專(zhuān)利名稱(chēng)：：Ⅰ型和ⅱ型抗-cd20抗體的組合療法的制作方法I型和II型抗-CD20抗體的組合療法本發(fā)明涉及兩種不同的抗-CD20抗體用于制備用于治療癌癥，尤其是表達(dá)CD20的癌癥的藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：⑶20分子(也稱(chēng)為人B-淋巴細(xì)胞-限制性分化抗原或Bp35)是位于前-B淋巴細(xì)胞和成熟B淋巴細(xì)胞上的分子量約為35kD的疏水性跨膜蛋白(Valentine，Μ.Α.，等生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)264(19)(1989)11282-11287；和Einfield，D.Α.，等EMBOJ.7(3)(1988)711-717)。⑶20存在于超過(guò)90%的來(lái)自外周血或淋巴器官的B細(xì)胞的表面上并且在前B細(xì)胞發(fā)育的早期過(guò)程中表達(dá)，并且保持直到血漿細(xì)胞分化。CD20存在于正常B細(xì)胞以及惡性B細(xì)胞二者上。具體而言，⑶20在超過(guò)90%的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)上表達(dá)(Anderson,K.C.，等，血液(Blood)63(6)(1984)1424-1433)，但是不存在于造血干細(xì)胞，前B細(xì)胞，正常血漿細(xì)胞或其它正常組織(Tedder，Τ.F.，等，J，Immunol.(免疫學(xué)雜志)135(2)(1985)973-979)。CD20蛋白的85個(gè)氨基酸的羧基末端區(qū)域位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。該區(qū)域的長(zhǎng)度與其它B細(xì)胞特異性表面結(jié)構(gòu)如IgM，IgD，和IgG重鏈或Il類(lèi)組織相容性抗原α或β鏈的長(zhǎng)度形成對(duì)照，其分別具有3，3，28，15，和16個(gè)氨基酸的相對(duì)較短的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域(K0mar0my，M.，等，NAR11(1983)6775-6785)。在最后61個(gè)羧基端氨基酸中，有21個(gè)是酸性殘基，而僅有2個(gè)是堿性的，這說(shuō)明該區(qū)域具有強(qiáng)凈負(fù)電荷。GenBank登記號(hào)是NP-690605。認(rèn)為⑶20可能參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞的活化和分化過(guò)程中的早期步驟(Tedder等，Eur.J.Immunol.(歐洲免疫學(xué)雜志)25卷16(1986)881-887)并且可以起鈣離子通道的作用(Tedder，T.F.，等，細(xì)胞生物化學(xué)雜志(J.Cell.Biochem.)14D(1990)195)。存在兩種不同類(lèi)型的抗-⑶20抗體，其顯著不同在于它們的⑶20結(jié)合模式和生物活性(Cragg,M.S.，等，血液(Blood)，103(2004)2738-2743；和Cragg,M.S.，等，血液(Blood)，101(2003)1045-1052)。I型抗體，如利妥昔單抗，在補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性中是有效的，而II型抗體，如托西莫單抗(Bi)，11B8和AT80或人源化的B-Lyl抗體通過(guò)伴隨磷脂酰絲氨酸暴露的胱天蛋白酶不依賴(lài)性程序性細(xì)胞死亡有效地起始靶細(xì)胞死亡。I型和II型抗⑶-20抗體的共享共有特征總結(jié)如下表1<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>表1:1型和II型抗⑶-20抗體的性質(zhì)W02004035607涉及針對(duì)CD20的人單克隆抗體及其用于治療與表達(dá)CD20的細(xì)胞相關(guān)的疾病的應(yīng)用。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明包括I型抗-⑶20抗體用于制備藥物的應(yīng)用，所述藥物用于治療表達(dá)⑶20的癌癥，所述應(yīng)用的特征在于所述I型抗-CD20抗體與II型抗-CD20抗體共同施用。本發(fā)明還包括I型抗-⑶20抗體作為第一抗-⑶20抗體用于制備藥物的應(yīng)用，所述藥物用于治療表達(dá)CD20的癌癥，所述應(yīng)用的特征在于所述a)所述第一抗-⑶20抗體具有這樣的比率，即關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力，所述第一抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比0.8-1.2的比率，b)所述第一抗-⑶20抗體與作為第二抗-⑶20抗體的II型抗-⑶20抗體共同施用c)所述第二抗-⑶20抗體具有這樣的比率，即關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力，所述第二抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比0.3-0.6的比率。本發(fā)明包括I型抗-⑶20抗體用于制備藥物的應(yīng)用，所述藥物用于治療患有表達(dá)CD20的癌癥的患者，所述應(yīng)用的特征在于所述I型抗-CD20抗體與II型抗CD-20抗體共同施用。本發(fā)明還包括I型抗-⑶20抗體作為第一抗-⑶20抗體用于制備藥物的應(yīng)用，所述藥物用于治療患有表達(dá)CD20的癌癥的患者，所述應(yīng)用的特征在于所述a)所述第一抗-⑶20抗體具有這樣的比率，S卩，關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力，所述第一抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比0.8-1.2的比率，b)所述第一抗-⑶20抗體與作為第二抗-⑶20抗體的II型抗-⑶20抗體共同施用c)所述第二抗-⑶20抗體具有這樣的比率，即關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力，所述第二抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比0.3-0.6的比率。本發(fā)明還包括I型抗-⑶20抗體，其用于治療表達(dá)⑶20的癌癥，其特征在于所述I型抗-⑶20抗體與II型抗⑶-20抗體共同施用。本發(fā)明還包括I型抗-⑶20抗體，其用于治療患有表達(dá)⑶20的癌癥的患者，其特征在于所述I型抗-CD20抗體與II型抗CD-20抗體共同施用。優(yōu)選地，所述表達(dá)⑶20的癌癥是B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。優(yōu)選地，所述第一和第二抗-⑶20抗體(I型和II型)是單克隆抗體。優(yōu)選地，所述I型抗-⑶20抗體是利妥昔單抗。優(yōu)選地，所述II型抗-⑶20抗體是人源化的B-Ly1抗體。優(yōu)選地，所述II型抗-⑶20抗體具有增加的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用(ADCC)。優(yōu)選地，所述I型抗-⑶20抗體具有這樣的比率，即關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC_No.CCL-86)上⑶20的結(jié)合能力，所述第一抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比0.9-1.1的比率。優(yōu)選地，所述II型抗-⑶20抗體具有這樣的比率，即關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上⑶20的結(jié)合能力，所述第二抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比0.35-0.55，更優(yōu)選地，0.4-0.5的比率。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述I型抗-CD20抗體是利妥昔單抗，所述II型抗-⑶20抗體是人源化的B-Lyl抗體并且所述表達(dá)⑶20的癌癥是B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。本發(fā)明還包括用于組合治療患有表達(dá)⑶20癌癥的患者的試劑盒，其包括II型抗-⑶20抗體和I型抗-⑶20抗體。優(yōu)選地，所述試劑盒特征在于所述I型抗-CD20抗體是利妥昔單抗，所述II型抗-⑶20抗體是人源化的B-Lyl抗體并且所述表達(dá)⑶20的癌癥是B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)ο發(fā)明詳述術(shù)語(yǔ)“抗體”包括各種形式的抗體，其包括但不限于完整抗體、人抗體、人源化抗體和遺傳改造的抗體如單克隆抗體，嵌合抗體或重組抗體以及所述抗體的片段，條件是保持按照本發(fā)明的特征性特點(diǎn)。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指單氨基酸組成的抗體分子的制劑。因此，術(shù)語(yǔ)“人單克隆抗體”指顯示單一結(jié)合特異性的抗體，其具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人單克隆抗體是通過(guò)雜交瘤產(chǎn)生的，所述雜交瘤包含獲自轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠的B細(xì)胞，所述B細(xì)胞具有包含融合于無(wú)限增殖化細(xì)胞的人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。優(yōu)選地，所述第一和第二抗-⑶20抗體(I型和II型)是單克隆抗體。術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”指一種單克隆抗體，其包括來(lái)自一種來(lái)源或物種的可變區(qū)，即結(jié)合區(qū)，以及源自不同來(lái)源或物種的恒定區(qū)的至少一部分，其通常通過(guò)重組DNA技術(shù)進(jìn)行制備。特別優(yōu)選包括鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。這種鼠/人嵌合抗體是表達(dá)的免疫球蛋白基因的產(chǎn)物，所述免疫球蛋白基因包括編碼鼠免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼人免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段。本發(fā)明涵蓋的“嵌合抗體”的其它形式是其中類(lèi)或亞類(lèi)已經(jīng)經(jīng)過(guò)從初始抗體的類(lèi)或亞類(lèi)修飾或改變的那些。也將這種“嵌合”抗體稱(chēng)作“類(lèi)別轉(zhuǎn)換抗體”。制備嵌合抗體的方法包括目前在本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。見(jiàn)，例如，Morrison,S.L.，等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Natl.AcadSci.USA)81(1984)6851-6855；US5,202，238和5，204，244。術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”指這樣的抗體，其中的構(gòu)架或“互補(bǔ)性決定區(qū)”(CDR)已經(jīng)被修飾從而包括與親本免疫球蛋白的特異性不同的免疫球蛋白的CDR。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將鼠⑶R移植到人抗體的構(gòu)架區(qū)以制備“人源化抗體”。見(jiàn)，例如，Riechmann,L.，等，自然(Nature)332(1988)323-327；和Neuberger，Μ.S.，等，自然(Nature)314(1985)268-270。特別優(yōu)選的CDRs對(duì)應(yīng)于識(shí)別以上指出的關(guān)于嵌合和雙功能抗體的抗原的那些代表性序列。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“人抗體”意欲包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)中公知的(vanDijk，M.A.，和vandeWinkel，J.G.，當(dāng)前化學(xué)生物學(xué)觀點(diǎn)(Curr.Opin.inChemicalBiology)5(2001)368-374)?；谒黾夹g(shù)，可以生產(chǎn)針對(duì)多種靶標(biāo)的人抗體。人抗體的實(shí)例例如描述于Kellermarm，S.Α.，等，當(dāng)前生物技術(shù)觀點(diǎn)(CurrOpinBiotechnol.)13(2002)593-597。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重組人抗體”意欲包括所有通過(guò)重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的人抗體，諸如分離自宿主細(xì)胞，諸如NSO或CHO細(xì)胞的抗體或分離自人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)的抗體，或利用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體。這種重組人抗體具有處于重排形式的源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。按照本發(fā)明的重組人抗體已經(jīng)經(jīng)過(guò)體內(nèi)體細(xì)胞高變。因此，重組抗體的VH和VL區(qū)域的氨基酸序列是盡管源自并涉及人種系VH和VL序列，但在體內(nèi)可能不天然存在于人抗體種系所有組成成分中的序列。用于本文時(shí)，“特異性結(jié)合”或“特異性結(jié)合于”指特異性結(jié)合于CD20抗原的抗體。優(yōu)選地，結(jié)合親和性是10_8mOl/l以下，優(yōu)選地，10_9mOl/l以下(例如lO.mol/l)的KD值，更優(yōu)選地，具有I(T1V)Vl以下(例如，10_12mol/l)的KD-值。結(jié)合親和性用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定法，如在表達(dá)CD20的細(xì)胞上的表面等離振子共振技術(shù)(例如Biacore)來(lái)確定。用于本文時(shí)“核酸分子”意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但是優(yōu)選是雙鏈DNA?！昂愣ńY(jié)構(gòu)域”不直接參與抗體與抗原的結(jié)合但是參與效應(yīng)子功能(ADCC，補(bǔ)體結(jié)合和CDC)。用于本文時(shí)，“可變區(qū)”(輕鏈(VL)的可變區(qū)，重鏈(VH)的可變區(qū))表示直接參與抗體與抗原結(jié)合的每個(gè)輕鏈和重鏈對(duì)?？勺?nèi)溯p鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)并且每個(gè)結(jié)構(gòu)域包括4個(gè)構(gòu)架(FR)區(qū)，所述構(gòu)架區(qū)的序列是廣泛保守的，并通過(guò)三個(gè)“高變區(qū)”(或互補(bǔ)性決定區(qū)，CDRs)連接。所述構(gòu)架區(qū)采取b折疊構(gòu)象并且所述CDRs可以形成連接b折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDRs通過(guò)構(gòu)架區(qū)保持它們的三維結(jié)構(gòu)并且與來(lái)自另一條鏈的CDRs—起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w的重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在按照本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和性中具有特別重要的作用，并且因此提供本發(fā)明的另外的目標(biāo)。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”或“抗體的抗原結(jié)合部分”指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)包括來(lái)自“互補(bǔ)性決定區(qū)”或“CDRs”的氨基酸殘基?！皹?gòu)架”或“FR”區(qū)是除本文中定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈從N端到C端包括結(jié)構(gòu)域FRl，CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特別地，重鏈的CDR3是最有助于抗原結(jié)合的區(qū)域。按照KabatE.A.等，免疫目的的蛋白質(zhì)序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，第5版，公眾健康服務(wù)，國(guó)家健康研究所(PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth)，Bethesda，MD.(1991))的標(biāo)準(zhǔn)定義和/或來(lái)自“高變環(huán)”的那些殘基來(lái)確定⑶R和FR區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“⑶20‘‘和‘‘⑶20抗原‘‘在本文中交互使用，并且包括人⑶20的任何變體，同種型和物種同源物，其由細(xì)胞天然表達(dá)或在用CD20基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上表達(dá)。本發(fā)明的抗體與CD20抗原的結(jié)合通過(guò)使CD20失活來(lái)介導(dǎo)對(duì)表達(dá)CD20的細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)的殺死。對(duì)表達(dá)⑶20的細(xì)胞的殺死可以通過(guò)下列機(jī)制中的一種或多種發(fā)生細(xì)胞死亡/程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)，ADCC和/或⑶C。⑶20的同義詞，如本領(lǐng)域所公認(rèn)地，包括B-淋巴細(xì)胞抗原⑶20，B_淋巴細(xì)胞表面抗原Bi，Leu-16,Bp35,BM5，和LF5。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“抗-CD20抗體”是特異性結(jié)合于CD20抗原的抗體。根據(jù)抗-⑶20抗體與⑶20抗原的結(jié)合性質(zhì)和生物活性，可以根據(jù)Cragg，Μ.S.，等，血液(Blood)103(2004)2738-2743；和Cragg,M.S.，等血液(Blood)101(2003)1045-1052區(qū)分兩種類(lèi)型的抗-CD20抗體(I型和II型抗CD-20抗體)，見(jiàn)表2。表2:1型和II型抗⑶-20抗體的性質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>I型和II型抗-CD20抗體的一種基本性質(zhì)是它們的結(jié)合模式。因此，I型和II型抗-⑶20抗體可以通過(guò)所述抗-⑶20抗體和利妥昔單抗與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20結(jié)合能力相比的比率進(jìn)行分類(lèi)。I型抗⑶-20抗體具有這樣的比率，即關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力，所述抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比0.8-1.2，優(yōu)選地0.9-1.1的比率。所述I型抗CD-20抗體的實(shí)例包括例如利妥昔單抗，1F5IgG2a(ECACC,雜交瘤；Press，0.W.，等，血液(Blood)69/2(1987)584-591)，HI47IgG3(ECACC,雜交瘤)，2C6IgGl(如在WO2005/103081中公開(kāi))，2F2IgGl(如在WO2004/035607和WO2005/103081中公開(kāi))和2H7IgGl(如公開(kāi)于WO2004/056312)。優(yōu)選地，所述I型抗-CD20抗體是與利妥昔單抗結(jié)合相同的表位的單克隆抗體。所述II型抗CD-20抗體具有這樣的比率，即關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力，所述抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比0.3到0.6，優(yōu)選地，0.35到0.55，更優(yōu)選地，0.4到0.5的比率。所述II型抗⑶-20抗體的實(shí)例包括例如托西莫單抗(BiIgG2a)，人源化的B-Lyl抗體IgGl(如公開(kāi)于WO2005/044859的嵌合人源化的IgGl抗體)，11B8IgGl(如公開(kāi)于WO2004/035607)，和AT80IgGl。優(yōu)選地，所述II型抗-CD20抗體是與人源化的B-Lyl抗體(如公開(kāi)于WO2005/044859)結(jié)合相同表位的單克隆抗體?！瓣P(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的結(jié)合能力，抗-CD20抗體與利妥昔單抗相比的比率”通過(guò)在關(guān)于Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)的FACS陣列(FACSArray)(BectonDickinson)中使用所述與Cy5綴合的抗-⑶20抗體和與Cy5綴合的利妥昔單抗的直接免疫熒光測(cè)量(測(cè)量平均熒光強(qiáng)度(MFI))來(lái)確定，如在實(shí)施例2中所述，并且計(jì)算如下與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的結(jié)合能力的比率=MFI(Cv5-抗-CD20抗體)χCv5-標(biāo)記比率(Cv5-利妥昔單抗)MFI(Cy5-利妥昔單抗)Cy5-標(biāo)記的比率(Cy5-抗-CD20抗體)MFI是平均熒光強(qiáng)度?！癈y5-標(biāo)記的比率”用于本文時(shí)意指Cy5-標(biāo)記分子的數(shù)量/分子抗體。典型地，所述I型抗-⑶20抗體具有這樣的比率，即關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力，所述第一抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比0.8-1.2，優(yōu)選地，0.9-1.1的比率。典型地，所述II型抗-⑶20抗體具有這樣的比率，即關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力，所述第二抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比0.3-0.6，優(yōu)選地，0.35-0.55，更優(yōu)選地0.4-0.5的比率。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述II型抗-⑶20抗體，優(yōu)選地，人源化的B-Lyl抗體，具有增加的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用(ADCC)。所謂“具有增加的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用(ADCC)的抗體”意為這樣的抗體，如該術(shù)語(yǔ)在本文中定義地，其具有如通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適合方法確定的增加的ADCC。一個(gè)被接受的體外ADCC測(cè)定法如下1)所述測(cè)定法使用靶細(xì)胞，已知所述靶細(xì)胞表達(dá)由抗體的抗原結(jié)合區(qū)識(shí)別的靶抗原；2)所述測(cè)定法使用由隨機(jī)選擇的健康供體血液分離的人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，如效應(yīng)細(xì)胞；3)所述測(cè)定法根據(jù)下述流程進(jìn)行i)使用標(biāo)準(zhǔn)密度離心方法分離PBMCs，并且以5X106細(xì)胞/ml懸浮在RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基中；)靶細(xì)胞通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)，從具有高于90%的存活力的指數(shù)生長(zhǎng)期收獲，在RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基中洗滌，并用100微居的“Cl-標(biāo)記，用細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌2次，并以10'細(xì)胞/ml的密度重懸于細(xì)胞培養(yǎng)基中；iii)將上述100微升的最終靶細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移到96孔微量滴定板的每個(gè)孔中；iv)所述抗體在細(xì)胞培養(yǎng)基中從4000ng/ml系列稀釋到0.04ng/ml并將50微升由此生成的抗體溶液加入96孔微量滴定板中的靶細(xì)胞中，一式三份地測(cè)試完全涵蓋上述濃度范圍的多種抗體濃度；ν)對(duì)于最大的釋放(MR)對(duì)照，含有標(biāo)記的靶細(xì)胞的板中的3個(gè)另外的孔接受50微升的2%(VN)非離子去垢劑的水溶液(Nonidet，西格瑪(Sigma)，圣路易斯)，代替抗體溶液(上述iv點(diǎn))；vi)對(duì)于自發(fā)的釋放(SR)對(duì)照，含有標(biāo)記的靶細(xì)胞的板中的3個(gè)另外的孔接受50微升的RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)，代替抗體溶液(上述iv點(diǎn))；vii)然后，將96孔微量滴定板以50xg離心1分鐘并在4C溫育1小時(shí)；viii)將50微升的PBMC混懸液(上述i點(diǎn))加入每個(gè)孔中，從而產(chǎn)生251的效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞比率，并將所述板置于5%C02大氣下，37C的溫箱中4小時(shí)；ix)收獲來(lái)自每個(gè)孔的無(wú)細(xì)胞上清液，并使用Y-計(jì)數(shù)器量化通過(guò)實(shí)驗(yàn)釋放的放射性(ER)；χ)按照式(ER-MR)/(MR-SR)X100計(jì)算關(guān)于每種抗體濃度的特異性溶胞百分比，其中ER是關(guān)于該抗體濃度量化的平均放射性(見(jiàn)以上ix點(diǎn))，MR是關(guān)于MR對(duì)照(見(jiàn)以上V點(diǎn))量化的平均放射性(見(jiàn)以上ix點(diǎn))，并且SR是關(guān)于SR對(duì)照(見(jiàn)以上vi點(diǎn))量化的平均放射性(見(jiàn)以上ix點(diǎn))；4)“增加的ADCC”定義為在上述測(cè)試的抗體濃度范圍內(nèi)觀察到的最大特異性溶胞百分比的增加，和/或獲得在上述測(cè)試的抗體濃度范圍內(nèi)觀察到的最大特異性溶胞百分比的一半所需要的抗體濃度的減少。ADCC的增加與這樣的ADCC有關(guān)，其使用上述測(cè)定法測(cè)量，由相同抗體介導(dǎo)，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的相同標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)、純化、配制和貯存方法由相同類(lèi)型的宿主細(xì)胞產(chǎn)生，但是其尚未通過(guò)被改造為過(guò)表達(dá)GnTIII的宿主細(xì)胞產(chǎn)生。所述“增加的ADCC”可以通過(guò)所述抗體的糖改造獲得，這意味著，通過(guò)改造它們的寡糖成分來(lái)增強(qiáng)所述單克隆抗體的天然，細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能，如在Umana，P.，等，自然生物技術(shù)(NatureBiotechnol).17(1999)176-180和US6，602，684中所述。術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)體-依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)，，指根據(jù)本發(fā)明的抗體在補(bǔ)體存在下，溶解人腫瘤靶細(xì)胞。優(yōu)選地，通過(guò)用根據(jù)本發(fā)明的抗-CD20抗體在補(bǔ)體存在下處理表達(dá)CD20的細(xì)胞制劑來(lái)測(cè)量CDC。如果抗體以IOOnM的濃度，在4小時(shí)后誘導(dǎo)20%以上的腫瘤細(xì)胞溶解(細(xì)胞死亡)，則存在CDC。優(yōu)選地，測(cè)定使用51Cr或Eu標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞和測(cè)量釋放的51Cr或Eu來(lái)進(jìn)行。對(duì)照包括與補(bǔ)體，但無(wú)抗體一起溫育腫瘤靶細(xì)胞。典型地，IgGl同種型的I型和II型抗⑶-20抗體顯示特征性⑶C性質(zhì)。彼此比較，I型抗⑶-20抗體具有增加的⑶C(如果是IgGl同種型)且II型抗⑶-20抗體具有減少的⑶C(如果是IgGl同種型)。優(yōu)選地，I型和II型抗⑶-20抗體二者均是IgGl同種型抗體?！袄孜魡慰埂笨贵w是包含人Y1鼠恒定結(jié)構(gòu)域的針對(duì)人CD20抗原的遺傳改造的嵌合單克隆抗體。這種嵌合抗體包含人Yl恒定結(jié)構(gòu)域并且在US5,736,137(Andersen,等)中以〃C2B8"的名稱(chēng)鑒定，所述US5，736，137于1998年4月17日授權(quán)，并且轉(zhuǎn)讓給IDEC藥物公司(IDECPharmaceuticalsCorporation)。利妥昔單抗被批準(zhǔn)用于治療患有復(fù)發(fā)或頑固性(refrating)低級(jí)或?yàn)V泡性，⑶20陽(yáng)性，B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的患者。作用研究的體外機(jī)制顯示利妥昔單抗展示人補(bǔ)體-依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)(Reiff,M.Ε.等，血液(Blood)83(2)435-445(1994))。另外，其在測(cè)量抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用(ADCC)的測(cè)定法中顯示顯著的活性。術(shù)語(yǔ)“人源化的B-Lyl抗體”指如公開(kāi)于WO2005/044859和WO2007/031875的人源化的B-Lyl抗體，其通過(guò)與來(lái)自IgGl的人恒定結(jié)構(gòu)域嵌合化(chimerization)和隨后的人源化(見(jiàn)WO2005/044859和WO2007/031875)獲自鼠單克隆抗-CD20抗體B-Lyl(鼠重鏈(VH)的可變區(qū)=SEQIDNO1；鼠輕鏈(VL)的可變區(qū)=SEQIDNO:2_見(jiàn)Poppema，S.禾口Visser,L.，生物測(cè)試公報(bào)(BiotestBulletin)3(1987)131-139)。這些“人源化的B-Lyl抗體”詳細(xì)公開(kāi)于WO2005/044859和WO2007/031875中。優(yōu)選地，“人源化的B-Lyl抗體”具有重鏈(VH)可變區(qū)，其選自SEQIDNo.3到SEQIDNo.20的組(TO2005/044859和WO2007/031875的B-HH2到B-HH9和B-HL8到B-HL17)。特別優(yōu)選的是Seq.IDNo.3,4,7,9,11，13和15(TO2005/044859的B-HH2，BHH-3，B-HH6，B-HH8，B-HL8，B-HLll和B-HL13)。優(yōu)選地，所述“人源化的B-Lyl抗體”具有輕鏈(VL)可變區(qū)SEQIDNo.20(W02005/044859的B-KV1)。此外，所述人源化的B-Lyl抗體優(yōu)選地是IgGl抗體。優(yōu)選地，所述人源化的B-Lyl抗體在Fc區(qū)中根據(jù)WO2005/044859,WO2004/065540,WO2007/031875,Umana,P.，等，自然生物技術(shù)(NatureBiotechnol.)17(1999)176-180和WO99/154342中所述的方法進(jìn)行糖改造。所述糖改造的人源化B-Lyl抗體在Fc區(qū)中具有改變的糖基化模式，優(yōu)選地具有減少的巖藻糖殘基水平。優(yōu)選地，F(xiàn)c區(qū)的至少40%以上(在一個(gè)實(shí)施方案中介于40%和60%之間，在另一個(gè)實(shí)施方案中至少50%，并且在另一個(gè)實(shí)施方案中至少70%以上的)的寡糖是非-巖藻糖基化的。此外，F(xiàn)c區(qū)的寡糖優(yōu)選地是二等分的(bisected)。本發(fā)明包括I型抗-⑶20抗體用于制備藥物的應(yīng)用，所述藥物用于治療表達(dá)⑶20的癌癥，所述應(yīng)用的特征在于所述I型抗-CD20抗體與II型抗CD-20抗體共同施用。本發(fā)明包括I型抗-⑶20抗體用于制備藥物的應(yīng)用，所述藥物用于治療患有表達(dá)CD20的癌癥的患者，所述應(yīng)用的特征在于所述I型抗-CD20抗體與II型抗CD-20抗體共同施用。優(yōu)選地，所述應(yīng)用的特征在于所述I型抗-CD20抗體是利妥昔單抗，所述II型抗-⑶20抗體是人源化的B-Lyl抗體并且表達(dá)⑶20的癌癥是B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。寡糖成分可以顯著地影響與治療性糖蛋白的功效相關(guān)的性質(zhì)，包括物理穩(wěn)定性，對(duì)蛋白酶攻擊的抗性，與免疫系統(tǒng)的相互作用，藥物代謝動(dòng)力學(xué)和特定的生物活性。所述性質(zhì)可以不僅取決于寡糖的存在與否，還取決于寡糖的特殊結(jié)構(gòu)?？梢宰饕恍┕烟墙Y(jié)構(gòu)和糖蛋白功能之間的歸納。例如，某些寡糖結(jié)構(gòu)介導(dǎo)糖蛋白通過(guò)與特定的碳水化合物結(jié)合蛋白的相互作用從血流中快速清除，而其它的可以被抗體結(jié)合并且引發(fā)不需要的免疫反應(yīng)(Jenkins,N.，等，自然生物技術(shù)(NatureBiotechnol).14(1996)975-81)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞是用于生產(chǎn)治療性糖蛋白的優(yōu)選的宿主，這是由于它們以對(duì)于人應(yīng)用最相容的形式使蛋白糖基化的能力(Cumming，D.Α.，等，糖生物學(xué)(Glycobiology)1(1991)115-30Jenkins，N.，等，自然生物技術(shù)(NatureBiotechnol).14(1996)975-81)。細(xì)菌極少使蛋白糖基化，并且象其它類(lèi)型的常用宿主，如酵母、絲狀真菌、昆蟲(chóng)和植物細(xì)胞一樣，產(chǎn)生這樣的糖基化模式，其與從血流中快速清除，不合需要的免疫相互作用，和在某些特殊情形中，與減少的生物活性相關(guān)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，在過(guò)去的二十年里，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞是最常用的。除了提供適合的糖基化模式外，這些細(xì)胞容許持續(xù)的產(chǎn)生遺傳穩(wěn)定，高產(chǎn)率的克隆細(xì)胞系。它們可以使用無(wú)血清的培養(yǎng)基在簡(jiǎn)單的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)到高密度，并且容許發(fā)展安全和可再現(xiàn)的生物工藝。其它常用的動(dòng)物細(xì)胞包括幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞，NSO-和SP2/0-小鼠骨髓瘤細(xì)胞。更近期，還已經(jīng)測(cè)試了由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)(Jenkins，N.，等，自然生物技術(shù)(NatureBiotechnol).14(1996)975-81。所有抗體在重鏈恒定區(qū)域中的保守位置包含碳水化合物結(jié)構(gòu)，每種同種型具有N-連接的碳水化合物結(jié)構(gòu)的獨(dú)特陣列，其以不同方式影響蛋白裝配，分泌或功能活性。(Wright,Α.，和Morrison,S.L.，生物技術(shù)趨勢(shì)(TrendsBiotech).15(1997)26-32)。所連接的N連接的碳水化合物的結(jié)構(gòu)，根據(jù)加工的程度顯著不同，并且可以包括高甘露糖，多分支的以及二分支的復(fù)合寡糖。(Wright，Α.，和Morrison，S.L.，生物技術(shù)趨勢(shì)(TrendsBiotech).15(1997)26-32)。典型地，存在對(duì)在特定的糖基化位點(diǎn)連接的核心寡糖結(jié)構(gòu)的不同種類(lèi)的(heterogeneous)處理從而使甚至單克隆抗體以多種糖形存在。同樣地，已經(jīng)顯示細(xì)胞系之間存在抗體糖基化的主要差異，并且甚至對(duì)在不同培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的給定細(xì)胞系，觀察到了微小差異(Lifely,M.R.等，糖生物學(xué)(Glycobiology)5(8)(1995)813-22)0獲得較大的效力增加，而又同時(shí)保持簡(jiǎn)單的生產(chǎn)工藝并潛在避免明顯的，不合乎需要的副作用的一種方式，是通過(guò)改造它們的糖成分從而增強(qiáng)單克隆抗體的天然，細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能，如在Umana，P.，等，自然生物技術(shù)(NatureBiotechnol.)17(1999)176-180和US6，602，684中所述。IgGl型抗體，即在癌癥免疫療法中最常用的抗體，是在每個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域中的Asn297處具有保守性N-連接糖基化位點(diǎn)的糖蛋白。與Asn297連接的兩個(gè)復(fù)合的二分支寡糖埋在CH2結(jié)構(gòu)域之間，形成與多肽主鏈的廣泛接觸，并且它們的存在對(duì)于抗體介導(dǎo)效應(yīng)子功能如抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用(ADCC)是必需的(Lifely,M.R.，等，糖生物學(xué)(Glycobiology)5=813-822(1995)Jefferis,R.，等，免疫學(xué)綜述(Immunol.Rev.)163:59_76(1998)；Wright,Α.和Morrison,S.L.，生物技術(shù)趨勢(shì)(TrendsBiotechnol.)15:26_32(1997))。以前已經(jīng)顯示β(1，4)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶111(〃GnTII17y)，即一種催化二等分的寡糖形成的糖基轉(zhuǎn)移酶)在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)，顯著增加由改造的CHO細(xì)胞產(chǎn)生的抗成神經(jīng)細(xì)胞瘤嵌合單克隆抗體(chCE7)的體外ADCC活性(見(jiàn)Umana，P.，等，自然生物技術(shù)(NatureBiotechnol.)17(1999)176-180；和WO99/154342，將其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考)?？贵wchCE7屬于一大類(lèi)未綴合的單克隆抗體，其具有高腫瘤親和性和特異性，但是當(dāng)以缺乏GnTIII酶的標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)化細(xì)胞系生產(chǎn)時(shí)，其效力太低而無(wú)法在臨床上有效使用(Umana，P.，等，自然生物技術(shù)(NatureBiotechnol.)17(1999)176-180。該研究首先顯示ADCC活性的較大增加可以通過(guò)改造生成抗體的細(xì)胞以表達(dá)GnTIII來(lái)獲得，其還導(dǎo)致按與恒定區(qū)(Fe)-相關(guān)的二等分的寡糖，包括二等分的，非巖藻糖基化寡糖的比例，高于天然存在的抗體中存在的水平的增加。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)⑶20”抗原意欲指⑶20抗原在細(xì)胞中，優(yōu)選地在T細(xì)胞或B細(xì)胞，更優(yōu)選地B細(xì)胞的細(xì)胞表面上的顯著的表達(dá)水平，所述細(xì)胞分別來(lái)自腫瘤或癌癥，優(yōu)選地非實(shí)體腫瘤。具有“表達(dá)CD20的癌癥”的患者可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法確定。例如，⑶20抗原表達(dá)使用免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)，F(xiàn)ACS或通過(guò)基于PCR的相應(yīng)mRNA的檢測(cè)進(jìn)行測(cè)量。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)⑶20的癌癥”用于本文時(shí)，優(yōu)選地指淋巴瘤(優(yōu)選地，B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL))和淋巴細(xì)胞性白血病。所述淋巴瘤和淋巴細(xì)胞性白血病包括例如a)濾泡性淋巴瘤，b)小無(wú)裂細(xì)胞淋巴瘤/伯基特淋巴瘤(包括地方性伯基特淋巴瘤，散發(fā)性伯基特淋巴瘤和非伯基特淋巴瘤)，c)邊緣區(qū)淋巴瘤(包括結(jié)節(jié)外(extranodal)邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(黏膜相關(guān)的淋巴組織淋巴瘤，MALT)，結(jié)節(jié)邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤和脾邊緣區(qū)淋巴瘤)，d)套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)，e)大細(xì)胞性淋巴瘤(包括B細(xì)胞彌漫型大細(xì)胞性淋巴瘤(DLCL)，彌漫型混合細(xì)胞性淋巴瘤，成免疫細(xì)胞性淋巴瘤，原發(fā)縱隔B細(xì)胞淋巴瘤，血管中心型淋巴瘤-肺B細(xì)胞淋巴瘤)f)毛細(xì)胞性白血病，g)淋巴細(xì)胞性淋巴瘤，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥，h)急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)，慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(SLL)，B細(xì)胞前淋巴細(xì)胞性白血病，i)漿細(xì)胞瘤，漿細(xì)胞骨髓瘤，多發(fā)性骨髓瘤，漿細(xì)胞瘤j)霍奇金病。優(yōu)選地，所述表達(dá)⑶20的癌癥是B細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤(NHL)。特別地，表達(dá)⑶20的癌癥包括套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)，急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)，慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)，B細(xì)胞彌漫型大細(xì)胞性淋巴瘤(DLCL)，伯基特淋巴瘤，毛細(xì)胞性白血病，濾泡性淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，邊緣區(qū)淋巴瘤，移植后淋巴組織增生病癥(PTLD)，HIV相關(guān)的淋巴瘤，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥，或原發(fā)性CNS淋巴瘤。術(shù)語(yǔ)“治療方法”或其等價(jià)物，當(dāng)應(yīng)用于例如癌癥時(shí)，指被設(shè)計(jì)用于減少或消除患者的癌細(xì)胞數(shù)量或減輕癌癥癥狀的方法或作用過(guò)程?！爸委煱┌Y或其它增生病癥的方法”并不必然意味著癌細(xì)胞或其它病癥實(shí)際上會(huì)消除，細(xì)胞的數(shù)量或病癥實(shí)際上會(huì)減少，或癌癥或其它病癥的癥狀實(shí)際上會(huì)減輕。通常，治療癌癥的方法會(huì)被執(zhí)行，即使僅有很低的成功可能性，但是只要考慮到患者的醫(yī)療歷史和估計(jì)的存活預(yù)期期限，仍然認(rèn)為該方法誘導(dǎo)了總體有益的作用過(guò)程。術(shù)語(yǔ)“共同施用(co-administration)”或“共同施用(co-administering)”指將所述第一和第二抗-CD20抗體作為一個(gè)單一制劑或兩個(gè)分開(kāi)的制劑進(jìn)行施用。所述共同施用可以同時(shí)或以任何順序相繼進(jìn)行，其中優(yōu)選地，存在一段這樣的時(shí)間，其間兩種(或所有的)活性劑同時(shí)發(fā)揮它們的生物活性。如果使用一種單一制劑，同時(shí)共同施用兩種抗-CD20抗體。如果使用兩種分開(kāi)的制劑(一種關(guān)于第一抗-CD20抗體，一種關(guān)于第二抗-CD20抗體)，所述第一和第二抗-CD20抗體同時(shí)(例如通過(guò)一次單獨(dú)的持續(xù)輸注或通過(guò)同時(shí)進(jìn)行的兩次分開(kāi)的持續(xù)輸注)或相繼共同施用。當(dāng)將兩種抗體相繼共同施用時(shí)，劑量以同一天兩次分開(kāi)的給藥進(jìn)行施用，例如在不同時(shí)間的兩次分開(kāi)的持續(xù)輸注，或一種抗體在第1天施用，且第二抗體在第2-7天，優(yōu)選地在第2-4天共同施用。因此，術(shù)語(yǔ)“相繼”意指在給藥第一抗體后7天內(nèi)，優(yōu)選地，在第一抗體給藥后4天內(nèi)；術(shù)語(yǔ)“同時(shí)地”意指在同一時(shí)間。術(shù)語(yǔ)“共同施用”，針對(duì)抗-CD20抗體的維持劑量，意指維持劑量可以同時(shí)共同施用，例如在一次持續(xù)的輸注中，條件是該治療周期對(duì)于兩種抗體是合適的，例如每周?；蚓S持劑量在一天或數(shù)天內(nèi)，相繼共同施用，例如一種抗體的維持劑量約每周施用，并且第二抗體的維持劑量也是每2周進(jìn)行共同施用。此外，其它治療周期/通常例如從3天到數(shù)周，可以用于兩種抗體。將抗體以有效量施用于患者是不言而喻的，所述有效量是將激發(fā)由研究者，獸醫(yī)，醫(yī)生或其它臨床醫(yī)生探索的組織、系統(tǒng)，動(dòng)物或人的生物或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的主題化合物或組合的量。所述第一和第二抗-CD20抗體共同施用的量和共同施用的時(shí)機(jī)取決于被治療的患者的類(lèi)型(物種，性別，年齡，體重等)和病癥和被治療的疾病或病癥的嚴(yán)重性。所述第一和第二抗-CD20抗體以一次或經(jīng)過(guò)一系列治療適當(dāng)?shù)毓餐┯糜诨颊?。根?jù)疾病的類(lèi)型和嚴(yán)重性，約1μg/kg到50mg/kg(例如0.l_20mg/kg)的所述第一或第二抗-CD20抗體是對(duì)于給患者共同施用的初始候選劑量，不管其是例如通過(guò)一次或多次分開(kāi)的施用，或是通過(guò)持續(xù)輸注進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，關(guān)于所述第一或第二抗-CD20抗體的初始輸注時(shí)間可以比隨后的輸注時(shí)間更長(zhǎng)，例如關(guān)于初始輸注約90分鐘，和關(guān)于隨后的輸注約30分鐘(如果初始輸注被充分耐受)。所述第一或第二抗-⑶20抗體的優(yōu)選劑量應(yīng)該在約0.05mg/kg到約30mg/kg的范圍內(nèi)。因此，約0.5mg/kg,2.Omg/kg,4.Omg/kg,10mg/kg或30mg/kg(或其任何組合)的一個(gè)或多個(gè)劑量可以被共同施用于患者。根據(jù)患者的類(lèi)型(物種，性別，年齡，體重等)和患者的病癥以及根據(jù)抗-CD20抗體的類(lèi)型，所述第一的劑量可以不同于第二抗-CD20抗體的劑量。所述劑量可以每天地或間歇地共同施用，例如每隔2天到每6天或甚至每1-3周?？梢允┯贸跏驾^高的負(fù)荷劑量，隨后是一個(gè)或多個(gè)較低的劑量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物用于在所述患有表達(dá)⑶20的癌癥的患者中預(yù)防或減少轉(zhuǎn)移或進(jìn)一步的彌散。所述藥物有效用于增加所述患者的存活的延續(xù)時(shí)間，增加所述患者的無(wú)進(jìn)展的(progressionfree)存活，增加反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間，導(dǎo)致被治療患者的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著和臨床有意義的改善，如通過(guò)存活的延續(xù)時(shí)間，無(wú)進(jìn)展存活，應(yīng)答率或反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間測(cè)量地。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物有效用于增加一組患者中的應(yīng)答率。在本發(fā)明的背景下，可以將另外的其它細(xì)胞毒劑，化療劑，或抗癌劑或增強(qiáng)所述藥劑效果的化合物用于關(guān)于表達(dá)CD20癌癥的抗-CD20抗體組合治療中。優(yōu)選地，所述抗-CD20抗體組合治療在沒(méi)有所述另外的細(xì)胞毒劑，化療劑，或抗癌劑，或增強(qiáng)所述藥劑的化合物的情況下使用。所述藥劑包括，例如烷化劑，或具有烷化作用的試劑，如環(huán)磷酰胺(CTX；例如Cytoxan)，苯丁酸氮芥(CHL；例如留可然(leukeran))，順鉬(CisP；例如順鉬(platinol))白消安(例如馬利蘭(myleran))，美法倉(cāng)，卡莫司汀(BCNU)，鏈脲霉素，曲他胺(TEM)，絲裂霉素C，等；抗代謝藥，如甲氨蝶呤(MTX)，依托泊苷(VP16；例如凡畢士(vepesid))，6-巰基嘌呤(6MP)，6-硫鳥(niǎo)嘌呤(6-thiocguanine)(6TG)，阿糖胞苷(Ara-C)，5-氟尿嘧啶(5-FU)，卡培他濱(例如希羅達(dá)(Xeloda))，達(dá)卡巴嗪(DTIC)，等；抗生素如放線菌素D，多柔比星(DXR;例如亞德里亞霉素(adriamycin))，柔紅霉素(道諾霉素)，博來(lái)霉素，普卡霉素等；生物堿，如長(zhǎng)春花生物堿如長(zhǎng)春新堿(VCR)，長(zhǎng)春堿，等；和其它抗腫瘤藥劑，如紫杉醇(例如泰素(taxol))和紫杉醇衍生物，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，糖皮質(zhì)類(lèi)固醇如地塞米松(DEX;例如地卡特隆(decadron))和皮質(zhì)甾類(lèi)如潑尼松，核苷酶抑制劑如羥基脲，氨基酸缺失(Cbpleting)酶類(lèi)如門(mén)冬酰胺酶，亞葉酸和其它葉酸衍生物，和類(lèi)似的，多樣的抗腫瘤藥劑。還可以將下列藥劑用作另外的藥劑阿米福汀(arnifostine)(例如氨磷汀>(ethyol))，放線菌素D，氮芥(mechlorethamine)(氮芥(nitrogenmustard))，鏈佐星，環(huán)磷酰胺，洛莫司汀(CCNU)，多柔比星脂質(zhì)體(doxorubicinlipo)(例如鹽酸多柔比星脂質(zhì)體(doxil))，吉西他濱(例如健)，柔紅霉素脂質(zhì)體(daunorubicinlipo)(例如枸櫞酸柔紅霉素脂質(zhì)體(daunoxome))，丙卡巴胼，絲裂霉素，多西他賽(例如泰索帝(taxotere))，阿地白介素，卡鉬，奧沙利鉬，克拉屈濱，喜樹(shù)堿，CPT11(伊立替康)，10-羥基7-乙基-喜樹(shù)堿(SN38)，氟尿苷，氟達(dá)拉濱異環(huán)磷酰胺，伊達(dá)比星，美鈉，干擾素β，干擾素α，米托蒽醌，托泊替康，亮丙立德，甲地孕酮，美法侖，巰嘌呤，普卡霉素，米托坦，培門(mén)冬酶，噴司他丁，哌泊溴烷，普卡霉素，他莫昔芬，替尼泊苷，睪內(nèi)酯，硫鳥(niǎo)嘌呤，塞替派，烏拉莫司汀(uracilmustard)，長(zhǎng)春瑞濱，苯丁酸氮芥。優(yōu)選地，所述抗-CD20抗體組合治療在無(wú)所述另外的藥劑的情況下使用。上述細(xì)胞毒劑和抗癌劑以及抗增生靶特異性抗癌藥如蛋白激酶抑制劑在化學(xué)治療方案中的應(yīng)用是癌癥治療領(lǐng)域中通常充分表征的，并且它們?cè)诒疚牡膽?yīng)用被歸入與用于監(jiān)測(cè)耐受性和有效性，以及用于控制施用路徑和劑量相同的考慮因素中，其具有一些調(diào)整。例如，細(xì)胞毒劑的實(shí)際劑量可以根據(jù)患者培養(yǎng)的細(xì)胞反應(yīng)而改變，所述細(xì)胞反應(yīng)通過(guò)使用組織培養(yǎng)法來(lái)測(cè)定。一般情況下，與在缺少另外的其它藥劑的情況下使用的量比較，所述劑量應(yīng)該減少。有效的細(xì)胞毒劑的典型劑量可以在生產(chǎn)商推薦的范圍內(nèi)，并且在通過(guò)動(dòng)物模型中的一種或多種體外反應(yīng)指示時(shí)，可以減少至多約一個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度或量。因此，實(shí)際的劑量將取決于醫(yī)師的判斷，患者的病癥，和治療法的有效性，所述治療法基于原代培養(yǎng)的惡性細(xì)胞和組織培養(yǎng)的組織樣品的體外反應(yīng)性或在適合的動(dòng)物模型中觀察到的反應(yīng)。在本發(fā)明的背景中，可以進(jìn)行有效量的電離輻射，和/或除了表達(dá)CD20的癌癥的抗CD20抗體組合治療之外，可以使用防輻射藥物。輻射源可以在被治療的患者內(nèi)部或外部。當(dāng)所述源在患者外部時(shí)，所述療法已知為外部光束放射療法(EBRT)。當(dāng)所述輻射源在患者內(nèi)部時(shí)，所述治療稱(chēng)為近距放射治療(BT)。用于本發(fā)明背景下的放射性原子可以選自包括，但不限于鐳、銫-137、銥-192、镅-241、金-198、鈷-57、銅-67、锝-99、碘-123和銦-111的組。也可以用所述放射性同位素標(biāo)記所述抗體。優(yōu)選地，抗-CD20抗體組合治療在無(wú)所述電離輻射的情況下使用。放射療法是用于控制不可切除或不可手術(shù)的腫瘤和/或腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)準(zhǔn)治療。當(dāng)放射療法與化學(xué)療法組合時(shí)，觀察到了改進(jìn)的效果。放射療法基于這樣的原則，即被遞送到靶區(qū)域的高劑量輻射將導(dǎo)致腫瘤和正常組織中的生殖細(xì)胞的死亡。輻射劑量方案通常在輻射吸收劑量(Gy)，時(shí)間和分級(jí)(fractionation)方面進(jìn)行限定，并且必須由腫瘤學(xué)家仔細(xì)限定?；颊呓邮艿妮椛涞牧繉⑷Q于多種考慮因素，但是兩個(gè)最重要的考慮因素是腫瘤相對(duì)于身體的其它重要結(jié)構(gòu)或器官的位置，以及腫瘤擴(kuò)散的程度。關(guān)于經(jīng)歷放射療法的患者的典型治療過(guò)程應(yīng)該是在1-6周期間的治療時(shí)間表，其中施用于患者的總劑量在10和SOGy之間，施用以約1.8到2.OGy的單一每日部分施用于患者，每周5天。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)人患者中的腫瘤用本發(fā)明的組合療法和放射治療時(shí)，存在協(xié)同作用。換言之，當(dāng)與輻射組合，任選地與另外的化療劑或抗癌劑組合時(shí)，包含本發(fā)明的組合的藥劑對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制被增強(qiáng)。輔助放射療法的參數(shù)例如包含在WO99/60023中。根據(jù)已知方法，通過(guò)作為推注(bolus)靜脈內(nèi)施用或通過(guò)在一段時(shí)期內(nèi)持續(xù)輸注，通過(guò)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)(intracerobrospinal)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)或鞘內(nèi)途徑將所述抗體施用于患者。優(yōu)選抗體的靜脈內(nèi)或皮下施用。本發(fā)明還包括試劑盒，其特征在于包含容器，所述容器內(nèi)的包含所述I型和II型抗-CD20抗體的的組合物，其以一個(gè)單一或兩個(gè)分開(kāi)的制劑的形式存在，以及指導(dǎo)所述組合物的使用者向患有表達(dá)CD20的癌癥的患者施用所述I型和II型抗-CD20抗體的包裝插件。優(yōu)選地，所述試劑盒的特征在于所述I型抗-CD20抗體是利妥昔單抗，所述II型抗-⑶20抗體是人源化的B-Lyl抗體并且所述表達(dá)⑶20的癌癥是B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)ο術(shù)語(yǔ)“包裝插件”指通常包括在治療產(chǎn)品的商業(yè)包裝中的說(shuō)明書(shū)，其可以包括關(guān)于適應(yīng)癥(indication)、使用、劑量、施用、禁忌癥(contraindication)和/或關(guān)于使用所述治療產(chǎn)品的警示信息。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，制品容器的成品還可以包含藥用載體。制品的成品還可以包括無(wú)菌稀釋劑，其優(yōu)選地貯存在單獨(dú)的另外的容器中。當(dāng)用于本文時(shí)，“藥用載體”意欲包括任何和所有與藥物施用相容的物質(zhì)，包括溶齊U、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等以及與藥物施用相容的其它物質(zhì)和化合物。除了在任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑與活性化合物不相容的情況下以外，預(yù)期其在本發(fā)明的組合物中的應(yīng)用。還可以將補(bǔ)充性活性化合物引入到組合物中。藥物制劑根據(jù)本發(fā)明使用的抗體的治療制劑通過(guò)將具有需要的純度的抗體與任選的藥用載體，賦形劑或穩(wěn)定劑混合來(lái)制備以用于貯存(雷明頓藥物科學(xué)(Remington'sPharmaceuticalSciences)第16版，Osol,A.Ed.(1980))，其以?xún)龈芍苿┗蛩芤旱男问酱嬖?。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所用的劑量和濃度對(duì)于受者是無(wú)毒的，并且包括緩沖劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如氯化十八烷基二甲基芐基銨；六甲氯銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚，丁醇或芐醇；對(duì)羥基苯甲酸烷基酯如羥苯甲酸甲酯或?qū)αu苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲苯酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)的多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴(lài)氨酸；單糖；二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；形成鹽的平衡離子如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如鋅蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如TWEEN，PLUR0NICS或聚乙二醇(PEG)。根據(jù)本發(fā)明的制劑可以是關(guān)于每種抗-CD20抗體的兩種分開(kāi)的制劑。備選地，本文的制劑還可以在一種制劑中包含兩種抗體。另外地，所述組合物還可以包括化療劑，細(xì)胞毒劑，細(xì)胞因子，生長(zhǎng)抑制劑或抗血管生成劑。所述分子合適地以有效用于預(yù)期目的的量組合存在?；钚猿煞诌€可以包埋在微囊劑中，所述微囊劑是例如通過(guò)團(tuán)聚技術(shù)或通過(guò)界面(interracial)聚合制備的，例如分別在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體，白蛋白微球體，微乳，納米顆粒和納米膠囊)或在粗乳狀液(macroemulsion)中的羥甲基纖維素或明膠微囊劑和聚(甲基丙烯酸甲酯(methylmethacylate))微囊劑。所述技術(shù)在雷明頓藥物科學(xué)(Remington'sPharmaceuticalSciences),第16版，Osol,Α·編輯(1980)中公開(kāi)?？梢灾苽涑掷m(xù)釋放制劑。適合的持續(xù)釋放制劑的實(shí)例包括包含抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)以成形的制品形式存在，例如薄膜，或微囊劑。持續(xù)釋放基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯，水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯))，或聚(乙烯醇)，聚交酯(US3，773，919)，L-谷氨酸和Y-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸_乙醇酸共聚物如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙立德組成的可注射的微球體)，和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。用于體內(nèi)施用的制劑必需是無(wú)菌的。這通過(guò)無(wú)菌濾膜過(guò)濾來(lái)容易地實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還包括I型抗-⑶20抗體，其用于治療表達(dá)⑶20的癌癥，其特征在于所述I型抗-⑶20抗體與II型抗⑶-20抗體共同施用。本發(fā)明還包括I型抗-⑶20抗體，其用于治療患有表達(dá)⑶20的癌癥的患者，其特征在于所述I型抗-CD20抗體與II型抗CD-20抗體共同施用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述I型抗-CD20抗體是利妥昔單抗，所述II型抗-⑶20抗體是人源化的B-Lyl抗體并且表達(dá)所述⑶20的癌癥是B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)ο本發(fā)明還包括I型抗-⑶20抗體，其用于治療表達(dá)⑶20的癌癥或患有表達(dá)⑶20的癌癥的患者，其特征在于a)所述I型抗-⑶20抗體具有這樣的比率，S卩，關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力，所述I型抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比0.8-1.2的比率，b)所述I型抗-⑶20抗體與11型抗-⑶20抗體共同施用，和c)所述II型抗-⑶20抗體具有這樣的比率，即關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力，所述II型抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比0.3-0.6的比率。優(yōu)選地，所述表達(dá)⑶20的癌癥是B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。優(yōu)選地，所述I型抗-⑶20抗體是利妥昔單抗。優(yōu)選地，所述II型抗-⑶20抗體是人源化的B-Ly1抗體。優(yōu)選地，所述II型抗-⑶20抗體具有增加的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用(ADCC)。提供下面的實(shí)施例和圖來(lái)輔助理解本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)際范圍由后附的權(quán)利要求提出。要理解的是可以在不背離本發(fā)明精神的前提下對(duì)提出的方法進(jìn)行改進(jìn)。序列表SEQIDNO1鼠單克隆抗-⑶20抗體B-Lyl的重鏈(VH)的可變區(qū)的氨基酸序列。SEQIDNO2鼠單克隆抗-⑶20抗體B-Lyl的輕鏈(VL)的可變區(qū)的氨基酸序列。SEQIDNO:3_19人源化的B-Lyl抗體的重鏈(VH)的可變區(qū)的氨基酸序列(B-HH2-B-HH9,B-HL8，和B-HLlO到B-HL17)SEQIDNO20人源化的B-Lyl抗體的輕鏈(VL)的可變區(qū)的氨基酸序列B-KVl附圖簡(jiǎn)述圖II型抗-CD20抗體(利妥昔單抗)與II型抗-CD20抗體(B-HH6-B-KV1GE)的組合治療對(duì)OCI-LylS人非霍奇金淋巴瘤(NHL)的抗腫瘤活性，所述I型抗-⑶20抗體(利妥昔單抗)具有這樣的比率，即，關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力，所述I型抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比1.0的比率，所述II型抗-⑶20抗體(B-HH6-B-KV1GE)具有這樣的比率，即，關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的結(jié)合能力，所述II型抗-CD20抗體與利妥昔單抗相比0.44的比率。腫瘤體積的平均值[mm3]繪制在y軸上；腫瘤細(xì)胞注射后的天數(shù)繪制在χ-軸上。圖例A)賦形劑(圓形)，B)利妥昔單抗30mg/kgi.v.一周一次(三角形)·C)人源化的B-Iyl(B-HH6-B-KV1GE)30mg/kg一周一次(正方形)和D)利妥昔單抗與B-HH6-B-KV1GE共同施用(每種30mg/kg，一周一次)(交叉形)圖21型抗-⑶20抗體(Cy5_利妥昔單抗=白色條)和II型抗-⑶20抗體(Cy5人源化的B-LylB-HH6-B-KV1GE=黑色條)在Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的平均熒光強(qiáng)度(MFI，左y-軸)；關(guān)于與CD20的結(jié)合能力，I型抗-CD20抗體(利妥昔單抗)和II型抗-⑶20抗體(B-HH6-B-KV1GE)與利妥昔單抗相比的比率(在右y_軸上的刻度)圖3兩種II型抗⑶-20抗體的治療對(duì)于Z138人非霍奇金淋巴瘤(NHL)的抗腫瘤活性。兩種抗體都是人源化的B-Lyl抗-⑶20抗體；1)B-HH6-B-KV1糖改造的(GE)和2)B-HH6-B-KV1野生型(wt，未糖改造)。腫瘤體積的平均值[mm3]繪制在y軸上；在腫瘤細(xì)胞注射后的天數(shù)繪制在χ軸上。圖例A)賦形劑(圓形)，B)人源化的B-IylGE(B-HH6-B-KV1GE)30mg/kg每周一次(三角形)和C)人源化的B-Iylwt(B-HH6-B-KVlwt)30mg/kg一周一次(交叉形)實(shí)驗(yàn)方法實(shí)施例1I型抗-CD20抗體(利妥昔單抗)與II型抗-CD20抗體(B-HH6-B-KV1GE)的組合治療的抗腫瘤活件測(cè)試藥劑I型抗-⑶20抗體利妥昔單抗以?xún)?chǔ)液(c=10mg/ml)提供，其來(lái)自霍夫曼-拉羅奇，巴塞爾，瑞士(HoffmannLaRoche，Basel，Switzerland)。緩沖液包含聚山梨醇酯80，氯化鈉和檸檬酸鈉。II型抗-CD20抗體B-HH6-B-KV1GE(=人源化的Β-Lyl，糖改造的B-HH6-B-KV1，見(jiàn)WO2005/044859和WO2007/031875))以?xún)?chǔ)液提供(c=9.4mg/kg)，其來(lái)自格利卡特，SchlierenJi^±(GlycArt，Schlieren，Switzerland)。抗體緩沖劑包含組氨酸，海藻糖和聚山梨醇酯20。兩種溶液都適當(dāng)?shù)貜膬?chǔ)液稀釋在PBS中，以用于在前的注射。細(xì)胞系和培養(yǎng)條件使用0CI_Lyl8人非霍奇金淋巴瘤(NHL)細(xì)胞(Chang，H.，等，白細(xì)胞淋巴瘤(LeukLymphoma)·1992年9月；8(1-2)129-36)(彌漫型大細(xì)胞性淋巴瘤-DLCL)。將腫瘤細(xì)胞系常規(guī)培養(yǎng)在補(bǔ)充了20%胎牛血清(PAA實(shí)驗(yàn)室，奧地利)和2mML-谷氨酰胺，25nMHEPES和0.05mM巰基乙醇的INDM培養(yǎng)基(PAA，實(shí)驗(yàn)室，奧地利)中，條件為37°C，在5%CO2的水飽和大氣下。將第2代用于移植。動(dòng)物雌性SCID米色鼠；到達(dá)時(shí)4-5周齡(購(gòu)自Bomholtgard，Ry,丹麥)在無(wú)特定病原體的條件下維持，伴隨每天12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的周期，根據(jù)規(guī)定指南(committedguidelines(GV-Solas；Felasa；TierschG)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)研究方案由當(dāng)?shù)卣畬彶楹团鷾?zhǔn)。到來(lái)后，將動(dòng)物維持在動(dòng)物機(jī)構(gòu)的隔離區(qū)中一周，以使它們適應(yīng)新環(huán)境和用于觀察。常規(guī)進(jìn)行持續(xù)的健康監(jiān)測(cè)。任意提供膳食(ProvimiKliba3337)和水(酸化的pH2.5-3)。監(jiān)測(cè)每天控制動(dòng)物的臨床癥狀并檢測(cè)不利的效果。為了在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中監(jiān)測(cè)，每周兩次記錄動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)體重，并且在分期后用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤體積。動(dòng)物的治療動(dòng)物治療在隨機(jī)化那天，即細(xì)胞移植后24天開(kāi)始。人源化的II型抗-CD20抗體B-HH6-B-KV1GE接受組和相應(yīng)的賦形劑組以指定的30mg/kg劑量，在第24，31，38，45和52研究日i.v.q7d治療。在第26，33，40，47和54天，進(jìn)行I型抗-⑶20抗體利妥昔單抗作為單一藥劑的治療和與II型抗-⑶20抗體B-HH6-B-KV1GE組合的治療。體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制研究由于腫瘤負(fù)荷，接受賦形劑對(duì)照的荷瘤動(dòng)物在治療后10天被排除。以30mg/kg的利妥昔單抗作為單一藥劑每周一次治療動(dòng)物抑制了異種移植物生長(zhǎng)達(dá)10天(TGI68%)0之后，盡管進(jìn)行了另外的每周一次的利妥昔單抗單一藥劑注射，腫瘤異種移植物持續(xù)進(jìn)展。相反，每周一次用B-HH6-B-KV1GE(30mg/kg)進(jìn)行的單一藥劑治療控制了OCI-LylS腫瘤生長(zhǎng)(TGI100%)。盡管如此，最終腫瘤移植物還是在B-HH6-B-KV1GE單一藥劑施用下開(kāi)始進(jìn)展。然而，都在30mg/kg的利妥昔單抗和B-HH6-B-KV1GE的組合則明顯表現(xiàn)出優(yōu)越的功效。異種移植的腫瘤得到控制，并且與每種單一藥劑抗體武器(arm)相反，腫瘤停滯隨時(shí)間推移仍維持。實(shí)施例2關(guān)于與Raii細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力，II型抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比的比率的確定將Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)維持在包含10%FCS(Gibco，Cat.-No.10500-064)的RPMI-1640培養(yǎng)基(PanBiotechGmbH,Cat.-No.P04-18500)的培養(yǎng)物中。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，使用Cy5MonoNHS酯(阿莫仙GE健康保健(AmershamGEHealthcare)，目錄號(hào)PA15101)來(lái)標(biāo)記II型抗-⑶20抗體B-HH6-B-KV1(人源化的B-Lyl抗體)和利妥昔單抗。Cy5-綴合的利妥昔單抗具有2.0分子Cy5/抗體的標(biāo)記比率，Cy5-綴合的B-HH6-B-KV1具有2.2分子Cy5/抗體的標(biāo)記比率。為了確定和比較兩種抗體的結(jié)合能力和模式，通過(guò)使用伯基特淋巴瘤細(xì)胞系Raji(ATCC-No.CCL-86)的直接免疫熒光生成結(jié)合曲線(通過(guò)Cy5_綴合的利妥昔單抗和Cy5-綴合的B-HH6-B-KV1的滴定)。分別關(guān)于Cy5_綴合的利妥昔單抗和Cy5-綴合的B-HH6-B-KV1將平均熒光強(qiáng)度(MFI)分析為EC50(最大強(qiáng)度的50%)。將5*105細(xì)胞/樣品在4°C染色30分鐘。之后，將細(xì)胞在培養(yǎng)基中洗滌。將碘化丙錠(PI)染色用于排除死細(xì)胞。使用FACS陣列(BectonDickinson)進(jìn)行測(cè)量，在FarRedA測(cè)量碘化丙錠(PI)，在Red-A測(cè)量Cy5。圖2顯示，Cy5~標(biāo)記的B-HH6-B-KV1(黑色條)和Cy5_標(biāo)記的利妥昔單抗(白色條)以EC50(最大強(qiáng)度的50%)結(jié)合的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。接著，根據(jù)下式計(jì)算與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力的比率。與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的結(jié)合能力的比率二MFI(Cv5-抗-CD20抗體)χCv5標(biāo)記比率(Cv5-利妥昔單抗)MFI(Cy5-利妥昔單抗)Cy5標(biāo)記的比率(Cy5-抗-CD20抗體)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>=MFI(B-HH6-B-KVnχCy5標(biāo)記比率(Cy5-利妥昔單抗)MFI(Cy5-利妥昔單抗)Cy5標(biāo)記的比率(B-HH6-B-KV1)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>因此與利妥昔單抗相比，作為典型II型抗-⑶20抗體的B-HH6-B-KV1表現(xiàn)出降低的結(jié)合能力。實(shí)施例3糖改造的(GE)和非糖改造的(野生型，wt)抗-⑶20抗體(B-HH6-B-KV1GE和wt)針對(duì)SCID米代鼠中的Z138MCL異種移棺物的類(lèi)似的抗腫瘤活件測(cè)試藥劑II型抗-⑶20抗體B-HH6-B-KV1GE(糖改造的(GE)和野生型(wt))以?xún)?chǔ)液提供(c=9.4mg/kg和12.5mg/ml)，其來(lái)自格利卡特，Schlieren，瑞士(GlycArt，Schlieren,Switzerland)。抗體緩沖劑包含組氨酸，海藻糖和聚山梨醇酯20。兩種溶液都適當(dāng)?shù)貜膬?chǔ)液稀釋在PBS中，以用于在前的注射。細(xì)胞系和培養(yǎng)條件Z138人B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)細(xì)胞最初獲自格利卡特(GlycArt)(套細(xì)胞淋巴瘤-MCL)。將腫瘤細(xì)胞系常規(guī)培養(yǎng)在補(bǔ)充了20%胎牛血清(PAA實(shí)驗(yàn)室，奧地利)和2mML-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基(PAA，實(shí)驗(yàn)室，奧地利)中，條件為37°C，在5%CO2的水飽和大氣下。將第2代用于移植。動(dòng)物雌性SCID米色鼠；到達(dá)時(shí)4-5周齡(購(gòu)自Bomholtgard，Ry，丹麥)在無(wú)特定病原體的條件下維持，伴隨每天12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的周期，根據(jù)規(guī)定指南(committedguidelines(GV-Solas；Felasa；TierschG)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)研究方案由當(dāng)?shù)卣畬彶楹团鷾?zhǔn)。到來(lái)后，將動(dòng)物維持在動(dòng)物機(jī)構(gòu)的隔離區(qū)中一周，以使它們適應(yīng)新環(huán)境和用于觀察。常規(guī)進(jìn)行持續(xù)的健康監(jiān)測(cè)。任意提供膳食(ProvimiKliba3337)和水(酸化的pH2.5-3)。監(jiān)測(cè)每天控制動(dòng)物的臨床癥狀并檢測(cè)不利的效果。為了在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中監(jiān)測(cè)，每周兩次記錄動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)體重，并且在分期后用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤體積。治療動(dòng)物動(dòng)物治療在隨機(jī)化那天，即s.c.細(xì)胞移植后14天開(kāi)始。以指定的10mg/kg的劑量，在第14，20，27和34研究日，i.v.q7d治療人源化的抗CD20抗體(B-HH6-B-KV1GE和wt)接受組和相應(yīng)的賦形劑組。體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制研究由于腫瘤負(fù)荷，將接受賦形劑對(duì)照的荷瘤動(dòng)物在治療開(kāi)始后的19天排除。用10mg/kg的作為wt或糖改造的B-HH6-B-KV1(B-HH6-B-KV1GE和wt)每周治療動(dòng)物在開(kāi)始治療后不久即抑制了異種移植物的長(zhǎng)出(outgrowth)。在控制終止時(shí)，所有的抗體腫瘤退化，并且隨后，大部分的Z138腫瘤異種移植物顯示完全的好轉(zhuǎn)。在這種異種移植物模型中，觀察到在wt和糖改造形式的抗⑶20抗體B-HH6-B-KV1之間沒(méi)有顯著的差異。這并不是不可能的，因?yàn)樾∈蟛辉谒鼈兊腘K細(xì)胞上表達(dá)正確的Fc受體，并且此外，由于嚴(yán)重的三重免疫缺陷，認(rèn)為SCID米色鼠對(duì)于NK-介導(dǎo)的ADCC是無(wú)能力的。因此，在SCID米色鼠中的s.c.異種移植物模型不適合于模擬關(guān)于糖改造修飾抗體的人ADCC介導(dǎo)的效果。權(quán)利要求I型抗-CD20抗體用于制備藥物的應(yīng)用，所述藥物用于治療表達(dá)CD20的癌癥，所述應(yīng)用的特征在于所述I型抗-CD20抗體與II型抗CD-20抗體共同施用。2.I型抗-⑶20抗體用于制備藥物的應(yīng)用，所述藥物用于治療患有表達(dá)⑶20的癌癥的患者，所述應(yīng)用的特征在于所述I型抗-CD20抗體與II型抗CD-20抗體共同施用。3.I型抗-⑶20抗體，用于治療表達(dá)⑶20的癌癥，其特征在于所述I型抗-⑶20抗體與II型抗⑶-20抗體共同施用。4.I型抗-CD20抗體，用于治療患有表達(dá)CD20的癌癥的患者，其特征在于所述I型抗-⑶20抗體與II型抗⑶-20抗體共同施用。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于a)所述I型抗-⑶20抗體具有這樣的比率，即關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力，所述I型抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比0.8-1.2的比率，和b)所述II型抗-⑶20抗體具有這樣的比率，即關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力，所述II型抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比0.3-0.6的比率。6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于所述表達(dá)CD20的癌癥是B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于所述I型和II型抗-CD20抗體是單克隆抗體。8.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于所述I型抗-CD20抗體是利妥昔單抗。9.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于所述II型抗-CD20抗體是人源化的B-Lyl抗體。10.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于所述I型抗-CD20抗體是利妥昔單抗，所述II型抗-CD20抗體是人源化的B-Lyl抗體并且所述表達(dá)CD20的癌癥是B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。11.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于所述II型抗-CD20抗體具有增加的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用(ADCC)。12.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于，所述II型抗-⑶20抗體Fc區(qū)的至少40%以上的寡糖是非巖藻糖基化的。13.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于所述I型抗-CD20抗體具有這樣的比率，即關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力，所述I型抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比0.9-1.1的比率。14.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于所述II型抗-CD20抗體具有這樣的比率，即關(guān)于與Raji細(xì)胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力，所述II型抗-⑶20抗體與利妥昔單抗相比0.35-0.55，優(yōu)選地0.4-0.5的比率。15.一種試劑盒，其包含II型抗-⑶20抗體和I型抗-⑶20抗體，用于組合治療患有表達(dá)⑶20的癌癥的患者。16.根據(jù)權(quán)利要求15的試劑盒，其特征在于所述I型抗-CD20抗體是利妥昔單抗，所述II型抗-⑶20抗體是人源化的B-Lyl抗體并且所述表達(dá)⑶20的癌癥是B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。全文摘要本發(fā)明涉及I型和II型抗-CD20抗體的組合療法，其用于治療癌癥，尤其是表達(dá)CD20的癌癥。文檔編號(hào)C07K16/28GK101821292SQ200880105614公開(kāi)日2010年9月1日申請(qǐng)日期2008年8月20日優(yōu)先權(quán)日2007年9月5日發(fā)明者克里斯蒂安·克萊因,巴勃羅·烏馬納,托馬斯·弗里斯申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司;羅氏格黎卡特股份公司