專(zhuān)利名稱(chēng)：：重組、單鏈、三價(jià)三特異性或雙特異性抗體衍生物的制作方法重組、單鏈、三價(jià)三特異性或雙特異性抗體衍生物本發(fā)明涉及編碼多肽的核酸分子，其中所述多肽包括(a)第一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與VH結(jié)構(gòu)域連接的VL結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原；(b)第二免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與VH結(jié)構(gòu)域連接的VL結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原；以及(c)第三免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與VH結(jié)構(gòu)域連接的VL結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞抗原，其中所述效應(yīng)細(xì)胞選自NK細(xì)胞、T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；其中腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的并被(a)或(b)所述的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合的至少一種所述抗原是腫瘤干細(xì)胞上和/或腫瘤前體或祖細(xì)胞上表達(dá)的抗原；以及其中結(jié)合腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞抗原的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的比例是至少21。此外，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明核酸分子的載體，用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化的非人宿主，產(chǎn)生多肽的方法，其包括在合適的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主并分離產(chǎn)生的多肽，以及由本發(fā)明的核酸分子編碼的或由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多肽。另外，本發(fā)明涉及用于治療腫瘤的診斷和藥學(xué)組合物以及方法。在本說(shuō)明書(shū)中引用大量文獻(xiàn)。這些文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容包括制造商手冊(cè)在此通過(guò)引用全部并入。白血病是血癌或骨髓癌，其特征在于血細(xì)胞通常是白細(xì)胞的異常增殖。白血病在臨床和病理上分為急性和慢性形式。急性白血病的特征在于未成熟血細(xì)胞的快速增殖。這種大量的未成熟細(xì)胞使骨髓不能產(chǎn)生健康的血細(xì)胞。白血病急性形式可在兒童和青少年中發(fā)生。急性白血病需要即刻治療，原因在于惡性細(xì)胞的快速發(fā)展和積聚，然后溢出至血流并擴(kuò)散至機(jī)體的其他器官。慢性白血病的區(qū)別在于相對(duì)成熟但仍是異常的血細(xì)胞的過(guò)度建立。通常經(jīng)歷幾個(gè)月至幾年的時(shí)間來(lái)發(fā)展，細(xì)胞以大大高于正常細(xì)胞的速率產(chǎn)生，導(dǎo)致血液中許多異常的白血細(xì)胞。慢性白血病主要發(fā)生在老年人中，但理論上可發(fā)生在任何年齡組。但是急性白血病必須即刻治療，有時(shí)，慢性形式在治療前監(jiān)測(cè)一段時(shí)間以確保治療的最大效力。進(jìn)一步，根據(jù)血液中最常見(jiàn)的異常細(xì)胞類(lèi)型(淋巴細(xì)胞對(duì)骨髓細(xì)胞)將疾病分為四種主要類(lèi)型的白血病急性淋巴細(xì)胞白血病(也稱(chēng)為急性淋巴母細(xì)胞白血病，或ALL)、慢性淋巴白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(也稱(chēng)為急性骨髓白血病，或AML)和慢性骨髓性白血病(CML)。對(duì)于源于造血系統(tǒng)的癌癥疾病，通常應(yīng)用的治療包括放射和/或化療。另外，在某些情況下，骨髓移植的另外可能性被認(rèn)為是合適的。但是，這些療法對(duì)患者具有或多或少的毒性，在大多數(shù)情況下，它們不引起疾病完全治愈。最近，基于單克隆抗體的免疫療法已進(jìn)入臨床階段并已證實(shí)有效。顯著的實(shí)例是用于某些非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤(NHL)治療的利妥昔單抗(抗⑶20)以及某些慢性淋巴白血病治療中的CampathIH(抗⑶52)(Reff等，1994；Onrust等，1999；Riechmann等，1988；Hale等，1988)。該方法也已證實(shí)在疾病中獲得成功，例如不同種類(lèi)的骨髓組織增殖(haemoblastos)以及實(shí)體腫瘤。其他抗體處于晚期臨床狀態(tài)，例如用于NHLs的Epratuzumab(抗CD22)(Carnahan等，2003；Leonard等，2003)。對(duì)那些抗體的替代是連接到放射性同位素的抗體。這些抗體的實(shí)例是BEXXAR(抗CD20-I131)和ZEVALIN(抗CD20-Y90)(Kaminski等，1993;Davis等，2007;Cheung等；2006)。替代放射性同位素，可使用其他物質(zhì)，例如毒素，例如用于免疫毒素Mylotarg(與毒素加里剎毒素偶聯(lián)的抗CD33；Hamann等，2002；Sievers等，1999)。在癌癥疾病的治療中，抗體的一般優(yōu)勢(shì)是它們對(duì)癌性細(xì)胞具有比對(duì)健康細(xì)胞更高的特異性。具體地，在血液疾病的情況下，腫瘤細(xì)胞易于獲得，原因在于它們存在于血液、骨髓或不太致密的組織中。上述使用的抗體的主要缺點(diǎn)是它們的大小，這限制它們向某些組織的進(jìn)入性或它們穿透腫瘤的能力。另外，抗體與非細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如B細(xì)胞或血小板)的Fc受體或與抑制性受體例如FcyRIIIb之間的相互作用損害它們的治療效果(Peipp和Valerius，2002；Clynes等，2000)。另外，雙等位基因多態(tài)性可降低對(duì)抗體療法的敏感性，例如利妥昔單抗所顯示的(Cartron等，2002；Weng和Levy，2003)。盡管補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性的臨床相關(guān)性仍不清楚(Weng和Levy2001)，但是通過(guò)結(jié)合Fc受體(FcR)，免疫效應(yīng)細(xì)胞的募集和ADCC的誘導(dǎo)在體外和體內(nèi)發(fā)揮重要作用，如利妥昔單抗所證明的(Cartron等2002，Weng和Levy2003)。因此，提高ADCC活性可成為一種有前景的方法以改進(jìn)基于Ab的治療方法。因此，已使用幾種不同方法來(lái)增強(qiáng)不同單克隆抗體(mAb)的效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的功能，例如，通過(guò)糖工程或通過(guò)氨基酸置換的引入對(duì)Fc部分與FcR結(jié)合的改進(jìn)(Barbin等2006，Lazar等2006)。通過(guò)雙特異性抗體(bsAb)的產(chǎn)生——其在一些情況下產(chǎn)生比親本mAb甚至更強(qiáng)的體外細(xì)胞毒性——獲得效應(yīng)子功能的另外顯著的改進(jìn)(Weiner，等1993)，并能夠克服常規(guī)抗體的一些限制(Peipp和Valerius，2002)。兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)——一個(gè)為腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原結(jié)合位點(diǎn)以及另一個(gè)為免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如T細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或粒細(xì)胞)表面上觸發(fā)分子結(jié)合位點(diǎn)——引起這些效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效募集以及經(jīng)由抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)或吞噬作用對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。通常地，通過(guò)抗體結(jié)合至細(xì)胞毒性觸發(fā)分子，例如⑶2、⑶28或⑶3(在T細(xì)胞上表達(dá))、⑶16(FeγRIIIa，在NK細(xì)胞上表達(dá))、⑶64(FeyRI；在激活的嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上表達(dá))或CD89(FeαRI，在嗜中性粒細(xì)胞上表達(dá)；Peipp和Valerius，2002)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞裂解。已知干細(xì)胞移植后，NK細(xì)胞是最先再生的細(xì)胞之一，這使得它們特別合適于消除微小殘留疾病(MRD)的細(xì)胞(Eyrich等，2001；Lang等，2003)。與以前所使用的技術(shù)相比，重組抗體的可利用性大大促進(jìn)雙特異性抗體的產(chǎn)生和純化。通常已知的抗體形式是雙抗體、微型抗體(minibody)、單鏈雙抗體或串聯(lián)雙特異性單鏈可變片段(bsscFv)(Peipp和Valerius，2002)，后面兩種僅由一個(gè)分子組成。治療抗體衍生物選擇結(jié)合的抗原(一種或更多種)對(duì)治療至關(guān)重要。以前已描述在B淋巴瘤形成的治療中的結(jié)合B細(xì)胞上表達(dá)的⑶19的抗體(Grossbard等，1992)。在它們發(fā)展的所有時(shí)期，CD19在B細(xì)胞上表達(dá)，除了成熟血漿細(xì)胞。迄今，該抗原未在B淋巴區(qū)室以外的造血干細(xì)胞或其他細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)。迄今使用的形式包括全抗體、免疫偶聯(lián)物、免疫脂質(zhì)體、免疫毒素和雙特異性形式。用鼠CD19IgG2A抗體治療六名患者在一名患者中引起部分緩解(Hekmarm等，1991)。乙二醇工程化的嵌合⑶19抗體能夠經(jīng)由NK細(xì)胞介導(dǎo)ADCC(Barbin等，2006)，進(jìn)一步的嵌合CD19抗體在SCID-小鼠模型中減緩CD19陽(yáng)性腫瘤的生長(zhǎng)(Pietersz等，1995)。開(kāi)發(fā)了抗⑶19抗體衍生物——其偶聯(lián)至酪氨酸激酶抑制劑染料木黃酮以及偶聯(lián)至放射性核素、細(xì)胞毒素或外毒素，均顯示癌癥狀況的改善(Messinger等，1998；Vervoordeldonk等，1994；Vallera等，2004；Schwemmlein等，2007)。已知的雙特異性抗體是例如那些針對(duì)CD19和CD64的，其使用干擾素刺激的巨噬細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞(Ely等，1996)。針對(duì)CD19和CD3(Haagen等，1992；Weiner和deGast,1995；Kiprianov等，1998；Loffler等，2000)以及CD19和CD16(Kiprianov等，2002)的抗體衍生物分別活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞或NK細(xì)胞。雖然細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)據(jù)表明對(duì)[CD19xCD3]雙特異性抗體衍生物的顯著裂解活性，但是由抗體介導(dǎo)的CD3的交聯(lián)產(chǎn)生非特異的T細(xì)胞活化，導(dǎo)致對(duì)與抗體結(jié)合的細(xì)胞的毒性(Segal等，1999)。[⑶19x^16]抗體衍生物已經(jīng)作為單鏈Fv分子、雙鏈雙抗體和作為四價(jià)雙抗體產(chǎn)生，并已證實(shí)在人淋巴瘤的小鼠模型中有效(EP1314741；AffimedTherapeuticsAG)。CD16是IgG的低親和性受體(FeyRIII)，其在NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表面上作為跨膜同種型組成型地表達(dá)(⑶16a)，以及在嗜中性粒細(xì)胞的表面上作為糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨定分子表達(dá)(CD16b)(Ravetch和Kinet，1991；vandeffinkel和Anderson,1991)。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，CD16a需要與含有免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)的FcRY鏈結(jié)合，所述基序觸發(fā)下游信號(hào)傳導(dǎo)。對(duì)經(jīng)由CD16重新定向NK細(xì)胞的的常規(guī)偶聯(lián)的雙特異性抗體研究表明在培養(yǎng)的惡性細(xì)胞和動(dòng)物模型中有效的細(xì)胞裂解(GarciadePalazzo等，1992；Hombach等，1993；Kipriyanov等，2002)。因此，啟動(dòng)對(duì)CD16定向的雙特異性抗體的臨床研究(Weiner等，1995；Hartmann等，1997)。但是，雜交-雜交瘤抗體的免疫原性以及由Fc結(jié)構(gòu)域的存在導(dǎo)致的不期望的副作用以及產(chǎn)生足夠量的臨床級(jí)材料的困難限制了這些臨床研究。另一個(gè)雙特異性抗[⑶19x^16]抗體利用在一個(gè)多肽鏈中組合的兩個(gè)單鏈Fv(Bruenke等，2005)?？贵w的效力取決于它們?cè)谌搜逯械姆€(wěn)定性，它們?cè)谏镏械亩ㄎ灰约八鼈兊挠H和性。已發(fā)展了幾種方法來(lái)影響這些性質(zhì)。例如，scFv抗體兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域之間的二硫橋可大大改進(jìn)血清穩(wěn)定性，但常常導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)的不可溶表達(dá)或?qū)е掠H和性的降低?？捎糜谒幬飫?dòng)力學(xué)性質(zhì)改進(jìn)的進(jìn)一步測(cè)量是將抗體衍生物偶聯(lián)至聚乙二醇(PEG)——結(jié)合人血清白蛋白(HSA)的成分，偶聯(lián)至HAS自身或偶聯(lián)至向抗體衍生物提供N-糖基化位點(diǎn)的肽(Kubetzko等，2006;Huhalov&Chester，2004;Muller等，2007;Schoonjans等，2000；Stork等，2008)。最后，通過(guò)發(fā)展多價(jià)抗體衍生物，可提高與靶向腫瘤細(xì)胞的親和性。公開(kāi)的形式包括微型抗體、三鏈抗體(tribodies)、四價(jià)二鏈抗體或三價(jià)三鏈抗體，其具備一個(gè)或更多特異性。它們減少的尺寸使得侵入腫瘤并在生物體中保留較長(zhǎng)時(shí)間，這是由于它們分子量仍處于腎的排阻屏障之上。包括兩個(gè)以上抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子的一個(gè)剩余缺點(diǎn)是它們?nèi)杂芍辽賰蓚€(gè)多肽鏈組成，原因在于迄今沒(méi)有描述可獲得具有兩個(gè)以上特異性的單鏈分子，其可作為治療劑應(yīng)用。如果抗體衍生物由一個(gè)以上多肽鏈組成，產(chǎn)生和純化該衍生物以獲得同質(zhì)混合物將更加困難。最后，具有腫瘤細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的相同數(shù)目特異結(jié)合位點(diǎn)的抗體衍生物相似親和性通常引起效應(yīng)細(xì)胞的活化，而不在之前被募集至腫瘤或其他細(xì)胞，其引起效應(yīng)細(xì)胞降低的細(xì)胞毒性潛能。本發(fā)明提供新的和有利的抗體衍生物，其合適用作為對(duì)腫瘤細(xì)胞比對(duì)效應(yīng)細(xì)胞具有更高親和性的血液疾病的治療劑，從而改變對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和力、更穩(wěn)定并顯示體內(nèi)延長(zhǎng)的血漿保留時(shí)間。因此，本發(fā)明涉及編碼多肽的核酸分子，其中所述多肽包括(a)第一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與VH結(jié)構(gòu)域連接的VL結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原；(b)第二免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與VH結(jié)構(gòu)域連接的VL結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原；以及(c)第三免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與VH結(jié)構(gòu)域連接的VL結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞抗原，其中所述效應(yīng)細(xì)胞選自NK細(xì)胞、T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；其中腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的并被(a)或(b)所述的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合的至少一種所述抗原是腫瘤干細(xì)胞上和/或腫瘤前體或祖細(xì)胞上表達(dá)的抗原；以及其中結(jié)合腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞抗原的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的比例是至少21。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”定義為由大于30個(gè)核苷酸組成的線性分子鏈。此處命名為“核酸分子”的分子群還包括完整基因。根據(jù)本發(fā)明，“核酸分子”包括DNA，例如cDNA或基因組DNA，以及RNA。進(jìn)一步包括的是本領(lǐng)域已知的核酸模擬分子，例如DNA或RNA的合成或半合成衍生物和混合聚合物。根據(jù)本發(fā)明，這些核酸模擬分子或核酸衍生物包括硫代磷酸核酸、氨基磷酸酯核酸、2’-0-甲氧基乙基核糖核酸、嗎啉代核酸、己糖醇核酸(hexitolnucleicacid,HNA)和鎖核酸(lockednucleicacid，LNA)(參見(jiàn)Braasch和Corey，ChemBiol2001,81)。LNA是RNA衍生物，其中核糖環(huán)被2’-氧和4’-碳之間的亞甲基鍵束縛。它們可含有另外的非自然的或衍生的核苷酸堿基，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)容易理解的。此外，本發(fā)明預(yù)期與上述定義的核酸分子互補(bǔ)的核酸分子以及在嚴(yán)格條件下與其雜交的核酸分子。本領(lǐng)域公知的是如何用核酸分子進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。相關(guān)地，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道她/他必須使用什么樣的雜交條件以獲得成功的雜交。合適的雜交條件的建立參考于標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)，例如Sambrook,Russell"MolecularCloning,ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(2001)；Ausubel,"CurrentProtocolsinMolecularBiology，，，GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y.(1989)或Higgins禾口Hames(Eds.)“Nucleicacidhybridization,apracticalapproach"IRLPressOxford,WashingtonDC,(1985)。“嚴(yán)格條件”是指雜交條件，在該條件下，能夠與本發(fā)明的多核苷酸或其部分雜交的多核苷酸與這些靶序列雜交至經(jīng)檢測(cè)高于其他序列的程度(例如，高于背景至少2倍)。嚴(yán)格條件是序列依賴(lài)的并應(yīng)在不同情況下而不同。通過(guò)控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，與探針具有至少90%序列同一性、更優(yōu)選地95%、例如98%和更優(yōu)選的100%序列同一性的靶序列可被鑒定(較高嚴(yán)格雜交條件)?？蛇x地，可調(diào)整嚴(yán)格條件以使得序列中較高程度的錯(cuò)配(雜交的較低嚴(yán)格條件)。這些用于雜交的較高嚴(yán)格和較低嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。例如“嚴(yán)格條件”是指雜交條件，其包括，例如在4XSSC(600mMNaCl，60mM檸檬酸鈉)中在65°C過(guò)夜溫育，然后在0.IXSSC中在65°C洗滌一小時(shí)?？蛇x地，雜交條件可包括在包括50%甲酰胺、5XSSC(750mMNaCl，75mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5XDenhardt's溶液、10%硫酸右旋糖酐(dextransulfate)和20μg/ml變性、剪切的鮭精DNA的溶液中在42°C過(guò)夜溫育，然后在例如0.1-0.5XSSC中以約55_65°C洗滌約5至20分鐘。所述雜交條件也是作為“雜交的較高嚴(yán)格條件”而為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。還可預(yù)期的是這樣的核酸分子，其在較低嚴(yán)格雜交條件下與本發(fā)明的多核苷酸雜交(“雜交的較低嚴(yán)格條件”)。雜交嚴(yán)格性中的變化主要通過(guò)操作甲酰胺濃度(甲酰胺的較低百分比產(chǎn)生較低嚴(yán)格性)、鹽條件或溫度實(shí)現(xiàn)。例如，較低嚴(yán)格條件包括在4XSSC中在50°C過(guò)夜溫育或在包括6XSSPE(20XSSPE=3MNaCl；0.2MNaH2P04；0.02MEDTA,pH7.4),0.5%SDS、30%甲酰胺、100mg/ml鮭精封閉DNA的溶液中在37°C過(guò)夜溫育；然后用1XSSPE、0.1%SDS在50°C洗滌。另外，為獲得甚至更低的嚴(yán)格性，在嚴(yán)格雜交后進(jìn)行的洗滌可以在較高鹽濃度(例如5XSSC)下進(jìn)行。應(yīng)注意的是在上述條件中的變化可通過(guò)可替代封閉劑的包含和/或置換來(lái)完成。通常的封閉劑包括Denhardt's試劑、BLOTTO、肝素、變性鮭精DNA和可購(gòu)得的專(zhuān)用配方。由于兼容性問(wèn)題，具體封閉劑的包含可要求修改如上所述的雜交條件。這些修改可通常由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員進(jìn)行而無(wú)需進(jìn)一步創(chuàng)造性勞動(dòng)。上文引用的實(shí)施方式優(yōu)選地是指較高嚴(yán)格條件并可選地是指較低嚴(yán)格條件。雜交復(fù)合體可在溶液中形成(例如，Cot或Rot分析)或在溶液中存在的一個(gè)核酸序列與固體支持物(例如，膜、濾膜、芯片、針或載玻片，例如，細(xì)胞已固定其上)上固定的另一個(gè)核酸序列之間形成。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多肽”描述氨基酸的線性分子鏈，其包括單鏈蛋白質(zhì)或它們的片段，其含有大于30個(gè)氨基酸。因此，用于本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“肽”描述氨基酸線性鏈，其含有高達(dá)30個(gè)氨基酸。另外，氨基酸(一個(gè)或更多個(gè))和/或肽鍵(一個(gè)或更多個(gè))已被功能類(lèi)似物取代的這些蛋白質(zhì)/多肽的模擬肽也被本發(fā)明包括。這些功能類(lèi)似物包括除了20個(gè)基因編碼的氨基酸外的所有已知的氨基酸，例如硒代半胱氨酸。術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”——其可互換使用——還指自然修飾的多肽/蛋白質(zhì)，其中修飾可通過(guò)例如糖基化、乙?；?、磷酸化和本領(lǐng)域公知的類(lèi)似修飾進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與VH結(jié)構(gòu)域連接的VL結(jié)構(gòu)域”是指免疫球蛋白的單鏈片段可變結(jié)構(gòu)域(scFv)，其已顯示對(duì)結(jié)合它們的抗原是必要且充分的。每個(gè)Vh或八結(jié)構(gòu)域包括三個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)，主要負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的高度可變區(qū)。當(dāng)應(yīng)用時(shí)，\或乂11結(jié)構(gòu)域在每個(gè)結(jié)構(gòu)域上可由至少一個(gè)⑶R組成，優(yōu)選地至少兩個(gè)，優(yōu)選地所有三個(gè)，只要產(chǎn)生的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)揮所期望的功能，即特異性結(jié)合它的靶抗原。本發(fā)明的核酸分子可編碼源自單個(gè)物種的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，也可以是嵌合或人源化分子。關(guān)于免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中\(zhòng)和Vh結(jié)構(gòu)域的排列，Vl結(jié)構(gòu)域可定位在Vh結(jié)構(gòu)域的N-或C-末端。因此，在本發(fā)明的核酸中，編碼\結(jié)構(gòu)域的核酸可定位在編碼Vh結(jié)構(gòu)域的核酸的5’或3’。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠確定哪種VH和VL結(jié)構(gòu)域的排列更合適于具體的ScFv0如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”或“特異性結(jié)合的”(與“特異性地相互作用”具有相同意思)意思是免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域不或基本上不與具有與靶抗原類(lèi)似結(jié)構(gòu)的表位進(jìn)行交叉反應(yīng)。所研究的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域系列的交叉反應(yīng)性可進(jìn)行檢測(cè)，例如通過(guò)評(píng)估所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域系列在常規(guī)條件下與感興趣的表位以及與大量或多或少(結(jié)構(gòu)地和/或功能地)密切相關(guān)的表位的結(jié)合。只有在它的相關(guān)背景中與感興趣的表位結(jié)合(例如在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的具體基序)但不或基本上不與任何其他表位結(jié)合的那些免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為對(duì)感興趣的表位是特異性的，并從而被認(rèn)為是根據(jù)本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。相應(yīng)的方法例如在Harlow和Lane,1988和1999，Ioccit中所述。術(shù)語(yǔ)“在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原”是指在腫瘤細(xì)胞的表面上表達(dá)的抗原。根據(jù)本發(fā)明，“腫瘤細(xì)胞”是轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其特征在于或引起腫瘤。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“腫瘤”不但指實(shí)體腫瘤，而且指非實(shí)體腫瘤性病癥，舉例來(lái)說(shuō)，例如白血病?！靶?yīng)細(xì)胞抗原”是在效應(yīng)細(xì)胞的表面上表達(dá)的抗原。用于本發(fā)明全文，術(shù)語(yǔ)“效應(yīng)細(xì)胞”是指終端分化的白細(xì)胞，其發(fā)揮免疫系統(tǒng)中一個(gè)或更多特定功能。根據(jù)本發(fā)明，“效應(yīng)細(xì)胞”是NK細(xì)胞、T細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞。優(yōu)選的是效應(yīng)細(xì)胞是NK細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”是指在所有多細(xì)胞生物中發(fā)現(xiàn)的原始細(xì)胞，其保持通過(guò)細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行自我更新的能力并可分化為不同范圍的特化的細(xì)胞類(lèi)型。造血干細(xì)胞(HSC)是骨髓細(xì)胞的一種小亞型，代表大約1IO5-IIO6細(xì)胞，具有產(chǎn)生造血系統(tǒng)所有其他成熟細(xì)胞類(lèi)型的獨(dú)特能力。它們具有確定的特征性能力，其以對(duì)稱(chēng)和非對(duì)稱(chēng)方式分裂以及產(chǎn)生譜系限制的(lineagecommitted)子代細(xì)胞。HSC很少分裂，但具有較高的自我更新能力。譜系限制的子細(xì)胞是“先祖”和“前體細(xì)胞”，其更活躍地增殖(Spangrude等，1988;Bryder等，2006)。術(shù)語(yǔ)“前體或祖細(xì)胞”是指未成熟或未分化的細(xì)胞，通常在出生后的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“腫瘤前體或祖細(xì)胞”是指具有可改變的性質(zhì)的細(xì)胞，例如關(guān)于它們?cè)鲋承袨榛蚧虮磉_(dá)模式，產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞。這些腫瘤前體或祖細(xì)胞的實(shí)例是例如白血病前體或祖細(xì)胞。祖細(xì)胞具有與干細(xì)胞相同的許多共同特征。與干細(xì)胞一樣，祖細(xì)胞具有自我更新和分化的能力，雖然與干細(xì)胞的那些性質(zhì)相比，這些性質(zhì)可能是有限的。先祖或前體細(xì)胞可被看作仍能夠增殖的干細(xì)胞中間子代。結(jié)合腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞抗原的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的比例是本發(fā)明的重要特征。如上所述，以前所知的抗體衍生物包括多鏈免疫球蛋白的雙特異性或三特異性衍生物或單鏈Fvs的雙特異性衍生物。在申請(qǐng)人的最大知識(shí)范圍內(nèi)，腫瘤抗原的結(jié)合位點(diǎn)和效應(yīng)細(xì)胞抗原的結(jié)合位點(diǎn)的比例最優(yōu)化以及它對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)質(zhì)量的影響至今沒(méi)有公開(kāi)。本發(fā)明首次公開(kāi)了結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原與結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞抗原的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的比例為至少21。結(jié)合腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的分?jǐn)?shù)越高，其具有腫瘤細(xì)胞親和性的作用越高。因此，定向于在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原的抗原結(jié)合部分的較高數(shù)量增加在本發(fā)明的多肽結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞之前結(jié)合腫瘤細(xì)胞的可能性。在效應(yīng)細(xì)胞之前腫瘤細(xì)胞的募集是有利的，基于下列原因直至現(xiàn)在，在治療情況下，在具有一個(gè)或兩個(gè)特異性的免疫球蛋白或天然觸發(fā)分子與在介導(dǎo)免疫反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞表面上表達(dá)的各自抗原結(jié)合時(shí)，免疫反應(yīng)被誘導(dǎo)。因此，效應(yīng)細(xì)胞不能區(qū)分抗體分子是否結(jié)合至腫瘤細(xì)胞或如果抗體衍生物不結(jié)合腫瘤細(xì)胞則不導(dǎo)致非特異的免疫反應(yīng)。相反，對(duì)腫瘤抗原特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)與對(duì)效應(yīng)細(xì)胞特異性的那些位點(diǎn)的21比例增強(qiáng)在本發(fā)明抗體衍生物結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞的抗原之前其結(jié)合腫瘤細(xì)胞的可能性。作為與腫瘤細(xì)胞的親和力增加的結(jié)果，在腫瘤細(xì)胞上的細(xì)胞表面保留時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致改進(jìn)的如上所述的靶向潛能。這大大降低非特異免疫反應(yīng)的數(shù)量并因此降低以前所知分子的不利的副作用。期望的是比例為大于21，例如31或41，其也是本發(fā)明所預(yù)期的，該比例發(fā)揮相同或更有利的性質(zhì)。與如上所述作用不同，本發(fā)明首次證明以scFvs的形式包括三個(gè)抗原結(jié)合特異性的單鏈多肽可重組地并可溶地表達(dá)，并發(fā)揮所期望的作用。如上所述，雙特異性單鏈Fv抗體是現(xiàn)有技術(shù)已知的。但是，通常不認(rèn)為可獲得被假設(shè)為結(jié)構(gòu)性復(fù)合體的三特異性單鏈分子，其正確折疊、穩(wěn)定并還具有所期望的功能，即它結(jié)合它的靶抗原，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞抗原的親和力高于對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的親和力。通常，已融合至其他蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域——例如其他抗體衍生的片段——的scFv與單獨(dú)scFvs相比具有較低的親和性(Lu等，2002；McCall等，2001；Schwenkert等，2008)。因此可預(yù)期的是中央scFv，其以scFv三鏈抗體的形式在它的N-和C-末端與另一個(gè)蛋白質(zhì)連接，應(yīng)具有顯著降低的親和性或功能性。本發(fā)明多肽形式的進(jìn)一步優(yōu)勢(shì)是在一個(gè)多肽中三個(gè)scFv的組合降低分子的表面。在抗體源自其他生物而不是腫瘤被治愈的那種生物的情況下，該優(yōu)勢(shì)與缺乏恒定抗體結(jié)構(gòu)域可降低潛在的免疫原性。另外，以它們最簡(jiǎn)單形式的雙特異性抗體衍生物由兩個(gè)scFv組成，其由大約10-20個(gè)氨基酸的柔性接頭連接，具有僅為約50-60kDa的相對(duì)分子量(Mr)，以及具有Mr65kDa的蛋白質(zhì)快速地由腎從血流中清除(Kipriyanov等，1999;Huhalov&Chester，2004)。從血中的快速清除引起在腫瘤位點(diǎn)的很少保留(Hu等，1996)。因此，通過(guò)各種修飾——包括PEG化(Kubetzko等，2006)、N_糖基化或進(jìn)一步蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的添加——增加雙特異性蛋白質(zhì)的大小(Huhalov&Chester，2004；Muller等，2007；Schoonjans等，2000；Stork等，2008)。這些修飾引起改進(jìn)的血漿保留時(shí)間和體內(nèi)機(jī)體保留時(shí)間(Kontermann，2005)，但是不能改進(jìn)分子與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合性質(zhì)，如本發(fā)明的分子可獲得的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，(a)項(xiàng)和(b)項(xiàng)所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的相同抗原。例如，兩種免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域可結(jié)合⑶7、⑶19、⑶33、⑶13、⑶44var、⑶123、C-型凝集素樣分子-I(CLL-I)、CD96，后者存在于AML的白血病干細(xì)胞(LSC)中，或黑素瘤相關(guān)的軟骨素硫酸蛋白聚糖(MCSP)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，(a)項(xiàng)和(b)項(xiàng)的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的不同抗原。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，在腫瘤干細(xì)胞或腫瘤前體或祖細(xì)胞上表達(dá)的至少一個(gè)抗原是CD19、CD33、CD13、CD44var、CD123、CLL-I或CD96。在本發(fā)明另外優(yōu)選的實(shí)施方式中，在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)、優(yōu)選地在腫瘤干細(xì)胞或腫瘤前體或祖細(xì)胞上表達(dá)、并被(a)和(b)的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗原是CD19和CD33、CD19和CD13、CD19和CD123、CD19和CD44var、CD19和MCSP、CD33和CD13、CD33和CD123、CD33和CD44var、CD33和CLL-1、CD33和CD96、CD13和CD123、CD13和CD44var、CD13禾口CLL-UCD13和CD96、CD123和CD44var、CD123和CLL_1、CD123和CD96、CD44var和CLL-1、CD44var和CD96、或CLL-1和CD96。通常，在健康的細(xì)胞上，每次僅表達(dá)上述抗原的一種類(lèi)型。但是，在某些腫瘤中，特別是在某些白血病中，可同時(shí)表達(dá)一個(gè)以上的上述或其他特異抗原。現(xiàn)有技術(shù)中所述的顯著實(shí)例是⑶13和⑶19、⑶33和⑶19、以及⑶19和MCSP(黑素瘤相關(guān)的軟骨素硫酸蛋白聚糖)，其在雙表型或混合譜系白血病中共表達(dá)(Greil等，1994；Hrusak和Porwit-MacDonald,2002；Casasnovas等，2003；Haagen等，1992)。由本發(fā)明核酸分子編碼的并對(duì)通常不在健康的細(xì)胞上同時(shí)表達(dá)的兩個(gè)不同抗原具有特異性的多肽對(duì)異常細(xì)胞具有增加的親和性，異常細(xì)胞即同時(shí)表達(dá)兩個(gè)上述抗原的腫瘤細(xì)胞。這增強(qiáng)分子對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，被(C)的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合的效應(yīng)細(xì)胞抗原是CD16(FcYRIIIa)或CD64(FeγRI)。合適于本
發(fā)明內(nèi)容的進(jìn)一步抗原是CD89、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3、CD28或CD2。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域包括至少一個(gè)能夠形成分子內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸殘基。已知分子內(nèi)半胱氨酸橋穩(wěn)定抗體_片段和正面影響它的血清穩(wěn)定性和/或在一些情況下影響它對(duì)靶表位的結(jié)合親和性等等。二硫橋通常在自然發(fā)生抗體中發(fā)現(xiàn)，其中它們存在于可變和恒定區(qū)中。發(fā)現(xiàn)許多scFv抗體對(duì)抗原具有比Fab負(fù)體更低的親和性，其歸因于scFv的肽接頭干擾結(jié)合的事實(shí)(Batra等，1992；Pantoliano等，1991；Stemmer等，1993)。為了改進(jìn)具有不同數(shù)量結(jié)合位點(diǎn)的scFv抗體的性質(zhì)，試圖在分子中二硫橋不能自然發(fā)生的位置引入能夠形成二硫橋的半胱氨酸。當(dāng)設(shè)計(jì)具有人工半胱氨酸橋的修飾的抗體時(shí)，必須滿足下列先決條件。首先，二硫橋應(yīng)在Fv的結(jié)構(gòu)保守區(qū)中即在Vh和\區(qū)中連接氨基酸。另外，結(jié)構(gòu)域之間的距離應(yīng)足夠小以使二硫橋形成而不在Fv分子中產(chǎn)生反向張力。最后，二硫橋應(yīng)距⑶R足夠遠(yuǎn)以便不干擾抗原結(jié)合。因而，引入形成二硫橋的半胱氨酸在Fv的框架區(qū)，其在大部分抗體中在結(jié)構(gòu)保守的位置，連接Vh和\區(qū)的CDR。Glockshuber等(1990)、Brinkmann等(1993)和Reiter等(1994)闡述了這些標(biāo)準(zhǔn)并成功地建立了第一個(gè)二硫鍵穩(wěn)定的Fv抗體。但是，以這種方式用于穩(wěn)定僅包括可變區(qū)的抗體，如在scFv中的大部分試驗(yàn)面臨各種困難，即與重組全抗體的表達(dá)相比在修飾的抗體表達(dá)過(guò)程中面臨的類(lèi)似問(wèn)題。例如，當(dāng)重組表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生的分子變?yōu)椴豢扇艿?，其可能的原因在于未受控制的二硫橋形成及其產(chǎn)生的聚集。除此之外，與它們未用二硫鍵穩(wěn)定的負(fù)體相比，二硫穩(wěn)定的scFv還通常顯示對(duì)抗原的降低的親和性。本發(fā)明可克服該問(wèn)題。雖然本領(lǐng)域各種專(zhuān)業(yè)人員如上所述預(yù)測(cè)產(chǎn)生類(lèi)似困難，本發(fā)明抗體衍生物的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域可通過(guò)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的半胱氨酸橋而穩(wěn)定，而不同時(shí)將全部分子變?yōu)椴豢扇?。本發(fā)明多核苷酸的氨基酸序列中的突變可例如根據(jù)Reiter等(1994)以堿基三聯(lián)體在\結(jié)構(gòu)域的位置100或在Vh結(jié)構(gòu)域的位置44引入，以使它們編碼半胱氨酸殘基。所有位置是根據(jù)Kabat編號(hào)(Kabat等，1991)。在本發(fā)明的內(nèi)容中，通過(guò)將兩個(gè)適合的氨基酸如上所述突變?yōu)榘腚装彼?，以使結(jié)合某些抗原的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定。將二硫橋引入至對(duì)⑶19和⑶16具有特異性的scFv的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域顯示大大增強(qiáng)分子的穩(wěn)定性，而不影響它們的特異性或降低它們親和性和功能性，如本發(fā)明人在對(duì)MCSP或CD7具有特異性的其他scFv中觀察到的。將突變引入核酸分子的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的并可從例如Sambrook，2001和Ausubel，2001中得到。在一個(gè)不同的優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子編碼至少一個(gè)接頭，其將至少一個(gè)VH與VL結(jié)構(gòu)域分離或?qū)⒅辽僖粋€(gè)VL與VH結(jié)構(gòu)域分離。根據(jù)本發(fā)明，所用的術(shù)語(yǔ)“接頭”涉及一段氨基酸序列，其連接一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域。因此，接頭可將形成一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)Vh和\區(qū)分離和/或接頭可將鄰近的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)\和Vh區(qū)分離。本發(fā)明所用接頭是長(zhǎng)度為1至40個(gè)氨基酸的(多)肽接頭。優(yōu)選地，所述接頭長(zhǎng)度為5至25個(gè)氨基酸。甚至更優(yōu)選地，所述接頭長(zhǎng)度為10至20個(gè)氨基酸。分離一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的Vh和\結(jié)構(gòu)域的接頭以及分離不同免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的接頭可具有相同或不同的長(zhǎng)度并可包括相同或不同的氨基酸序列。優(yōu)選地，接頭具有相同長(zhǎng)度和相同氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，分離免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的接頭在長(zhǎng)度和/或氨基酸序列上不同于在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中分離％和\區(qū)的接頭。例如，前者可以較長(zhǎng)并設(shè)計(jì)以促進(jìn)互相面對(duì)的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的柔性或促進(jìn)分子的正確折疊和/或增強(qiáng)一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)λ陌锌乖挠H和性。另外，接頭的性質(zhì)，即接頭的長(zhǎng)度和/或氨基酸序列可修飾或增強(qiáng)分子的穩(wěn)定性和/或溶解性。接頭的長(zhǎng)度和序列取決于形成免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的Vh和\結(jié)構(gòu)域的組成。例如，從本發(fā)明多肽的N-末端或從本發(fā)明核酸分子的5’-端起始，如果\結(jié)構(gòu)域后是Vh結(jié)構(gòu)域，分離一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的V區(qū)的20個(gè)氨基酸的接頭可能是最佳的。相反，如果Vh結(jié)構(gòu)域后是\結(jié)構(gòu)域，各個(gè)接頭可具有15個(gè)氨基酸的最佳長(zhǎng)度。不期望被任何科學(xué)理論限制，應(yīng)認(rèn)為的是這些差異的原因可能在于空間原因，其導(dǎo)致不同長(zhǎng)度的接頭促進(jìn)具有不同的V結(jié)構(gòu)域排列的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的正確折疊。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)或免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域之間測(cè)試不同接頭適合性的方法。例如，分子的性質(zhì)可通過(guò)比較免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和性容易測(cè)定。在本發(fā)明的三特異性分子的情況下，可對(duì)每個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分別測(cè)量?？蓽y(cè)量產(chǎn)生的分子的穩(wěn)定性——使用基于流式細(xì)胞術(shù)的方法以測(cè)定在人血清中在37°C溫育幾個(gè)時(shí)間段后分子的殘余結(jié)合能力。其他合適的測(cè)試可在例如Bruenke等(2005)中發(fā)現(xiàn)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)柔性接頭使用例如氨基酸丙氨酸和絲氨酸或甘氨酸和絲氨酸，將至少兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域融合。優(yōu)選地，接頭序列是(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)或之間在至少一個(gè)Vh和\結(jié)構(gòu)域或\和Vh結(jié)構(gòu)域之間不存在接頭。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子編碼兩個(gè)特異性結(jié)合CD19的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)特異性結(jié)合CD16(FeYRIIIa)的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子編碼兩個(gè)特異性結(jié)合CD33的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)特異性結(jié)合CD16(FeYRIIIa)的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。與雙特異性scFv抗體衍生物相比，由本發(fā)明的核酸分子編碼的抗體——其包括兩個(gè)腫瘤抗原結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)效應(yīng)子抗原結(jié)合位點(diǎn)——具有優(yōu)異性質(zhì)。與雙特異性scFv衍生物相比，本發(fā)明新的抗體衍生物在抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用(ADCC)分析中顯示更高效力。另外，單鏈Fv三聯(lián)體(三鏈抗體)具有更有利的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。在小鼠中，體內(nèi)血清保留半衰期高于串聯(lián)雙特異性scFv抗體顯示的半衰期。另外，與雙特異性scFv抗體的非二硫鍵_穩(wěn)定的變體相比，在所有免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中具有二硫橋的二硫鍵_穩(wěn)定的抗體在之前顯示更加穩(wěn)定(Bruenke等，2005)。如實(shí)施例顯示，與用作⑶33單價(jià)對(duì)照蛋白的bSSCFv[33XdS16]相比，重組抗體片段[⑶33X⑶16X⑶33]對(duì)骨髓腫瘤抗原⑶33具有更高的親和力。重要地是，對(duì)⑶33更高的親和力翻譯為增加的ADCC潛能單鏈Fv三鏈抗體(sctb)[33Xdsl6X33]需要比bsscFv[33Xdsl6]低8倍的濃度來(lái)誘導(dǎo)半最大的裂解。還在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，多肽進(jìn)一步包括與免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域不相關(guān)的至少一個(gè)(多)肽，其可以是例如適于改進(jìn)本發(fā)明多肽性質(zhì)的標(biāo)記或功能(多)肽。標(biāo)簽可以是例如Str印-標(biāo)記、His-標(biāo)記、Myc標(biāo)記或Flag標(biāo)記。功能多肽是例如κ分泌前導(dǎo)區(qū)、人血清白蛋白(hsa)或其片段，能夠結(jié)合hsa或其他血清蛋白的肽；能夠結(jié)合新生兒Fc受體(FcRn)、人肌肉醛縮酶(hma)的肽或其片段；CD鉸鏈區(qū)、免疫球蛋白恒定區(qū)、白細(xì)胞介素_2、白細(xì)胞介素-15和白細(xì)胞介素-18、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)，粒細(xì)胞刺激因子(G-CSF)或具有至少一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的肽。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“(多)肽”描述一組分子，其包括由直至30個(gè)氨基酸組成的一組肽，以及如上所定義由大于30個(gè)氨基酸組成的一組多肽。與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“其片段”是指蛋白質(zhì)的片段，其仍具有全長(zhǎng)(多)肽的一種或更多種生物學(xué)功能。具體地，本發(fā)明擬用的(多)肽片段能夠增加本發(fā)明抗體衍生物的穩(wěn)定性和/或血清半衰期。本領(lǐng)域公知的是功能多肽可被切割以產(chǎn)生具有不改變或基本上不改變功能的片段。這些切割可包括去除給定數(shù)量的N-和/或C-末端氨基酸。另外地或可選地，許多內(nèi)部(非末端)氨基酸可以去除，條件是所獲得的多肽具有全長(zhǎng)(多)肽的功能。從末端和/或內(nèi)部區(qū)域去除的所述氨基酸數(shù)量可以是一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、15、20、25、30、40、50或大于50。在一至50之間的任何其他數(shù)量也是根據(jù)本發(fā)明可想象的。測(cè)定多肽的這些功能性結(jié)構(gòu)域的方式和方法是本領(lǐng)域公知的，并包括實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)方法。實(shí)驗(yàn)方法包括缺失突變體的系統(tǒng)產(chǎn)生以及對(duì)它們進(jìn)行上述本領(lǐng)域已知的期望功能的評(píng)估分析。生物信息學(xué)方法包括數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。合適的數(shù)據(jù)庫(kù)包括蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)。在這種情況下，顯著命中的多序列比對(duì)顯示結(jié)構(gòu)域界限，其中一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域包括那些與序列的剩余部分相比顯示提高的序列保守水平的子序列。進(jìn)一步合適的數(shù)據(jù)庫(kù)包括保守蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的統(tǒng)計(jì)模型數(shù)據(jù)庫(kù)，例如由SangerInstitute，UK維護(hù)的Pfam(www.sanger.ac.uk/Software/Pfam)。進(jìn)一步由本發(fā)明核酸分子編碼的一些(多)肽可促進(jìn)重組表達(dá)多肽的純化，例如各種標(biāo)記。將標(biāo)記和/或其他多肽添加至由本發(fā)明核酸分子編碼的多肽的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，例如Sambrook，2001中所述。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞優(yōu)選地是白血病或淋巴瘤細(xì)胞。取決于白血病產(chǎn)生的淋巴或骨髓細(xì)胞的來(lái)源和階段，在它們的表面上表達(dá)不同模式的抗原。在源自B細(xì)胞譜系的細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原是例如CD19、CD20或CD22，但是源自骨髓細(xì)胞的細(xì)胞的通?？乖抢纰?3、⑶33或⑶123。這些抗原不只是在白血病細(xì)胞上表達(dá)，也在健康的細(xì)胞上表達(dá)(Taussig等，2005)。已報(bào)道在來(lái)自B-ALL某些類(lèi)型的白血病干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞上表達(dá)⑶19(Castor等，2005)。⑶44v6在淋巴和骨髓前體細(xì)胞的亞型上表達(dá)并且在AML細(xì)胞和AML白血病干細(xì)胞(LSCs)上強(qiáng)過(guò)量表達(dá)(Jin等，2006；Legras等，1998)。CD13、CD33、CD96、CD123和CLL-I在骨髓來(lái)源的AML細(xì)胞和LSC上表達(dá)(Taussig等，2005；vanRhenen等，2007；Hosen等，2007)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，腫瘤干細(xì)胞是白血病干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，“白血病干細(xì)胞”(LSC)是惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群，其以HSC驅(qū)動(dòng)正常造血細(xì)胞產(chǎn)生的類(lèi)似方式驅(qū)動(dòng)白血病的發(fā)生。它們代表所有白血病細(xì)胞的少數(shù)(大約150，000-1IO6)。它們確定的性質(zhì)是無(wú)限自我更新能力和以對(duì)稱(chēng)和非對(duì)稱(chēng)方式分裂的能力。因此，在一名患者中所有白血病細(xì)胞的總和不是細(xì)胞的均質(zhì)群體，而是由白血病干細(xì)胞、中間祖細(xì)胞和大多數(shù)更加分化的白血病母細(xì)胞組成的異質(zhì)混合物。LSC具有不同于大量白血病細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記組成，其對(duì)化療藥物具有高度抗性。它們通常在消除大多數(shù)腫瘤細(xì)胞并產(chǎn)生退化的化學(xué)治療中存活。剩余的少數(shù)幾種LSC是微小殘留疾病(MRD)細(xì)胞，其引發(fā)白血病的再生(“復(fù)發(fā)”)(Tan等，2006；Bonnet和Dick,1997；Lapidot等，1994；Passegue等，2003)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，腫瘤前體或祖細(xì)胞是白血病前體或祖細(xì)胞。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，腫瘤是白血病或淋巴瘤。如上所述，白血病是血液癌癥或骨髓癌癥，其特征在于血細(xì)胞異常增殖，通常為白細(xì)胞異常增殖。白血病可在發(fā)育過(guò)程中的不同階段發(fā)生，包括干細(xì)胞階段(Castor等，2005)。在一個(gè)不同的方面，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明核酸分子的載體。優(yōu)選地，載體是質(zhì)粒、黏粒、病毒、噬菌體或例如常規(guī)用于基因工程中的其它載體。本發(fā)明核酸分子可插入至幾種可購(gòu)得的載體中。非限制性實(shí)例包括原核質(zhì)粒載體，例如PUC-系列、pBluescript(Stratagene)、表達(dá)載體的pET系列(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)以及適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的載體，例如pREP(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMClneo(Stratagene)、pXTl(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EB0_pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2_dhfr、pIZD35、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK_10(EdgeBiosystems)、pTriEx-Hygro(Novagen)和pCINeo(Promega)。適于巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)的質(zhì)粒載體實(shí)例包括例如質(zhì)粒pA0815、pPIC9K和pPIC3.5K(均為Intvitrogen)。如上所指的本發(fā)明的核酸分子也可插入至載體以便產(chǎn)生與另一個(gè)核酸分子的翻譯融合。其他核酸分子可編碼蛋白質(zhì)，其可例如提高本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的溶解性和/或促進(jìn)純化。非限制性實(shí)例包括PET32、pET41、pET43(Novagen)。載體也可含有可另外表達(dá)的多核苷酸，其編碼一個(gè)或更多分子伴侶以促進(jìn)正確的蛋白質(zhì)折疊。合適的細(xì)菌表達(dá)宿主包括例如源自BL21的菌株(例如BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS、BL21(DE3)RIL、BL21(DE3)PRARE)或Rosetta。對(duì)于載體修飾技術(shù)，參見(jiàn)Sambrook和Russel，2001。通常地，載體可含有一個(gè)或更多復(fù)制起點(diǎn)(ori)和用于克隆或表達(dá)的遺傳系統(tǒng)，用于在宿主中選擇的一個(gè)或更多標(biāo)記，例如抗生素抗性，以及一個(gè)或更多表達(dá)盒。合適的復(fù)制起點(diǎn)(ori)包括，例如，ColEUSV40病毒和M13復(fù)制起點(diǎn)。典型的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體含有啟動(dòng)子元件，其介導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄的起始、蛋白質(zhì)編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止所需信號(hào)和轉(zhuǎn)錄體的多聚腺苷化。另外，元件，例如復(fù)制起點(diǎn)、藥物抗性基因、調(diào)節(jié)子(作為可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的部分)也可包括。Iac啟動(dòng)子是典型的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，用于原核細(xì)胞，其可以使用乳糖類(lèi)似物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(“IPTG”)誘導(dǎo)。對(duì)于重組表達(dá)，抗體片段可連接在例如周質(zhì)中引導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的PelB前導(dǎo)信號(hào)與稱(chēng)為pHEM噬菌粒中的基因III之間(描述于Ghahroudi等，1997中)。附加元件可包括增強(qiáng)子、Kozak序列和供體和受體位點(diǎn)位于其兩側(cè)的間插序列用于RNA剪接。使用SV40的早期和晚期啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒——例如RSV、HTLVI、HIVI——的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTRs)以及巨細(xì)胞病毒(CMV)的早期啟動(dòng)子，可以獲得高效轉(zhuǎn)錄。但是，也可使用細(xì)胞元件(例如人肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。用于實(shí)踐本發(fā)明的合適的表達(dá)載體包括例如載體，例如PSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC67109)。與可選擇標(biāo)記，例如用于真核細(xì)胞的dhfr、gpt、新霉素、潮霉素基因或用于大腸桿菌和其他細(xì)菌培養(yǎng)的四環(huán)素、卡納霉素或氨芐青霉素抗性基因共轉(zhuǎn)染可進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的鑒定和分離。轉(zhuǎn)染的核酸也可擴(kuò)增，以表達(dá)大量編碼的(多)肽。DHFR(二氫葉酸還原酶)標(biāo)記可用于產(chǎn)生攜帶感興趣基因的幾百個(gè)或甚至幾千個(gè)拷貝的細(xì)胞系。另一個(gè)可用的選擇標(biāo)記是酶——谷氨酸合成酶(GS)(Murphy等1991；Bebbington等1992)。使用這些標(biāo)記，將哺乳動(dòng)物細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并選擇具有最高抗性的細(xì)胞。允許在原核宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的可能的調(diào)節(jié)元件包括例如大腸桿菌中的lac、trp或tac啟動(dòng)子，lacUV5或trp啟動(dòng)子，允許在真核宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的調(diào)節(jié)元件的實(shí)例(更優(yōu)選的實(shí)施方式)是酵母中的AOXl或GALl啟動(dòng)子或在哺乳動(dòng)物和其他動(dòng)物細(xì)胞中的CMV-(巨細(xì)胞病毒)、SV40-、RSV-啟動(dòng)子(勞氏肉瘤病毒)、gailO啟動(dòng)子、人延伸因子1α_啟動(dòng)子、CMV增強(qiáng)子、CaM-激酶啟動(dòng)子、苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)多核型多角體病毒(AcMNPV)多角體啟動(dòng)子或球蛋白內(nèi)含子。優(yōu)選的啟動(dòng)子是天然免疫球蛋白啟動(dòng)子。除了負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄起始的元件以外，這些調(diào)節(jié)元件也可包括轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，例如SV40-poly-A位點(diǎn)或tk-poly-A位點(diǎn)或SV40、lacZ和AcMNPV多角體多聚腺苷化信號(hào)，其位于多核苷酸的下游。插入載體中的編碼序列可例如由標(biāo)準(zhǔn)方法合成，或從自然來(lái)源中分離或半合成產(chǎn)生，即通過(guò)組合化學(xué)合成和重組技術(shù)。可使用已建立的方法將編碼序列連接至轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和/或其他氨基酸編碼序列。確保在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(表達(dá)盒的部分)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。這些元件包括確保轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)序列(例如，翻譯起始密碼子、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和/或隔離子)，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)(Owens等，2001)和任選地確保轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄體穩(wěn)定的poly-A信號(hào)。附加調(diào)節(jié)元件可包括轉(zhuǎn)錄和翻譯的增強(qiáng)子和/或自然相關(guān)或異源啟動(dòng)子區(qū)。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸分子可操作地連接至這些表達(dá)控制序列，使得在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)。載體可進(jìn)一步包括編碼分泌信號(hào)的核苷酸序列，其作為另外的調(diào)節(jié)元件。這些序列是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。另外，取決于使用的表達(dá)系統(tǒng)，能夠?qū)⒈磉_(dá)的多肽引導(dǎo)至細(xì)胞區(qū)室的前導(dǎo)序列可添加至本發(fā)明多核苷酸的編碼序列。這些前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域公知的。具體設(shè)計(jì)的載體可在不同宿主之間進(jìn)行DNA穿梭，例如細(xì)菌-真菌細(xì)胞或細(xì)菌-動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體能夠引導(dǎo)復(fù)制以及本發(fā)明多核苷酸和編碼的酶的表達(dá)。包括所述調(diào)節(jié)元件的合適的表達(dá)載體是本領(lǐng)域已知的，例如Okayama-BergcDNA表達(dá)載體pcDVl(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNAl、pcDNA3(In-Vitrogene,如所附實(shí)例所用，等等)、pSPORTl(GIBC0BRL)或pGEMHE(Promega)或原核表達(dá)載體，例如λgtll、ρJOE、pBBRl-MCS-系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACTl或優(yōu)選地，pET載體(Novagen)。如本文以上所述，本發(fā)明的核酸分子可設(shè)計(jì)為直接引入或經(jīng)由脂質(zhì)體、噬菌體載體或病毒載體(例如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒)引入至細(xì)胞。另外，桿狀病毒系統(tǒng)或基于牛痘病毒或塞姆利基森林病毒(SemlikiForestVirus)的系統(tǒng)可用作本發(fā)明的核酸分子的真核表達(dá)系統(tǒng)。源自病毒，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、牛痘病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒或牛乳頭瘤病毒的表達(dá)載體可用于將多核苷酸或載體遞送至目標(biāo)細(xì)胞群體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法可用于構(gòu)建重組病毒載體；參見(jiàn)例如Sambrook，2001和Ausubel，2001所述技術(shù)。還在另一方面，本發(fā)明涉及用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化的非人宿主。合適的原核宿主包括例如埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬的種和鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)的細(xì)菌。合適的真核宿主細(xì)胞是例如真菌細(xì)胞等等，酵母，例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)或昆蟲(chóng)細(xì)胞，例如果蠅(Drosophila)S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9細(xì)胞和植物細(xì)胞。上述宿主細(xì)胞適合的培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域已知的?？墒褂玫牟溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞包括人Hela、HEK293、H9和Jurkat細(xì)胞、小鼠NIH3T3和C127細(xì)胞、COS1、COS7和CVl、quailQC1-3細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和鮑斯(Bowes)黑色素瘤細(xì)胞。原代哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)也在本發(fā)明范圍內(nèi)。可選地，本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)可在含有整合至染色體的基因構(gòu)建體的穩(wěn)定細(xì)胞系中表達(dá)。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是原代細(xì)胞或原代細(xì)胞系。原代細(xì)胞是直接從生物中獲得的細(xì)胞。合適的原代細(xì)胞是例如小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、小鼠原代肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞以及小鼠肌肉干細(xì)胞(衛(wèi)星細(xì)胞)及其衍生的穩(wěn)定的永生化細(xì)胞系。用本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)染的和/或表達(dá)本發(fā)明核酸分子的作為宿主的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物也在本發(fā)明的范圍中。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，例如倉(cāng)鼠、牛、貓、豬、狗或馬。另外，本發(fā)明涉及產(chǎn)生多肽的方法，其包括在合適的條件下本發(fā)明的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)和產(chǎn)生的重組多肽的分離。用于培養(yǎng)原核或真核宿主的合適的條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。例如，用于培養(yǎng)細(xì)菌的合適的條件是在LuriaBertani(LB)培養(yǎng)基中在通風(fēng)下培養(yǎng)它們。為了提高表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量和溶解性，可以將培養(yǎng)基緩沖或添加已知提高或促進(jìn)產(chǎn)量和溶解性的合適添加劑?？梢栽?至約37°C培養(yǎng)大腸桿菌，精確的溫度或溫度的順序取決于將被過(guò)表達(dá)的分子。通常，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還應(yīng)知道這些條件必須適于宿主需要和表達(dá)的多肽的要求。在可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制宿主細(xì)胞中存在的載體中的本發(fā)明核酸的情況下，多肽的表達(dá)可以通過(guò)添加合適的誘導(dǎo)劑來(lái)誘導(dǎo)。合適的表達(dá)方法和策略是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。取決于細(xì)胞類(lèi)型和它的具體要求，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)可在例如RPMI或DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行，其含有10%(v/v)FCS、2mML-谷氨酸和100U/ml青霉素/鏈霉素。細(xì)胞可以保持在37°C，在5%CO2、水飽和的環(huán)境中。適于昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基是例如TNM+10%FCS或SF900培養(yǎng)基。昆蟲(chóng)細(xì)胞通常在27°C以粘附或懸浮培養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)。適于真核細(xì)胞的表達(dá)方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的并可從例如Sambrook，2001中得到。分離產(chǎn)生的多肽的方法是本領(lǐng)域公知的，其包括且不限于方法步驟，例如離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析(大小排阻層析)、親和層析、高壓液相層析(HPLC)、逆相HPLC、圓盤(pán)凝膠電泳或免疫沉淀，參見(jiàn)例如Sambrook，2001。另一方面，本發(fā)明涉及由本發(fā)明的核酸分子編碼的或由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多肽。另外，本發(fā)明涉及診斷組合物，其包括本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的載體或本發(fā)明的多肽中的至少一個(gè)。本發(fā)明多肽的提高的親和性和/或親和力使它能夠用于診斷分析。例如，這些分子可以用作在細(xì)胞表面上表達(dá)各自抗原的惡性細(xì)胞的靈敏檢測(cè)劑。因此，可產(chǎn)生高親和力的單特異性變體，其具備針對(duì)一個(gè)細(xì)胞表面抗原的三個(gè)結(jié)合部分。作為另一個(gè)實(shí)例，三特異性分子可用于檢測(cè)表達(dá)該分子所針對(duì)的三個(gè)抗原中至少一個(gè)的細(xì)胞，其中應(yīng)用一種單獨(dú)試齊U。特別地，二硫鍵穩(wěn)定的SCFv片段的高穩(wěn)定性——其以該形式引入——使其可長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存，這是診斷劑所期望的。另外，本發(fā)明涉及藥學(xué)組合物，其包括本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的載體或本發(fā)明的多肽。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)組合物”涉及組合物，用于施用至患者，優(yōu)選地人患者。本發(fā)明的藥學(xué)組合物包括上文引用的化合物(其中術(shù)語(yǔ)“化合物”是指提及的核酸分子、載體和多肽以及其片段或衍生物或修飾)，單獨(dú)或聯(lián)合。任選地，其可進(jìn)一步包括能夠改變本發(fā)明化合物特征的分子，從而例如穩(wěn)定、調(diào)節(jié)和/或激活它們的功能。組合物可以是固體、液體或氣體形式，并且可以是粉末、片劑、溶液或氣溶膠形式等等。本發(fā)明的藥學(xué)組合物可任選地和另外地包括藥學(xué)上可接受的載體。“藥學(xué)上可接受的載體”意思是無(wú)毒固體、半固體或液體填充物、稀釋劑、任何類(lèi)型的包封材料或配方輔劑。合適的藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例是本領(lǐng)域公知的，其包括磷酸緩沖鹽溶液、水、乳液例如油/水乳液、各種類(lèi)型的潤(rùn)濕劑、無(wú)菌溶液、有機(jī)溶劑包括DMSO等等。包括這些載體的組合物可通過(guò)熟知的常規(guī)方法配置。如本文所用術(shù)語(yǔ)“腸胃外”是指施用方式，其包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射以及輸注。這些藥學(xué)組合物可以合適的劑量施用至對(duì)象。由主治醫(yī)生和臨床因素來(lái)決定劑量方案。如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域公知的，用于任何一名患者的劑量取決于許多因素，包括患者的大小、體表面積、年齡、施用的具體化合物、性別、施用時(shí)間和途徑、總體健康和同時(shí)施用的其他藥物。給定情況的治療有效量將通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)易于測(cè)定，并在普通臨床醫(yī)生和醫(yī)師的技術(shù)和判斷內(nèi)。通常地，作為藥學(xué)組合物常規(guī)施用的方案應(yīng)在每天μg至5g單位的范圍內(nèi)。但是，更優(yōu)選的劑量可在每天0.Olmg至IOOmg的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選地，每天0.Olmg至50mg以及最優(yōu)選地每天0.Olmg至10mg。如上所述，本發(fā)明的核酸分子可以配制為藥學(xué)組合物。最后，將核酸分子引入所期望的細(xì)胞。適合的配方包括這樣的配方，其中每次劑量施用IO6至IO12個(gè)拷貝的DNA分子，其有利地包括在適合的載體中。載體可以是例如噬菌體、質(zhì)粒、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以是能夠復(fù)制的或復(fù)制有缺陷的。在后一種情況中，病毒繁殖應(yīng)通常僅發(fā)生在互補(bǔ)宿主/細(xì)胞中。本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的載體或本發(fā)明的多肽可用于腫瘤的治療。因此，本發(fā)明還涉及治療腫瘤的方法，其包括施用有效劑量的本發(fā)明的核酸、本發(fā)明的載體或本發(fā)明的多肽，以便在所需要的患者中發(fā)揮所期望的作用。與治療方法相關(guān)的所期望的作用是誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)靶腫瘤抗原的細(xì)胞——特別是白血病細(xì)胞——的免疫反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，待被治療的腫瘤是白血病或淋巴瘤。本發(fā)明針對(duì)的白血病或淋巴瘤是例如如上所定義的AML、CML、ALL、CLL或非霍奇金淋巴瘤。附圖顯示圖1.重組串聯(lián)單鏈Fv三聯(lián)體(或三鏈抗體；sctb)的構(gòu)建。兩個(gè)末端的scFv對(duì)腫瘤抗原具有特異性，中央scFv針對(duì)效應(yīng)細(xì)胞上的激活觸發(fā)分子。CMV，巨細(xì)胞病毒即刻早期啟動(dòng)子；Igκ，鼠IgKL鏈的分泌前導(dǎo)序列八、VH，編碼IgL-或H-鏈的V區(qū)的cDNA序列；Str印、c-myc、6XHis，編碼str印、c-myc或六組氨酸標(biāo)記的cDNA。圖2.sctb二硫鍵-穩(wěn)定的(ds)[19X16X19]的構(gòu)建和表達(dá)。(A)sctbds[19X16X19]的設(shè)計(jì)。兩個(gè)末端scFv對(duì)腫瘤抗原⑶19具有特異性，中央scFv針對(duì)NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的激活觸發(fā)分子CD16。CMV，巨細(xì)胞病毒即刻早期啟動(dòng)子；IgK，鼠IgκL鏈的分泌前導(dǎo)序列；Vl、Vh,編碼IgL-或H-鏈的V區(qū)的cDNA序列；L，編碼20個(gè)氨基酸柔性接頭的cDNA，例如(Gly4Ser)4；Strep,c_myc、6XHis、編碼str印、c-myc或六組氨酸標(biāo)記的cDNA；S-S,穩(wěn)定的二硫鍵。在用Ni-NTA瓊脂糖珠進(jìn)行親和層析后，評(píng)價(jià)sctbds[19X16X19]的完整性和純度，其通過(guò)還原SDS-PAGE和用考馬斯藍(lán)染色(B)并分別使用用于檢測(cè)的抗his或抗Strep抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析(C)。3.sctbds[19X16X19]的特異和同時(shí)抗原結(jié)合。(A)sctbds[19X16X19]對(duì)CD19陽(yáng)性SEM細(xì)胞⑴、CD19-陰性CEM細(xì)胞(ii)、CD16-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(iii)和未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(iv)的特異結(jié)合的FACS分析(白色峰同種型對(duì)照的信號(hào)；黑色峰sctbds[19X16X19]的信號(hào))。(B)同時(shí)結(jié)合CD19和CD16。將SEM細(xì)胞與sctbds[19X16X19]溫育并通過(guò)添加由⑶16的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和GFP組成的融合蛋白(⑶16ex-GFP)顯示同時(shí)結(jié)合(i)。通過(guò)用50倍摩爾過(guò)量的⑶19mAb4G7預(yù)溫育SEM細(xì)胞(ii)或通過(guò)用⑶16mAb3G8預(yù)溫育⑶16ex-GFP融合蛋白(iii)來(lái)封閉由⑶16ex_GFP產(chǎn)生的熒光信號(hào)。通過(guò)添加非相關(guān)IgGl同種型未發(fā)生封閉(白色峰對(duì)照sctb的信號(hào)；黑色峰sctbds[19X16X19]的信號(hào)；深灰色峰添加親本mAb后獲得的信號(hào)；淺灰色峰添加IgGl同種型后獲得的信號(hào))。4.sctbds[19X16X19]和雙特異性(bs)scFvds[19X16]結(jié)合活性的比較。(A)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)獲得的sctbds[19X16X19](左)和bsscFvds[19X16](右)的平衡結(jié)合曲線。將增加濃度的sctb和bsscFv添加至⑶19陽(yáng)性SEM(實(shí)心黑色方形)或添加至⑶16-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(空心灰色三角形)并用抗His抗體檢測(cè)。通過(guò)Langmuir/Scatchard算法計(jì)算Kd值。(B)⑶19mAb4G7結(jié)合至SEM細(xì)胞的濃度依賴(lài)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)到隨著抑制劑sctbds[19X16X19](實(shí)心黑色方形)或bsscFvds[19X16](空心灰色三角形)濃度的增加，mAb4G7結(jié)合降低。對(duì)于抑制劑的每個(gè)濃度，計(jì)算產(chǎn)生的抑制百分比。(C)體外細(xì)胞表面保留。分別用sctbds[19X16X19](實(shí)心黑色方形)或bsscFvds[19X16](空心灰色三角形)修飾SEM細(xì)胞并在37°C溫育。洗滌掉過(guò)量分子后，取出等分試樣并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)在指定時(shí)間點(diǎn)分析在細(xì)胞表面上保留的分子。*sctbds[19X16X19]^PbsscFvds[19X16]之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。圖5.通過(guò)將新鮮分離的MNC作為效應(yīng)細(xì)胞，sctbds[19X16X19]介導(dǎo)⑶19陽(yáng)性SEM靶細(xì)胞的有效裂解。(A)ADCC誘導(dǎo)是⑶19特異的和⑶16-依賴(lài)的。以InM的濃度，以效應(yīng)子與靶(ET)細(xì)胞比例為40Lsctbds[19X16X19]誘導(dǎo)特異性裂解。非相關(guān)對(duì)照sctb和親本mAb4G7(⑶19)和3G8(⑶16)均不能以等摩爾濃度單獨(dú)誘導(dǎo)顯著裂解。通過(guò)添加125倍摩爾過(guò)量的親本mAb4G7或3G8，ADCC被競(jìng)爭(zhēng)性抑制，但不能被相應(yīng)過(guò)量的IgGl同種型競(jìng)爭(zhēng)性抑制。(B)以InM的濃度，在寬范圍的ET比例，sctbds[19X16X19]誘導(dǎo)顯著ADCC，以及隨著ET比例的增加，特異性裂解的程度增加(黑條sctbds[19X16X19]；灰條對(duì)照sctb；白條無(wú)抗體)。以裂解平均百分比士平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)提供數(shù)據(jù)，其從至少三個(gè)不同健康的供體中分離的MNC獲得。*與不添加抗體的對(duì)照比較，ADCC具有的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。#與單獨(dú)添加sctbds[19X16X19]比較，ADCC具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。圖6.由sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系的ADCC的劑量依賴(lài)誘導(dǎo)。⑶19陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系SEM(A)、BV-173⑶和ARH-77(C)作為靶以401的恒定ET細(xì)胞比例來(lái)比較sctb和bsscFv的效力。sctbds[19X16X19](實(shí)心黑色方形)和bsscFvds[19X16](空心灰色三角形)以劑量依賴(lài)的方式觸發(fā)ADCC。非相關(guān)對(duì)照sctb(實(shí)心黑色圓形)和非相關(guān)對(duì)照bsscFv(空心灰色圓形)均不能誘導(dǎo)顯著殺傷。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表裂解的平均百分比士SEM，其從至少六個(gè)不同健康的供體中分離的MNC獲得。*與不添加抗體的對(duì)照比較，ADCC具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。#由sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]誘導(dǎo)的殺傷之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。圖7.由sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]對(duì)CD19陽(yáng)性原代淋巴瘤細(xì)胞和白血病母細(xì)胞的有效裂解。(A)用sctbds[19X16X19](黑條)和bsscFvds[19X16](白條)以InM的濃度，使用來(lái)自健康供體的MNC，以401的ET比例，來(lái)裂解來(lái)自外周血(PB)的惡性細(xì)胞或來(lái)自九名B-CLL患者、來(lái)自一名MCL和一名B-ALL患者的骨髓(BM)。非相關(guān)sctb(深灰條)或MNC單獨(dú)(淺灰條)不能誘導(dǎo)裂解。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表三次測(cè)定的平均值，誤差棒代表SEM。(B)利用B-CLL患者1_4的細(xì)胞作為靶向，以401的ET比例的劑量反應(yīng)曲線。sctbds[19X16X19](實(shí)心黑色方形)誘導(dǎo)裂解，其具有低于bsscFvds[19X16](空心灰色三角形)10-至20倍的EC5tl值。在非相關(guān)對(duì)照sctb(空心圓形)沒(méi)有觀察到顯著裂解。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示裂解的平均百分比士SEM，其從至少三個(gè)不同健康的供體中分離的MNC獲得。*與不添加抗體的對(duì)照比較，ADCC具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。#由％讓ds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]誘導(dǎo)的殺傷之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。圖8.體內(nèi)血漿保留時(shí)間。將sctbds[19X16X19](實(shí)心黑色方形)和bSSCFvdS[19X16](空心灰色三角形)分別靜脈注射至NOD-SCID小鼠。在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠取血并使用⑶19陽(yáng)性SEM(A)和⑶16-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(B)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析血清是否存在免疫反應(yīng)性sctb和bsscFv。*在sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]的殘余結(jié)合之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。圖9.37°C體外血清穩(wěn)定性。在37°C在人血清中將sctbds[19X16X19](實(shí)心黑色方形)溫育幾個(gè)時(shí)間段。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CD19和CD16結(jié)合部分的殘余結(jié)合能力。(A)對(duì)CD19陽(yáng)性SEM細(xì)胞的殘余結(jié)合。(B)對(duì)CD16-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的殘余結(jié)合。圖10.sctb[33Xdsl6X33]的構(gòu)建和表達(dá)。(A)sctb[33Xdsl6X33]的設(shè)計(jì)。兩個(gè)末端scFv對(duì)骨髓腫瘤抗原CD33具有特異性，中央scFv針對(duì)NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的激活觸發(fā)分子⑶16。CMV，巨細(xì)胞病毒即刻早期啟動(dòng)子；IgK^^IgκL鏈的分泌前導(dǎo)序列；VL>VH,編碼IgL-或H-鏈的V區(qū)的cDNA序列；L，編碼20個(gè)氨基酸柔性接頭(Gly4Ser)4的cDNA；Strep,c_myc、6XHis，編碼str印、c-myc或六組氨酸標(biāo)記的cDNA；S-S，穩(wěn)定的二硫鍵。在用Ni-NTA瓊脂糖珠進(jìn)行親和層析后，評(píng)價(jià)sctb[33Xdsl6X33]的完整性和純度，其通過(guò)還原SDS-PAGE和用考馬斯藍(lán)染色(B)并使用用于檢測(cè)的抗his抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析(C)。圖11.bsscFv[33Xdsl6]的構(gòu)建和表達(dá)。(A)bsscFv[33Xdsl6]的設(shè)計(jì)。N-末端scFv特異性針對(duì)腫瘤抗原CD33，C-末端scFv針對(duì)NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的激活觸發(fā)分子CD16。CMV，巨細(xì)胞病毒即刻早期啟動(dòng)子；Igκ，鼠IgκL鏈的分泌前導(dǎo)序列八、Vh,編碼IgL-或H-鏈的V區(qū)的cDNA序列；L，編碼20個(gè)氨基酸柔性接頭(Gly4Ser)4的cDNA；Strep,c_myc、6XHis，編碼str印、c-myc或六組氨酸標(biāo)記的cDNA；S-S，穩(wěn)定的二硫鍵。在用Ni-NTA瓊脂糖珠進(jìn)行親和層析后，評(píng)價(jià)bsscFv[33Xdsl6]的完整性和純度，其通過(guò)還原SDS-PAGE和用考馬斯藍(lán)染色(B)并使用用于檢測(cè)的抗his抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析(C)。圖12.sctb[33Xdsl6X33]特異性地并同時(shí)結(jié)合各自抗原。(A)經(jīng)由熒光分析檢測(cè)到sctb[33Xdsl6X33]對(duì)CD33陽(yáng)性HL-60細(xì)胞(i)、CD16-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(ii)以及⑶33和⑶16抗原陰性SEM細(xì)胞(iii)的特異性結(jié)合(灰色峰對(duì)照sctb的信號(hào)；白色峰sctb[33Xdsl6X33]的信號(hào))。(B)同時(shí)結(jié)合CD16和CD33。將CD16-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞與sctb[33Xdsl6X33]溫育并通過(guò)添加由⑶33的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和DsRed組成的融合蛋白(CD33ex-DsRed)顯示同時(shí)結(jié)合(灰色峰對(duì)照sctb的信號(hào)；白色峰sctb[33Xds16X33]的信號(hào))。圖13.對(duì)照蛋白bsscFv[33Xdsl6]]特異性地并同時(shí)結(jié)合各自靶抗原。(A)經(jīng)由熒光分析檢測(cè)到bsscFv[33Xdsl6]對(duì)CD33陽(yáng)性HL-60細(xì)胞(i)、CD16_轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(ii)和CD33和CD16抗原陰性SEM細(xì)胞(iii)的特異性結(jié)合(灰色峰對(duì)照bsscFv的信號(hào)；白色峰sctb[33Xdsl6]的信號(hào))。(B)同時(shí)結(jié)合CD16和CD33。將⑶16-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞與bsscFv[33Xdsl6]溫育并通過(guò)添加由⑶33的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和DsRed組成的融合蛋白(CD33eX-DSRed)顯示同時(shí)結(jié)合(灰色峰對(duì)照bsscFv的信號(hào)；白色峰:bsscFv[33Xdsl6]的信號(hào))。圖14.sctb[33Xdsl6X33]和bsscFv[33Xdsl6]的平衡結(jié)合曲線。經(jīng)由流式細(xì)胞術(shù)獲得平衡結(jié)合曲線。將CD33陽(yáng)性HL-60細(xì)胞(左)或CD16-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(CH016-10)(右)與增加濃度的抗體片段溫育并用抗His抗體檢測(cè)。通過(guò)Langmuir/Scatchard算法計(jì)算Kd值(Benedict等，1997)。(A)sctb[33Xdsl6X33]，(B)bsscFv[33Xdsl6]。圖15.由sctb[33Xdsl6X33]和bsscFv[33Xdsl6]進(jìn)行的ADCC劑量依賴(lài)的誘導(dǎo)。將⑶33陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系HL-60作為靶以401的恒定ET細(xì)胞比例來(lái)比較sctb和bsscFv的效力。sctb[33Xdsl6X33](實(shí)心方形)和bsscFv[33Xdsl6](空心方形)以劑量依賴(lài)的方式觸發(fā)ADCC。非相關(guān)對(duì)照sctb(實(shí)心圓形)和非相關(guān)對(duì)照bsscFv(空心圓形)均不誘導(dǎo)顯著殺傷。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示裂解的平均百分比士SEM，其從八個(gè)不同健康的供體中分離的MNC獲得。*與各自同種型抗體比較，ADCC具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。#由％讓ds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]誘導(dǎo)的殺傷之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。實(shí)施例1串聯(lián)ScFv三聯(lián)體(三鏈抗體)的構(gòu)建單鏈Fv三聯(lián)體(三鏈抗體；sctb)由具有串聯(lián)連接的三個(gè)scFv的一條單多肽鏈組成(圖1)。優(yōu)選地末端scFv可對(duì)任何腫瘤抗原具有特異性，中央scFv對(duì)效應(yīng)細(xì)胞上的任何觸發(fā)分子，例如NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的⑶16(FeyRIII)具有特異性。其他排列也是可能的，以使末端scFv的其中一個(gè)可針對(duì)效應(yīng)細(xì)胞上的抗原，而其他兩個(gè)scFv對(duì)在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原具有特異性。為了產(chǎn)生重組串聯(lián)單鏈Fv三聯(lián)體(sctb)的形式，三個(gè)scFv——其中每個(gè)包括可變輕鏈和可變重鏈，經(jīng)由20aa接頭連接(Krebber等，1997)——必須用柔性接頭(例如20aa(G4S)4)融合在一起。對(duì)于串聯(lián)單鏈Fv三聯(lián)體(三鏈抗體)的構(gòu)建，必須將多克隆位點(diǎn)(MCS)連接至合適的表達(dá)載體，例如使用適合的限制位點(diǎn)，連接至真核表達(dá)載體pSecTag2HygroC(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)。該多克隆位點(diǎn)和產(chǎn)生的載體必須提供用于三個(gè)scFv插入的限制位點(diǎn)、接頭序列、用于純化和檢測(cè)的標(biāo)記(例如6XHis，Strep；c-myc)、分泌前導(dǎo)(例如IgK鏈前導(dǎo)序列)以及在選擇系統(tǒng)中用于表達(dá)所必需的元件，對(duì)于真核表達(dá)，例如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和多聚腺苷化信號(hào)。抗性盒(例如潮霉素C)將有助于產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)細(xì)胞系。上述載體可以是遺傳改造的，因?yàn)榈谝籹cFv可插入作為SfiI盒，第二scFv作為Notl/Xhol盒以及第三scFv作為KasI/EcoRV盒。使用其他限制酶也是可能的。然后，每個(gè)scFv可被另一個(gè)scFv替換，其提供不同特異性的scFv快速重組的系統(tǒng)(圖1)。如必要，應(yīng)使用二硫鍵穩(wěn)定的scFv變體以獲得在37°C的高血清穩(wěn)定性。在該形式中，針對(duì)腫瘤抗原例如⑶19的兩個(gè)scFv可與針對(duì)效應(yīng)子抗原例如⑶16的scFv組合，產(chǎn)生sctb[19X16X19]。如必要，可使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增各自scFv，從而使用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法引入將它們克隆至載體所需的限制位點(diǎn)(Sambrook&RusseldOOl)。實(shí)施例2串聯(lián)SCFv三聯(lián)體(三鏈抗體)的表達(dá)和純化在使用包括氯喹的磷酸鈣技術(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，各自串聯(lián)scFv三聯(lián)體可在真核細(xì)胞中表達(dá)，例如293T細(xì)胞(Sambrook&RusseldOOl)。優(yōu)選地，生產(chǎn)細(xì)胞系通過(guò)用編碼該串聯(lián)scFv三聯(lián)體的線性化的(例如酶Fspl，用于載體pSecTag2Hygr0C的衍生物)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生。可通過(guò)例如200μg/ml潮霉素C(CarlRoth,Karlsruhe,Germany)選擇陽(yáng)性克隆并隨后可被單一化。對(duì)于表達(dá)，可在永久選擇下在小-PERM生物反應(yīng)器(GreinerBio-One,Frickenhausen,Germany)中根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)用12.5kDa的透析膜培養(yǎng)單克隆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞。含有重組蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基通常必須在兩周的時(shí)間段中收集4次并在4°C以4000倍過(guò)量的含有50mMNaH2P04、300mMNaClUOmM咪唑、pH8.0的緩沖液透析。通過(guò)例如用鎳-氨三乙酸(Ni-NTA)瓊脂糖珠(Qiagen)經(jīng)親和層析可純化重組標(biāo)記的蛋白質(zhì)并最終用PBS透析。使用標(biāo)準(zhǔn)方法(Laemmli，1970)通過(guò)還原十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)可分析洗脫的蛋白質(zhì)(例如sctb[19X16X19])。用考馬斯亮藍(lán)R250(Sigma-Aldrich,Taufkirchen,Germany)染膠，顯示大約Mr=80_95kDa的蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)印跡分析中，可使用針對(duì)各自標(biāo)記的抗體來(lái)檢測(cè)串聯(lián)scFv三聯(lián)體(三鏈抗體)，例如使用非結(jié)合的五-His抗體(Qiagen，HildemGermany)和次級(jí)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(Dianova，Hamburg,Germany)抗體，或使用HRP結(jié)合的Str印標(biāo)簽抗體(IBA，Goettingen,Germany)。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光劑(AmershamPharmaciaBiotech,Freiburg,Germany)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。該純化的sctb可例如用于下列實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3抗體平衡常數(shù)(Kd-值)的測(cè)定為了評(píng)估第二靶細(xì)胞scFv的摻入是否導(dǎo)致親和性/親和力的增加，可測(cè)定抗體平衡常數(shù)(Kd值；獲得半最大結(jié)合的抗體濃度)。這些可如前所述通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量(Benedict等，1997；Bruenke等，2004)。應(yīng)使用CellQuest軟件(BectonDickinson,Heidelberg,Germany)，在FACSCalibur設(shè)備上進(jìn)行免疫熒光染色。簡(jiǎn)言之，在冰上將腫瘤抗原陽(yáng)性細(xì)胞，例如⑶19陽(yáng)性SEM細(xì)胞(Greil等，1994)與增加濃度的重組抗體片段溫育。洗滌后，可使用適合的抗體例如五-His抗體和藻紅蛋白(PE)-結(jié)合的山羊抗小鼠IgG(DAK0DiagnosticaGmbH,Hamburg,Germany)檢測(cè)抗體片段。對(duì)每個(gè)樣本收集1XIO4個(gè)細(xì)胞并使用適合的散射門(mén)分析全部細(xì)胞以排除細(xì)胞碎片和聚集。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次并在將最大熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化至100%后，用GraphPad軟件(GraphPadsoftwareInc.,SanDiego,CA,USA),使用非線性衰退曲線擬合，進(jìn)行數(shù)值和繪圖分析。應(yīng)以平均值士平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)報(bào)道各組數(shù)據(jù)。使用未配對(duì)Student'st-試驗(yàn)分析Kd值之間的差異。P-值<0.05被認(rèn)為是顯著的。同樣地，可測(cè)量對(duì)效應(yīng)細(xì)胞抗原，例如⑶16的親和性。在這些實(shí)驗(yàn)中，將串聯(lián)scFv三聯(lián)體與單價(jià)常規(guī)bsscFv(Bruenke等，2004)比較，其中單價(jià)常規(guī)bsscFv由用于串聯(lián)scFv三聯(lián)體構(gòu)建的相同scFv組成，例如一個(gè)⑶19-和一個(gè)⑶16-定向的scFv，其源自相同雜交瘤。如果腫瘤細(xì)胞定向的結(jié)合部分均是功能性的并促進(jìn)抗原結(jié)合，那么與它的單價(jià)負(fù)體相比，串聯(lián)scFv三聯(lián)體應(yīng)具有對(duì)腫瘤細(xì)胞更高的親和性/親和力并應(yīng)顯示低納摩爾范圍內(nèi)的Kd值。優(yōu)選地，另外scFv的附加N-或C-末端融合應(yīng)不改變對(duì)效應(yīng)細(xì)胞抗原例如CD16的親和性。對(duì)于效應(yīng)細(xì)胞抗原，串聯(lián)scFv三聯(lián)體應(yīng)顯示與腫瘤細(xì)胞抗原相比4至6倍高的Kd值。因此，該分子的親和性/親和力將有望向白血病細(xì)胞移動(dòng)，如所期望的。實(shí)施例4與相應(yīng)的雙特異性抗體bsscFv相比，串聯(lián)scFv三聯(lián)體(三鏈抗體)的效力。關(guān)于效應(yīng)細(xì)胞例如單核細(xì)胞(MNCs)的抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒性(ADCC)誘導(dǎo)，可將串聯(lián)scFv三聯(lián)體與bsscFv平行比較。用健康供體的MNC和腫瘤衍生的抗原陽(yáng)性細(xì)胞系進(jìn)行ADCC分析，其進(jìn)行三個(gè)重復(fù)，通過(guò)3-小時(shí)51Chr釋放分析如所述進(jìn)行(Elsasser等1996)。以401的恒定效應(yīng)子與靶(ET)的比例，以幾個(gè)等摩爾5倍連續(xù)稀釋將抗體衍生物添加至樣本，在用Graph-PadPrism軟件通過(guò)非線性回歸曲線擬合減去背景裂解后，計(jì)算EC5tl值(產(chǎn)生最大獲得的腫瘤細(xì)胞裂解50%的抗體衍生物濃度)。以至少4不同實(shí)驗(yàn)的平均值士SEM報(bào)道各組數(shù)據(jù)。使用配對(duì)Student'st_試驗(yàn)分析各組之間的差異。P-值<0.05被認(rèn)為是顯著的。串聯(lián)scFv三聯(lián)體能夠以劑量依賴(lài)方式，以皮摩爾范圍的EC5tl值誘導(dǎo)ADCC并裂解至少三種不同腫瘤衍生的細(xì)胞系，例如SEM。在相同條件下，bsscFv抗體也應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞裂解，但是其效力被認(rèn)為是相當(dāng)?shù)偷摹Ｓ?jì)算的EC5tl值被期望顯著提高并可以是高30至40倍。如果相應(yīng)的數(shù)據(jù)被實(shí)驗(yàn)證實(shí)，那么其明確地說(shuō)明在相同實(shí)驗(yàn)條件下，與bsscFv相比，串聯(lián)scFv三聯(lián)體應(yīng)顯示優(yōu)異的裂解活性。實(shí)施例5:材料和方法細(xì)胞系和雜交瘤用人⑶16AcDNA表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞來(lái)自J.vandeWinkelffi(UniversityMedicalCentre,Utrecht,TheNetherlands)。4G7(CD19，mlgGl；Meeker等，1984)來(lái)自R.Levy博士(StanfordUniversity,PaloAlto,CA,USA)雜交瘤3G8(FcgRIII、CD16，mIgGl；Fleit等，1982)來(lái)自美國(guó)典型細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas,VA,USA)。CHO細(xì)胞、雜交瘤和B-前體ALL衍生的細(xì)胞系SEM(Greil等，1994)、EBV-轉(zhuǎn)化的B-類(lèi)淋巴母細(xì)胞系A(chǔ)RH-77(ATCC),T-ALL衍生的細(xì)胞系CEM(ATCC)和前-B表型的細(xì)胞系BV-173(GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures,DSMZ,Braunschweig,Germany)和ML-衍生的細(xì)胞系HL-60(ATCC)培養(yǎng)在RoswellParkMemorialInstitute(RPMI)1640Glutamax-I士音中(Invitrogen,Karlsruhe,Germany),10%胎牛血清(FCS；Invitrogen)、100單位/ml青霉素(Invitrogen)和100μg/ml鏈霉素(Invitrogen)。人胚胎腎293T細(xì)胞(ATCC)培養(yǎng)在Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEM)Glutamax-I培養(yǎng)基(Invitrogen)中，其添加10%FCS、分別為100單位/ml和100μg/ml的青霉素和鏈霉素。重組串聯(lián)scFv三聯(lián)體(scFv三聯(lián)體或三鏈抗體；sctb)和融合蛋白的構(gòu)建#KλJff(Escherichiacoli)胃^XL-Iblue(Stratagene,Amsterdam,TheNetherlands)用作宿主用于質(zhì)粒的擴(kuò)增和克隆。為了產(chǎn)生sctbds[19X16X19]的表達(dá)載體，將編碼⑶19scFv的二硫鍵穩(wěn)定的(ds)變體的cDNA從載體pSecTag2HygroC-Strep-dsCD194G7xdsCD16(Bruenke等，2005)上切除并以SfiI盒克隆至載體pSecTag2HygroC(Invitrogen)的衍生物，產(chǎn)生載體pSecTag2HygroC-Strep-dsl90為了構(gòu)建pSecTag2HygroC-Strep-dsl9xdsl6xdsl9,從pSecTag2HygroC_Step-dsCD194G7xdsCD16通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼scFvdsCD16和scFvdsCD19的序列，并分別使用NotI/XhoI和Xhol/Agel限制位點(diǎn)連接至PSecTag2HygroC-Str印_dsl9。使用等同限制位點(diǎn)，通過(guò)用編碼CD7scFvTH69的序列替代CD19scFv的編碼序列，構(gòu)建表達(dá)載體pSecTag2HygroC-Strep-7xdsl6x7(Peipp等，2002)。用于對(duì)照bsscFv[7Xdsl6]的表達(dá)載體——pSecTag2HygroC-Strep7xdsl6,通過(guò)用作為SfiI片段的編碼scFvTH69的序列替代在pSecTag2HygroC-StrepdsCD194G7xdsCD16中編碼CD19scFv的序列而產(chǎn)生。為了構(gòu)建sCtb[33Xdsl6X33]的表達(dá)載體，將CD33scFv的編碼序列從載體ρet27b(+)-Strep-HiS-CD33-ETA-KDEL(Schwemmlein等，2006)上切除并以SfiI盒克隆至載體pSecTag2HygroCStr印-dsl9xdsl6xdsl9，替代N-末端CD19scFv的編碼序列，并產(chǎn)生pSecTag2HygroCStrep33Xdsl6xdsl9。為了產(chǎn)生載體pSecTag2HygroC_Strep33Xds16X33，從pet27b(+)-Strep-HiS-CD33-ETA-KDEL通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼CD33scFv的序列，并使用XhoI/EcoRV限制位點(diǎn)，連接至PSecTag2HygroCStr印33Xdsl6xdsl9，替代C-末端CD19scFv的編碼序列。通過(guò)用作為SfiI片段的編碼CD33scFv的序列來(lái)替代在pSecTag2HygroC_Str印dsCD194G7xdsCD16中編碼dsCD19scFv的序列，產(chǎn)生對(duì)照bsscFv[33Xdsl6]的表達(dá)載體，pSecTag2HygroC-Strep33Xds16。為了構(gòu)建CD33ex_DsRed融合蛋白的表達(dá)載體，從載體pSecTag-ChCD33_Fc通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼CD33細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA(Schwemmlein等，2006)，并作為Sfil盒連接至載體pSEC標(biāo)記Hygro-DsRed(Peipp等，2003)。為了證實(shí)正確的構(gòu)建，在AppliedBiosystemsautomatedDNA測(cè)序儀(ABIPrism310GeneticAnalyzer；Perkin-Elmer,Ueberlingen,Germany)上對(duì)最終構(gòu)建體進(jìn)行測(cè)序(Sambrook和Russel，2001)。重組抗體片段和融合蛋白的表達(dá)和純化為了表達(dá)重組單鏈Fv三聯(lián)體sctbds[19X16X19]、sctb[33Xdsl6X33]和sCtb[7Xdsl6X7]，使用包括氯喹的磷酸鈣技術(shù)，用各自表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(Sambrook和RUSSel，2001)。在使用被限制酶Fspl線性化的各自載體轉(zhuǎn)染后，獲得每個(gè)構(gòu)建體的穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系。在存在200iig/ml潮霉素B(Roth，Karlsruhe,Germany)的情況下，選擇陽(yáng)性克隆，并通過(guò)有限稀釋分離單個(gè)細(xì)胞克隆。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)上清液中抗體片段的存在進(jìn)行分析。對(duì)于高級(jí)表達(dá)，可在永久選擇下在小-PERM生物反應(yīng)器(GreinerBio-One,Frickenhausen，Germany)中根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)，使用具有對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)彡12.5kDa的孔徑的膜培養(yǎng)細(xì)胞克隆，并對(duì)含有重組蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基在兩周的時(shí)間段中收集4次。通過(guò)用鎳-氨三乙酸(Ni-NTA)瓊脂糖珠(Qiagen)經(jīng)親和層析純化重組His標(biāo)記的蛋白質(zhì)，如所述(Bruenke等，2005)，并最終用磷酸緩沖鹽(PBS)透析。在相同條件下，平行產(chǎn)生和純化用作對(duì)照的相應(yīng)的雙特異性scFv片段:bsscFvds[19X16]、bsscFv[33Xdsl6]和bsscFv[7Xdsl6]。將與綠色熒光蛋白(GFP)和紅色熒光蛋白質(zhì)DsRed的融合蛋白在293T細(xì)胞中表達(dá)并純化，如前所述(Bruenke等，2004)。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行SDS-PAGE(Sambrook和Russel，2001)。在蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中，用對(duì)Str印標(biāo)記具有特異性的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-結(jié)合的抗體(IBA，Goettingen,Germany)或非結(jié)合的五-His抗體(Qiagen,Hilden，Germany)以及次級(jí)HRP-偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG抗體(Dianova，Hamburg,Germany)檢測(cè)重組蛋白。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光劑(AmershamPharmaciaBiotech,Freiburg,Germany)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。流式細(xì)胞分析如所述，使用CellQuest軟件(BectonDickinson,Heidelberg,Germany)在FACSCalibur設(shè)備上進(jìn)行免疫熒光分析(Bruenke等，2004)。簡(jiǎn)言之，對(duì)每個(gè)樣本收集IX104個(gè)細(xì)胞并使用適合的散射門(mén)分析全部細(xì)胞以排除細(xì)胞碎片和聚集。使用五-His抗體和藻紅蛋白(PE)-結(jié)合的山羊抗小鼠IgG抗體(DAK0DiagnosticaGmbH,Hamburg,Germany)檢測(cè)重組抗體片段，除非另有說(shuō)明。平衡常數(shù)(Kd)的測(cè)定如所述，使用基于流式細(xì)胞術(shù)的方法測(cè)定KD值(Bruenke等，2004；Benedict等，1997)。將最高平均熒光值設(shè)定為100%并將所有數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)4至7次并報(bào)告平均值。使用非線性回歸曲線擬合計(jì)算KD值。細(xì)胞表面保留分析在阻止抗原內(nèi)化的條件下，用公開(kāi)的方法進(jìn)行細(xì)胞表面保留分析(Adams，等，1998)。簡(jiǎn)言之，將4X106個(gè)CD19陽(yáng)性的SEM或CD16-轉(zhuǎn)染的CH0細(xì)胞在冰上與10ug/ml的sctbds[19X16X19]或bsscFvds[19X16]溫育lh。用12ml的冷FACS緩沖液(0.154M氯化鈉、10mM磷酸鈉、牛血清白蛋白、0.疊氮化鈉、pH7.2)將細(xì)胞洗滌兩次，然后通過(guò)離心收集。將細(xì)胞重懸于4mlFACS緩沖液并在37°C溫育。在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，再次洗滌細(xì)胞以去除解離的分子并重懸于FACS緩沖液。取出0.5X106細(xì)胞等分試樣，置于冰上5分鐘并再次洗滌。然后使用AlexaFluor555結(jié)合的抗-His抗體(Qiagen)，通過(guò)FACS檢測(cè)保留在細(xì)胞表面上的分子。將所有數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化至?xí)r間點(diǎn)、=100%。將實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次和報(bào)告平均值。然后，通過(guò)將數(shù)據(jù)擬合至單階指數(shù)衰減獲得細(xì)胞表面保留的半衰期值。競(jìng)爭(zhēng)性抑制分析在冰上將SEM細(xì)胞與以0.5iig/ml飽和濃度的單克隆抗體(mAb)4G7單獨(dú)溫育或在存在變化濃度的sctbds[19X16X19]或bsscFvds[19X16]作為抑制劑的情況下溫育。洗滌后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，用PE標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(DAKODiagnostica)在細(xì)胞上檢測(cè)mAb4G7。mAb4G7結(jié)合的相對(duì)抑制如下計(jì)算％抑制=[(不含抑制劑的％FI-含有抑制劑的％FI)/(不含抑制劑的％FI)]X100(FI，熒光強(qiáng)度)。將實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5次并報(bào)告平均值。使用S形劑量反應(yīng)曲線擬合計(jì)算IC5(I值(產(chǎn)生mAb4G7結(jié)合的50%抑制的抑制劑濃度)。從人供體分離MNC和惡性白血病和淋巴瘤細(xì)胞在得到正式同意并經(jīng)艾爾蘭根-紐倫堡大學(xué)倫理委員會(huì)(EthicsCommitteeoftheUniversityofErlangen-Nuremberg)批準(zhǔn)后，從健康的志愿者和白血病或淋巴瘤患者獲得檸檬酸緩沖的或肝素化的外周血(PB)和骨髓(BM)樣本。通過(guò)Lymphoflot(Biotest,Dreieich,Germany)Ficoll密度離心在Leukosep管(Greiner,Frickenhausen,Germany)中根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)富集MNC，并懸浮在RPMI1640Glutamax-I培養(yǎng)基中，其含有10%FCS和分別為100單位/ml和100ug/ml的青霉素和鏈霉素。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除法證實(shí)存活率，其超過(guò)95%。通過(guò)用PE-結(jié)合的CD19抗體(BDBiosciences，Heidelberg,Germany)染色，分析患者衍生樣本的CD19表達(dá)。用單克隆CD33小鼠抗體(DakoCytomation,Glostrup,Denmark)評(píng)估AML母細(xì)胞上CD33的表達(dá)，用多克隆PE-結(jié)合的山羊抗小鼠IgG抗體(DakoCytomation,Glostrup,Denmark)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。ADCC反應(yīng)使用來(lái)自健康供體的MNC作為效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行ADCC分析，其進(jìn)行三個(gè)重復(fù)，使用3小時(shí)51Cr釋放分析如所述進(jìn)行(Elsasser等，1996)。對(duì)于封閉實(shí)驗(yàn)，以125倍摩爾過(guò)量添加親本抗體4G7和3G8。以401的恒定效應(yīng)子與靶(ET)的比例，使用各自抗體片段的幾個(gè)等摩爾5倍連續(xù)稀釋?zhuān)涗泟┝糠磻?yīng)曲線。將MNC單獨(dú)誘導(dǎo)的背景裂解從每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)減去，并通過(guò)使用S形劑量反應(yīng)曲線擬合計(jì)算EC5(I值(產(chǎn)生50%的最大特異性裂解的抗體片段濃度)。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)4至7次并報(bào)告平均值。體外血清穩(wěn)定性的測(cè)量以2.5iig/ml的亞飽和濃度以總體積220ill在37°C在人血清中溫育sCtbds[19X16X19]。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定殘余結(jié)合活性。將時(shí)間點(diǎn)tQ設(shè)定為100%并將所有數(shù)據(jù)針對(duì)該值標(biāo)準(zhǔn)化。將實(shí)驗(yàn)進(jìn)行7次和報(bào)告平均值。從一階指數(shù)衰減曲線擬合計(jì)算每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的半衰期值。小鼠體內(nèi)血漿半衰期的測(cè)定根據(jù)聯(lián)邦和歐洲指導(dǎo)進(jìn)行動(dòng)物飼養(yǎng)和所有實(shí)驗(yàn)并已經(jīng)得到大學(xué)和政府機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)。N0D-SCID小鼠(雄性，12周，重量在20至25g之間，4只小鼠/組)接受靜脈注射200u1PBS總體積中0.7nmolsctbds[19X16X19](60ug)或bsscFvds[19X16](40ug)或單獨(dú)PBS。在各種時(shí)間點(diǎn)，獲取血液樣本(50-100u1)。使用BDMicrotainerSST管(BectonDickinson)制備血清并儲(chǔ)存在_20°C。使用CD19陽(yáng)性SEM和CD16-轉(zhuǎn)染的CH0細(xì)胞，用AlexaFluor555結(jié)合的抗五-His抗體(Qiagen)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血清中的保留的抗體片段的殘余免疫反應(yīng)水平。將在第一時(shí)間點(diǎn)(1分鐘)獲得的值設(shè)定為100%。使用一階指數(shù)衰減曲線擬合計(jì)算血漿半衰期。繪圖和統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPadPrism軟件(GraphPadSoftwareInc.，SanDiego,CA,USA)進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計(jì)分析。以平均值士平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)報(bào)道各組數(shù)據(jù)。使用未配對(duì)(或如果適合)或配對(duì)Student’st-試驗(yàn)分析各組之間的差異。P-值<0.05被認(rèn)為是顯著的。實(shí)施例6串聯(lián)scFv三聯(lián)體(三鏈抗體)sctbds[19X16X19]的構(gòu)建、表達(dá)和純化從以前公開(kāi)的二硫鍵-穩(wěn)定的對(duì)⑶19和⑶16具有特異性的scFv組分構(gòu)建sctbds[19X16X19](Bruenke等，2005，圖2A)。兩個(gè)末端scFv對(duì)淋巴腫瘤抗原CD19具有特異性，中央scFv對(duì)NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的觸發(fā)分子CD16具有特異性。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人293T細(xì)胞中產(chǎn)生sctbds[19X16X19]和用于比較的bsscFvds[19X16]，并通過(guò)親和層析從培養(yǎng)基中純化，其中細(xì)胞培養(yǎng)在小-PERM生物反應(yīng)器中。每種純化蛋白質(zhì)的產(chǎn)量在不同生產(chǎn)輪次中以每升培養(yǎng)基3-10mg范圍變化。在SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)中，sctbds[19X16X19]具有相應(yīng)于M,為大約90kDa的電泳遷移率，其與由它的序列預(yù)測(cè)的88.6kDa的值緊密一致(圖2B)。在非還原SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)有觀察免疫反應(yīng)降解產(chǎn)物(圖3C)和未檢測(cè)到共價(jià)蛋白質(zhì)聚集(數(shù)據(jù)未顯示)。將該純化的sctbds[19X16X19]用于下列實(shí)驗(yàn)實(shí)施例7:sctbds[19X16X19]的特異和同時(shí)抗原結(jié)合將sctbds[19X16X19]與未處理(intact)細(xì)胞上的CD19和CD16反應(yīng)，如它的特異性結(jié)合細(xì)胞的能力所表明，所述細(xì)胞分別表達(dá)這些抗原中的每種(圖3A)。為了排除蛋白質(zhì)制備物由分子的兩個(gè)亞群組成的可能性，其中每個(gè)亞群均能夠僅結(jié)合這些抗原其中之一，分析同時(shí)結(jié)合兩個(gè)抗原的能力(圖3B)。為獲得該效果，使用CD16細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和GFP之間的重組融合蛋白，稱(chēng)為⑶16ex-GFP，并為了比較，使用由⑶64細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和GFP組成的類(lèi)似融合蛋白，稱(chēng)為⑶64ex-GFP(Bruenke等，2005)。首先將⑶19陽(yáng)性白血病-衍生的SEM細(xì)胞與sctbds[19X16X19]溫育，然后與⑶16ex_GFP反應(yīng)。結(jié)果，觀察到強(qiáng)的細(xì)胞結(jié)合熒光信號(hào)，表明重組蛋白質(zhì)能夠同時(shí)結(jié)合細(xì)胞-結(jié)合的CD19和流動(dòng)相CD16ex。當(dāng)將CD7-陰性SEM細(xì)胞與類(lèi)似產(chǎn)生的對(duì)照sctb[7Xdsl6X7]或?qū)φ盏鞍證D64ex_GFP溫育時(shí)，沒(méi)有獲得熒光信號(hào)(數(shù)據(jù)未顯示)。在競(jìng)爭(zhēng)-結(jié)合實(shí)驗(yàn)中已建立結(jié)合特異性。當(dāng)添加過(guò)量的親本⑶19抗體mAb4G7或親本⑶16抗體mAb3G8時(shí)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度降低至基線水平，但是在添加非相關(guān)IgGl同種型對(duì)照后，信號(hào)沒(méi)有降低(圖3B)。實(shí)施例8:sctbds[19X16X19]與bsscFvds[19X16]結(jié)合能力的比較為了評(píng)估在sctb中針對(duì)靶細(xì)胞抗原的第二scFv-組分的摻入是否引起對(duì)⑶19親和力的增加，進(jìn)行三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。首先，測(cè)定sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]的平衡常數(shù)(Kd)。通過(guò)校準(zhǔn)的流式細(xì)胞術(shù)記錄兩個(gè)分子的平衡結(jié)合曲線，并衍生出Kd值(圖4A)。sctbds[19X16X19]對(duì)CD19具有13.0士1.2nM的總KD，而bsscFvds[19X16]的親和性比其低大約3倍:Kd=42.4士5.7nM(P=0.0048)。因此，完整sctbds[19X16X19]對(duì)⑶19的親和力比包含在bsscFvds[19X16]中的單價(jià)⑶19特異scFv的親和性高大約3倍，表明兩個(gè)⑶19特異scFv組分是功能性的并負(fù)責(zé)在未處理細(xì)胞上sctbds[19X16X19]對(duì)⑶19的總親和力。相反，⑶16特異的scFv的親和性保持不變，其與該組分是否在bsscFvds[19X16]中攜帶無(wú)關(guān)，其中僅其N(xiāo)-末端連接，或在ds[19X16X19]中，它在兩個(gè)末端被CD19scFvs連接。sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]對(duì)CD16的KD值分別為58.6士4.OnM禾口57.6士8.9nM(P=0.772)。因此，結(jié)合CD19的3倍增加是真實(shí)的親和力作用，并且在該形式中，兩個(gè)末端定位的⑶19特異的scFv必須貢獻(xiàn)于sctbds[19X16X19]對(duì)靶細(xì)胞表面抗原的總親和力。第二獨(dú)立實(shí)驗(yàn)提供對(duì)要求(聲稱(chēng))的另外的支持，所提要求為對(duì)于CD19，sctbds[19X16X19]具有比bsscFvds[19X16]更高的親和力。在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，首先將CD19陽(yáng)性SEM細(xì)胞與親本CD19抗體mAb4G7溫育，然后添加增加的量的sctbds[19X16X19]或bsscFvds[19X16]作為競(jìng)爭(zhēng)劑，并測(cè)定mAb4G7與細(xì)胞的殘余結(jié)合(圖4B)。sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]以濃度依賴(lài)方式競(jìng)爭(zhēng)性抑制mAb4G7的結(jié)合，通過(guò)添加450倍摩爾過(guò)量的sctbds[19X16X19]，將結(jié)合抑制到>95%。為了比較兩個(gè)構(gòu)建體，測(cè)定IC50值，即達(dá)到半最大抑制的濃度。sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]的IC5。值分別為81.3士1.2nM和287.5士1.3nM(P=0.013)。因此，為獲得半最大抑制，需要bsscFvds[19X16]的濃度高于sctbds[19X16X19]濃度大約3.5倍。該值非常接近親和力的3倍差異，因此，獨(dú)立測(cè)量互相證實(shí)并支持在sctbds[19X16X19]的總親和力上大約3倍的提高的要求(聲稱(chēng))。在第三獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，在37°C，測(cè)量在未處理的⑶19陽(yáng)性SEM細(xì)胞上sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]的細(xì)胞表面保留。在該實(shí)驗(yàn)中，在存在疊氮化鈉的情況下，分別用sctbds[19X16X19]或bsscFvds[19X16]修飾SEM細(xì)胞，以阻止內(nèi)化。通過(guò)離心去除過(guò)量的未結(jié)合分子，然后在37°C溫育細(xì)胞。在不同時(shí)間點(diǎn)，再次使細(xì)胞沉淀以去除釋放的分子并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定保留的細(xì)胞結(jié)合分子。在這些條件下，bsscFvds[19X16]以保留t1/2為7.7士0.5分鐘從表面釋放，sctbds[19X16X19]以t1/2為51.5士2.9分鐘從表面釋放(P=0.006；圖4C)。在⑶16陽(yáng)性細(xì)胞上由⑶16產(chǎn)生的兩個(gè)構(gòu)建體之一的細(xì)胞表面保留未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。由CD16產(chǎn)生的bsscFv和sctbds[19X16X19]的保留t1/2值分別為14.5士1.9分鐘和15.5士1.2分鐘(P=0.848)?？傊?，這些三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)對(duì)兩個(gè)⑶19特異scFv組分均貢獻(xiàn)于sctbds[19X16X19]總親和力的結(jié)論提供強(qiáng)有力的支持。實(shí)施例9由sctbds[19X16X19]介導(dǎo)的白血病-衍生的細(xì)胞系的ADCC首先對(duì)pro-BALL衍生的細(xì)胞系SEM測(cè)量與來(lái)自健康的人供體的效應(yīng)細(xì)胞組合，sctbds[19X16X19]介導(dǎo)人白血病細(xì)胞的ADCC的能力。用來(lái)自不相關(guān)健康供體的新鮮制備的未刺激的MNC進(jìn)行ADCC反應(yīng)。結(jié)果，sctbds[19X16X19]介導(dǎo)有效腫瘤細(xì)胞裂解，但是對(duì)⑶7和⑶16具有特異性的對(duì)照sctb無(wú)效(圖5A；SEM細(xì)胞是⑶7-陰性)。而且，親本抗體mAb4G7(CD19)和MAb3G8(CD16)不能誘導(dǎo)ADCC。為了測(cè)試裂解的抗原特異性，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。125倍過(guò)量的親本mAb4G7或3G8的添加顯著降低靶細(xì)胞裂解程度(分別為P=0.011和0.004)，而非相關(guān)IgGl同種型抗體的添加沒(méi)有影響(P=0.45；圖5A)。因此，腫瘤細(xì)胞裂解是抗原特異的，并且sctbds[19X16X19]要求腫瘤細(xì)胞上的靶抗原與效應(yīng)細(xì)胞上的觸發(fā)分子之間特異的相互作用以介導(dǎo)它的裂解作用。另外，sctbds[19X16X19]通過(guò)ADCC以寬范圍的效應(yīng)子-對(duì)-靶細(xì)胞(ET)比例，從801至2.51范圍變化，來(lái)誘導(dǎo)靶細(xì)胞裂解(圖5B)。裂解程度隨ET比例以可飽和的方式增加，表明腫瘤細(xì)胞裂解對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的明確依賴(lài)性。該作用是抗原特異的，因?yàn)閷?duì)CD7具有特異性的類(lèi)似構(gòu)建的對(duì)照sctb不產(chǎn)生顯著裂解，即使在高ET比例也不產(chǎn)生。實(shí)施例10:與相應(yīng)的雙特異性抗體bsscFvds[19X16]相比，串聯(lián)scFv三聯(lián)體(三鏈抗體)sctbds[19X16X19]的效力。為研究sctbds[19X16X19]對(duì)CD19的親和力高于bsscFvds[19X16]對(duì)CD19的親和力是否與增強(qiáng)的細(xì)胞毒素潛能相關(guān)，對(duì)三個(gè)不同CD19陽(yáng)性腫瘤衍生的細(xì)胞系平行測(cè)量?jī)煞N分子介導(dǎo)ADCC的能力。選擇細(xì)胞系SEM、BV-173和ARH-77，原因在于它們代表不同的B-淋巴惡性腫瘤和B-淋巴成熟的不同階段。SEM細(xì)胞代表高危原B-ALL。BV-173代表具有混合譜系表型的B細(xì)胞前體白血病(⑶19和⑶33雙陽(yáng)性)，其通常具有較差的預(yù)后。ARH-77代表EBV陽(yáng)性B-類(lèi)淋巴母細(xì)胞系。所有三個(gè)系被sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]以濃度依賴(lài)方式有效消除(圖6)。在所有三種情況下，sctbds[19X16X19]比bsscFvds[19X16]更有效，但是即使在高濃度，CD7特異的對(duì)照sctb和bsscFv仍保持無(wú)效(圖6，A-C)。EC5。值顯示于表I中；sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]對(duì)于SEM細(xì)胞的EC5(1值分別為4.lpM和113.6pM。獲得的sctb的EC5(1值在低的皮摩爾范圍，其表明非常高的效價(jià)。重要地是，對(duì)于相同靶細(xì)胞系，在比bsscFvds[19X16]低27.7倍的濃度，sctbds[19X16X19]獲得相同的ADCC水平。類(lèi)似地，對(duì)于細(xì)胞系BV-173和ARH-77，sctbds[19X16X19]以比bsscFvds[19X16]低26.3倍和44.0倍的濃度產(chǎn)生半最大裂解，這表明sctb相對(duì)于bsscFv的親和力增加轉(zhuǎn)化為ADCC-潛能的顯著增加。表I采用MNCa，sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]對(duì)ADCC的EC5。值<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>aEC5tl值從顯示于圖6A-C和7B中的劑量反應(yīng)曲線推斷(Cl置信區(qū)間)。最后，在平行ADCC反應(yīng)中還測(cè)量?jī)煞N蛋白質(zhì)介導(dǎo)來(lái)自患者的新鮮惡性細(xì)胞的消除的能力(圖7)。為了該作用，從11名患者的外周血(PB)或骨髓(BM)中分離MNC。這些患者中的九名被診斷為患有B-CLL、一名被診斷為患有套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)、一名被診斷為患有B-ALL。將來(lái)自不相關(guān)健康供體的MNC用作效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)每個(gè)患者樣本提供一個(gè)供體。不進(jìn)行深思熟慮的的工作來(lái)匹配腫瘤細(xì)胞和供體的組織相容性類(lèi)型和殺傷細(xì)胞Ig樣受體(KIR)模式。以ET比例為401使用MNC并以濃度為InM使用sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]。對(duì)于所有i^一名患者,相對(duì)于對(duì)照反應(yīng)，sctbds[19X16X19]介導(dǎo)特異腫瘤細(xì)胞裂解程度的明顯增強(qiáng)，其中對(duì)照反應(yīng)不含有添加的抗體_衍生劑或含有非相關(guān)對(duì)照sctb(圖7A)。對(duì)于所有i^一個(gè)樣本，sctbds[19X16X19]均產(chǎn)生高于bssFvds[19X16]的特異靶細(xì)胞裂解。對(duì)于四名B-CLL患者(患者1_4)，在至少三個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中記錄劑量反應(yīng)曲線，對(duì)于每個(gè)患者樣本以401的ET比例使用來(lái)自至少三個(gè)不同健康供體的MNC。對(duì)于所有四名患者，在等摩爾濃度，sctbds[19X16X19]均介導(dǎo)顯著高于bsscFvds[19X16]的ADCC(圖7B)。所有四名患者的sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]的EC5tl值總結(jié)于表I中。在所有情況下，sctbds[19X16X19]在比bsscFvds[19X16]低大約11至21倍的濃度產(chǎn)生半最大裂解，其類(lèi)似于白血病_衍生的靶系觀察到的作用(圖6)。sctbds[19X16X19]的EC5tl值仍在低的皮摩爾范圍。在所有情況下，sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]之間裂解能力的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，其卩-值<0.05。這些結(jié)果明確地表明，sctb的該形式與各自bsscFv相比具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞裂解的優(yōu)異潛能。實(shí)施例11小鼠中sctbds[19X16X19]延長(zhǎng)的體內(nèi)血漿保留。另一個(gè)影響抗體-衍生的蛋白質(zhì)的治療值的重要參數(shù)是它們體內(nèi)血漿保留時(shí)間或血漿半衰期。為測(cè)量該參數(shù)，將等摩爾劑量的sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]分別靜脈注射至NOD-SCID小鼠。在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)獲得血漿樣本，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量對(duì)CD19陽(yáng)性SEM細(xì)胞上的CD19的殘余結(jié)合能力(圖8A)和對(duì)在CD16陽(yáng)性CHO-轉(zhuǎn)染子上的CD16的殘余結(jié)合能力(圖8B)。sctbds[19X16X19]和bsscFvds[19X16]的血漿保留時(shí)間(t1/2)分別為4h和2h，表明第二⑶19特異scFv摻入至sctb導(dǎo)致體內(nèi)血漿保留時(shí)間的加倍。實(shí)施例12在37°C測(cè)量體外血清穩(wěn)定性影響抗體-衍生的蛋白質(zhì)治療效力的一個(gè)重要因素是它們?cè)谌搜逯械姆€(wěn)定性。為測(cè)量該性質(zhì)，在37°C將純化的sctbds[19X16X19]在人血清中體外溫育，并通過(guò)FACS-分析分別測(cè)量在未處理細(xì)胞上與⑶19(圖9A)和⑶16(圖9B)的殘余結(jié)合。測(cè)定t1/2值。在這些條件下，sctbds[19X16X19]高度穩(wěn)定，其對(duì)結(jié)合⑶19和⑶16分別具有94.0士3.Ih和153.1士4.6h的、/2。因此，sctbds[19X16X19]具有比非穩(wěn)定的bsscFv[19X16]更高的穩(wěn)定性，非穩(wěn)定的bsscFv[19X16]對(duì)結(jié)合CD19和CD16的t1/2分別為18h和40h,如Bruenke等，2005中報(bào)道。實(shí)施例13:sctbds[33Xdsl6X33]和bsscFv[33Xdsl6]的構(gòu)建和表達(dá)從以前公開(kāi)的對(duì)CD33具有特異性的scFv組分(Schwemmlein等，2005)構(gòu)建sctb[33Xdsl6X33](圖10)和bsscFv[33Xdsl6](圖11)。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人293T細(xì)胞中產(chǎn)生sctbds[33Xdsl6X33]和用于比較的bsscFv[33Xdsl6]，其中細(xì)胞培養(yǎng)在小-PERM生物反應(yīng)器中。通過(guò)親和層析從培養(yǎng)基中純化重組蛋白質(zhì)。每種純化蛋白質(zhì)的產(chǎn)量在每升培養(yǎng)基2-6mg范圍內(nèi)變化。在SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)中，sctb[33Xdsl6X33]和bsscFv[33Xdsl6]具有相應(yīng)于虬分別為約90kDa和60kDa的電泳遷移率，其與從它們的序列計(jì)算的sctb[33Xdsl6X33]為86，5kDa(圖10)以及bsscFv[33Xdsl6](圖11)為59，8kDa的值緊密一致。實(shí)施例14:sctb[33Xdsl6X33]和bsscFv[33Xdsl6]的特異和同時(shí)抗原結(jié)合將sctb[33Xdsl6X33](圖12A)和bsscFv[33Xdsl6](圖13A)與未處理細(xì)胞上的骨髓腫瘤抗原⑶33和觸發(fā)分子⑶16反應(yīng)，如它能夠特異性結(jié)合分別表達(dá)這些抗原中的每種的細(xì)胞。為了證實(shí)蛋白質(zhì)能夠同時(shí)結(jié)合兩種抗原，首先將CD16陽(yáng)性細(xì)胞與sctb[33Xdsl6X33](圖12B)或bsscFv[33Xdsl6](圖13B)溫育，然后與由CD33細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和DsRed組成的融合蛋白⑶33eX-DSRed反應(yīng)。結(jié)果，觀察到強(qiáng)的紅色細(xì)胞結(jié)合熒光信號(hào)，表明重組蛋白質(zhì)能夠同時(shí)與細(xì)胞結(jié)合的CD16和流動(dòng)相CD33ex反應(yīng)。實(shí)施例15平衡常數(shù)測(cè)定為了評(píng)估在sctb中針對(duì)靶細(xì)胞抗原的第二scFv-組分的摻入是否引起對(duì)⑶33親和力的增加，測(cè)定sctb[33Xdsl6X33]和bsscFv[33Xdsl6]的平衡常數(shù)(Kd)。通過(guò)校準(zhǔn)的流式細(xì)胞術(shù)對(duì)兩種抗原記錄平衡結(jié)合曲線，由該平衡結(jié)合曲線得到兩種蛋白質(zhì)的Kd值(圖14)。Kd值總結(jié)于表II中。Sctb[33Xdsl6X33]和bsscFv[33Xdsl6]與CD33反應(yīng)，其Kd值分別為28.9士1.9nM禾口7.9士1.InM。因此，sctb[33Xdsl6X33]對(duì)CD33的親和力比bsscFv[33Xdsl6]中含有的CD33特異的scFv的親和性高大約3_4倍。這表明兩個(gè)CD33特異scFv部分是功能性的并負(fù)責(zé)結(jié)合在未處理細(xì)胞上的⑶33。相反，⑶16特異的scFv的親和性在相同范圍。sctb[33Xdsl6X33]和bsscFv[33Xdsl6]對(duì)CD16的Kd值分別為45.1士4.3nM和34.2士2.3nM。因此，在該形式中，兩個(gè)末端定位的⑶33特異的scFvs貢獻(xiàn)于sCtb[33Xdsl6X33]對(duì)腫瘤細(xì)胞上細(xì)胞表面抗原的總親和力。表II:bsscFv[33Xdsl6]和sctb[33Xdsl6X33]的平衡常數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>實(shí)施例16與相應(yīng)的雙特異性抗體bSSCFv[33XdS16]相比，串聯(lián)scFv三聯(lián)體(三鏈抗體)sctbds[33Xdsl6X33]的效力。為了分析sctb[33Xdsl6X33]對(duì)CD33的親和力高于bsscFv[33Xdsl6]對(duì)CD33的親和力是否引起增加的細(xì)胞裂解潛能，平行測(cè)量?jī)煞N抗體片段誘導(dǎo)ADCC的效力。將CD33陽(yáng)性早幼粒細(xì)胞白血病-衍生的腫瘤細(xì)胞系HL-60用作靶以比較sctb和bsscFv。以401的恒定ET細(xì)胞比例，將來(lái)自健康供體的MNC用作效應(yīng)細(xì)胞。Sctb[33Xdsl6X33]和bsscFv[33Xdsl6]以劑量依賴(lài)方式觸發(fā)ADCC，但是即使在高濃度，CD7特異的對(duì)照sctb和bsscFv仍保持無(wú)效。但是，sctb[33Xdsl6X33]比bsscFv[33Xdsl6]更有效(圖15)。sctb[33Xdsl6X33]和bsscFv[33Xdsl6]對(duì)HL-60細(xì)胞的EC5tl值分別為21pM禾Π174ρΜ(ρ=0，018)。重要的是，對(duì)于相同靶細(xì)胞系，sctb[33Xdsl6X33]以低于bsscFv[33Xdsl6]8倍的濃度產(chǎn)生半最大殺傷，這表明sctb相對(duì)于bsscFv的親和力增加轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒素潛能的顯著增加。參考文獻(xiàn)Ausubel,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenPublishingAssociatesandffileyInterscience,N.Y.(2001).AdamsGP,SchierR,McCallAM,CrawfordRS,WolfEJ,WeinerLM,MarksJD.ProlongedinvivotumourretentionofahumandiabodytargetingtheextracellulardomainofhumanHER2/neu.BrJCancer.1998；77:1405_1412·BarbinK,StieglmaierJ,SaulD,StieglmaierK,StockmeyerB,PfeifferM,LangP,FeyGH.InfluenceofvariableN-glycosylationonthecytolyticpotentialofchimericCD19antibodies.JImmunother(1997).2006；29122-133.BatraJK,KasprzykPG,BirdRE,PastanI,KingCR.Recombinantanti-erbB2immunotoxinscontainingPseudomonasexotoxin.ProcNatlAcadSciUSA.1992；89:5867_5871·BebbingtonCR,RennerG,ThomsonS,KingD,AbramsD,YarrantonGT.High-Ievelexpressionofarecombinantantibodyfrommyelomacellsusingaglutaminesynthetasegeneasanamplifiableselectablemarker.Bio/Technology1992；10:169-175.BenedictCA,MacKrellAJ,AndersonWF.Determinationofthebindingaffinityofananti_CD34single-chainantibodyusinganovel,flowcytometrybasedassay.JImmunolMethods.1997；201(2):223_31.BonnetDandDickJE.Humanacutemyeloidleukemiaisorganizedasahierarchythatoriginatesfromaprimitivehematopoieticcell.NatMed.1997；3(7):730-7.BraaschDAandCoreyDR.Lockednucleicacid(LNA):fine_tuningtherecognitionofDNAandRNA.ChemBiol.2001；8(1):1_7·BrinkmannU，LeeBKandPastanI.RecombinantImmunotoxinsContainingtheVHorVLDomainofMonoclonalAntibodyB3fusedtoPseudomonasExotoxin.J.Immunology.1993；150:2774_2782.BruenkeJ，BarbinK，KunertS，LangP，PfeifferM，StieglmaierK，NiethammerD，StockmeyerB，PeippM，ReppR，ValeriusTandFeyGH.Effectivelysisoflymphomacellswithastabilisedbispecificsingle-chainFvantibodyagainstCD19andFcγRIII(CD16).BritishJournalofHaematology.2005;130:218_228.BruenkeJ，F(xiàn)ischerB，BarbinK，SchreiterK，WachterY，MahrK，TitgemeyerF，NiederweisM，PeippM，ZuninoSJ,ReppR，ValeriusT，F(xiàn)eyGH.Arecombinantbispecificsingle-chainFvantibodyagainstHLAclassIIandFcgammaRI11(CD16)triggerseffectivelysisoflymphomacelIs.BritJHaematol.2004；125(2)167-79.BryderD，RossiDJ,WeissmanIL.HematopoieticStemCells.AmJPathol.2006；169(2):338_46.CarnahanJ，WangP，KendallR，ChenC，HuS，BooneT，JuanT，TalvenheimoJ，MontestruqueS，SunJ，ElliottG，ThomasJ，F(xiàn)erbasJ，KernB，BriddellR，LeonardJP,CesanoA.Epratuzumab,ahumanizedmonoclonalantibodytargetingCD22characterizationofinvitroproperties.ClinCancerRes.2003；9:3982S_3990S.CartronG，DacheuxL，SallesG，Solal-CelignyP，BardosP，ColombatP，WatierH.Therapeuticactivityofhumanizedanti_CD20monoclonalantibodyandpolymorphisminIgGFcreceptorFcgammaRIIIagene.Blood.2002；99754-758.CasasnovasRO，SlimaneFK，GarantR，F(xiàn)aureGC，CamposL,DeneysV，BernierM，F(xiàn)alkenrodtA,LecalvezG，MaynadieMandDeneMC.Immunologicalclassificationofacutemyeloplasticleukaemias:relevancetopatientoutcome.Leukemia.2003；17:515-527.CastorA，NilssonL，Astrand-GrundstromI，BuitenhuisM，RamirezC，AndersonK，StrombeckB，GarwiczS，BekassyAN，SchmiegelowK，LausenB，HoklandP，LehmannS，JuliussonG，JohanssonB，JacobsenSE.Distinctpatternsofhematopoieticstemcellinvolvementinacutelymphoblasticleukemia.NatMed.2005；11:630_637.CheungMC,HaynesAE，StevensA，MeyerRM,ImrieK.Yttrium90ibritumomabtiuxetaninlymphoma.LeukLymphoma.2006；47:967_977·ClynesRA,TowersTL,PrestaLG,RavetchJV.InhibitoryFcreceptorsmodulateinvivocytoxicityagainsttumortargets.NatMed.2000；6443-446.DaviesAJ.RadioimmunotherapyforB-celllymphoma:Y90ibritumomabtiuxetanandl(131)tositumomab.Oncogene.2007；26:3614_3628·dePalazzoIG,KitsonJ，Gercel-TaylorC，AdamsS，WeinerLM.BispecificmonoclonalantibodyregulationofFcgammaRill—directedtumorcytotoxicitybylargegranularlymphocytes.CellImmunol.1992；142:338_347·ElsasserD，ValeriusT，ReppR,WeinerGJ，DeoY，KaldenJR，vandeWinkelJG,StevensonGT,GlennieMJiGramatzkiM.HLAclassIIaspotentialtargetantigenonmalignantBcellsfortherapywithbispecificantibodiesincombinationwithgranulocytecolony-stimulatingfactor.Blood.1996;87:3803-12·ElyP，WallacePK，GivanAL，GrazianoRF，GuyrePM，F(xiàn)angerMW.Bispecific-armed,interferongamma-primedmacrophage-mediatedphagocytosisofmalIgnantnon-Hodgkinrslymphoma.Blood.1996；873813-3821.EyrichM，LangP，LalS，BaderP，HandgretingerR，KlingebielT，NiethammerD，SchlegelPG.Aprospectiveanalysisofthepatternofimmunereconstitutioninapaediatriccohortfollowingtransplantationofpositivelyselectedhumanleucocyteantigen-disparatehaematopoieticstemcellsfromparentaldonors.BrJHaematol.2001；114422-432.GhahroudiMA,DesmyterA，WynsL，HamersRandMuyldermansS.Selectionandidentificationofsingledomainantibodyfragmentsfromcamelheavy-chainantibodies.FEBSLetters1997;414:521-526.GlockshuberR，MaliaM，PfitzingerI，PluckthunA.AcomparisonofstrategiestostabilizeimmunoglobulinFv-fragments.Biochemistry.1990；291362-1367.GreilJ，GramatzkiM，BurgerR，MarschalekR，PeltnerM，TrautmannU，Hansen-HaggeTE,BartramCR.FeyGH,StehrK，etal.TheacutelymphoblasticleukaemiacelllineSEMwitht(4；11)chromosomalrearrangementisbiphenotypicandresponsivetointerleukin-7.BrJHaematol.1994；86(2):275_83·GrossbardML，PressOW,AppelbaumFR,BernsteinID，NadlerLM.Monoclonalantibody-basedtherapiesofleukemiaandlymphoma.Blood.1992；80863-878.HaagenΙΑ,vandeGriendR，ClarkM，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球蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的相同抗原。3.權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中(a)項(xiàng)和(b)項(xiàng)所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的不同抗原。4.權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的核酸分子，其中腫瘤干細(xì)胞上或腫瘤前體或祖細(xì)胞上表達(dá)的所述至少一種抗原是⑶19、⑶33、⑶13、⑶44var、⑶123、⑶96或CLL-I。5.權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的核酸分子，其中腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的并被(a)和(b)的所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合的所述抗原是⑶19和⑶33、⑶19和⑶13、⑶19和⑶123、⑶19和CD44var、CD19和MCSP、CD33和CD13、CD33和CD123、CD33和CD44var、CD33和CD96、CD33和CLL-I、CD13和CD123、CD13和CD44var、CD13和CD96、CD13和CLL_1、CD123和CD44var、CD123和CD96、CD123和CLL-1、CD44var和CD96、CD44var和CLL-1、或CD96和CLL-1。6.權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所述的核酸分子，其中被(c)的所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合的所述效應(yīng)細(xì)胞抗原是CD16(FeyRIIIa)、CD64(FeyRI)、NKG2D、ΝΚρ30、ΝΚρ44、ΝΚρ46、CD28、CD2或CD3。7.權(quán)利要求1至6任意一項(xiàng)所述的核酸分子，其中至少一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域包括至少一個(gè)能夠形成分子內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸殘基。8.權(quán)利要求1至7任意一項(xiàng)所述的核酸，其中所述核酸分子編碼至少一個(gè)接頭，其將至少一個(gè)Vh與\結(jié)構(gòu)域分離或?qū)⒅辽僖粋€(gè)\與Vh結(jié)構(gòu)域分離。9.權(quán)利要求8所述的核酸分子，其中所述接頭是至少5個(gè)氨基酸的肽接頭。10.權(quán)利要求8或9所述的核酸，其中如果存在多于一個(gè)接頭，所述接頭具有統(tǒng)一長(zhǎng)度。11.權(quán)利要求8或9所述的核酸，其中如果存在多于一個(gè)接頭，所述接頭具有不同長(zhǎng)度。12.權(quán)利要求10所述的核酸，其中所述接頭的氨基酸序列是相同的。13.權(quán)利要求10所述的核酸，其中所述接頭的氨基酸序列是不同的。14.權(quán)利要求1至7任意一項(xiàng)所述的核酸，其中在至少一個(gè)Vh和\結(jié)構(gòu)域之間或\和Vh結(jié)構(gòu)域之間不存在接頭。15.權(quán)利要求1至14任意一項(xiàng)所述的核酸，其編碼特異性結(jié)合CD19的兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和特異性結(jié)合⑶16(FeγRIIIa)的一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域.16.權(quán)利要求1至14任意一項(xiàng)所述的核酸，其編碼特異性結(jié)合CD33的兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和特異性結(jié)合⑶16(FeγRIIIa)的一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。17.權(quán)利要求1至16任意一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述多肽進(jìn)一步包括至少一個(gè)(多)肽。18.權(quán)利要求17所述的核酸分子，其中所述(多)肽是Str印-標(biāo)記、His-標(biāo)記、Myc-標(biāo)記、Flag-標(biāo)記、κ分泌前導(dǎo)區(qū)、人血清白蛋白(hsa)或其片段，能夠結(jié)合hsa或其他血清蛋白的肽；能夠結(jié)合新生兒Fc受體(FcRn)的肽、人肌肉醛縮酶(hma)或其片段、CD8鉸鏈區(qū)、免疫球蛋白恒定區(qū)、白細(xì)胞介素_2、白細(xì)胞介素-15和白細(xì)胞介素-18，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)，粒細(xì)胞刺激因子(G-CSF)或提供至少一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的肽。19.權(quán)利要求1至18任意一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述腫瘤細(xì)胞是白血病細(xì)胞。20.權(quán)利要求1至18任意一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述腫瘤干細(xì)胞是白血病干細(xì)胞。21.權(quán)利要求1至18任意一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述腫瘤前體或祖細(xì)胞是白血病前體或祖細(xì)胞。22.權(quán)利要求1至21任意一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述腫瘤是白血病或淋巴瘤。23.載體，其包括權(quán)利要求1至22任意一項(xiàng)所述的核酸分子。24.非人宿主，其用權(quán)利要求23所述的載體轉(zhuǎn)化。25.權(quán)利要求24所述的非人宿主，其中所述宿主是細(xì)胞。26.產(chǎn)生多肽的方法，其包括在合適的條件下權(quán)利要求25所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)以及產(chǎn)生的所述重組多肽的分離。27.多肽，其由權(quán)利要求1至22任意一項(xiàng)所述的核酸分子編碼或由權(quán)利要求26所述的方法產(chǎn)生。28.診斷組合物，其包括以下至少一個(gè)(a)權(quán)利要求1至22任意一項(xiàng)所述的核酸分子，(b)權(quán)利要求23所述的載體，或(c)權(quán)利要求27所述的多肽。29.藥學(xué)組合物，其包括(a)權(quán)利要求1至22任意一項(xiàng)所述的核酸分子，(b)權(quán)利要求23所述的載體，或(c)權(quán)利要求27所述的多肽。30.權(quán)利要求1至22任意一項(xiàng)所述的核酸分子，權(quán)利要求23所述的載體或權(quán)利要求27所述的多肽，用于腫瘤治療。31.腫瘤治療的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求1至22任意一項(xiàng)所述的核酸、權(quán)利要求23所述的載體或權(quán)利要求27所述的多肽，以便在所需要的患者中發(fā)揮所期望的作用。32.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述腫瘤是白血病或淋巴瘤.33.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述白血病是AML、CML、ALL、CLL非霍奇金淋巴瘤。全文摘要本發(fā)明涉及編碼多肽的核酸分子，其中所述多肽包括(a)第一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與VH結(jié)構(gòu)域連接的VL結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原；(b)第二免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與VH結(jié)構(gòu)域連接的VL結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原；以及(c)第三免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與VH結(jié)構(gòu)域連接的VL結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞抗原，其中所述效應(yīng)細(xì)胞選自NK細(xì)胞、T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；其中腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的并被(a)或(b)的所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合的至少一種所述抗原是在腫瘤干細(xì)胞上和/或腫瘤前體或祖細(xì)胞上表達(dá)的抗原；以及其中結(jié)合腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞抗原的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的比例是至少2∶1。此外，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明核酸分子的載體，用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化的非人宿主，產(chǎn)生多肽的方法，該方法包括在合適的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主并分離產(chǎn)生的多肽，以及由本發(fā)明的核酸分子編碼的或由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多肽。另外，本發(fā)明涉及用于治療腫瘤的診斷和藥學(xué)組合物以及方法。文檔編號(hào)C07K16/30GK101802010SQ200880105888公開(kāi)日2010年8月11日申請(qǐng)日期2008年7月10日優(yōu)先權(quán)日2007年7月10日發(fā)明者C·謝爾納,G·H·法伊,H·辛格,J·布倫克申請(qǐng)人:費(fèi)里德瑞奇亞歷山大大學(xué)