品進(jìn)行SDS-PAGE，按常規(guī)方法將蛋白轉(zhuǎn)印于NC膜上。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，取出硝酸纖維素膜，作好標(biāo)記，放入平皿中，用PBST(含5%脫脂奶粉)室溫封閉過夜，將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移到封閉液稀釋的雜交瘤上清中，室溫作用2小時(shí)之后，用PBS洗膜3次，每次10分鐘。再分別將膜轉(zhuǎn)移入用封閉液1:100倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體中，室溫作用2小時(shí)后，再用PBS洗3遍，每次10分鐘，DAB進(jìn)行顯色。免疫印跡結(jié)果表明此四株單克隆抗體均能與狂犬病CTN株病毒反應(yīng)，其中2C5株還能與融合表達(dá)的狂犬病糖蛋白GST-RVG(另文報(bào)道)反應(yīng)，而與GST載體菌蛋白不反應(yīng)，表明此單克隆抗體針對(duì)的是狂犬病糖蛋白的，見圖4。四株單克隆抗體腹水的ELISA效價(jià)測定滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒以5lig/mL的濃度包被ELISA板，100uL/孔，腹水以PBS倍比稀釋，做間接ELISA反應(yīng)，以P/N>2.1為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究制備的2C5單抗腹水效價(jià)分別為1:25600。權(quán)利要求1、一種抗狂犬病病毒的單克隆抗體，是由保藏號(hào)為CGMCCNo.3014的抗狂犬病病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2C5所分泌。2、權(quán)利要求1所述的抗狂犬病病毒的單克隆抗體的制備方法，其特征在于(1)免疫原準(zhǔn)備與免疫免疫原的制備采用滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒動(dòng)物免疫將上述滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒，測定蛋白濃度為0.67mg/mL，按1:1加入弗氏完全佐劑混合，振蕩乳化半小時(shí)，皮下按100"g/只的劑量免疫BALB/c小鼠；2周后，改用弗氏不完全佐劑乳化抗原，以同樣方法進(jìn)行再次免疫；二免后2周，腹腔注射200ug純化抗原加強(qiáng)免疫，三天后融合；(2)雜交瘤細(xì)胞的融合在融合前摘眼球法取陽性血備用；取脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長期的SP2/0細(xì)胞用PEG-2000融合，同時(shí)，分別從BALB/c免疫小鼠、提供詞養(yǎng)細(xì)胞的ICR小鼠采血，作為篩選單抗時(shí)對(duì)照用的陽性、陰性血清，融合后的細(xì)胞用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝96孔板，置37°C，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，5-7d換加新鮮HAT，經(jīng)常觀察，適時(shí)換液和檢測；(3)雜交瘤細(xì)胞的檢測酶標(biāo)板的包被在酶標(biāo)板上，做方陣試驗(yàn)，即以滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒為抗原，橫向用PBS倍比稀釋包被ELISA板，以陽性血清為一抗縱向以100倍、200倍、400倍、800倍稀釋，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果選擇包被濃度，酶標(biāo)板的包被簡述如下取純化的抗原蛋白，以碳酸鹽緩沖液，即0.2mol/LNa2C038mL，0.2mol/LNaHC0317mL，加去離子水至100mL，pH9.6，稀釋至包被濃度，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照；以100uL/孔加入ELISA板中，37°C，3小時(shí);PBST，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+0.5%Tween-20洗滌3次，5分鐘/次；加PBS/FCS，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+10%FCS或1%BSA，200yL/孔，37。C封閉3小時(shí)或4。C過夜；PBST洗3次，5分鐘/次，晾干，一2(TC或4。C存放備用；雜交瘤細(xì)胞的檢測用上述包被的ELISA板，常規(guī)間接ELISA法檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，檢測雜交瘤細(xì)胞上清和滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒反應(yīng)的值，以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照，P/N>2.l為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)；經(jīng)常規(guī)ELISA檢測，根據(jù)所設(shè)的判定標(biāo)準(zhǔn)，得到七個(gè)陽性反應(yīng)的細(xì)胞株，分別經(jīng)過三次亞克隆后發(fā)現(xiàn)其中三株陽性反應(yīng)丟失，棄去；其余四株雜交瘤細(xì)胞株仍保持了分泌抗狂犬病病毒抗體的能力，其中一株命名為2C5;(4)細(xì)胞株的建立與腹水制備、純化細(xì)胞株的建立按上述判定標(biāo)準(zhǔn)，將篩選得到的陽性雜交瘤細(xì)胞2C5進(jìn)行亞克隆，取分泌抗體穩(wěn)定的和四次亞克隆后細(xì)胞形態(tài)良好，生長旺盛的強(qiáng)陽性單克隆細(xì)胞，命名建株并擴(kuò)大培養(yǎng)，一部分液氮凍存，一部分用于單抗腹水制備；腹水制備每只BALB/c小鼠注射0.5mL降植烷與弗氏不完全佐劑的等體積混合物，7天后腹腔分別注射2C5株的雜交瘤細(xì)胞，接種量為5倍105個(gè)細(xì)胞，約經(jīng)過一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取上清，等量加入ra7.2巴比妥緩沖鹽水，即VBS;0.004mol/L巴比妥，0.15mol/LNaCl，0.8mmol/LMg2+，0.3mmol/LCa1希釋；然后以每10ml腹水中加150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鐘，不時(shí)搖動(dòng)；2000g離心20分鐘，脂質(zhì)等通過該法除去，即可得澄清得腹水。腹水0.22um微孔濾膜過濾，備用；抗體純化用結(jié)合緩沖液，即20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0，平衡HiTrapProteinGHP層析柱，用結(jié)合緩沖液稀釋樣品后通過層析柱待蛋白峰下降后，用O.1M甘氨酸緩沖液，pH2.7，洗脫層析柱，收集洗脫液。用1MTris，pH9.0，調(diào)節(jié)pH至7，PBS透析，純化的抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用EL工SA檢測抗體效價(jià)；(5)單克隆抗體的鑒定單克隆抗體亞類鑒定使用捕獲ELISA試劑盒檢測單克隆抗體的亞類1)將表位特征性抗體IgA，IgGl，IgG2b，IgG2a，IgG3，IgM分別用PBS進(jìn)行l(wèi):1000稀釋，100ul/孔包被，每種特征性抗體包被兩孔，37'C孵育1小時(shí)。2)用洗滌液PBST洗滌3次，5分鐘/次。3)每孔加入100ul待檢測的單抗上清，37。C孵育1小時(shí)。4)用洗滌液洗滌3次，5分鐘/次。5)用PBST將辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊工gG抗體進(jìn)行1:1000稀釋，每孔100ul，37。C孵育30分鐘。6)用洗滌液洗滌三次，5分鐘/次。7)每孔加入新鮮配置的底物溶液100u1，37t:避光孵育20分鐘。8)每孔加入50ul2MH2S04終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上讀取OD，的值，以0D值明顯高于其他各個(gè)孔的表位特征性抗體判為其單抗亞類。間接ELISA滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒以5wg/mL的濃度100u1/孔包被ELISA板，37'C濕盒作用2.5小時(shí)，PBST洗3次，5分鐘/次；拍干后用含5%小牛血清的PBS封閉，37"C濕盒作用2.5小時(shí)，PBST洗3次，5分鐘/次，拍干后加入100倍、200倍、400倍、800倍稀釋、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍、25600倍、51200倍稀釋的本研究制備的單抗腹水，37"C濕盒作用90分鐘，PBST洗3次，5分鐘/次，拍干后加入1:1000稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，37。C濕盒作用90分鐘，以TMB顯色，設(shè)正常ICR小鼠的血清為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，本發(fā)明制備的單抗腹水與滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒的反應(yīng)為陽性，與正常ICR小鼠的陰性血清的反應(yīng)為陰性；斑點(diǎn)ELISA將滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒，稀釋至濃度為5ug/mL，分別滴加于硝酸纖維素膜上，2!4V點(diǎn)，37。C溫箱烘干，用含1%BSA的PBS溶液37。C封閉2小時(shí)，PBS洗三次，5分鐘/次，然后將其浸入1:1000稀釋的2C5、2G4、3C7和5E11株雜交瘤細(xì)胞的單抗腹水，37。C作用60分鐘，漂洗后浸入1:1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，37。C作用60分鐘，PBS洗三次，5分鐘/次，以DAB顯色，蒸餾水終止反應(yīng)。以SP2/0培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照；本單克隆抗體的腹水、陽性血清均能與滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒為抗原的點(diǎn)顯色為陽性；而以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清與之顯色為陰性；免疫印跡檢測單克隆抗體的特異性分別以滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒、GST融合表達(dá)的狂犬病糖蛋白的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的GST-RVG蛋白和pGEX-6p-l的誘導(dǎo)裂解物為電泳樣品迸行SDS-PAGE，按常規(guī)方法將蛋白轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)印結(jié)束后，取出硝酸纖維素膜，作好標(biāo)記，放入平皿中，用PBST，含5%脫脂奶粉，室溫封閉過夜，將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移到封閉液稀釋的雜交瘤上清中，室溫作用2小時(shí)之后，用PBS洗膜3次，每次10分鐘。再分別將膜轉(zhuǎn)移入用封閉液1:100倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體中，室溫作用2小時(shí)后，再用PBS洗3遍，每次10分鐘，DAB進(jìn)行顯色；免疫印跡結(jié)果表明此株單克隆抗體均能與狂犬病CTN株病毒反應(yīng)，其中2C5株還能與融合表達(dá)的狂犬病糖蛋白GST-RVG反應(yīng)，而與GST載體菌蛋白不反應(yīng)，表明此單克隆抗體針對(duì)的是狂犬病糖蛋白的。單克隆抗體腹水的ELISA效價(jià)測定滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒以5iig/mL的濃度包被ELISA板，100uL/孔，腹水以PBS倍比稀釋，做間接ELISA反應(yīng)，以P/N》2.1為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。3、權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在檢測狂犬病病毒抗原中的應(yīng)用。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述檢測狂犬病病毒抗原方法包括間接酶聯(lián)免疫吸附檢測法、Dot-ELISA、免疫組織化學(xué)檢測法或試紙條檢測法。5、權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備狂犬病病毒檢測試劑盒中的應(yīng)用。6、含有權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的檢測狂犬病病毒的試劑盒。7、分泌權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，是保藏號(hào)為CGMCCNo.3014的抗狂犬病病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2C5。全文摘要本發(fā)明抗狂犬病病毒單克隆抗體及其制備方法、應(yīng)用涉及的是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種能識(shí)別狂犬病病毒的單克隆抗體的制備及其應(yīng)用。本發(fā)明單克隆抗體經(jīng)間接酶聯(lián)免疫法篩選，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析、斑點(diǎn)ELISA、免疫印跡分析等方法鑒定了其與抗原結(jié)合的特異性和親和力等特性。本發(fā)明的抗狂犬病毒單克隆抗體可應(yīng)用于狂犬病病毒的抗原的多種檢測方法中，也可應(yīng)用于制備狂犬病病毒檢測試劑盒。一種抗狂犬病病毒的單克隆抗體，是由保藏號(hào)為CGMCCNo.3014的抗狂犬病病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2C5所分泌。文檔編號(hào)C07K16/10GK101560255SQ200910026398公開日2009年10月21日申請(qǐng)日期2009年4月22日優(yōu)先權(quán)日2009年4月22日發(fā)明者馮振卿,劉新建,奇唐,進(jìn)朱,琛李,管曉虹,黃劍飛申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué);中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所