專利名稱：Il-23拮抗劑治療感染的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及感染的治療。具體而言，本發(fā)明涉及將IL-23拮抗劑(例如， 抗體)給予表現(xiàn)出感染(諸如，慢性細(xì)菌感染、真菌感染或病毒感染)的個(gè)體。
背景技術(shù)：
許多病原體引起慢性感染。例如各種病毒、真菌和細(xì)菌可以引起無(wú)法消退 的持久性感染。
隨著嚴(yán)重真菌感染的數(shù)目繼續(xù)上升，對(duì)用于其治療的方法和組合物的需要 更為緊迫。主要真菌病原體包括白色念珠菌(Om^V/a fl/Z^a"力、煙曲霉 (y45pergz'〃tw/i/mz'ga/w力以及新型隱J求菌(C^y/ tococcw5 weoy^附am1)， 其中在美國(guó)， 涉及此類病原體的侵襲性霉菌病的每年發(fā)病率經(jīng)估算為每一百萬(wàn)人口中72-228 例(念珠菌物種)、12-34例(曲霉菌物種)及30-66例(新型隱球菌)感染。 Pfaller等人(2006) C7/". /"/e". 43:S3-14。真菌感染的上升主要?dú)w因于免疫受 損患者數(shù)目增加，這是醫(yī)學(xué)發(fā)展(移植和化療)的結(jié)果以及AIDS患者人口漸增 的結(jié)果。免疫受損患者中80%以上的真菌感染由念珠菌物種引起。隱球菌病 (cryptoccosis)為繼念珠菌病(candidiasis)之后在AIDS患者中第二位流行的真菌 感染。曲菌病(aspergillosis)引起癌癥及器官移植患者中至少30。/。的感染并且具有 高死亡率。
雖然多年來(lái)氟康唑(fluconazole)已成為抵抗真菌病原體的有效藥物，但抗性 也在日益增加。諸如兩性霉素B(amphotericinB)的替代藥物具有嚴(yán)重缺點(diǎn)，包括 諸如發(fā)熱、腎損壞、貧血、低血壓、頭痛、惡心、嘔吐及靜脈炎的副作用。
由于免疫受損個(gè)體的人口增加以及抗生素抗性菌林廣泛發(fā)展，盡管抗生素 很普遍，但細(xì)菌感染仍為重要問(wèn)題。免疫受損個(gè)體包括老年人、移植接受者、 化療患者以及患有獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的個(gè)體。在美國(guó)每年在醫(yī)院中 有近兩百萬(wàn)患者受到感染，且引起這些感染的細(xì)菌的70%對(duì)至少一種抗生素具有抗性。NIAID Fact Sheet, "The Problem of Antimicrobial Resistance," 2006年4 月。近年來(lái)，在美國(guó)有約90，000人死于感染，遠(yuǎn)高于1992的13,300人。雖然大部 分細(xì)菌感染仍對(duì)至少一種抗生素的延長(zhǎng)治療時(shí)程(例如，連續(xù)靜脈內(nèi)給予萬(wàn)古 霉素(vancomycin))敏感，但無(wú)法保證這對(duì)將來(lái)的病原菌仍然成立。曱氧西林抗 性金黃色葡萄球菌(Methicillin resistant 5V印Ao/ococcias aMreM， MRSA)為代表重 大公眾健康挑戰(zhàn)的多重抗生素抗性微生物的主要實(shí)例。2002年，疾病控制中心 (Centers for Disease Control, CDC)報(bào)導(dǎo)了密歇根州(Michigan)的第一例在患者中 完全耐受萬(wàn)古霉素的金黃色葡萄球菌感染(稱為VRSA)。持久性細(xì)菌病原體還包 括沙門氏菌屬(Sa/mowe〃a 5pp.)、布魯氏桿菌屬CBrace〃a及衣原體屬
分枝桿菌(Mycobacteria)為 一組多樣且廣泛分布的不形成芽孢的需氧不動(dòng) 桿菌(bacilli)，其具有高細(xì)胞壁脂質(zhì)含量及緩慢的生長(zhǎng)速率。分枝桿菌屬(genus M;;co^c^7'Mm)的成員的毒性不同，例如自無(wú)害至具有重大病原性的物種，例 如結(jié)核病(TB)中的病原體結(jié)核分枝桿菌(M. rt^ercw/ow'力。TB為世界上第二主要 感染死因。據(jù)估算約二十億人或全世界人口的三分之一感染有結(jié)核分枝桿菌。 每年發(fā)生八百萬(wàn)新病例且近三百萬(wàn)人死亡。TB直接引起全世界所有死亡的70/。， 由于抗藥生物體的傳播(spread)以及HIV的持續(xù)流行，TB這一全球流行病可 能惡化。參見(jiàn)例如Dale及Federman (編輯)(2002)『AMZ) 5Wewfty c Mec//"'"e， WebMD Professional Publishing, New York, NY。
目前治療TB的大部分方法包括使用廣譜抗感染劑，諸如異煙肼(isoniazid)、 利福平(rifampin) 、 p比溱酰胺(pyrazinamide)、 乙胺丁醇(ethambutol)、鏈霉素 (streptomycin)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)及氧氟沙星(ofloxacin)。然而,這些藥劑 可在多種器官中引起毒性，且隨著若干抗生素抗性TB菌株生長(zhǎng)而失去功效。通 過(guò)使用多種非抗生素藥劑降低結(jié)核患者肺中的分枝桿菌負(fù)荷可以防止疾病形 成、傳纟番及死亡。
慢性病毒感染也代表了對(duì)公眾健康的重大威脅。無(wú)法完全根除諸如丙型肝 炎病毒(HCV)或人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒感染可能導(dǎo)致隨后再活化和并發(fā) 癥，分別如肝癌或獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。 Robertson及Hasenkrug (2006) S; n'"ger&w/w./mmw". 28:51。此外，人乳頭瘤病毒(HPV)基因型16、 18、 31、 33、 45及56為95%以上的宮頸癌病例的原因。Berzofsky等人(2004) /. C"m./wveW.114:450。據(jù)估算實(shí)際上在100。/。的HIV感染病例、55-85。/。的HCV感染病例及300/0 以上的HPV病例中會(huì)出現(xiàn)慢性感染。Berzofsky等人(2004)。
對(duì)用于治療和/或預(yù)防細(xì)菌感染、病毒感染以及真菌感染的改良方法和組合 物存在需要。與現(xiàn)有治療方法和組合物相比，這些方法和組合物優(yōu)選具有較低 毒性和/或較高功效。
發(fā)明概述
本發(fā)明通過(guò)提供使用IL-23拮抗劑對(duì)抗細(xì)菌感染、病毒感染和真菌感染的組 合物、藥物以及方法來(lái)滿足這些需要及更多需要。
一方面，本發(fā)明涉及治療患有感染、懷疑患有感染、或有獲得感染風(fēng)險(xiǎn)的 個(gè)體的方法，該方法包括給予IL-23拮抗劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，拮抗劑為與IL-23 或其pl9亞基結(jié)合的結(jié)合化合物，諸如抗體或其結(jié)合片段。在一些實(shí)施方式中， 抗體的結(jié)合阻斷IL-23或其pl9亞基與IL-23受體或其IL-23R亞基的結(jié)合。在另一 個(gè)實(shí)施方式中，IL-23拮抗劑與IL-23受體或其IL-23R亞基結(jié)合。在一些實(shí)施方式 中，拮抗劑與IL-23受體或其IL-23R亞基結(jié)合，阻斷與IL-23或其pl9亞基的結(jié)合。 在另 一方面中，本發(fā)明涉及用于所述治療方法中的組合物。
在一些實(shí)施方式中，感染病癥包括感染疾病，諸如細(xì)菌感染、分枝桿菌感 染、病毒感染或真菌感染。在一個(gè)實(shí)施方式中，感染病癥為由牛分枝桿菌(M. 6ov&)、麻風(fēng)分枝桿菌(M. /eprae)或結(jié)核分枝桿菌引起的分枝桿菌感染。在一個(gè) 實(shí)施方式中，感染病癥為TB。在另一個(gè)實(shí)施方式中，感染病癥為選自曱真菌病 (onychomycosis)、念i朱菌病(candidiasisa)、曲菌病、隱5求菌病的真菌感染。在另 一個(gè)實(shí)施方式中，感染病癥為由白色念珠菌(例如，慢性皮膚粘膜念珠菌病 (chronic mucouctaneous candidiasis),我鳥(niǎo)口掩(thrush))、新型隱球菌或煙曲霉 引起的真菌感染。在另一個(gè)實(shí)施方式中，感染病癥為病毒感染，例如由人免疫 缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)或人乳頭瘤病毒 (HPV)引起的病毒感染。
在其它實(shí)施方式中，感染病癥為慢性感染。在各種實(shí)施方式中，盡管先前 曾進(jìn)行至少一次消退感染的嘗試，但慢性感染已持續(xù)l、 2、 4、 6、 9、 12、 18、 24、 36或48個(gè)月或更久。在各種實(shí)施方式中，消退慢性感染的先前嘗試包括用 抗微生物劑、抗生素、抗病毒劑或抗真菌劑治療。
8在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及組合給予IL-23拮抗劑與至少一種其它治療 形式(諸如，另一治療劑)的組合療法。在各種實(shí)施方式中，另一治療劑為IL-17A 拮抗劑、IL-17F拮抗劑、IL-12激動(dòng)劑(包括IL-12)、 TGF-(3拮抗劑或IL-6拮抗 劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，另一治療劑為一種或多種選自下列物質(zhì)的抗真菌劑 泊沙康峻(posaconazole)、氟康哇、伏立康哇(voriconazole)、 ^f尹曲康哇 (itraconazole)、酉同康哇(ketoconazole)、矛H可峻(liarozole)、 j尹替馬哇(irtemazol)、 克霉哇(clotrimazole)、咪康哇(miconazole)、益康峻(econazole)、布康哇 (butoconazole)、奧昔康峻(oxiconazole)、硫康哇(sulconazole)、漆康哇(tioconazole) 及特康唑(terconazole)、經(jīng)取代的遂唑、蓬二唑、嚼二唑、卡泊芬凈(caspoftmgin)、 兩性霉素B 、制霉菌素(nystatin)、匹馬菌素(pimaricin)、氟胞嘧，定(flucytosine)(5-氟胞嘧啶，5-fluorocytosine)、萘替芬(naftifine)、特比萘芬(terbinafine)、布替萘 芬(butenafme)、硫代碳酸酯托萘酯(thiocarbonate tolnaftate)、灰黃霉素 (griseoftilvin)、胺石典酮(amiodarone)、多不p比司(ciclopirox)、舒苯汀(sulbentine)、阿 莫羅芬(amorolfine)、氯碘羥喹(clioquinol)、龍膽紫(gentian violet)、碘化鉀、硫 代硫酸鈉、石炭酸-品紅溶液及棘白菌素(echinocandins)(例如，乙酸卡泊芬凈 (caspofimgin acetate)、米卡芬凈(micafungin)及P可尼芬凈(anidulaftingin))。
在另 一個(gè)實(shí)施方式中，另 一治療劑為 一種或多種選自由下列的抗微生物劑 異煙肼、利福平、吡"秦酰胺、乙胺丁醇、鏈霉素、環(huán)丙沙星、萬(wàn)古霉素或氧氟 沙星。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，另一治療劑為一種或多種選自下列的抗病毒劑阿 巴卡韋(abacavir)、阿昔洛韋(acyclovir)、金剛烷胺(amantadine)、安普那韋 (amprenavir)、地拉韋"定(delavirdine)、去羥肌香(didanosine)、依發(fā)韋侖(efavirenz)、 泛昔洛韋(famciclovir^ 茚地那韋(indinavir)、干擾素a(interferon alfa, IFN-a)、 利巴韋林(ribavirin)、拉米夫定(lamivudine)、奈非那韋(nelfinavir)、奈韋拉平 (nevirapine)、奧司他韋(oseltamivir)、噴昔洛韋(penciclovir)、利巴韋林、利托那 韋(ritonavir)、沙查那韋(saquinavir),司他夫定(stavudine)、萬(wàn)乃洛韋(valacyclovir)、 扎西他濱(zalcitabine)、扎那米韋(zanamivir)、齊多夫定(zidovudine)(疊氮脫氧胸 香(azidodeoxythymidine) ， AZT)。
一方面，本發(fā)明涉及增強(qiáng)患有感染或懷疑患有感染的個(gè)體中l(wèi)型(Thl)免疫 反應(yīng)的方法。在各種實(shí)施方式中，Thl反應(yīng)的增強(qiáng)反映在與經(jīng)IL-23拮抗劑治療
9之前的T細(xì)胞的百分比相比，表達(dá)IFN-y的CD4+T細(xì)胞百分比增加、表達(dá)IL-17A 的CD4+T細(xì)胞百分比減少或兩者。在各種實(shí)施方式中，增加或減少1.5倍、2倍、 3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更多。在另一方面中，本發(fā)明涉及用于所述增 強(qiáng)Th 1反應(yīng)的方法中的組合物。
在各種實(shí)施方式中，另 一治療劑在給藥IL-23拮抗劑之前和/或同時(shí)和/或之 后給藥。在一個(gè)實(shí)施方式中，IL-17A拮抗劑在給藥IL-23拮抗劑之前和/或同時(shí)給 藥。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗菌劑、抗真菌劑或抗病毒劑與IL-23拮抗劑同時(shí)給 藥。
在另一方面中，本發(fā)明涉及治療患有感染、懷疑患有感染或處于獲得感染 的風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體的方法，其包括給予IL-17A和/或IL-17F的拮抗劑，諸如針對(duì)細(xì) 胞因子自身或其各受體或受體亞基的拮抗型抗體。
在其它實(shí)施方式中，IL-23拮抗劑包括多核苷酸。在各種實(shí)施方式中，多核 苷酸為反義多核苷酸(例如，反義RNA)或小干擾RNA(siRNA)。在一個(gè)實(shí)施方式 中，IL-23的多核苷酸拮抗劑以諸如腺病毒、慢病毒(lentivirus)、逆轉(zhuǎn)錄病毒或 腺相關(guān)病毒載體的基因療法載體遞送。在另一個(gè)實(shí)施方式中，IL-23的多核苦酸 拮抗劑以治療劑形式遞送。
在另 一個(gè)實(shí)施方式中，IL-23拮抗劑包括可溶性受體多肽。在一實(shí)施方式中， IL-23拮抗劑為來(lái)源于IL-23R的胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性片段。
在各種實(shí)施方式中，IL-23拮抗劑為抗體或其抗原結(jié)合片段。在各種實(shí)施方 式中，抗體或其抗原結(jié)合片段包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、完 全人抗體；抗體片l殳(例如，F(xiàn)ab、 Fab'、 Fab'-SH、 Fv、 scFv、 F(ab')2及雙功能抗 體(diabody))。在其它實(shí)施方式中，拮抗劑包括抗體的肽^t擬物。在其它實(shí)施 方式中，抗體或其抗原結(jié)合片段經(jīng)可檢測(cè)標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方式中，IL-23拮抗 劑為展現(xiàn)降低的補(bǔ)體活化、抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)或兩者的抗體或其抗原 結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，具有降低的效應(yīng)功能的IL-23拮抗劑抗體或其片 段為抗IL-23受體(例如，抗IL-23R)抗體或片段。在各種實(shí)施方式中，具有降低 的效應(yīng)功能的抗體為抗體片段(例如，F(xiàn)ab、 Fab'、 Fab'-SH、 Fv、 scFv、 F(ab')2)、 IgG4或具有改變的糖基化作用。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及通過(guò)給予有效量的特異性結(jié)合選自 IL隱23pl9、 IL-23R、 IL-17A、 IL-17F、 IL陽(yáng)17RA、 IL畫17RC、 IL-6及TGF-(3的任兩種蛋白的雙特異性抗體來(lái)治療感染，例如，慢性真菌感染、細(xì)菌感染或病毒感 染。在一實(shí)施方式中，蛋白為人蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方式中，IL-23拮抗劑對(duì)IL-23(或其受體)具有特異性且不拮抗 IL-12(或其受體)。在各種實(shí)施方式中，通過(guò)體外結(jié)合檢觀'J(例如，ELISA)或通過(guò) 生物檢測(cè)(例如，BaF3細(xì)胞增殖或Thl7細(xì)胞產(chǎn)生的促進(jìn))來(lái)檢測(cè)拮抗作用。在各 種實(shí)施方式中，抑制IL-12與其受體結(jié)合的IC50與抑制IL-23與其受體結(jié)合的IC50 的比率(IC50u2/IC50!L-23)為1.5、 2、 3、 4、 5、 7、 10、 15、 20、 50、 IOO或更大。
在一個(gè)實(shí)施方式中，使用本發(fā)明的方法和組合物來(lái)治療TB且治療的成功通 過(guò)細(xì)菌負(fù)荷減少來(lái)沖企測(cè)。在各種實(shí)施方式中，分枝桿菌負(fù)荷通過(guò)結(jié)核菌素 (tuberculin)測(cè)試、曼托測(cè)試(Mantoux test)或臨床樣品中分枝桿菌DNA或RNA的 存在來(lái)4企測(cè)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，患有感染的個(gè)體先前已使用其它方法或組合 物治療過(guò)。在一個(gè)實(shí)施方式中，先前治療沒(méi)有有效消除感染。在另一個(gè)實(shí)施方
如)AIDS、移植或化療而免疫受損。
本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋IL-23拮抗劑在制備用于治療 一種或多種選自下列感染 疾病的藥物中的用途真菌感染、持久性真菌感染、念珠菌病、慢性皮膚粘膜 念珠菌病(CMC)、曲菌病、隱球菌病、病毒感染、持久性病毒感染、HIV感染、 HBV感染、HCV感染、持久性細(xì)菌感染、分枝桿菌感染、結(jié)核分枝桿菌感染、 牛分枝桿菌感染及麻風(fēng)分枝桿菌感染。在一些實(shí)施方式中，藥物可以包含一種 或多種其它治療劑。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物可與一種或多種其它治 療劑結(jié)合使用。
附圖簡(jiǎn)述


圖1A-1 E顯示關(guān)于IL-23/IL-17依賴性途徑對(duì)念珠菌病易感性的作用的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果。經(jīng)胃內(nèi)給小鼠注射108毒性念珠菌。自三次實(shí)驗(yàn)匯集結(jié)果(每次實(shí)驗(yàn)每組6 只小鼠)。
圖lA顯示pl9一、 p35一、 p40;及C57BL/6(WT)小鼠隨時(shí)間的存活百分比(0/0)。
圖1B顯示在感染后第3天及第10天胃中的真菌生長(zhǎng)(CFU)。在第3天及第10
天的時(shí)間點(diǎn)pl9一、 p35;或p40一小鼠與C57BL/6小鼠相比，結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有
ii差異(p<0.05，由*指示)。
圖1C顯示MLN中的p35和pl9 mRNA表達(dá)(感染1天后)以及IL-12p2R和 IL-23RmRNA表達(dá)(感染3天后)。通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)。
圖1D顯示感染一周后產(chǎn)IFN-Y、 IL-17或IL-4的MLNCD4+細(xì)胞的頻率。產(chǎn)生 細(xì)胞因子的細(xì)胞的頻率通過(guò)ELISPOT檢測(cè)測(cè)定，值為每105個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞因 子的細(xì)胞的平均數(shù)(士SE)。
圖1E顯示感染3天后胃勻漿中炎性細(xì)胞因子(IL-17、 IL-23、 IFN-y、 IL-12) 的含量。細(xì)胞因子通過(guò)ELISA檢測(cè)(pg/ml)。
在圖1C-1E中，如圖中所示，比較感染小鼠(+)與未經(jīng)感染小鼠(-)(*)時(shí)，以 及比較pl9一或p35一小鼠與C57BL/6小鼠(**)時(shí)，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(p0.05)。
圖2A和2B顯示關(guān)于IL-23/IL-17依賴性途徑對(duì)曲菌病易感性的作用的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果。小鼠經(jīng)鼻內(nèi)感染2xl(f個(gè)曲霉菌休眠分生孢子。圖2A和2B中所示的結(jié)果 自四次實(shí)驗(yàn)匯集(6只動(dòng)物/組)。
圖2A顯示感染3天后肺中的真菌生長(zhǎng)(幾丁質(zhì)含量，表示為葡糖胺微克數(shù)/ 器官)。當(dāng)比較pl9一、 p35;或p40一小鼠與C57BL/6小鼠("時(shí)差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著 (p<0.05)。
圖2B顯示TLN中的p35/p 19 mRNA表達(dá)(感染1天后)和IL-12p2R/IL-23R mRNA表達(dá)(感染3天后)。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)信使RNA(Messenger RNA)表達(dá)。如 圖中所示，當(dāng)比較感染小鼠(+)與未經(jīng)感染小鼠(-)(*)時(shí)，以及比較pl9一或p35^ 小鼠與C57BL/6小鼠(**)時(shí)，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(p0.05)。
圖3A-3C顯示關(guān)于IL-23/IL-17依賴性途徑對(duì)真菌感染的易感性中的重要性 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖1及2中感染小鼠，在感染5h后用200jigpl9或IL-17中和抗體 或在感染5 h和24 h后用1 mg TGF-P中和抗體治療。
圖3A顯示在感染3天后患有念珠菌病(白色念珠菌)或曲菌病(煙曲霉)的小鼠 的胃或肺中的真菌生長(zhǎng)。如圖中所示，當(dāng)比較經(jīng)治療小鼠(+)與未經(jīng)治療(-)小鼠 (*)時(shí)，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(p0.05)。
圖3B分別顯示如通過(guò)ELISPOT^r測(cè)所測(cè)定，來(lái)自患有念珠菌病或曲菌病的 小鼠的MLN或TLN的產(chǎn)生IFN-y或IL-17的CD4+細(xì)胞頻率。值為每105個(gè)細(xì)胞中 產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞的平均數(shù)(士SE)。圖3B進(jìn)一步展示在經(jīng)抗原刺激的未分級(jí)分 離的MLN或TLN的培養(yǎng)物上清液中的實(shí)際IL-17產(chǎn)生(感染一周后)。如圖中所示，當(dāng)比較經(jīng)感染與未經(jīng)感染(Ct)小鼠("時(shí)，以及比較經(jīng)治療(+)與未經(jīng)治療(-) 小鼠(**)時(shí)，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(p0.05)。
圖3C顯示在感染3天后經(jīng)上述pl9中和抗體治療的患有念珠菌病的小鼠胃 中的真菌生長(zhǎng)。如圖中所示，當(dāng)比較經(jīng)治療小鼠(+)與未經(jīng)治療小鼠(-)(*)時(shí)，以 及比較IL-4一、 IFN-/-、 p35^或IFN-,7p35一小鼠與BALB/c小鼠(^)時(shí)，差異在 統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(p0.05)。
圖4A-4D顯示關(guān)于DC亞群中響應(yīng)真菌的IL-23和IL-12產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將
激，評(píng)估其細(xì)胞因子表達(dá)。
圖4A顯示細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)RT-PCR分析，圖4B展示如通過(guò) ELISA檢測(cè)的細(xì)胞因子表達(dá)(pg/ml)。使用酵母聚糖(Zymosan)、 LPS(IO嗎/ml)或 CpG-ODN 2006(0.06 pM)作為陽(yáng)性對(duì)照。將DC以10:1的比率暴露于酵母。如圖 中所示，當(dāng)比較暴露的DC與未暴露("未")的DC("時(shí)，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著 (p<0.05)。
圖4C顯示來(lái)自pl9一小鼠或p35一小鼠的脾CDllc+DC中的IL-12及IL-23 產(chǎn)生。在;f企測(cè)培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因子前用真菌刺激小鼠。
圖4D顯示如圖中所示，在IL-12或IL-23(10 ng/ml)存在(+)或不存在(-)下或在 中和抗IL-12或抗IL-23抗體(10iig/ml)存在下，來(lái)自暴露于真菌12 h的C57BL/6小 鼠的脾CD1 lc+ DC中的IL-12及IL-23產(chǎn)生。
圖5A-5C顯示關(guān)于對(duì)真菌反應(yīng)的炎性DC響應(yīng)真菌產(chǎn)生IL-23的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具 體而言該產(chǎn)生是否具有TLR及T細(xì)胞依賴性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖5A顯示來(lái)自先暴露于真菌12 11的不同類型小鼠的脾00110+ DC中的 IL-23產(chǎn)生(pg/ml)。顯示了自四次實(shí)驗(yàn)匯集的結(jié)果。如圖中所示，當(dāng)比較暴露的 DC與未暴露("未")的DC("時(shí)，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(p0.05)。
C57BL/6(WT)或p35一小鼠的脾CD4十T細(xì)胞在未經(jīng)脈沖(組2及5)或經(jīng)念珠菌酵母 (Ag)脈沖(組3及6)的相應(yīng)脾DC存在下培養(yǎng)。脈沖后5天，通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞因 子(IL-12、 IL-23、 IFN-y、 IL-17)。組l及4為經(jīng)真菌刺激且無(wú)T細(xì)胞的C57BL/6或 p35一 DC。組7及8為在真菌存在下分別用C57BL/6或p35一DC培養(yǎng)的p35^或 C57BL/6 CD4+T細(xì)胞。如圖中所示，當(dāng)比較組3和7與組1的IFN-Y產(chǎn)生，以及當(dāng)比較組6和8與組4的IL-23和IL-17產(chǎn)生時(shí)，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(p0.05，由*指 示)。
圖5C顯示類似于圖5B中所示數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)，不同的是一些樣品包括抗IL-23 或抗TGF-卩抗體。在相應(yīng)脾DC存在下培養(yǎng)來(lái)自C57BL/6(WT)(組l-3)或p35,組 4-6)小鼠的脾CD4十T細(xì)胞。在10嗎/ml IL-23或TGF-P中和抗體存在下將培養(yǎng)物 用念珠菌酵母(Ag)脈沖，通過(guò)ELISA定量培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因子(IFN-y、
IL-17產(chǎn)生將組5與組4比較時(shí)，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(p0.05，由*指示)。
圖6A-6E顯示關(guān)于IL-23和IL-17削弱抗真菌效應(yīng)功能及破壞PMN的抗炎程 序的能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖6A顯示在37。C下在5:1的效應(yīng)物與真菌細(xì)胞比率下用未經(jīng)調(diào)理的酵母(30 min)或分生孢子(60 min)將育后來(lái)自C57BL/6(WT)、 pl9一或p35一小鼠的PMN中 的殺真菌活性。結(jié)果繪制為菌落形成單位抑制百分比(平均值士SE)的圖。結(jié)果反 映來(lái)自三次實(shí)驗(yàn)的匯集數(shù)據(jù)。如圖中所示，當(dāng)比較pl9一或p35一 PMN與 C57BL/6(WT)PMN("時(shí)，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(p0.05)。
圖6B顯示來(lái)自暴露于指定濃度下的IL-23或IL-17的C57BL/6(WT)小鼠的 PMN殺真菌活性。當(dāng)比較暴露于細(xì)胞因子的PMN與未暴露的PMN("時(shí)，差異 在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(p0.05)。
圖6C和6D顯示來(lái)自暴露于IFN-丫(50 ng /ml)、 IL-23(100 ng /ml)及IL-17(100 ng /ml)的各種組合60 min的C57BL/6(WT)小鼠的PMN殺真菌活性。檢測(cè)抵抗念 珠菌酵母或曲霉菌分生孢子的殺真菌活性(圖6C)。還檢測(cè)了MMP9/MPO產(chǎn)生(圖 6D)。通過(guò)明膠酶譜法(zymography)評(píng)估明膠酶及髓過(guò)氧化物酶的產(chǎn)生，對(duì)培養(yǎng) 物上清液進(jìn)行Western印跡分析。凝膠展示對(duì)應(yīng)于活性92 kDa MMP9及60 kDa MPO的條帶。如圖中所示，當(dāng)比較暴露于細(xì)胞因子的PMN與未暴露的PMN時(shí)C10 以及當(dāng)比較暴露于(IFN-y+IL-23)或(IFN-"IL-17)的PMN與暴露于IFN-y的P畫 時(shí)(**)，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(p0.05)。
圖6E顯示W(wǎng)estern印跡上的條帶。將PMN在體外暴露于IFN-y、 IL-23 及IL-17的各種組合12h。接著通過(guò)Western印跡法測(cè)定IDO蛋白表達(dá)。表達(dá)
IDO的MC24轉(zhuǎn)染子及經(jīng)模擬轉(zhuǎn)染的MC22細(xì)胞分別充當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
卩-微管蛋白充當(dāng)加樣對(duì)照。發(fā)明詳述
除非上下文另外清楚規(guī)定，否則如本文(包括隨附權(quán)利要求書)所用的單數(shù) 形式的詞(諸如，"一個(gè)"、"一種"和"所述")包括其相應(yīng)復(fù)數(shù)指示物。除
些例示性實(shí)施方式之前可放置諸如"例如，，、"在一實(shí)施方式中，，或其它此類 非限制性語(yǔ)言的短語(yǔ)，或其例示性質(zhì)可自上下文顯而易見(jiàn)(例如，"實(shí)施例")。 除非另外指示，否則諸如"不抑制"的術(shù)語(yǔ)意欲為相對(duì)的而非絕對(duì)的。舉例而
言，抑制IL-23但"不"抑制IL-12的藥劑指當(dāng)該藥劑以給定濃度存在于這兩種細(xì) 胞因子的比較檢測(cè)中時(shí)，抑制IL-12不如抑制IL-23有效的藥劑。
本文所引用的所有文獻(xiàn)以全文引用的方式并入，其并入程度如同各單獨(dú)出 版物、數(shù)據(jù)庫(kù)條目、專利申請(qǐng)或?qū)＠鞔_且單獨(dú)地以引用的方式并入一般。
I.定義
除非上下文另外明確指示，否則"活化"、"刺激"和"治療"在其應(yīng)用 于細(xì)胞或受體時(shí)可具有相同含義，例如用配體活化、刺激或治療細(xì)胞或受體。
"配體"涵蓋天然和合成配體，例如細(xì)胞因子、細(xì)胞因子變體、類似物、突變 蛋白質(zhì)及來(lái)源于抗體的結(jié)合組合物。"配體"還涵蓋小分子，例如細(xì)胞因子的 肽模擬物和抗體的肽模擬物。"活化"可指如由內(nèi)部機(jī)制以及外部或環(huán)境因素 調(diào)控的細(xì)胞活化。例如細(xì)胞、組織、器官或生物體的"反應(yīng)"涵蓋生物化學(xué)或 生理學(xué)行為(例如，生理隔室內(nèi)的濃度、密度、粘著或遷移、基因表達(dá)率或分 化狀態(tài))的變化，其中該變化與活化、刺激或治療或諸如基因程序設(shè)計(jì)的內(nèi)部 機(jī)制相關(guān)聯(lián)。
分子的"活性"可描述或指分子與配體或受體的結(jié)合；催化活性；刺激基
因表達(dá)或細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化或成熟的能力；抗原活性；對(duì)其他分子活性的調(diào)
節(jié)等。分子的"活性"還可指調(diào)節(jié)或保持細(xì)胞-細(xì)胞相互作用(例如，粘著)的活
性或保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)(例如，細(xì)胞膜或細(xì)胞骨架)的活性。"活性"還可指比活性 (例如[催化活性]/[蛋白質(zhì)毫克數(shù)]或[免疫活性]/[蛋白質(zhì)毫克數(shù)])、生物代謝區(qū)
中的濃度等。"增殖活性"涵蓋促進(jìn)(例如)正常細(xì)胞分裂以及癌癥、腫瘤、 發(fā)育不良、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移及血管生成所需的活性或與它們特定相關(guān)的活性。"給藥(給予)(administration)"和"治療(處理)(treatment)"在其應(yīng) 用于動(dòng)物、人、實(shí)驗(yàn)個(gè)體、細(xì)胞、組織、器官或生物流體時(shí)指外源藥物、治療 劑、診斷劑或組合物與動(dòng)物、人、個(gè)體、細(xì)胞、組織、器官或生物流體的接觸。
"給藥(給予)"和"治療(處理)"可指例如，治療性的、藥物動(dòng)力學(xué)的、 診斷的、研究和實(shí)驗(yàn)性方法。細(xì)胞的處理涵蓋試劑與細(xì)胞的接觸以及試劑與流 體的接觸，其中該流體與細(xì)胞接觸。"給藥(給予)"和"治療(處理)"還 指通過(guò)試劑、診斷、結(jié)合組合物或另一細(xì)胞對(duì)(例如)細(xì)胞的體外和離體治療
(處理)。"治療"在其應(yīng)用于人個(gè)體、獸醫(yī)學(xué)個(gè)體或研究個(gè)體時(shí)指治療性治 療、預(yù)防性或防止性措施，還指研究及診斷應(yīng)用。"治療(處理)"在其應(yīng)用 于人個(gè)體、獸醫(yī)學(xué)個(gè)體或研究個(gè)體或細(xì)胞、組織或器官時(shí)涵蓋IL-23或IL-23R拮 抗劑與人或動(dòng)物個(gè)體、細(xì)胞、組織、生理隔室或生理流體的接觸。"細(xì)胞的處 理"還涵蓋(例如)在流體相或膠體相中IL-23或IL-23R拮抗劑與IL-23R復(fù)合體
(IL-23R/IL-12R(31異二聚體)接觸的情形，但也涵蓋拮抗劑不與細(xì)胞或接受 者接觸的情形。
"結(jié)合組合物"指能夠與靶標(biāo)結(jié)合的分子、小分子、大分子、抗體、其片 段或類似物或可溶性受體。"結(jié)合組合物"還可指能夠與標(biāo)靶結(jié)合的分子復(fù)合 體(例如，非共價(jià)復(fù)合體)、離子化分子及經(jīng)共價(jià)或非共價(jià)修飾的分子(例如， 經(jīng)磷酸化、?；?、交聯(lián)、環(huán)化或限制性裂解修飾)。"結(jié)合組合物"還可指能夠 與標(biāo)靶結(jié)合的與穩(wěn)定劑、賦形劑、鹽、緩沖劑、溶劑或添加劑組合的分子。"結(jié) 合"可定義為結(jié)合組合物與標(biāo)靶的締合(association)，其中在結(jié)合組合物可以 溶解或懸浮于溶液中的情況下，締合會(huì)導(dǎo)致結(jié)合組合物的正常布朗運(yùn)動(dòng) (Brownian motion)減少。
本發(fā)明的結(jié)合化合物可以包括雙特異性抗體。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"雙特異 性抗體"指對(duì)至少兩種不同抗原表位具有結(jié)合特異性的抗體，通常為單克隆抗 體。在一個(gè)實(shí)施方式中，表位來(lái)自相同抗原。在另一個(gè)實(shí)施方式中，表位來(lái)自 兩種不同抗原。用于制造雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。舉例而言，可 使用兩種免疫球蛋白重鏈/輕鏈對(duì)的共同表達(dá)來(lái)重組產(chǎn)生雙特異性抗體。參見(jiàn)例 如Milstein等人(1983)A^/w" 305: 537-39?；蛘?，可使用化學(xué)鍵聯(lián)來(lái)制備雙特異 性抗體。參見(jiàn)例如Brennan等人(1985) 6We"ce 229: 81。雙特異性抗體包括雙特 異性抗體片段。參見(jiàn)例如Holliger等人(1993) /Voc. A^/.爿cW."S乂 90:6444-48, Gruber等人，/www"o/. 152: 5368 (1994)。
"典型TH1型T細(xì)胞，，為表達(dá)干擾素-y(IFN力程度比表達(dá)IL-4、 IL-5或IL-13 中的每一種大的T細(xì)胞，而"典型TH2型T細(xì)胞，，為表達(dá)IL-4、 IL-5或IL-13每一 種的程度比表達(dá)IFNy大的T細(xì)胞。"程度"通常為典型TH2型細(xì)胞的4倍或更大， 更通常8倍或更大，且最通常16倍或更大。
如本文所定義的"記憶T細(xì)胞"為之前暴露于給定抗原的長(zhǎng)命(long-lived) T細(xì)胞的亞群。記憶T細(xì)胞可存在于生物體中多年，以允許對(duì)隨后相同抗原的激 發(fā)作出快速反應(yīng)。小鼠記憶T細(xì)胞的表型定義為CD4+高CD45RB低。人記憶T細(xì)胞 的表型定義為CD45RA陰性,低CD45R0高。對(duì)這些記憶T細(xì)胞的IL-23處理導(dǎo)致IL-17 的增殖及表達(dá)。除非另外指示，否則如本文所用的"IL-17"指IL-17A。參見(jiàn)例 如Moseley等人(2003) C>toh>7e c& Factor Aev. 14:155。
"保守修飾的變體"適用于氨基酸和核酸序列。對(duì)于具體的核酸序列，保 守修飾的變體指編碼相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不 編碼氨基酸序列的情況下指基本上相同的核酸序列。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性， 所以大量功能相同的核酸可編碼任何給定的蛋白。
關(guān)于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到所編碼的序列中氨基酸或小部 分氨基酸經(jīng)保守氨基酸取代的核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的改變?yōu)?保守修 飾的變體。提供功能類似的氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域熟知的。保守取代的 實(shí)例為以下一組中的氨基酸換為同 一組的另 一種氨基酸(授予Lee等人的美國(guó)專 利No.5,767,063; Kyte和Doolittle (1982)/. Mo/.所o/. 157: 105-132):
(1) 疏水性正亮胺酸、Ile、 Val、 Leu、 Phe、 Cys或Met;
(2) 中性親水性Cys、 Ser、 Thr;
(3) 酸'I"生Asp、 Glu;
(4) 石威性Asn、 Gln、 His、 Lys、 Arg;
(5) 影響鏈取向的殘基Gly、 Pro;
(6) 芳族Trp、 Tyr、 Phe;
(7) 小氨基酸Gly、 Ala、 Ser。
"有效量"涵蓋足以改善或預(yù)防醫(yī)學(xué)病狀的癥狀或體征的量。有效量還指 足以允許或利于診斷的量。對(duì)特定患者或獸醫(yī)個(gè)體而言的有效量可視下列因素 而變諸如所治療的病狀、患者的整體健康狀況、給藥的方法途徑和劑量、以及副作用嚴(yán)重程度。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No. 5,888,530。有效量可為避免顯著副 作用或毒性效應(yīng)的最大劑量或給藥方案。該效應(yīng)將使得診斷檢測(cè)或參數(shù)改善至 少5%，通常至少10%，更通常至少20%,最通常至少30%，優(yōu)選至少40%,更 優(yōu)選至少50%,最優(yōu)選至少60%，理想地至少70%，更理想地至少80%，且最理 想地至少90%，其中100%定義為正常個(gè)體所顯示的診斷參數(shù)。參見(jiàn)例如Maynard 等人(1996)爿T/朋必ooA o/ SOi^/or Good C7Z"/ca/尸rac"'ce, Interpharm Press, Boca Raton， FL; Dent (2001) Good丄a6orato^y awe Good C7Zm'ca/尸racrtce， Urch Publ., London, UK。
"外源，，指視上下文而定在生物體、細(xì)胞或人體外部產(chǎn)生的物質(zhì)。"內(nèi)源" 指視上下文而定在細(xì)胞、生物體或人體內(nèi)部產(chǎn)生的物質(zhì)。
"感染性疾病"指生物體、器官、組織或細(xì)胞的微生物(例如，細(xì)菌、病 毒和/或真菌)感染。
"產(chǎn)IL-17細(xì)胞，，指不為典型TH1型T細(xì)胞或典型TH2型T細(xì)胞的T細(xì)胞。"產(chǎn) IL-17細(xì)胞"還指表達(dá)基因或多肽(例如，有絲分裂原反應(yīng)性P-蛋白；趨化因子 配體2;白介素-17(IL-17);轉(zhuǎn)錄因子ROR-fT相關(guān)的；細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑
其中"大于，，定義如下。在IL-23激動(dòng)劑下的表達(dá)通常比在IL-12處理下大至少5 倍，通常大至少10倍，更通常大至少15倍，最通常大至少20倍，優(yōu)選大至少25 倍，且最優(yōu)選大至少30倍?？蓹z測(cè)(例如)在處理基本上純的產(chǎn)IL-17細(xì)胞群體的 情況下的表達(dá)。
此外，"產(chǎn)IL-17細(xì)胞，，包括在細(xì)胞發(fā)育或細(xì)胞分化的途徑中分化成如上定 義的產(chǎn)IL-17細(xì)胞的祖細(xì)胞或前體細(xì)胞。產(chǎn)IL-17細(xì)胞的祖細(xì)胞或前體細(xì)胞可見(jiàn)于 引流淋巴結(jié)(DLN)中。此外，"產(chǎn)IL-17細(xì)胞"涵蓋已(例如)通過(guò)佛波醇酯(phorbol ester)、離子載體(ionophore)和/或致癌劑(例如)活化，進(jìn)一步分化、儲(chǔ)存、冷 凍、干燥、滅活，(例如)通過(guò)細(xì)胞凋亡、蛋白水解或脂質(zhì)氧化部分降解或(例如) 通過(guò)重組技術(shù)修飾的如上定義的產(chǎn)IL-17細(xì)胞。
"抑制劑""拮抗劑"指抑制(例如)配體、受體、輔因子、基因、細(xì)胞、 組織或器官的抑制分子。基因、受體、配體或細(xì)胞的調(diào)節(jié)劑是改變基因、受體、 配體或細(xì)胞的活性的分子，其中調(diào)節(jié)特性方面的活性可^皮活化、抑制或改變。 調(diào)節(jié)劑可單獨(dú)作用，或其可使用輔因子，例如蛋白質(zhì)、金屬離子或小分子。抑制劑是降低、阻斷、阻止、延遲活化、滅活、脫敏或下調(diào)(例如)基因、蛋白、 配體、受體或細(xì)胞的化合物?；罨瘎樵黾?、活化、促進(jìn)、增強(qiáng)活化、敏化或 上調(diào)(例如)基因、蛋白、配體、受體或細(xì)胞的化合物。抑制劑還可定義為降 低、阻斷或滅活組成性活性的組合物。"拮抗劑"為對(duì)抗激動(dòng)劑作用的化合物。 拮抗劑阻止、降低、抑制或中和激動(dòng)劑活性。拮抗劑還可在甚至不存在確定的 激動(dòng)劑情況下阻止、抑制或降低靶標(biāo)(例如，靶受體)的組成性活性。
IL-23的拮抗劑(例如)包括破壞IL-23的生物活性(諸如，如下文更詳細(xì)描 述的Thl7細(xì)胞的擴(kuò)增及存活)的任何藥劑。IL-23受體和IL-23R的拮抗劑為IL-23 拮抗劑的亞類，因?yàn)樗鼈冇靡酝ㄟ^(guò)阻斷IL-23信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)阻斷IL-23活性。
為^r測(cè)抑制程度，舉例而言，用潛在活化劑或抑制劑處理包含給定蛋白、 基因、細(xì)胞或生物體的樣品或檢測(cè)，將它們與無(wú)抑制劑的對(duì)照樣品比較。指定 對(duì)照樣品(即，未經(jīng)拮抗劑處理)具有100%的相對(duì)活性值。當(dāng)相對(duì)于對(duì)照的活 性值為約90%或更小，通常85%或更小，更通常80%或更小，最通常75%或更小， 一般70%或更小，更一般65%或更小，最一般60%或更小，通常55%或更小，通 常50%或更小，更通常45%或更小，最通常40%或更小，優(yōu)選35%或更小，更優(yōu) 選30%或更小，更優(yōu)選25%或更小且最優(yōu)選小于25%時(shí)，實(shí)現(xiàn)抑制。當(dāng)相對(duì)于對(duì) 照的活性值為約110%， 一般至少120%,更一4殳至少140%，更一4殳至少160%， 通常至少180%，更通常至少2倍，最通常至少2.5倍，通常至少5倍，更通常至少 10倍，優(yōu)選至少20倍，更優(yōu)選至少40倍，且最優(yōu)選超過(guò)40倍時(shí)，實(shí)現(xiàn)活化。
活化或抑制的終點(diǎn)可如下監(jiān)測(cè)?？赏ㄟ^(guò)終點(diǎn)來(lái)監(jiān)測(cè)(例如)細(xì)胞、生理流體、 組織、器官和動(dòng)物或人個(gè)體的活化、抑制及對(duì)治療的反應(yīng)。終點(diǎn)可包括(例如)) 的細(xì)菌負(fù)荷、致癌性、或細(xì)胞脫?；蚍置?如細(xì)胞因子、有毒氧或蛋白酶的釋 放)的標(biāo)記降低預(yù)定的量或百分比。終點(diǎn)可包含(例如)預(yù)定量的離子流或輸 送；細(xì)胞遷移；細(xì)胞粘附；細(xì)胞增殖；轉(zhuǎn)移的可能性；細(xì)胞分化；及表型變化 (例如與炎癥、凋亡、轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期或轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因表達(dá)的變化)。參見(jiàn) 例如Knight (2000) j朋.C"".丄W. 30:145-158; Hood及Cheresh (2002) iVa/M^ i ev. 2:91-100; Timme等人(2003) CWr i>wg rwgete 4:251-261; Robbins
及Itzkowitz P002)M^/. C7z.". 7VoW/ 爿m. 86:1467-1495; Gmdy及Markowitz P00"
T ev. ( ewomz.c^//wn. GeweA 3:101-128; Bauer等人(2001) 36:235-243; Stanimirovic及Satoh (2000) 5razw尸a/Ao/. 10:113-126。抑制終點(diǎn)一般為對(duì)照的75%或更少，優(yōu)選為對(duì)照的50%或更少，更優(yōu)選為 對(duì)照的25%或更少，且最優(yōu)選為對(duì)照的10%或更少。 一般而言，活化終點(diǎn)為對(duì) 照的至少150Q/。，優(yōu)選為至少對(duì)照的2倍，更優(yōu)選為至少對(duì)照的四倍且最優(yōu)選為 至少對(duì)照的10倍。
"敲除，，(KO)指部分或完全降低由(例如)編碼IL-23或IL-23受體的亞基的 基因編碼的至少一部分多肽的表達(dá)，其中該基因?qū)Σ溉閯?dòng)物的單一細(xì)胞、所選 細(xì)胞或所有細(xì)胞為內(nèi)源的。KO還涵蓋其中生物學(xué)功能P爭(zhēng)低但表達(dá)未必降低的實(shí) 施方式，例如含有插入的滅活肽的多肽。敲除技術(shù)涵蓋編碼序列或調(diào)控序列的 破壞。細(xì)胞或哺乳動(dòng)物可為"雜合敲除"，其中內(nèi)源基因的一個(gè)等位基因被破 壞?；蛘?，細(xì)胞或哺乳動(dòng)物可為"純合敲除"，其中內(nèi)源基因的兩個(gè)等位基因 都被破壞。"純合敲除"不欲將兩個(gè)等位基因的破壞限于相同技術(shù)或基因組的 相同結(jié)果。
通過(guò)光譜學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、同位素或化學(xué)方法可直4^或 間接才企測(cè)經(jīng)"標(biāo)記，，的組合物。舉例而言，可用的標(biāo)記包括"P、 33P、 35S、 14C、 3H、 125I、穩(wěn)定同位素、熒光染料、電子致密試劑(electron-densereagent)、底物、 表位標(biāo)簽、或酶(例如，如用于酶聯(lián)免疫檢測(cè))或仿氟(fluorette)。例如參見(jiàn)Rozinov 及Nolan (1998) CAew.所o/. 5:713-728。
"配體""指(例如))可充當(dāng)受體的激動(dòng)劑或拮抗劑的小分子、肽、多肽及
膜締合或膜結(jié)合分子或其復(fù)合體。"配體"還涵蓋并非激動(dòng)劑或拮抗劑但可與 受體結(jié)合的藥劑。此外，"配體，，包括已(例如)通過(guò)化學(xué)或重組方法改變的 膜結(jié)合配體、該膜結(jié)合配體的可溶性形式。通常在配體經(jīng)膜結(jié)合于第一細(xì)胞上 的情況下，受體通常存在于第二細(xì)胞上。第二細(xì)胞可具有與第一細(xì)胞相同或不 同的特性。配體或受體可完全在細(xì)胞內(nèi)，即，其可存在于細(xì)胞液、核或一些其 它胞內(nèi)隔室中。配體或受體可改變其位置，例如自胞內(nèi)隔室至質(zhì)膜的外表面。 配體與受體的復(fù)合體稱為"配體受體復(fù)合體"。在配體及受體參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途 徑中的情況下，配體存在于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游位置且受體存在于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路 徑的下游^f立置。
"標(biāo)記"涉及細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物(例如，產(chǎn)IL-17細(xì)胞)的表型。標(biāo) 記用以(例如)在細(xì)胞純化、定量、轉(zhuǎn)移、活化、成熟或發(fā)育期間4企測(cè)細(xì)胞， 可用于體外及體內(nèi)研究。活化標(biāo)記為與細(xì)胞活化有關(guān)的標(biāo)記。
20"經(jīng)純化的細(xì)胞，，涵蓋基本上不含其它類型細(xì)胞(例如，無(wú)其它類型T細(xì)
胞污染)的(例如) 一種或多種"產(chǎn)IL-17細(xì)胞，，。純度可通過(guò)使用由幾何坐 標(biāo)或包括(例如)燒瓶、管或小瓶的隔室界定的體積來(lái)評(píng)估。"經(jīng)純化的產(chǎn)IL-17 細(xì)胞"可通過(guò)(例如)隔室定義，其中"產(chǎn)IL-17細(xì)胞，，通常占所有細(xì)胞的至少 20%，更通常所有細(xì)胞的至少30%,最通常所有細(xì)胞的至少40%， 一般所有細(xì)胞 的至少50%,更一般所有細(xì)胞的至少60%,最一般所有細(xì)胞的至少70%，優(yōu)選所 有細(xì)胞的至少80%，更優(yōu)選所有細(xì)胞的至少90%;且最優(yōu)選所有細(xì)胞的至少95%。 "小分子"定義為分子量小于10kD，通常小于2kD且優(yōu)選小于l kD的分子。 小分子包括但不限于無(wú)機(jī)分子、有機(jī)分子、含有無(wú)機(jī)組份的有機(jī)分子、包含放 射性原子的分子、合成分子、肽模擬物及抗體模擬物。作為治療劑，與大分子 相比，小分子更可透過(guò)細(xì)胞，較不易降解且較不易于引起免疫反應(yīng)。諸如抗體 和細(xì)胞因子的肽模擬物的小分子以及小分子毒素在本領(lǐng)域中已知。參見(jiàn)例如 Casset等人(2003)說(shuō)oc/ e附.5一/ , T^s. C蘭mw". 307:198-205; Muyldermans (2001) 歷ofec/mo/. 74:277-302; Li (2000) 7Va/. AotecA"o/. 18:1251-1256; Apostolopoulos等人(2002) Cw/r. CAe附.9:411-420; Monfardini等人(2002)
Cwm8:2185-2199; Domingues等人(1999) 說(shuō)o/. 6:652-656; Sato及Sone (2003)所ocAew.丄371:603-608;美國(guó)專利No. 6,326,482。 當(dāng)涉及配體/受體、抗體/抗原或其它結(jié)合對(duì)時(shí)，"特異性"或"選擇性"結(jié) 合指示決定蛋白質(zhì)在異源群體的蛋白質(zhì)和其它生物制品中的存在的結(jié)合反應(yīng)。 因此，在指定條件下，指定配體與特定受體結(jié)合且不以顯著量與樣品中存在的
物與其抗原或其變體或突變蛋白質(zhì)結(jié)合的親和力比與任何其它抗體或來(lái)源于其 的結(jié)合組合物的親和力大至少2倍，優(yōu)選大至少10倍，更優(yōu)選大至少20倍且最優(yōu) 選大至少100倍。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體對(duì)所需靶標(biāo)的親和力大于約109 升/摩爾(如(例如)由Scatchard分析所測(cè)定)。Munsen等人(1980) 乂wa(yf.別oc/iem. 107:220-239。
與IL-23或IL-23受體"特異性結(jié)合"的抗體不與不包含IL-23衍生的序列的 蛋白質(zhì)結(jié)合，即本文所用的"特異性"涉及IL-23特異性，而非任何其它可能存 在于所討論蛋白質(zhì)中的序列。舉例而言，如本文所用，與IL-23 "特異性結(jié)合" 的抗體通常結(jié)合包含IL-23及FLAG㊣肽標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)FLAG-hlL-23,,但不結(jié)合單獨(dú)的？1^0@肽標(biāo)簽或與非IL-23的蛋白質(zhì)融合的FLAG 肽標(biāo)簽。依據(jù)本 文，對(duì)IL-23的特異性還可指與IL-23 (或其受體)結(jié)合而不與其它蛋白質(zhì)諸如 IL-12 (或其受體)結(jié)合的能力。
II.概述
雖然IL-23及IL-12為具有共同亞基及共同受體亞基的異二聚體細(xì)胞因子，但 近來(lái)的結(jié)果表明它們?cè)谘装Y及宿主防御中的作用更為拮抗的而非重疊的。白介 素-23(IL-23)為由兩個(gè)亞基(即pl9和p40)組成的異二聚體細(xì)胞因子。pl9亞基 在結(jié)構(gòu)上與IL-6、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)及IL-12的p35亞基相關(guān)。p40亞基 為細(xì)胞因子IL-12的一部分，IL-12由p35和p40組成。異二聚體IL-12通常稱為 IL-12p70。 IL-23通過(guò)結(jié)合由IL-23R和IL-12Rpi組成的異二聚體受體來(lái)介導(dǎo)信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)。IL-12Rpi亞基為IL-12受體所具有的，IL-12受體由IL-12R(31和IL-12R卩2 組成。IL-23及IL-23受體及其各自的IL-23特異性亞基公開(kāi)于WO 99/05280、 WO 01/18051 、 WO 00/73451及WO 01/85790中。
IL-12的大量早期研究涉及p40的遺傳缺失(p40敲除小鼠；p40KO小鼠)， 但隨后由IL-23的發(fā)現(xiàn)認(rèn)識(shí)到這些小鼠的IL-12及IL-23兩者均有缺失。Oppmann 等人(2000) /附www々 13:715-725 ; Wiekowski等人(2001) 7m附ww /. 166:7563-7570; Parham等人(2002) / /附ww"o/. 168:5699- 708; Frucht (2002) 57X^2002， El-E3; Elkins等人(2002)/w/ec"ow immMw砂70:1936-1948。這些結(jié)果 改變了最初認(rèn)為與IL-12及Thl反應(yīng)有關(guān)的許多早期觀測(cè)的解釋。
近來(lái)的研究表明CD4十T細(xì)胞效應(yīng)物庫(kù)(effector repertoire)的種類比Thl/Th2 范例所涵蓋更多。目前認(rèn)為Thl7細(xì)胞為效應(yīng)Th細(xì)胞的單獨(dú)譜系，該效應(yīng)Th細(xì)胞 參與先前歸因于Thl譜系的免疫病理學(xué)。雖然導(dǎo)致Thl7分化的通路尚未清楚 (Dong (2006) A^Aev/mm柳o/6:329),但I(xiàn)L-23為產(chǎn)生及維持此譜系的關(guān)鍵細(xì)胞 因子(Trinchieri等人(2003) /wm柳^ 19:641)。雖然IL-12及IL-23都可誘導(dǎo)CD4十T 細(xì)胞表達(dá)IFN-y，但僅IL-23促進(jìn)Th細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子IL-17。
盡管有許多類似之處，但日益增加的證據(jù)表明IL-12及IL-23啟動(dòng)不同免疫通 路。IL-17致敏的細(xì)胞(Thl7細(xì)胞)引起多種器官相關(guān)的自體免疫疾病(Harrington 等人(2006) 0#r. C^'w. /wm柳o/. 18:349 )，包括實(shí)-驗(yàn)性自體免疫腦脊髓炎 (experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)(Langrish等人(2005) 五xp.201:233)、關(guān)節(jié)炎(Murphy等人(2003)五x; . 198:1951)、結(jié)腸炎(Yen 等人(2006) C"". /"ve" 116:1310)及自體免疫心肌炎(Sonderegger等人(2006) /附m柳o/. 36:2844)。此外，雖然不太明確，但高含量IL-23/IL-17的產(chǎn)生比 IL-12/IFN-y與各種感染中疾病的嚴(yán)重程度及免疫病理學(xué)關(guān)聯(lián)更密切。Hunter (2005) A^. T ev. 7mmw"o/. 5:521; Rutitzky (2005) //wmw"o/. 175:3920。其它研究 表明IL-12和IL-23在抵抗肺炎克雷伯氏桿菌(〖/^si'e〃a ;wewmom'ae)(Happel等人 (2005) 202:761)和嚙齒動(dòng)物 一寧檬酸桿菌(C"ra6a"er
ra&w"wm)(Mangan等人(2006) A/^w" 441:231)的宿主防御中具有不同作用。這 些研究表明IL-12和IL-23對(duì)體內(nèi)促進(jìn)抗微生物免疫反應(yīng)和疾病具有不同作用。
IL-12及IL-23在炎癥及宿主防御中的不同作用對(duì)慢性感染(諸如，慢性真菌 感染)具有重要意義。雖然炎癥為迅速控制真菌感染所需，但為保持感染和相 關(guān)疾病的〗呆護(hù)與免疫病理學(xué)之間的平衡需要消退炎癥。Han和Ulevitch (2005) A/aA /附mw"o/. 6:1198。長(zhǎng)期炎癥為多種慢性疾病及自體免疫性的標(biāo)志。Han及 Ulevitch (2005)。對(duì)于念珠菌，無(wú)法消退炎癥與真菌清除缺陷有關(guān)。未消退的念 珠菌感染導(dǎo)致了慢性皮膚粘膜念珠菌病(CMC)。 CMC與自體免疫性多內(nèi)分泌病 -念J朱菌病-夕卜胚層營(yíng)養(yǎng)不良(polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy)(功能異常T細(xì)胞活性的病狀)有關(guān)。Ryan等人(2005) /.爿〃wgy /mmimo/. 116:1158。 CMC還涵蓋多種免疫發(fā)病機(jī)理未知的臨床病癥。Lilic (2002) Cwr. 0; z力./"/e" ZXs. 15:143。對(duì)于曲霉菌，伴隨難治的感染的持久性炎癥在同 種異體造血干細(xì)胞移植后的非中性白細(xì)胞減少癥患者(Ortega等人(2006) 5owe Mwraw 7)ww; /a"f 37:499)以及過(guò)每丈性真菌疾病(Schubert (2006) C/z'". i ev. 爿〃ergy/mmw"o/. 30:205)中常見(jiàn)。近二十年來(lái)，主要根據(jù)如受不同類型調(diào)節(jié)T細(xì) 胞(T reg)的組合影響的Thl/Th2平衡解釋真菌感染和相關(guān)炎癥疾病的免疫發(fā)病 機(jī)理。Romani (2004)艦Aev, /m臓wo/. 4:1; Romani及Puccetti (2006) T薦A M'c油W. 14:183。
雖然炎癥為對(duì)真菌的保護(hù)性反應(yīng)的基本組份，但其調(diào)節(jié)異?？赡茱@著惡化 真菌疾病。如本文所7>開(kāi)，IL-23和IL-17負(fù)性調(diào)節(jié)IL-12/Thl介導(dǎo)的對(duì)真菌的免 疫抗性，且具有先前歸因于不受控制的Thl細(xì)胞反應(yīng)的炎癥作用。已知IL-23促 進(jìn)Thl7細(xì)胞(它產(chǎn)生IL-17且引起炎癥)的存活，拮抗IL-12介導(dǎo)的Thl反應(yīng)(這 涉及干擾素-Y(IFN-力的產(chǎn)生)。Langrish等人(2004)/附mw"o/. T ev. 202:96。如本文所證實(shí)，IL-12產(chǎn)生及Thl反應(yīng)的IL-23相反調(diào)節(jié)導(dǎo)致不受控制的炎癥及兩種主要 人類真菌病原體白色念珠菌及煙曲霉的生長(zhǎng)。IL-23和IL-17均破壞炎癥程序及嗜 中性粒細(xì)胞的抗真菌活性，導(dǎo)致與感染有關(guān)的嚴(yán)重組織炎癥病理學(xué)?？傊?，IL-23 啟動(dòng)的炎癥促進(jìn)感染，削弱抗真菌免疫抗性。還參見(jiàn)Zelante等人(2007) /mmwwo/. 37:2695及Cooper (2007)/mmwwo/. 37:2680的相關(guān)評(píng)i侖。通過(guò) IL-23的拮抗作用調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)代表了 一種刺激對(duì)真菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)的有 前途的策略。
本發(fā)明提供用于治療感染(諸如，慢性感染)的組合物和方法，其通過(guò)阻 斷IL-23和/或IL-17的活性以減少Thl7細(xì)胞的影響，使得發(fā)生穩(wěn)固的Thl反應(yīng)并消 除受感染細(xì)胞或生物體來(lái)實(shí)現(xiàn)。在最優(yōu)選狀況下，結(jié)果為感染完全消退的無(wú)菌 治療(即，治療可停止而不會(huì)再發(fā)生感染)。
關(guān)于Thl7細(xì)胞在保持起反作用的炎癥狀態(tài)中的作用的相同論證適用于慢 性病毒及細(xì)菌感染(諸如，結(jié)核病(TB))的狀況。細(xì)胞因子為免疫細(xì)胞的可溶 性調(diào)節(jié)子。以下細(xì)胞因子已在感染TB的患者的胸膜或支氣管肺泡灌洗(BAL)流 體中4企測(cè)到IL-1|3、 TNFa、 IFNy、 TGF(3及IL-12。參見(jiàn)例如Crystal等人(編輯) (1997) 丄wwgv 5Wew"y c Fot/w/arto叫Lippincott-Raven, New York, NY， 第 2381-2394頁(yè)。已顯示示IFN-y和TNFa在分枝桿菌感染的控制中具有重要作用。 參見(jiàn)例如Cooper等人(1993) 乂五xp. 178:2243; Flynn等人(1993)丄五:cp. Me丄 178:2249; Kindler等人(1989) Ce〃 56:731; Cheuse等人(1994)爿w. / 尸aAo/. 145:1105。在IL-23促進(jìn)Thl7細(xì)胞存活，減少IL-12啟動(dòng)的IFN-y產(chǎn)生的程度上， 可期望IL-23活性的拮抗作用增強(qiáng)細(xì)菌感染的消退。
文獻(xiàn)表明)在(例如自體免疫病癥或慢性感染的治療中用IL-23拮抗劑治療 可比用IL-12拮抗劑治療安全。Chackerian等人描述其中經(jīng)由抗體中和作用或在 p 1 ,敲除(KO)小鼠中基因消除來(lái)消除IL-23活性并不損害對(duì)分枝桿菌(BCG)感 染的免疫性的實(shí)驗(yàn)。Chackerian等人(2006) 乂Me丄74:6092。 IL-23pl9 KO 小鼠中的感染過(guò)程與野生型小鼠中的感染過(guò)程難以區(qū)別，且經(jīng)抗IL-23pl9處理 的小鼠中細(xì)菌菌落形成單位數(shù)目與經(jīng)同種型對(duì)照處理的小鼠中的數(shù)目并無(wú)不 同。相比之下，IL-12缺陷型KO小鼠無(wú)法控制BCG的生長(zhǎng)，IL-12的抗體阻斷與 脾、肝及肺中CFU數(shù)比經(jīng)同種型對(duì)照處理的小鼠顯著更高相關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果表 明在IL-12存在下，IL-23在抵抗分枝桿菌的宿主防御中不具有重要作用，因此對(duì)IL-23的選擇性抑制可比涉及IL-12中和作用(同時(shí)具有或不具有IL-23中和作用)
損害宿主防御而安全，而且還在實(shí)際上可有利于幫助消退由IL-23/IL-17炎癥的 調(diào)節(jié)異常所引起的慢性感染。
Chackerian等人(2006)中的實(shí)驗(yàn)并沒(méi)用設(shè)計(jì)來(lái)解決阻斷IL-23是否能增強(qiáng)先 前存在的慢性分枝桿菌感染的清除的問(wèn)題。對(duì)照小鼠(WT小鼠，未經(jīng)處理或僅 經(jīng)同種型對(duì)照抗體處理)能夠有效清除感染而非發(fā)展慢性感染。在Chackerian 等人(2006)的KO小鼠及抗體阻斷實(shí)驗(yàn)中，將IL-23活性在靜脈內(nèi)感染BCG之前而 非感染之后消除。本文所述的實(shí)驗(yàn)涉及真菌感染而非分枝桿菌感染。此外，本 文實(shí)施例4和5中所述的實(shí)驗(yàn)包括使用胃內(nèi)和鼻內(nèi)給藥真菌病原體而非靜脈內(nèi)給 藥的實(shí)驗(yàn)。與靜脈內(nèi)遞送相比，這些真菌病原體直接遞送至肺及胃提供生理上 更相關(guān)的疾病模型。已提出在本文所述的實(shí)驗(yàn)中感染真菌病原體的組織作為其 中Thl7反應(yīng)可具有最重要生理作用的組織(即，肺及腸的粘膜屏障)。Cua及 Kastelein (2006) /mmimo/. 7:557。此外，在本文所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)中抗IL-23p19
和抗IL-17抗體在感染5小時(shí)后給藥而非感染之前給藥。
iii.真菌感染中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
長(zhǎng)期炎癥為多種慢性疾病及自體免疫性的標(biāo)志。Han和Ulevitch (2005)。在 發(fā)現(xiàn)IL-23以及近來(lái)證實(shí)的其在自體免疫炎癥中的作用(Cua等人(2003) A^wre 421:744; Langrish等人(2005) /Ex/ . 201:233)之前，認(rèn)為IL-12通過(guò)引發(fā)和 維持Thl反應(yīng)而引起反應(yīng)過(guò)度的免疫及自體免疫病癥。這對(duì)真菌感染及疾病也 成立，其中證明免疫調(diào)節(jié)為微調(diào)炎癥和不受控制的Thl/Th2抗真菌反應(yīng)性所必 需。Ryan等人(2005); Romani (2004); Romani及Puccetti (2006)。
本發(fā)明的研究結(jié)果證明IL-23/IL-17軸而非不受控制的Thl反應(yīng)與缺陷病原 體清除、無(wú)法消退炎癥及引發(fā)對(duì)念珠菌和曲霉菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)有關(guān)。因此， 新發(fā)現(xiàn)可用以調(diào)和慢性炎癥反應(yīng)與難治形式的真菌感染(其中真菌持續(xù)存在于 進(jìn)行中的炎癥表面上)的自相矛盾的關(guān)聯(lián)。
IL-23及IL-1 7甚至在IFN-y存在下也都能削弱PMN的抗真菌效應(yīng)活性，發(fā)現(xiàn) 結(jié)果表明Thl7效應(yīng)通路優(yōu)于Thl通路。此外，通過(guò)消除巧l咮胺2,3-雙加氧酶(IDO) 的IFN-y依賴性活化(已知其限制PMN的抗真菌炎癥狀況)(Bozza等人(2005) J.
25/附mtmo/. 174:2910)以及通過(guò)誘導(dǎo)MMP9及MPO的釋放(可能為與Thl7細(xì)胞活化 有關(guān)的高度炎癥病理及組織破壞的原因)，兩種細(xì)胞因子活化PMN的炎癥程序。
對(duì)IDO的作用受到了關(guān)注。IDO在白色念珠菌中表達(dá)，它參與色胺酸營(yíng)養(yǎng)缺 陷型依賴性的真菌發(fā)酵抑制。Bozza等人(2005)。類似于IDO阻斷且與IFN-Y相反 (Kalo-Klein等人(1990)/"/e"./mm柳.58:260)， IL-17促進(jìn)真菌發(fā)酵(數(shù)據(jù)未展示)， 發(fā)現(xiàn)結(jié)果表明了對(duì)真菌IDO (對(duì)來(lái)自哺乳動(dòng)物宿主免疫系統(tǒng)的信號(hào)具有高度反 應(yīng)性的酶)的作用。Mellor及Munn (2004) A/aA Aev. 7mmwwo/. 4:762。因此，Thl7 通路的功能除了促進(jìn)炎癥和破壞抗微生物免疫性的能力，如已針對(duì)其它感染所 述(McKenzie等人(2006) 7Ve"A7mww"o/. 27:17)，還包括對(duì)真菌形態(tài)和毒性的作 用。這可以同時(shí)引起IL-4+Th2細(xì)胞活化(已知IL-4+Th2細(xì)胞活化嚴(yán)格依賴高度 真菌生長(zhǎng)(Mencacci等人(1996) /"/e". /mm柳.64:4907))進(jìn)一步阻止Thl起作用。
如已針對(duì)其它感染所述(Cruz等人(2006) / /mmtmo/. 177:1416; Park等人 (2005) A/a/./m/m/no/. 6:1133)， Thl或Thl7通路在兩種真菌感染中相互調(diào)節(jié)。這 個(gè)發(fā)現(xiàn)表明響應(yīng)真菌反應(yīng)的任一通路的存在處于嚴(yán)格環(huán)境控制之下。調(diào)節(jié)可發(fā) 生在不同階段。 一個(gè)明顯調(diào)節(jié)水平由IFN-Y代表，已知它調(diào)節(jié)Thl7細(xì)胞誘導(dǎo)。 Cruz等人(2006); Park等人(2005)。實(shí)際上IL-23/IL-17軸在兩種感染中IFN-Y缺乏 的情況下是加強(qiáng)的，而且產(chǎn)生IFN-Y的細(xì)胞數(shù)目在IL-17中和之后增加。這些數(shù) 據(jù)與患有念珠菌病的小鼠中IL-12反應(yīng)需要IFN-Y的觀點(diǎn)一致。Cenci等人(1998) J！ 7mmwwo/. 161:3543。
更重要地，IL-12的產(chǎn)生在pl9;DC中較高，IL-23的產(chǎn)生在p35^DC中較高， 且兩種細(xì)胞因子在WT DC中交叉調(diào)節(jié)。這些發(fā)現(xiàn)表明這些細(xì)胞因子在DC產(chǎn)生水 平上相互調(diào)節(jié)。Becker等人(2006)乂/mm柳o/. 177:2760。然而，因?yàn)閷?duì)真菌反應(yīng) 而產(chǎn)生IL-23的炎性DC似乎多于耐受性DC，所以這暗示Thl/Thl7平衡還視不同 身體部位的DC亞群之間的相互調(diào)節(jié)而定。
IL-23在高度威脅性炎癥情況下對(duì)真菌反應(yīng)而產(chǎn)生(通過(guò)炎癥DC經(jīng)由 TLRVMyD88通路對(duì)高酵母數(shù)目反應(yīng)產(chǎn)生)這一發(fā)現(xiàn)具有重要含意。他不僅指出 了 IL-23為炎癥過(guò)程與真菌毒性之間的重要分子連接點(diǎn)，而且還建立了惡性循環(huán) 可運(yùn)轉(zhuǎn)的情形。因?yàn)閜l9-z-小鼠產(chǎn)生較少IL-17并且據(jù)顯示TGF-p在抵抗真菌的 Thl7活化和/或維持中并非必要，所以可設(shè)想IL-23充當(dāng)著IL-17的鄰近調(diào)節(jié)子。 在此情形中，不受控制的真菌生長(zhǎng)可維持病原性Thl7細(xì)胞的活化，這表明了伴隨有非保護(hù)性Th2細(xì)胞的活化。
在此研究中一個(gè)有趣的觀測(cè)結(jié)果為雖然微生物刺激物可能為IL-23分泌的 主要誘導(dǎo)物，但獲得性免疫過(guò)程也可以調(diào)節(jié)其產(chǎn)生。為支持此觀測(cè)結(jié)果，我們 已提供DC的IL-23分泌在T細(xì)胞存在下顯著增加的證據(jù)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果表明經(jīng)活化的 T細(xì)胞可為進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-23提供正反饋回路。
存在的真菌。若經(jīng)由IL-23/IL-17軸的活化^^壞炎癥程序的能力可能最終導(dǎo)致免 疫調(diào)節(jié)異常，則其活化Treg細(xì)胞(針對(duì)念珠菌或曲霉菌的保護(hù)性免疫的整體和 基本組份(Romani及Puccetti (2006))的能力可代表防止免疫調(diào)節(jié)異常的機(jī)制。在 此方面，已描述了 Thl7與T reg細(xì)胞之間的功能拮抗作用(Bettelli及Kuchroo
(2005) /.五xp. Mo/. 201:169),包括IL-10在產(chǎn)IL-17細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)育過(guò)程中的抑制 作用。Kullberg等人(2006)丄Exp. Me《203:2485。因此，有可能的是產(chǎn)生Th17 和Treg細(xì)胞的交互(reciprocal)通路還可能在真菌感染中出現(xiàn)。我們未發(fā)現(xiàn)有 證據(jù)表明p35一小鼠中CD4+CD25+T reg細(xì)胞在感染后活化，發(fā)現(xiàn)結(jié)果表明Th17 和Treg細(xì)胞互相排斥。在pl9一小鼠中觀測(cè)到CD4+CD25+Treg細(xì)胞，不過(guò)IL-10 產(chǎn)生顯著降低，這與IL-23上調(diào)T細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的能力相符。Vanden Eijnden等 人(2005)五w. / /麵,/. 35:469-475。
本發(fā)明的研究的另一個(gè)重要觀測(cè)結(jié)果為IL-23/IL-17依賴性通路可在IFN-y 缺乏的條件下通過(guò)p35依賴性通路提供一些抗真菌抗性。已經(jīng)在下列疾病中報(bào)道 了 IL-23可以在IL-12缺乏的條件下起保護(hù)性作用慢性隱球菌病(Kleinschek等人
(2006) /m附w"o/. 176:1098)、分枝桿菌感染(Khader等人(2005) / /mww"o/. 175:788)及急性肺部肺炎克雷伯氏桿菌感染(Happel等人(2005) /"/e". immim.
IL-12p70)和募集PMN介導(dǎo)病原體清除的能力相關(guān)。Happel等人(2005) / Met/. 202:761。事實(shí)上，在實(shí)驗(yàn)性肝螺桿菌(7/e"co6"c^^印加'cw力誘導(dǎo)的結(jié)腸炎 中，已清楚顯示了IL-23啟動(dòng)產(chǎn)IFN-Y細(xì)胞和產(chǎn)IL-17細(xì)胞。Kullberg等人(2006)。 我們的結(jié)果似乎表明感染中Thl與Thl7路徑之間的交叉調(diào)節(jié)的另 一水平，這表 明在IL-23的作用中存在p35依賴性通路。最終，IL-23在受IL-12依賴性軸支配的 適當(dāng)免疫效應(yīng)功能開(kāi)始之前處理最初炎癥危險(xiǎn)信號(hào)的能力(McKenzie等人 (2006))與拮抗劑以及此對(duì)細(xì)胞因子之間的協(xié)作活性相符。總而言之，此研究中所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證明IL-23依賴性Thl7譜系在真菌感染中 的作用，該作用之前并不明確，這對(duì)宿主防御、免疫動(dòng)態(tài)平衡及對(duì)真菌的免疫 性的機(jī)制具有重要含意。此外，它們證明了無(wú)法消退炎癥與缺少抗真菌免疫抗 性之間的分子關(guān)聯(lián)。目前結(jié)果表明用于免疫治療真菌感染的策略，這些策略嘗 試限制炎癥以刺激有效免疫反應(yīng)。
IV. IL-23拮抗劑
IL-23拮抗劑包括能夠抑制IL-23的一種或多種生物活性的任何物質(zhì)或方法。 這些活性包括與IL-23 (包括pl9和p40亞基)、IL-23受體(包括IL-23R和IL-12R卩1 亞基)結(jié)合；和促進(jìn)和維持Thl7細(xì)胞。拮抗劑可包括(例如)小分子、抗體或抗 體片段、肽模擬物、適體(例如，如美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)No.2006-0193821中所公 開(kāi)的)、來(lái)源于IL-23受體的亞基的胞外區(qū)的可溶性受體、及核酸基拮抗劑。
IL-23的核酸基拮抗劑包括針對(duì)IL-23pl9基因或IL-23R基因的反義核酸和 siRNA。對(duì)于通用siRNA方法，參見(jiàn)WO 2006/06060598。還參見(jiàn)Arenz和Schepers (2003)胸wrvw'，騰Aa, 90:345; Sazani和Kole (2003) / C7z". 112:481;
Pirollo等人(2003)尸Aar顧co/. rAerapew^s 99:55; Wang等人(2003) Jwtomse Mic/.爿dc/Z)n/gZ)eve/. 13:169?；谌薎L-23pl9和IL-23RmRNA的已知序列，可 設(shè)計(jì)反義和siRNA分子。人IL-23pl9的mRNA和氨基酸序列分別見(jiàn)于GenBank登 錄號(hào)NMJ)16584及NPJ)57668 。人IL-23R的cDNA和氨基酸序列分別見(jiàn)于 GenBank登錄號(hào)AF461422及AAM44229。本發(fā)明還提供用于RNA干擾的組合物。
產(chǎn)生及使用siRNA的方法公開(kāi)于(例如)美國(guó)專利No. 6,506,559 (WO 99/32619)、 No.6,673,611(WO 99/054459)、 No.7，078,196 (WO 01/75164)、 No.7,071,311和PCT公開(kāi)WO 03/70914、 WO 03/70918、 WO 03/70966、 WO 03/74654、 WO 04/14312、 WO 04/13280、 WO 04/13355、 WO 04/58940、 WO 04/93788、 WO 05/19453、 WO 05/44981、 WO 03/78097中。列出了美國(guó)專利和 相關(guān)PCT公開(kāi)。在基因沉默和治療性治療中使用siRNA的例示性方法公開(kāi)于PCT 公開(kāi)WO 02/096927(VEGF和VEGF受體)、WO 03/70742(端粒酶)、WO 03〃0886(IVA型蛋白質(zhì)酪胺酸磷酸酶(Pr13))、 WO 03/70888(Chkl)、 WO 03A70895 和WO 05/03350(阿爾茨海默病(Alzheimer's disease))、 WO 03/70983(蛋白質(zhì)激酶 Ca)、 WO 03/72590(Map激酶)、WO 03/72705(細(xì)胞周期素D)、 WO 05/45034(帕金森氏癥，Parkinson's disease)中。關(guān)于siRNA的治療性用途的例示性實(shí)驗(yàn)還公 開(kāi)于Zender等人(2003) Proc. iVaA爿cfl《卩L/5^ 100:7797; Paddison等人 (2002) Proc. 7VW/.(77&4」99:1443;以及Sah (2006) h/e 79:1773中。 siRNA分子還用于(例如)慢性骨髓白血病(chronic myeloid leukemia, CML)(ClinicalTrials.gov標(biāo)識(shí)符NCT00257647)及老年性黃斑退化(age-related macular degeneration, AMD) (ClinicalTrials.gov標(biāo)識(shí)符NCT00363714)的臨床試 驗(yàn)中。
雖然術(shù)語(yǔ)"siRNA"在本文中用以指用于通過(guò)RNA干擾途徑誘導(dǎo)基因沉默的 分子(Fire等人(1998)M^" 391:806)，但這些siRNA分子無(wú)需嚴(yán)格為聚核糖核苷 酸，而是可以含有一種或多種對(duì)核酸的修飾以改善其作為治療劑的性質(zhì)。對(duì)于 短的干擾核酸，這些藥劑有時(shí)稱為"siNA"。雖然這些改變可在形式上使該分子 排除至"核糖"核苷酸定義之外，但這些分子在本文中仍稱為"siRNA"分子。用于 通過(guò)RNA干擾途徑誘導(dǎo)基因沉默的核酸的其它變體包括短發(fā)夾 RNA("shRNA")，例如，在美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)No.20060115453中所公開(kāi)。核酉tt 抑制劑可以(例如)通過(guò)用重組載體(如質(zhì)體或病毒，例如，如棵DNA)轉(zhuǎn)化或通過(guò) 利用任何已知基因療法載體(例如，腺關(guān)聯(lián)病毒(AAV)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或 慢病毒)的基因療法來(lái)遞送。核酸可通過(guò)轉(zhuǎn)化、電穿孔、生物彈轟擊(biolistic bombardment)或本領(lǐng)域中已知的其它方法來(lái)遞送。
IL-23受體的抗體。IL-23的例示性拮抗劑抗體包括抗人IL-23pl9抗體及其片段， 如共同轉(zhuǎn)讓的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/891，409及No. 60/891,413 (均在2007年2 月23日提交)、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)物No. 2007-0009526和No. 2007-0048315及國(guó)際 專利出版物No. WO 2007/076524、 WO 2007/024846和WO 2007/147019中所公 開(kāi)。IL-23的抗體拮抗劑還包括當(dāng)IL-12p40亞基與IL-23pl9結(jié)合時(shí)但并非在其與 IL-12p35結(jié)合時(shí)與IL-12p40亞基結(jié)合的抗體。參見(jiàn)例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)物No. 2005-0137385及美國(guó)專利No. 7,252,971。 IL-23的例示性拮抗劑抗體包括抗人 IL-23受體抗體(例如，抗IL-23R抗體)及其片段。IL-23R的例示性拮抗劑抗體公 開(kāi)于共同轉(zhuǎn)讓的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/892,104 (2007年2月28日提交)和No. 60/945,183 (2007年6月20日公開(kāi))中。IL-23的拮抗劑還包括雙特異性抗體。
高抗原性區(qū)域可用于抗體產(chǎn)生。人pl9的高抗原性區(qū)域存在于(例如)GenBankAAQ89442(gi: 37183284)的氨基酸16-28、 57-87、 110-114、 136-154 及182-186 。人IL-23R的具有增加的抗原性的區(qū)域存在于(例如)GenBank AAM44229(gi: 21239252)的氨基酸22-33、 57-63、 68-74、 101-112、 117-133、 164-177、 244-264、 294-302、 315-326、 347-354、 444-473、 510-530以及554-558。 通過(guò)Parker曲線圖4吏用Vector NTI Suite(Informax， Inc., Bethesda, MD)進(jìn)4亍分 析。本發(fā)明還提供為可溶性受體的IL-23拮抗劑，即包括IL-23R的胞外區(qū)(例如， GenBankAAM44229的氨基酸l-353)或其片段，其中胞外區(qū)或其片段與IL-23特異 性結(jié)合。小鼠IL-23R為GenBankNP—653131(gi: 21362353)。還涵蓋突變蛋白和 變體，例如聚乙二醇化或突變誘導(dǎo)以移除或置換脫酰胺基的Asn殘基。
用于本發(fā)明的方法和組合物的拮抗IL-23活性的其它可能方法包括給藥絲 狀血球凝集素(filamentous hemagglutinin, FHA)(WO 2006/109195)和疫苗接種以 產(chǎn)生抵抗IL-23的免疫反應(yīng)(WO 2005/058349)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)IL-17(Thl7)細(xì)胞的拮抗劑涵蓋特異性調(diào)節(jié)Thl7細(xì)胞 活性，而不影響例如初始T細(xì)胞(naive T cell)、 Thl型T細(xì)胞、TH2型T細(xì)胞、上 皮細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞活性的試劑。試劑可調(diào)節(jié)(例如)產(chǎn)IL-17細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子(例 如，RORyt)或粘附蛋白的表達(dá)或活性。此外，IL-23、 TGF-P或IL-6的拮抗劑可 以降低Thl7細(xì)胞的產(chǎn)生和存活，IL-17的拮抗劑可以降低這些細(xì)胞的炎癥作用 (例如，嗜中性粒細(xì)胞募集)。
可制備單克隆抗體、多克隆抗體和人源化抗體(參見(jiàn)例如Sheperd和Dean (編 輯)(2000) Mowoc/owa/ ^4w幼o(hù)t/z'as, Oxford Univ. Press, New York, NY; Kontermann及Dubel (編輯)(2001) Xw幼o(hù)辦E"g7'wee"'"g， Springer畫Verlag, New York; Harlow及Lane (1988)爿w必oc/^爿丄a6orato^y她wwa/, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,第139-243頁(yè)；Carpenter等人(2000) / /附mw"o/. 165:6205; He等人(l998),/mmwwo/. 160:1029; Tang等人(1999) 所o/. C&附.274:27371; Baca等人(1997) 乂祝o/. CAem. 272:10678; Chothia等人(1989) 7Vaft/" 342:877; Foote及Winter (1992) / Mo/.說(shuō)o/. 224:487;美國(guó)專利No. 6,329,511)。還可制備完全人抗體，其中全部抗體序列來(lái)源于人種系序列。這些 完全人抗體可以由經(jīng)工程化以表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或通過(guò)諸如 噬菌體展示等方法制備。參見(jiàn)例如Lonberg (2005) A/a/wre所otec/mo/. 23:1117; Vaughan等人(1998)A^wre祝o&c/mo/. 16:535?？贵w片段包括Fab、 Fab'、 Fab'-SH、Fv 、 單鏈Fv(scFv) 、 F(ab')2及雙功能抗體。Pluckthun (1994) THEPHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES ，第113巻，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag， New York,第269-315頁(yè)；Holliger及Hudson (2005)TVart/re丑Zo&cAwo/. 23:1126-1136。
本發(fā)明的抗體還包括具有經(jīng)修飾(或阻斷)的Fc區(qū)以提供改變的效應(yīng)功能的抗體。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No. 5,624,821、 WO 2003/086310、 WO 2005/120571、WO 2006/0057702、 Presta (2006) Jdv. Z>wg De//ve^y i ev. 58:640-656。這種修飾可用于增強(qiáng)或抑制免疫系統(tǒng)的各種反應(yīng)，對(duì)診斷及治療可能具有有利的作用。Fc區(qū)的改變包括氨基酸改變(取代、缺失及插入)、糖基化或去糖基化、以及添加多個(gè)Fc。對(duì)Fc的改變還可以改變治療抗體中抗體的半衰期，較長(zhǎng)半衰期會(huì)使得給藥頻率較低，隨之增加便利性并物質(zhì)的使用。可通過(guò)將特異性突變引入IgGl的Fc部分，例如通過(guò)將Asn297改變?yōu)?例如)Ala或Gln(N297A或N297Q)實(shí)現(xiàn)效應(yīng)功能改變。參見(jiàn)Presta (2005) 爿〃e^y C//". imww"o/. 116:731, 734-35。效應(yīng)功能還可通過(guò)選擇不同恒定結(jié)構(gòu)域來(lái)改變。舉例而言，若本發(fā)明的抗體(或片段)的特定預(yù)期用途需要改變的效應(yīng)功能，則可使用非IgGl的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域。雖然IgGl抗體提供長(zhǎng)半衰期和效應(yīng)功能，諸如補(bǔ)體活化及抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)，但這些活性可能并非為所有抗體用途所需要。在這些情況下，可以使用如IgG4恒定域之類的物質(zhì)。在IL-23受體(例如，IL-23R)抗體的狀況下，改變的效應(yīng)功能尤其恰當(dāng)，這是因?yàn)樵谝粋€(gè)實(shí)施方式(非唯一的實(shí)施方式)中，目標(biāo)并非誘導(dǎo)殺死表達(dá)IL-23受體的細(xì)胞，而是僅僅阻斷這些細(xì)胞中的IL-23信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在此實(shí)施方式中，目標(biāo)為將Th細(xì)胞由Thl7i普系轉(zhuǎn)為Thl譜系，在該狀況下殺死細(xì)胞無(wú)益。
抗原純化對(duì)抗體產(chǎn)生而言并非必需。免疫可通過(guò)DNA載體免疫來(lái)進(jìn)行，參見(jiàn)例如Wang等人(1997) Wro/ogy 228:278?；蛘?，可用具有相關(guān)抗原的細(xì)胞使動(dòng)物免疫。接著可將脾細(xì)胞自經(jīng)免疫的動(dòng)物分離，這些脾細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞系融合以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞(Meyaard等人(1997) /mmwm々7:283; Wright等人(2000)/mwwm'(y 13:233; Preston等人(1997)五wr. /7mmwwo/. 27:1911)。通過(guò)功能才企測(cè)或生物檢測(cè)可針對(duì)所需抗體的產(chǎn)生篩檢所得雜交瘤細(xì)胞，即檢測(cè)不依賴于經(jīng)純化的抗原有無(wú)。對(duì)于抗體產(chǎn)生而言，據(jù)證明細(xì)胞免疫可能優(yōu)于經(jīng)純化的抗原的免疫(Kaithamana等人(1999)乂 /附m柳o/. 163:5157)?？贵w與抗原及配體與受體的結(jié)合性質(zhì)可以(例如)通過(guò)表面等離子共振
(Karlsson等人(1991) /m附w"o/. M^Aocfc 145:229; Neri等人(1997) A^.5z'otecA"o/. 15:1271; Jonsson等人(1991)說(shuō)o^c/m^was 11:620)或通過(guò)竟?fàn)嶦LISA(Friguet等人(1985) /mmw"o/. M"Aois 77:305; Hubble (1997) 7mww"o/.7b^y 18:305)來(lái)檢測(cè)。抗體可用于親和力純化以分離抗體的耙抗原及相關(guān)結(jié)合蛋白質(zhì)。參見(jiàn)例如Wilchek等人(1984)MeA.五"^ywo/. 104:3。
抗體通常以至少約10^M、通常至少10々M、更通常至少10-SM、優(yōu)選至少約10^M,更優(yōu)選至少10"。M,最優(yōu)選至少10-"M的Ko結(jié)合。參見(jiàn)例如Presta等人(2001) 7T ram6. //"ewo化85:379; Yang等人(2001) O". Aev. Oco/. i/ewato/,38:17; Carnahan等人(2003) C//w. Omcer (增刊)9:3982s。
包含IL-23R的胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性受體可用于本發(fā)明的組合物和方法中。可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備及使用可溶性受體。參見(jiàn)例如Jones等人(2002)說(shuō)ocA/m.5—一. 1592:251; Prudhomme等人(2001)(9; /w'ow T"Aer. 1:359;Fernandez-Botran (1999) O". Aev. 36:165-224。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物和方法需要IL-23的拮抗作用且不需要IL-12的拮抗作用。目前存在若干正在研制中的可能治療劑，它們靶向IL-12和IL-23的IL-12p40亞基，阻斷IL-23及IL-12的活性。這些藥劑不適用于本發(fā)明的組合物和方法的此實(shí)施方式，因?yàn)樗鼈円种票景l(fā)明要促進(jìn)的穩(wěn)固的IL-12介導(dǎo)的Thl反應(yīng)。雖然原則上研制僅在IL-23情況下而不在IL-12情況下結(jié)合IL-12p40的藥劑是可能的(參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)No. 2005-0137385及美國(guó)專利No.7,252,971),但可能大部分靶向IL-12p40的藥劑抑制IL-12，因此不適于本發(fā)明。相同論點(diǎn)適用于IL-23和IL-12的共有受體亞基IL-12R(31。雖然原則上研制僅在IL-23情況下而不在IL-12受體情況下結(jié)合IL-12R(31的藥劑是可能的，但可能大部分靶向IL-12R(31的藥劑抑制IL-12受體，因此不適于本發(fā)明。相比之下，結(jié)合且拮抗對(duì)IL-23或其受體(即，分別為pl9和IL-23R)特異性的亞基的藥劑可能為IL-23而非IL-12的特異性抑制劑，因此更適用于本發(fā)明的組合物及方法中。
潛在治療劑是否特異性抑制IL-23而非IL-12可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何方法來(lái)測(cè)定。舉例而言，可測(cè)試潛在IL-23特異性拮抗劑阻斷IL-23與其受體或IL-12與其受體結(jié)合的能力。這些阻斷檢測(cè)可在溶液中(例如，通過(guò)熒光活化細(xì)胞分類術(shù))或在固體載體上(例如，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)-ELISA)進(jìn)行。IL-23及IL-12
32受體阻斷還可在生物檢測(cè)中#:測(cè)，諸如Ba/F3細(xì)胞增殖檢測(cè)。參見(jiàn)例如Ho等人(1995) Mo/. Ce〃.說(shuō)o/. (1995) 15:5043。在這些結(jié)合4企測(cè)中，潛在IL-23拮抗劑的效力和特異性可表示為IC50,或在給定組的檢測(cè)條件下實(shí)現(xiàn)IL-23結(jié)合(或依賴于結(jié)合的生物活性)減少50%所需的潛在拮抗劑濃度。較低IC50表明更有效的拮抗劑。潛在拮抗劑的IL-23特異性可表示為抑制IL-12與其受體結(jié)合的IC50與抑制IL-23與其受體結(jié)合的IC50的比率(IC50u2/IC50仏.23)。在各種實(shí)施方式中，若此比率(1050化.12/1€50化.23)為1.5、 2、 3、 4、 5、 7、 10、 15、 20、 50、 IOO或更大，則認(rèn)為潛在IL-23特異性拮抗劑具有IL-23特異性。在優(yōu)選實(shí)施方式中，調(diào)整抑制檢測(cè)中所用的IL-23和IL-12的含量以確保IL-23和IL-12^r測(cè)中的至少一個(gè)。優(yōu)選兩者都在線性劑量反應(yīng)濃度范圍內(nèi)進(jìn)行。
IL-23和IL-12還具有不同生物學(xué)功能，這些生物學(xué)功能可用以測(cè)定拮抗作用的特異性。與IL-12相比，如與初始T細(xì)胞群體相反，在人和小鼠中IL-23均優(yōu)先剌激記憶。IL-23活化大量細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，例如Jak2、 Tyk2、 Statl、Stat2、 Stat3及Stat4。 IL-12活化同一組分子，但Stat4對(duì)IL-23的反應(yīng)相對(duì)較弱，而Stat4對(duì)IL-12的反應(yīng)強(qiáng)。Oppmann等人(2000); Parham等人(2002)//wwwwo/.168:5699。
還可測(cè)試潛在IL-23特異性拮抗劑抑制IL-12和IL-23使Thl及Thl7細(xì)胞擴(kuò)增
活，而非IL-12介導(dǎo)的Thl細(xì)胞的擴(kuò)增和存活。Thl7細(xì)胞特征性分泌IL-17,而Thl細(xì)胞特征性分泌IFN-y。來(lái)自例示性Thl/Thl7檢測(cè)的數(shù)據(jù)見(jiàn)于Langrish等人(2005) 乂201:233的圖2，它證實(shí)11^23促進(jìn)產(chǎn)11^17的004+ T細(xì)胞的擴(kuò)增和存活，而IL-12促進(jìn)產(chǎn)IFN-y的CD4+ T細(xì)胞的擴(kuò)增和存活。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)藥劑能夠抑制IL-23介導(dǎo)的Th 17細(xì)胞的擴(kuò)增和存活而不抑制IL-12介導(dǎo)的Thl細(xì)胞的擴(kuò)增和存活時(shí)，認(rèn)為該藥劑為"IL-23特異性"拮抗劑(相對(duì)于IL-12) 。 Thl7/Thl細(xì)胞增殖的抑制可表示為IC50,或在給定組的檢測(cè)條件下實(shí)現(xiàn)4足進(jìn)產(chǎn)IL-n或IFN-y的特定T細(xì)胞亞群擴(kuò)增和存活的IL-23活性減少500/0所需的藥劑濃度。例示性檢測(cè)在實(shí)施例13提供。在如實(shí)施例13中所述的生物檢測(cè)的生物4企測(cè)中，IL-23拮抗劑的效力可表示為IC50化.23，即，將IL-23的活性降至其未受抑制的值的50%所需的拮抗劑濃度。類似IC50化-,2可針對(duì)IL-12及其促進(jìn)產(chǎn)IFN-y細(xì)胞產(chǎn)生的活性來(lái)測(cè)定。因此拮抗劑的IL-23特異性可表示為比率IC50n^/IC50化.23 。在各種實(shí)施方式中，經(jīng)驗(yàn)證的IL-23特異性拮抗劑的IC50u2/IC50!L-23比率為1.5、 2、 3、 4、 5、 7、 10、 15、 20、 50、 IOO或更大。
基本上如Langrish等人(2005)中所述，可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)熒光活化細(xì)胞分類術(shù)^八€3@分析)使用與細(xì)胞因子結(jié)合的熒光試劑來(lái)檢測(cè)IL-17A及IFN-Y的產(chǎn)生。重要的是對(duì)認(rèn)為是"產(chǎn)IL-17"或"產(chǎn)IFNY，的細(xì)胞界定活的CD4+T細(xì)胞中IL-17A或IFN-y的臨界(threshold)含量。在一個(gè)實(shí)施方式中，臨界含量定義為在未經(jīng)處理細(xì)胞的對(duì)照樣品中5%的活004+ T細(xì)胞"產(chǎn)IL-17，，或"產(chǎn)IFN-y"的含量。例示性未經(jīng)處理的細(xì)胞包括從在蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)存在下培養(yǎng)的經(jīng)PLP免疫的S JL小鼠中分離的引流淋巴結(jié)(DLN)細(xì)胞(TheJackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA)。
V.組合物及方法
為制備包含IL-23拮抗劑的醫(yī)藥或無(wú)菌組合物，將拮抗劑與藥學(xué)上可接受的載體或U武形齊寸〉'昆合，參見(jiàn)例^口 Aemz力gtowk尸Aamwcet^ca/ 5Wewcay禾口 f/.5".尸/wmwco戸'a: iVa"owa/ Formt//", Mack Publishing Company, Easton, PA(1984)。治療劑的制劑可通過(guò)與生理學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合以(例如)凍干粉、漿料、水溶液或懸浮液的形式來(lái)制備(參見(jiàn)例如Hardman等人(2001) Goodm朋朋J G^'/maw's 7T e尸Aamzaco/og/ca/ o/ 7Tzera; ew^s1,
McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) 5""'ewce am/
尸raWce o//V^m 2c_y, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis等人(編輯)(1993)尸A"rmacew"ca/ Dosage Foww..尸am^era/ MeJZc加'ow， MarcelDekker, NY; Lieberman等人(編輯)(1990)尸/wrmacew"'ca/Dosage Fo/msv !Ta6/ete，Marcel Dekker, NY; Lieberman等人(編輯)(1990)尸/wrmflcew"ca/ Dosage For,..Z)—erae S，ems, Marcel Dekker, NY; Weiner和Kotkoskie (2000)JbxZcW朋d ^"y^07. Marcel Dekker, Inc., New York, NY)。
給藥途徑為通過(guò)(例如)局部或皮膚涂敷；通過(guò)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、肌肉內(nèi)、目艮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、病灶內(nèi)或肺部途徑注射或輸液；或通過(guò)緩釋系統(tǒng)或植入物。已描述將基因轉(zhuǎn)移載體注射至中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。參見(jiàn)例如Cua等人(2001) //附wwwo/. 166:602; Sidman等人(1983) 5Zo/ o/_ymera 22:547; Langer等人(1981) / Ma^r.15:167; Langer (1982) Tec/ . 12:98;Epstein等人(1985)A/fl". XcW. OSL4 82:3688; Hwang等人(1980)尸rac.A^/. L/5L4 77:4030;美國(guó)專利No. 6,350，466及No. 6,316,024。
選擇治療劑的給藥方案視若干因素而定，包括藥劑的血清或組織藥劑清除率、癥狀程度、藥劑的免疫原性及生物基質(zhì)中標(biāo)靶細(xì)胞的可接近性。給藥方案優(yōu)選在伴有可接受程度的副作用的條件下將最大量的治療劑遞送至患者的量。因此，所遞送的藥劑的量部分視特定實(shí)體及所治療病狀的嚴(yán)重程度而定?？色@得選4奪適當(dāng)劑量的抗體、細(xì)胞因子和小分子的指南。參見(jiàn)例如Wawrzynczak(1996)」w"Z o辦77^rapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (編輯)(1991) Mowoc/owa/Q/威/was aw J Marcel Dekker, New York,
NY; Bach (編輯)(1993) Mowoc/owa/ Jw幼c^as1 _Pe/ "c/e 7%erap_y z'wJwtoz'mmwwe Z)^eoses， Marcel Dekker, New York, NY; Baert等人(2003) TVew ￡>zg7.
MW. 348:601; Milgrom等人(1999) 7Vew五"g/. MW. 341:1966; Slamon等人(2001) TVew ￡>zg/. / Me乂 344:783; Beniaminovitz等人(2000) 7Vew五wg/. /■ Me乂342:613; Ghosh等人(2003) iVew五"g/. 348:24; Lipsky等人(2000) 五"g/.
343:1594。
抗體、抗體片段和細(xì)胞因子可通過(guò)連續(xù)輸液或通過(guò)相隔(例如)一天、 一周或每周l-7次給藥來(lái)提供?？伸o脈內(nèi)、皮下、局部、經(jīng)口、經(jīng)鼻、直腸、肌肉內(nèi)、腦內(nèi)、脊髓內(nèi)或通過(guò)吸入來(lái)提供劑量。在各種實(shí)施方式中，根據(jù)主要感染所在位置(例如，肺或胃腸道)來(lái)選擇給藥模式。
優(yōu)選給藥方案包括避免顯著不良副作用的最大劑量或給藥頻率。每周總劑量一4殳為至少約0.05 pg/kg、 0.2 (ig/kg、 0.5 jxg/kg、 1 pg/kg、 10 pg/kg、 100嗎/kg、0.2mg/kg、 1.0mg/kg、 2.0 mg/kg、 10mg/kg、 25 mg/kg、或50 mg/kg。參見(jiàn)例如Yang等人(2003) ￡>zg/. 349:427; Herold等人(2002) 7Vew五"g/. Mo/.
346:1692; Liu等人(1999) /. iVewra/. A^wrasMrg.尸"cA. 67:451; Portielji等人(2003)Cawcer/附/mmo/./mmwzo^er. 52:133。小分子治療劑(例^口，狀才莫才以4勿、天然產(chǎn)物或有機(jī)化學(xué)藥品)的所需劑量與抗體或多肽的劑量大致相同，以摩爾/千克計(jì)。
針對(duì)特定患者的有效量可視下列因素而改變諸如所治療的病狀、患者的整體健康狀況、方法途徑及給藥劑量及副作用嚴(yán)重程度，參見(jiàn)例如Maynard等人(1996)爿Z/aw必ooA: o/51(9/^々r Good C7Zw'ca/尸rac"ce, Interpharm Press, BocaLondon, UK。
典型獸醫(yī)學(xué)、實(shí)驗(yàn)或研究個(gè)體包括猴、犬、貓、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、馬和人。
由臨床醫(yī)師(例如)使用本領(lǐng)域中已知或懷疑會(huì)影響治療或預(yù)計(jì)會(huì)影響治療的參數(shù)或因素進(jìn)行適當(dāng)劑量的確定。 一般而言，劑量以略小于最優(yōu)選劑量的量開(kāi)始，然后以小的增量增加直至相對(duì)于任何負(fù)面副作用實(shí)現(xiàn)所需或最優(yōu)選的效果。重要診斷檢測(cè)包括(例如)對(duì)感染或感染程度的癥狀的檢測(cè)。優(yōu)選地，待使用的生物制品來(lái)源于與治療所靶向的動(dòng)物相同的物種，或經(jīng)修_飾以;漠?dāng)M來(lái)源于相同物種的蛋白質(zhì)(例如，人源化抗體)，由此將對(duì)試劑的體液反應(yīng)減至最小。
用于與第二治療劑(例如，細(xì)胞因子、類固醇、化療劑、抗生素或輻射)共同給藥或治療的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。參見(jiàn)例如Hardman等人(編輯)(2001)
McGraw-Hill, New York, NY ; Poole及Peterson(編輯)(2001)尸/ a廠maco^^廠"/ 6wA'cs》廠J^/vawc6i/ /V"acft'c6.v4尸rac,/ca/ ^4/ /3廠oac/ ， Lippincott,Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner及Longo (編輯)(2001) C羅wC7 emo^ era^y 5ZoAerop少，Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA。有歲文量的治療劑將癥狀通常減少至少10%,通常至少20%，優(yōu)選至少約30%,更優(yōu)選至少40%，最優(yōu)選至少50%。
本發(fā)明進(jìn)一步提供IL-23或IL-23R拮抗劑或兩者在制備用于治療包括但不限于選自下列的感染性疾病的藥物中的用途真菌感染、持久性真菌感染、念珠菌病、CMC、曲菌病、隱球菌病、病毒感染、持久性病毒感染、HIV感染、HBV感染、HCV感染、細(xì)菌感染、分枝桿菌感染、結(jié)核分枝桿菌感染、牛分枝桿菌感染及麻風(fēng)分枝桿菌感染。在一些實(shí)施方式中，藥物可包含一種或多種其它治療劑。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物可與一種或多種其它治療劑結(jié)合使用。
VI. 抗個(gè)體基因型(Anti-idiotypic)抗體
基因型抗體?？箓€(gè)體基因型抗體為識(shí)別 一般與另 一抗體的抗原結(jié)合區(qū)結(jié)合的獨(dú)特決定簇的抗體?？赏ㄟ^(guò)用抗IL-23抗體或其含CDR區(qū)免疫與原始抗IL-23抗體的來(lái)源相同的物種和遺傳類型(例如，小鼠抹系)的動(dòng)物來(lái)制備抗個(gè)體基因型抗 體。接著經(jīng)免疫的動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)免疫抗體的個(gè)體基因型決定簇的抗體，以產(chǎn)生 抗個(gè)體基因型抗體?？箓€(gè)體基因型抗體還可用作免疫原以在另 一動(dòng)物中誘導(dǎo)免 疫反應(yīng)，產(chǎn)生所謂的"抗-抗-Id抗體"。
抗個(gè)體基因型抗體可用于(例如)測(cè)定個(gè)體中，例如經(jīng)歷抗IL-23治療的個(gè)體 的體液(例如，血液)中的治療性抗IL-23(或抗IL-23R)抗體的含量。個(gè)體中抗 IL-23(或抗IL-23R)抗體的含量的測(cè)定可用于保持個(gè)體中抗IL-23抗體的所需含 量，這是因?yàn)榻o藥可根據(jù)這些測(cè)定加以改變。給藥可增加或減少(在頻率和/或 每次給藥的量方面)以獲得在所需數(shù)值范圍內(nèi)的抗IL-23抗體的循環(huán)含量。所需 范圍可由開(kāi)業(yè)醫(yī)師通過(guò)本領(lǐng)域中典型的方法來(lái)確定，可以 一見(jiàn)抗IL-23(或抗 IL-23R)抗體或其片段的治療指數(shù)而定。
抗個(gè)體基因型抗體可以適于容易檢測(cè)的形式提供，包括具有多肽標(biāo)簽(例 如，F(xiàn)LAG⑧標(biāo)簽)或與染料、同位素、酶及金屬偶合的抗體。參見(jiàn)例如LeDoussal 等人(1991) A^w五wg/. Met/. 146:169; Gibellini等人(1998)丄immw"o/. 160:3891; Hsing及Bishop (1999) 7Vew五"g/. 162:2804; Everts等人(2002) 7Vew五"g/.
168:883。存在各種檢測(cè)形式，諸如放射免疫測(cè)定(RIA)、 ELISA及芯片實(shí) 驗(yàn)室(lab on a chip)。美國(guó)專利No. 6,176,962及No. 6,517,234。
VII.藥盒
本發(fā)明還提供在藥盒中的IL-23拮抗劑以用于治療罹患感染(諸如，慢性細(xì) 菌感染、分枝桿菌感染、病毒感染及真菌感染)的個(gè)體(人或非人類)。在一個(gè)實(shí) 施方式中，藥盒包括用于容納IL-23拮抗劑的隔室、IL-23拮抗劑自身(諸如，抗 體)、以及任選的使用說(shuō)明書、 一種或多種其它治療劑及一種或多種用于給藥的 醫(yī)學(xué)裝置(例如，注射器或一次性注射器，諸如RedipenTM注射器裝置)。IL-23拮 抗劑可為本文所述藥劑中的任一種，包括但不限于抗pl9抗體或其pl9結(jié)合片段、 抗IL-23R抗體或其IL-23R結(jié)合片段或可溶性IL-23R片l殳。
一種或多種其它治療劑包括但不限于非類固醇抗炎藥(NSAID)、類固醇、 IL-12或其激動(dòng)劑、及諸如IL-17A、 IL-17F、 TGF-(3、 IL-6的細(xì)胞因子或其各自 的受體的拮抗劑。細(xì)胞因子的拮抗劑包括與細(xì)胞因子、其亞基或其受體結(jié)合的 抗體。雖然并非所有結(jié)合細(xì)胞因子或其受體的抗體必需為拮抗劑，但這種拮抗劑活性可易于通過(guò)本領(lǐng)域中通常已知的技術(shù)(諸如，生物檢測(cè)或受體結(jié)合檢測(cè)) 來(lái)評(píng)估。已知各種(人)細(xì)胞因子和受體的核酸和氨基酸序列，包括
IL-17A(NM—002190 、 NP—002181) 、 IL-17F(NM一052872 、 NP—443104)、 IL-17RA(NM—014339 、 NP—055154) 、 IL-17RC(轉(zhuǎn)錄物變體NM—153461 、 NM—153460、 NM—032732、和其各自的翻譯產(chǎn)物)。
個(gè)體基因型抗體的藥盒。在一個(gè)實(shí)施方式中，該藥盒包括用于容納抗個(gè)體基因 型抗體的隔室、抗個(gè)體基因型抗體自身、以及任選的使用說(shuō)明書、 一種或多種 檢測(cè)試劑、 一種或多種用于檢測(cè)抗個(gè)體基因型抗體的裝置(諸如微量滴定板)、 以及一個(gè)或多個(gè)待檢測(cè)的抗IL-23抗體的樣品(或其它陽(yáng)性對(duì)照)。
VIII.用途
在結(jié)核病發(fā)展之前通常存在一個(gè)長(zhǎng)期無(wú)癥狀的臨床前時(shí)期。因此，可在分 析各種TB診斷標(biāo)記后開(kāi)始IL-23和IL-23R拮抗劑治療。與正常未感染患者相比， 表現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)核菌素測(cè)試或曼托測(cè)試(參見(jiàn)例如Dale和Federman (2002))的患者可 給藥IL-23或IL-23R拮抗劑治療，以防止分枝桿菌進(jìn)一步生長(zhǎng)或清除已存在的非 病理性感染。在生物樣品(例如BAL)中具有高含量分枝桿菌的患者還可受益于 IL-23和IL-23R拮抗劑治療，以防止分枝桿菌進(jìn)一步生長(zhǎng)，清除肺中的細(xì)菌負(fù)荷。 類似治療可用于臨床樣品中具有高分枝桿菌DNA或RNA含量或培養(yǎng)物中陽(yáng)性 煙堿酸(niacin)測(cè)試的患者。還設(shè)想IL-23及IL-23R拮抗劑與病理學(xué)癥狀性TB 感染結(jié)合使用以減輕或清除細(xì)菌負(fù)荷。
可使用本發(fā)明的方法和組合物治療的細(xì)菌感染包括(但不限于)由以下細(xì)菌 引起的那些金黃色葡萄球菌(5Va; /^/ococcw、表皮葡萄球菌 (5Vap/y;/ococci^印/cfewz/tfo);肺炎鏈3求菌(5Vr印tococcwspwet/mow'ae); 無(wú)乳鏈3求 菌(5Y，tococctw aga/ac"ae); 化腺鏈球菌(5V，tococc船/ _yogewas); 腸球菌屬 (五",erococciw s,); 炭疽軒菌C8fl"'〃ws a"^rac&); 錯(cuò)狀芽抱軒菌 (S c"/i cerew力；只又山支雙山支4干菌(5^/^o6a"en'wm 乳酉臾才干菌屬(丄a"o6acz7/us ^p.);
單核細(xì)月包增生利斯特菌(ZiWeha wowoqytogeway);々又卡菌屬(7Vocara^2 5p/ .);馬紅 球菌(i AoG ococcMS )(球軒菌(cocco6a"'〃—)； 紅斑丹毒絲菌/oArz'義 MwWo/ a^n'ae);白^f矣才奉^干菌(Co/jweZ ac/en't/m c^7Aen.fle);皰皰丙酉吏斥干菌(7Vopz.om'
38Z acten't/附acwes);》文纟戔菌屬(Jc""ow;;ces );肉毒才炎菌(C7oWn'd/wm 6o似/z."wm); 艱難才麥菌(C7o^n'fi^m AWc77e);產(chǎn)氣莢膜才炎菌(C/o^nWiwz/ er/W"ge"力；破傷風(fēng) 梭菌(C7oWnWt/m Zetom.); 動(dòng)彎桿菌屬(MoZn7t/wcz^ ; 消化鏈5求菌屬 (尸e/ toWrejptococcws " p; .);'淋病奈瑟3求菌(A^s^Wa go"orrAoeae);月S膜炎奈瑟菌 (7Ve^en'a腳m'"g/"fifes); 粘膜炎莫拉菌(Moroxe〃a catorr/^fo); 韋榮球菌屬 (F^'〃owe〃a M/ ,);》文線共生》文線4干菌04c"wo6ac〃/ws ac"wo/w少cetewcom"a似)；查包 氏不動(dòng)^干菌(Jcz7zetoZ acfer ^mwawm.0;百日P該才干菌(5o/^/ete〃aj! eWi^s^);布魯氏 菌屬C8raceZ/a 彎曲桿菌屬(Caw; j;/o^cter 5p; .); 二氧化碳嗜纖維菌屬
(G3/ woc少to/ / aga s/^-); 人心軒菌(CaWo6a"eW騰 ；噴蝕艾肯菌
(五汰e"e〃a co/rocfe"力；土拉熱弗朗西絲菌(Fra"c&e〃a似/are"57'力；杜克嗜血桿菌 (//ae附o/ /^7ws dwcre少()；5危感p耆血^干菌C^/""e附op/n7ws /w/7werazfle); 幽門蟲(chóng)累4干菌 (//e//coZ^c^r p少/w7〕； 金才各才干菌(A^'"ge〃a 嗜肺'l"生軍團(tuán)4干菌(丄eg7'o"e〃a
/wewwo/ / 7a); 多殺巴斯德菌(尸a^ewre〃a ww/toc/ofa)，' 肉^"^產(chǎn)義雷白氏桿菌 (A7eZw'e〃a graww/o附ato); 牙寧才蒙酸纟田菌屬(C"raZ a"er s; ; .); 腸斥干菌屬 (五"teraZ "cter 5早)；大腸桿菌(EscAen'c^ co/f); 肺炎克雷白氏桿菌(A7eZw7'e〃a /wei/mom'ae); 變形菌屬(iVo/ei^ 腸炎沙、門氏菌(5"a/mowe〃a ewten'c/"^); "f另
寒沙門菌(5^/mowe〃a (y/ /n〕； 志賀菌屬CS7n'ge〃a 5/ ; .); 粘質(zhì)沙雷氏菌(Serra"a marcascew力；小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Fera/w'a ew&raco/Wca); 鼠疫耶爾森菌 (7erw'w.a pas^s); 氣單月包菌屬(^4eromowos 5p/ .); 類,電、賀^卩單月包菌(尸/es/owowas s/^'ge〃o/6fes); 霍《L亍瓜菌(Fi^n'o c/ o/erae); 副溶血f瓜菌(Fi;'Z7n'o/ ara/^ewo/;^z'ci^); 致傷弧菌vw/一cw力；不動(dòng)桿菌屬(y4c/"etoZ7flCer ^p/ .); 黃桿菌屬 (F/avoZ ac&n'ww "^P!P.);纟錄膿4干菌(尸iS^Mfifo附o"as1 aen/gz'"osa);;羊蔥、4白克霍爾《急菌 (SwrMoc印ac/a); 類鼻疽伯克霍爾德、菌(SwrA:/jo/fifen'a /wei^owa〃ez'); 嗜麥 芽黃單胞菌(Xa"A蘭o"flw顧/鄉(xiāng)緣'a)或嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(&e"c^rapAomo"os 附fl/top/ ,/a);脆4f 4以4干菌(Sflc/ero/t/esyhxgz7&);類#干菌屬(S"ctero,c/es s; p.);普雷 '厭氏菌屬CfVevo/e//a >s^p.);才炎斥干菌屬CFtwoZja"eWt/An 5^ /0; 'J、蟲(chóng)累菌(5^^>7'//"附 w/"w力；博氏疏螺》走體(50^7^/& 6w/^/or/en〕； 回歸熱包柔氏螺J走體菌(5ofre/Za recwrew^y);;又賽巴爾通體菌(5aWowe〃a Ae似e/ae); 沙目艮衣原體(CA/awj^/z'a frac/wma"力；月申炎衣原體(C/ /aw;;c/opAz7a pwet/mom^e);嬰烏鵠熱口耆寸生衣原體 (CA/amj^/op/n7a /w'加cZ); 伯氏考克斯氏體(CoxZe〃a Zw"e〃z〕； 查菲埃立克體(￡7 Wz'c/n'a c/ q/Teeww'力；嗜吞嗟纟田月包無(wú)形體(^4wa; /asma; /wgoqy/o; /n7wn);軍團(tuán)菌 屬(Z^gZo"e〃a卿.)；鉤端螺旋體屬(丄印to—ra卿.)；立氏立克次體(iM;e咖'a ; 恙蟲(chóng)病東方體((9n'ew"a tewtewga附ws/n.); 蒼白密蟲(chóng)累方走體(7Ve; owema 戸〃油m)。
可使用本發(fā)明的方法和組合物治療的分枝桿菌感染包括但不限于由以下分 枝桿菌引起的那些膿肺分枝桿菌(M. afocesms)、非洲分枝桿菌(M. ayHcam/m)、 亞洲分支4干菌(A/！ aWarict/w)、鳥(niǎo)分4支4干菌復(fù)合4勿(AfycoZ a"en'w柳aWw附com/ /ex, MAC)、副結(jié)核鳥(niǎo)分枝桿菌(M. av/ww / ara似6ercM/o^;s)、牛分枝桿菌、龜分枝桿 菌(M. c/ze/owoe)、偶發(fā)分枝桿菌(M. /o、戈氏分枝桿菌(M. go、嗜 血分枝桿菌(M. /zaemo; Az7wm)、胞內(nèi)分枝桿菌(M. zWrace〃w/are)、堪薩斯分枝桿 菌(M. ^raaW)、豆?fàn)罘种U菌(M. /朋"y avtwz)、麻風(fēng)分枝桿菌、立夫分枝桿菌 (M./^/7a"t/")、馬爾摩分枝桿菌(M.附fl/moe"se)、海分枝桿菌(M.附an'"w附)、田鼠 分枝桿菌(M. m,cra")、草分枝桿菌(M pA/d)、假?gòu)椡锠罘种U菌(M. ;wewc/asAo,加'0、瘰疬分4支斥干菌(Af. scro/w/aceww)、彈丸狀分斗支桿菌(Af. 5/ "加7)、 恥垢分枝桿菌(M. smegmato)、三重分枝桿菌(M. &&/ex)、結(jié)核分枝桿菌、潰瘍 分支桿菌(M. w/cera"力、優(yōu)夫分牙支桿菌(Af. wvz'w附)及蟾分才支桿(M. xe"op()。
本發(fā)明的方法和組合物還可用以治療真菌病狀，包括但不限于組織胞漿菌 病(histoplasmosis)、球孑包子菌病(coccidioidomycosis)、 芽生菌病(blastomycosis)、 曲菌病、青霉病(penicilliosis),念珠菌病及隱球菌病。霉菌病的危險(xiǎn)因素包括血 液及骨髓移植、實(shí)體器官移植、大外科手術(shù)(尤其胃腸道外科手術(shù))、AIDS、腫 瘤性性疾病(neoplasticdisease)、老年、免疫抑制療法及嬰兒早產(chǎn)。
可使用本發(fā)明的方法和組合物治療的引起感染(及臨床綜合癥)的真菌病原 體包括(但不限于)白色念珠菌(鵝口瘡、陰道念珠菌病(vaginal candidiasis )、 食道念珠菌病(esophageal candidiasis))、新型隱球菌(腦膜炎)、莢膜組織胞漿 菌(/^/o; /aswa captz/a似m)(伴隨發(fā)熱及體重減輕的散播性感染)、粗球孢子菌 (Cocc7WoZcfes 彌漫性及病灶性月申病)、皮炎芽生菌(別astomycas
^ma加Vfo)(局部肺病及散播性感染，包括腦膜炎)、煙曲霉(伴隨發(fā)熱、咳-M 咳血的肺病)及馬爾尼菲青霉菌mamej^z')(僅發(fā)熱或伴隨肺浸潤(rùn) (pw/附cwa/7 ,"/^ra,e)、'淋巴結(jié)病(lymphadenopathy)或皮月夫病變)。本發(fā)明的方'法 和組合物還可用以治療念珠菌物種光滑念珠菌(C. g/flZ rato)、近平滑念珠菌(C.para;w7cw/力、熱帶念珠菌(C./ra/ Zcafc)、克魯斯念珠菌(C. AmseZ)、葡萄牙念珠 菌(C. /ww'to"z'ae)、季也蒙念珠菌(C. gw/〃/ermom/")及皺褶念珠菌(C. n/gosa)的感 染。前述真菌病原體(及臨床綜合癥)通常與HIV感染有關(guān)。
本發(fā)明的方法和組合物還可用以治療諸如光滑念珠菌、近平滑念珠菌、熱 帶念珠菌、克魯斯念珠菌、葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌及皺褶念珠菌的念珠
菌物種的感染。本發(fā)明的方法和組合物還可用以治療諸如黃曲霉菌(丄y avw力、
黑曲霉菌(A m'ger)、焦曲霉菌(A M似力及土曲霉菌(A ^rew力的曲霉菌物種的感 染。其它真菌病原體包括鐮孢菌物種(Fw5an'ww species)(例如，串珠鐮孢菌(尸. mom7^orwe)、腐皮鐮孢菌(尸.w/am〕、尖鐮孢菌(F. o砂5pon/w))及足》丈線病菌物 種0S"cedo5pon'wm species)(例如，尖端賽多孑包(51. a/^o^en^w)、 多育賽多孑包(S. pra/^c朋力)。其它真菌疾病包括由酒曲菌(A/n'zo/ w力物種(例如，米根霉(兄 07zae)、 少才艮才艮霉(i . a/T/ -zi ))、才艮毛霉(/ /n'zomt/cor)、 翠頭霉(JZw7Wa)、 小克 4艮漢霉(Cwww'"g/wme〃a)所《1起的蟲(chóng)乾疫霉病(zygomycoses)。
IL-23及IL-23R的拮抗劑可單獨(dú)使用或與旨在增強(qiáng)Thl反應(yīng)的藥劑(例如， IL-12或其激動(dòng)劑)或抑制Thl7反應(yīng)的藥劑(例如，TGF-p拮抗劑；IL-6拮抗劑； IL-17A和/或IL-17F拮抗劑)或兩者結(jié)合使用。還可使用這些細(xì)胞因子受體的激動(dòng) 劑和拮抗劑。這些藥劑可包括抗體及其抗原結(jié)合片段、小分子、siRNA及反義 核酸。IL-23和IL-23R的拮抗劑還可與抗炎藥(諸如皮質(zhì)類固醇(corticosteroid)， 例如潑尼;^(prednisone))結(jié)合使用。
IL-17拮抗劑可以通過(guò)直接或間接與IL-17A、 IL-17F、 IL-17RA或IL-17RC中 的一種或多種相互作用防止功能性配體-受體相互作用來(lái)抑制這些多肽的表達(dá) 或抑制IL-17信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，IL-17拮抗劑為與IL-17A、 IL-17F、 IL-17RA或IL-17RC中的任一種結(jié)合且抑制其活性的抗體或抗體片段。 在一個(gè)尤其優(yōu)選實(shí)施方式中，IL-17拮抗劑為與IL-17A特異性結(jié)合的單克隆抗 體。IL-17A的例示性拮抗劑抗體包括公開(kāi)于共同轉(zhuǎn)讓的美國(guó)專利申請(qǐng)No. 11/836,318 (2007年8月9日提交)、WO 2006/013107以及WO 2006/054059中的抗 人IL-17A抗體及其片段。在另一個(gè)實(shí)施方式中，IL-17拮抗劑包括雙特異性抗體。
在一個(gè)實(shí)施方式中，IL-23拮抗劑包括與IL-23結(jié)合且抑制其活性的雙特異性 抗體。這些雙特異性抗體可與IL-23pl9或IL-23R結(jié)合，并且還可與IL-17A、 IL-17F、 IL-17RA、 IL-17RC結(jié)合。在其它實(shí)施方式中，IL-23拮抗劑為與IL-23p19及IL-17結(jié)合且抑制其活性的雙特異性抗體。參見(jiàn)例如WO 2007/147019。或者， IL-23及IL-17拮抗劑雙特異性抗體可分別與IL-23受體(例如，IL-23R)或IL-17受 體(IL-17RA或IL-17Rd)結(jié)合，只要它們是拮抗劑抗體即可。拮抗IL-17和IL-23 活性二者的雙特異性抗體可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)制備。舉例而言，可 使用兩種免疫球蛋白重鏈/輕鏈對(duì)共同表達(dá)來(lái)重組制備雙特異性抗體。參見(jiàn)例如 Milstein等人(1983) M^/" 305:537-39?；蛘?，可使用化學(xué)鍵聯(lián)來(lái)制備雙特異性 抗體。參見(jiàn)例如Brennan等人(1985)5We"ce 229:81。還可以如下制備雙功能抗體 通過(guò)二石克化物交換、產(chǎn)生雜合-雜交瘤細(xì)胞(四體瘤(quadromas))，通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻 譯產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)雙特異性抗體的單一多肽鏈，或轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生一個(gè)以上可共價(jià)結(jié) 合以產(chǎn)生雙特異性抗體的多肽鏈。所預(yù)期的雙特異性抗體還可完全通過(guò)化學(xué)合 成來(lái)制備。雙特異性抗體可包含兩個(gè)不同可變區(qū)、兩個(gè)不同恒定區(qū)、可變區(qū)和 恒定區(qū)或其它變化形式。
IL-23及IL-23R的拮抗劑可單獨(dú)使用或與已知的抗菌劑(諸如異煙肼、利福 平、吡溱酰胺、乙胺丁醇、鏈霉素、環(huán)丙沙星及氧氟沙星)共同給藥。其它抗菌 劑包括(但不限于)阿拉曲沙星(alatrofloxacin)、阿奇霉素(azithromycin)、巴氯芬 (baclofen)、千星青霉素(benzathine penicillin)、西i若沙、星(cinoxacin)、克才立霉素 (clarithromycin),氯法齊明(clofazimine),氯峻西林(cloxacillin)、地美環(huán)素 (demeclocycline)、地紅霉素(dirithromycin)、 多西環(huán)素(doxycycline)、 紅霉素 (erythromycin)、乙石克異煙胺(ethionamide)、吹喃哇酉同(furazolidone)、沖各帕沙星 (grepafloxacin)、 亞胺培南(imipenem)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星 (lorefloxacin)、鹽酸莫西沙星(moxifloxacin HC1)、萘咬酸(nalidixic acid)、硝化呋 喃妥因(nitrofurantoin)、諾氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星、利福布汀(rifabutin)、 利福噴丁 (rifapentine)、司帕沙星(sparfloxacin)、螺旋霉素(spiramycin)、苯曱酰 磺胺(sulphabenzamide)、長(zhǎng)歲文石黃胺(sulphadoxine)、石黃胺曱基嘧p定(sulphamemzine)、 磺乙酰胺(Sulphacetamide)、磺胺嘧啶(sulphadiazine)、磺胺異噁哇 (sulphaftirazole)、磺胺曱嚼哇(sulphamethoxazole)、磺胺p比口定(sulphapyridine)、四 環(huán)素(tetracycline)、曱氧千口定(trimethoprim)、曲4戈沙星(trovafloxacin)以及萬(wàn)古霉 素。
本發(fā)明的方法和組合物可用以治療持久性病毒感染，包括(但不限于)由 HBV、 HCV、 HIV、人乳頭瘤病毒(HPV)引起的感染。這些慢性感染表示免疫
42反應(yīng)無(wú)法根除感染。IL-23及IL-23R的拮抗劑可單獨(dú)使用或與包括(但不限于)以 下各物的其它抗病毒劑結(jié)合使用阿巴卡韋、阿昔洛韋、金剛烷胺、安普那韋、 地拉韋啶、去羥肌苷、依發(fā)韋侖、泛昔洛韋、茚地那韋、干擾素a、利巴韋林、 拉米夫定、奈非那韋、奈韋拉平、奧司他韋、噴昔洛韋、利巴韋林、利托那韋、 沙查那韋、司他夫定、萬(wàn)乃洛韋、扎西他濱、扎那米韋、齊多夫定(疊氮脫氧胸 苷，AZT)。優(yōu)選的干擾素a藥劑包括聚乙二醇化干擾素a2a和聚乙二醇化干擾素 2b。干擾素a的例示性形式論述于美國(guó)專利No. 6，923,966中。IL-23拮抗劑還可與 病毒特異性藥劑組合使用，諸如用于慢性HCV感染的HCV蛋白酶或HCV聚合酶 抑制劑、和用于慢性HIV感染的CCR5拮抗劑。
IL-23及IL-23R的拮抗劑還可與治療性疫苗(例如，用于HIV感染的gpl20缺 失的整體滅活病毒、用于HCV感染的重組E1蛋白以及用于HPV感染的病毒E6及 E7致癌蛋白)結(jié)合使用。參見(jiàn)Berzofsky等人(2004)。這些治療性疫苗包括DNA疫 苗或病毒載體，任選以其中DNA疫苗之后跟隨病毒載體疫苗的異源初免 (priming)和加強(qiáng)方案給藥。Berzofsky等人(2004)。
IL-23及IL-23R的拮抗劑可單獨(dú)使用或與其它抗真菌劑結(jié)合使用，包括但不 限于泊沙康唑、氟康唑(美國(guó)專利第4,404,216號(hào))、伏立康唑、伊曲康唑(美國(guó) 專利第4，267,179號(hào))、酮康唑(美國(guó)專利第4,144,346號(hào)及第4,223,036號(hào))、利阿唑、 伊替馬唑、克霉唑、咪康唑、益康唑、布康唑、奧昔康唑、硫康唑、噻康唑及 特康唑、經(jīng)取代的噻唑、噻二唑、嚼二唑、卡泊芬凈、兩性霉素B、制霉菌素、 匹馬菌素、氟胞嘧啶(5-氟胞嘧啶)、萘替芬、特比萘芬、布替萘芬、硫代碳酸酯 托萘酯、灰黃霉素、胺碘酮、環(huán)吡司、舒苯汀、阿莫羅芬、氯碘羥喹、龍膽紫、 碘化鉀、硫代硫酸鈉、石炭酸-品紅溶液及棘白菌素(例如，乙酸卡泊芬凈、米 卡芬凈及阿尼芬凈)。
本發(fā)明的IL-23和IL-23R拮抗劑可與標(biāo)準(zhǔn)抗真菌劑以其在用作單一藥劑時(shí) 常用的劑量組合使用，或在藥物一起使用時(shí)若存在任何功效上的協(xié)同增強(qiáng)作用 則以較低劑量組合使用。氟康唑可(例如)以400-800毫克/天給藥。伏立康唑可以 4 mg/kg每日兩次給藥。伊曲康唑可以200-600毫克/天給藥。脫氧膽酸兩性霉素 B(Amphotericin B desoxycholate, D-AmB)可以每天0.5-l mg/kg纟合藥。關(guān)于可與本 發(fā)明的組合物和方法組合的藥劑類型及治療方案的通用指南可見(jiàn)于由Infectious Diseases Society of America(IDSAVi^布的在Pappas等人(2004) C//". /"/e".38:161(念珠菌病)和316￥6118等人(2000)(://". /"/e". 30:696(曲菌病)中的實(shí)施
International Standards for Tuberculosis Care中。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，患有感染或懷疑患有感染的個(gè)體先前已使用 其它方法或組合物(即，非本發(fā)明的方法或組合物)治療感染。先前治療以可包 括用本文所公開(kāi)的抗微生物劑、抗生素、抗真菌劑、抗病毒劑中的任一種或任 何其它治療方法或組合物治療。
在一些實(shí)施方式中，個(gè)體將進(jìn)行正式感染診斷，任選同時(shí)鑒別病原體，但
原體的部分診斷。在其它實(shí)施方式中，僅懷疑個(gè)體患有感染。在其它實(shí)施方式 中，個(gè)體處于患有或獲得感染的風(fēng)險(xiǎn)中，例如，正經(jīng)歷免疫抑制療法的個(gè)體處 于由于AIDS等而獲得真菌感染的風(fēng)險(xiǎn)中。在一些實(shí)施方式中，患有感染或懷疑 患有感染或處于患有或獲得感染的風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體(例如)由于AIDS、化療、移植、 老年而免疫受損。
如對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見(jiàn)的，在不悖離本發(fā)明的精神及范疇的情 況下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多修改及變更。本文所述的具體實(shí)施方式
僅以實(shí)例的 方式提供，且本發(fā)明將受隨附權(quán)利要求書的范疇以及這些權(quán)利要求的等同物的 全部范疇的限制；且本發(fā)明不受在本文中以實(shí)例的方式提供的具體實(shí)施方式
限 制。
實(shí)施例l 通用方法
標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法已經(jīng)有所描述(Maniatis等人(1982) Mo/ecw/ar C/om'"g， ^4丄aZ 0rato^7 M朋wa/, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook和Russell (2001) Mo/ec油r C7ow'wg， 第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) T^comZn.船"f ￡WJ,第217 巻，Academic Press, San Diego， CA)。標(biāo)準(zhǔn)方法還出現(xiàn)于Ausbel等人(2001) Cwrrewf /Votoco/s z>z Afo/ecw/ar 5z.o/ogy， 第l-4巻，John Wiley and Sons, Inc. New York, NY,它描述細(xì)菌細(xì)胞中的克隆和DNA謙變(第l巻)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及酵 母中的克隆(第2巻)、復(fù)合糖(glycoconjugate)和蛋白表達(dá)(第3巻)、以及生物信息學(xué)(第4巻)。
用于蛋白質(zhì)純化的方法已有所描述，其包括免疫沉淀法、層析法、電泳法、 離心法和結(jié)晶法。Coligan等人(2000) CWreW尸ratoco/s 5Wewce, 第l
巻，John Wiley and Sons, Inc., New York?；瘜W(xué)分析、化學(xué)修飾、翻譯后修飾、 融合蛋白質(zhì)的產(chǎn)生、蛋白質(zhì)糖基化也已有所描述。例如參見(jiàn)Coligan等人(2000) Cw/r^iVotoco/s 尸ra/ez." 5Wewce，第2巻,John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel等人(2001) Cw/rew/iVotoco/s z>z Mo/ecw/ar所o/ogy， 第3巻,John Wiley and Sons, Inc., NY, NY，第16.0.5-16.22.17頁(yè)；Sigma-Aldrich, Co. (2001) /Vot/wcto /or丄z/e 5Wewce / ayefln:/ ， St. Louis, MO;第45-89頁(yè)；Amersham Pharmacia Biotech (2001)歷oZ^ecto^，Piscataway,N丄，第384-391頁(yè))。還描述了多克隆抗體和單 克隆抗體的產(chǎn)生、純化和片段化。Coligan等人(2001) CM〃eW尸rateo/s z力 /m腿wo/ogy，第l巻,John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow和Lane (1999) t/s7力g爿wWoAay， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow和Lane(1998)?？梢岳糜糜阼b定配體/受體相互作用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。參見(jiàn) 例如Coligan等人(2001) CWrewf/Vofco/s/m畫wo/ogy,第4巻,John Wiley, Inc., New York。
可以利用用于流式細(xì)胞術(shù)的方法，包括熒光活化細(xì)胞分類術(shù)(FACS)(參見(jiàn)例 如Owens等人(1994) F/ow C,附"^y /Ww"j: /e51々r C7/w.ca/丄a6orato/j尸racrice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) F/ow C,/w"/7， 第2版； Wiley-Liss， Hoboken, NJ; Shapiro (2003)尸raWca/ F/cw Qv/畫e卿，John Wiley and Sons, Hoboken, NJ)?？梢岳眠m于修飾用作(例如)診斷試劑的核酸(包括核 酸引物及才笨針)、多肽、以及抗體的熒光試劑(Molecular Probes (2003) Cato/ogwe, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Cato/ogwe， St. Louis, MO)。
免疫系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)方法已有所描述。參見(jiàn)例如Muller-Harmelink (編輯) (1986) i/w羅w 77 ，肌.朋d尸威o/ogy, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt等人(2000) Co/or爿/to o///i^to/ogy, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila， PA; Louis等人(2002) //^to/ogv.'7kxt朋c/McGraw-Hill, New
York, NY。
可以利用用于測(cè)定(例如)抗原片段、前導(dǎo)序列、蛋白質(zhì)折疊、功能結(jié)構(gòu)域、糖基化位點(diǎn)及序列比對(duì)的軟件包和數(shù)據(jù)庫(kù)。參見(jiàn)例如GenBank, Vector NTI Suite(Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package(Accelrys， Inc., San Diego, CA); DeCypher (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne等人 (2000) 5Zoz>2/orm(2"(^ 16: 741-742; Menne等人(2000) 5/oz'"yb/7na"cs J; / /Zca//ow5 iVote 16:741; Wren等人(2002) Cbw; w/. Afe,/ ocis iVograww 5Zowed. 68:177; von Heijne (1983)五w. /說(shuō)ocAem. 133:17; von Heijne (1986) iVwc/e/c ^4"Vfe i^s. 14:4683。實(shí)施例2 真菌感染模型如下獲得用于研究真菌感染的小鼠株系。8-10周齡的雌性C57BL/6和 BALB/c小鼠自Charles River(Calco， Italy)購(gòu)得。在佩魯賈大學(xué)(Perugia University, Perugia, Italy)的動(dòng)物培養(yǎng)中心(Animal Facility)()在特定無(wú)病原體的 條件下繁殖以C57BL/6為背景的純和的IL-12p35 、 IL-23p 19或IL-12p40缺陷型小 鼠(下文分別稱為p35一、 pl9一和p407，、 TLR-2、 TLR-4、 MyD88或TRIF缺陷型 小鼠(下文稱為TLR-2一、 TLR-4一、 MyD88一或TRIF,的小鼠。以BALB/c為背景 的IFN-Z7p35一小鼠繁殖對(duì)由M. Colombo博士(Istituto Tumori, Milan Italy)提供。 以BALB/c為背景的IFN-Z和IL-4- 、鼠也在佩魯賈大學(xué)動(dòng)物培養(yǎng)中心繁殖。根 據(jù)意大利許可動(dòng)物福利保障法案A-3143-01(Italian Approved Animal Welfare Assurance A-3143-01)進(jìn)4亍實(shí)-瞼。如下研究真菌感染及其治療。已描述了用于此研究的白色念珠菌株的來(lái)源 和特征。Bacci等人(2002),/mm柳o/. 168:2904。對(duì)于胃腸感染，經(jīng)胃內(nèi)注射108 個(gè)念珠菌細(xì)胞，真菌生長(zhǎng)的量化表示為每個(gè)器官的CFU(平均值士SE)，如Bacci 等人(2002)所述。對(duì)于靜脈內(nèi)感染，小鼠經(jīng)靜脈內(nèi)接收0.5ml內(nèi)不同量的真菌。 煙曲霉菌林和培養(yǎng)條件如Montagnoli等人((2006)/mww"o/. 176:1712)所述。 小鼠經(jīng)鼻內(nèi)接收兩次劑量的2xlC^曲霉菌休眠分生孢子。如由鱟變形細(xì)胞溶解物 (Limulus amebocyte lysate, LAL)方法所測(cè)定，將真菌以小于1.0 EU/ml懸浮于無(wú) 內(nèi)毒素的溶液(Detoxi-gel， Pierce, Rockford, IL)中。通過(guò)幾丁質(zhì)檢測(cè)定量真菌生 長(zhǎng)，其中結(jié)果表示為葡糖胺微克凄t/器官。對(duì)于組織學(xué)，將組織切除，立即于福 爾馬林(formalin)中固定，將石蠟包埋組織的部分(3-4 fim)用過(guò)石典酸-希夫氏試劑46(periodic acid-Schiff reagent)染色并檢查。Bacci等人(2002); Montagnoli爭(zhēng)乂 (2006)。用的200嗎pl9中和Ab(Belladonna等人(2006) qyto&"e 34:161)或IL-17A 中和mAb(TCll-18H10, PharMingen, SanDiego, CA)治療經(jīng)感染的動(dòng)物，在感染5 小時(shí)后腹膜內(nèi)給藥。在感染后5 h及24 h腹膜內(nèi)給藥總共l mg經(jīng)純化的抗 TGF陽(yáng)(31、 TGF-卩2、 mAb(2G7)(Lucas等人(1990) ■//mmt/"o/. 145:1415)。用PBS注射對(duì)照小鼠，因?yàn)樵赑BS處理與同種型對(duì)照處理(各處理)的動(dòng)物(每組 n〉6)之間未觀測(cè)到差異。如下純化細(xì)胞。通過(guò)^f茲性活化分類術(shù)使用Ly-6G MicroBead和MidiMac (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)自小鼠的腹膜腔分離 Gr-1+CD1 lb+多形核白血球嗜中性粒細(xì)胞(PMN，根據(jù)FACS分析純度大于980/0)。 通過(guò)磁性活化分類術(shù)使用CD4 MicroBead和MidiMac (Miltenyi Biotech)自腸膜淋 巴結(jié)(MLN)、胸淋巴結(jié)(71^)及脾純化004+T細(xì)胞。DC由骨髓細(xì)胞獲得，將骨 髓細(xì)胞在伊氏改良培養(yǎng)基(Iscove's modified medium)中在150 U/ml小鼠 rGM匿CSF(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)和75 U/ml rlL-4(R & D Systems, Minneapolis, MN)存在下培養(yǎng)7天以獲得CD1 lb+ DC或在200 ng/ml FLT3-L(R & DSystems)存在下培養(yǎng)9天以獲得FL-DC。 Romani等人(2006) 108:2265。通過(guò)/f茲性活化分類術(shù)使用CDllc MicroBead和MidiMac(Miltenyi Biotech)純化由 90-95% CD8-、 5-10%008+和1-5%8220+細(xì)胞組成的脾DC(〉99。/。的CD1 lc+和 0.1。/o的CD3+)。如Bellocchio等人((2004) / /mmw"o/. 173:7406)所述使用來(lái)自 酉良酒酵母(Sacc/mramyces cerev&ae, 10 |ag/ml, Sigma畫Aldrich)的酵母聚沖唐、來(lái)自 明尼蘇達(dá)沙氏桿菌(Salmonella minnesota)Re 595的超純LPS (10 jag/ml, Labogen, Rho, Milan, Italy)以及CpG寡核香酸2006(CpGODN, 0.06 joM)。。將DC細(xì)胞如下脈沖和培養(yǎng)。如Bacci等人(2002); Montagnoli等人(2006)所 述，以1:1細(xì)胞:真菌比率將DC暴露于具有和沒(méi)有10 ng/ml細(xì)胞因子(來(lái)自R & D Systems; Space Import-Export srl, Milan, Italy;及BD Biosciences-PharMingen, San Diego, CA)或中和抗體(IO嗎/ml)的活的未經(jīng)調(diào)理的真菌。。在培養(yǎng)的12 h時(shí)收 獲細(xì)胞以供RT-PCR，通過(guò)ELISA評(píng)估上清液的細(xì)胞因子含量。在培養(yǎng)物上清液 中進(jìn)行細(xì)胞因子定量之前，在存在和不存在中和抗體(10pg/ml)的情況下，將脾 CD4+ T細(xì)胞(10e/ml)在平底96孔板中在5xl()S念珠菌脈沖的脾DC存在下培養(yǎng)5 天。如所述將未經(jīng)分級(jí)分離的MLN或TLN細(xì)胞用滅活真菌培養(yǎng)(Montagnoli等人(2006); Montagnoli等人(2002)乂/mmimo/. 169:6298),接著5天后在培養(yǎng)物上清 液中進(jìn)行細(xì)胞因子測(cè)定。實(shí)施例3抗真菌活性檢測(cè)如Bellocchio等人(2004)所述，進(jìn)行未經(jīng)調(diào)理的念珠菌酵母或曲霉菌分生孢 子的PMN噬菌作用和殺真菌活性的檢測(cè)。。結(jié)果表示為CFU抑制百分比(平均值 士SE)。將PMN暴露于不同濃度的IL-17或IL-23或50 ng/ml IFN-y 土 IL-23/IL-17(100 ng/ml)中歷時(shí)12 h，接著針對(duì)IDO進(jìn)行Western印跡法，或暴露 歷時(shí)60 min, 4妄著添加真菌，再過(guò)60 min,以進(jìn)4亍殺真菌活性的研究及 MMP9/MPO(小鼠髓過(guò)氧化物酶)測(cè)定。如Bellocchio等人(2004)所述進(jìn)行明膠酶 譜法(zymography)。通過(guò)掃描72 kD區(qū)的裂解條帶，測(cè)定基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase， MMP9)的溶膠活性。對(duì)于MPO測(cè)定，使用兔抗人MPO多克 隆Ab(Calbiochem, San Diego, CA)探測(cè)樣品，使用電致化學(xué)發(fā)光(ECL)(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)》見(jiàn)觀寸。如Bozza等人(2005)所述通過(guò)用兔IDO特異性多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡來(lái)檢 測(cè)吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)。陽(yáng)性對(duì)照由表達(dá)IDO的MC24轉(zhuǎn)染子組成且陰性對(duì) 照為空白轉(zhuǎn)染(mock-transfected)的MC22細(xì)胞。如下通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR、 ELISA及ELISPOT檢測(cè)定量細(xì)胞因子。使用iCycler iQ⑧^r測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad, Hercules, CA)和SYBR㊣Green chemistry (Finnzymes Oy, Espoo, Finland)進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR。裂解細(xì)胞，使用RNeasy Mini試劑盒(QIAGEN S.p.A., Milano, Italy)提取總RNA，根據(jù)制造商說(shuō)明用Sensiscript逆轉(zhuǎn)錄酶 (QIAGEN)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR引物自Invitrogen(Carlsbad，CA)獲得。所用PCR引物 為針對(duì)小鼠IL-12p35 ,正向引物5'-CACCCTTGCCCTCCTAAACC(SEQ ID NO: l)和反向引物5'-CAAGGCACAGGGTCATCATC(SEQ ID NO: 2); 針對(duì)小鼠IL-23p19 ，正向引物5'-CCAGCAGCTCTCTCGGAATC(SEQ ID NO: 3),和反向引物5'-TCATATGTCCCGCTGGTGC(SEQ ID NO: 4);針對(duì)IL-12R(32，正向引物5'-CTTCTTAACAGCACGTCCTGG(SEQ ID NO: 5)，及反向引物5'-GGTCTCAGATCTCGCAGGTCA(SEQ ID NO: 6); 針對(duì)IL曙23R,正向引物5'-TGAAAGAGACCCTACATCCCTTGA(SEQ ID NO: 7)及反向引物5'-CAGAAAATTGGAAGTTGGGATATGTT(SEQ ID NO: 8); 針對(duì)小鼠，肌動(dòng)蛋白，正向引物5'-CGCAAAGACCTGTATGCCAAT (SEQ ID NO: 9)，及反向引物5'-GGGCTGTGATCTCCTTCTGC(SEQ ID NO: 10)。 根據(jù)制造商說(shuō)明(Applied Biosystems, Foster City, CA)對(duì)各樣品(三份重復(fù)) 進(jìn)行持家y-肌動(dòng)蛋白基因(housekeeping y-actin gene)的PCR擴(kuò)增以作為樣品加樣 的對(duì)照，允許在樣品之間標(biāo)準(zhǔn)化。包括了水對(duì)照以確保特異性。SYBI^綠色實(shí) 時(shí)PCR的條件為在95。C下3 min，接著為4下列步驟的40次循環(huán)在95。C下進(jìn) 行變性15s，在60。C下進(jìn)行1 min退火/延伸步驟。通過(guò)分析擴(kuò)增曲線圖來(lái)檢查各 數(shù)據(jù)點(diǎn)的完整性。mRNA標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)表示為與空白感染細(xì)胞的細(xì)胞因子 mRNA相比經(jīng)處理的細(xì)胞中相對(duì)的細(xì)胞因子mRNA。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附4企測(cè) (R&D Systems及針對(duì)IL-23, eBioscience, Socieli Italiana Chimici, Rome, Italy)評(píng) 估培養(yǎng)細(xì)胞的組織勻漿或上清液細(xì)胞因子含量。檢測(cè)的檢出限(pg/ml)對(duì)于 IL-12p70小于16,對(duì)于IL-23小于30,對(duì)于IFN-y小于10,對(duì)于IL-10小于3，對(duì)于 IL-17小于10,及對(duì)于TGF-(31小于4.6。對(duì)與念珠菌脈沖的DC共同培養(yǎng)3天的經(jīng) 純化的MLN CD4+ T細(xì)胞使用AID EliSpot檢測(cè)試劑盒(Amplimedical， Buttigliera Alta, Turin, Italy)以對(duì)產(chǎn)細(xì)胞因子細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。如下進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。時(shí)序檢驗(yàn)(log-rank test)用于Kaplan-Meier存活曲 線的成對(duì)數(shù)據(jù)分析。使用斯氏t檢驗(yàn)(Student's t-test)或方差分析(ANOVA)和 Bonferroni檢驗(yàn)(Bonferroni's test)確定器官清除率與體外檢測(cè)的差異的統(tǒng)計(jì)顯著 性。顯著性定義為p0.05。所報(bào)導(dǎo)的數(shù)據(jù)來(lái)自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn) 或自3至5個(gè)實(shí)驗(yàn)匯集。體內(nèi)組由每組6-8只小鼠組成。實(shí)施例4IL-23/IL-17在對(duì)念珠菌病的易感性中的作用為評(píng)估IL-23/IL-17通路對(duì)白色念珠菌感染的作用，我們根據(jù)存活率、真菌 生長(zhǎng)及組織病理學(xué)，比4交pl9一、 p35一、 p40一和57BL/6小鼠對(duì)胃腸感染的易感性 以及炎癥和獲得性Thl/Thl7免疫性的參數(shù)。結(jié)果(圖1A-E)顯示對(duì)念珠菌病的抗 性在p35一小鼠中嚴(yán)重削弱，50。/Q以上p35一小鼠死于此感染(圖lA)，其中胃中真 菌生長(zhǎng)升高(圖1B)。相比之下，在感染3天和10天后，如與C57BL/6小鼠相比， pl9一小鼠中限制真菌生長(zhǎng)的能力大為增加。顯著地，缺乏IL-12和IL-23兩者的 p40一小鼠比p35一小鼠對(duì)念珠菌病的易感性較低，且比pl9一小鼠對(duì)念珠菌病的易 感性較高，這強(qiáng)調(diào)IL-12對(duì)控制念珠菌的不同作用。Mencacci等人(1998) 乂 /mmw"o/. 161:6228。在靜脈內(nèi)感染p35;和pl9一小鼠后觀測(cè)到類似結(jié)果，其中平 均存活時(shí)間(MST)分別為6土2天對(duì)20士3天(5xl()S個(gè)真菌細(xì)胞接種體)和4士2天對(duì) 15±3天(106個(gè)真菌細(xì)胞接種體)。胃的組織病理學(xué)檢查揭示在C57BL/6、 pl9〃-或 p4(T 、鼠中存在角化不全癥、棘皮癥及有限的炎癥反應(yīng)，不過(guò)p40一小鼠尤其 pl9一小鼠展示單核細(xì)胞浸潤(rùn)。相比之下，大量真菌菌絲存在于p35一小鼠胃中的 角質(zhì)化層中，這與PMN大量浸潤(rùn)、上皮壞死體征以及顯著棘皮癥相關(guān)。這些結(jié) 果表明IL-23及IL-12通路在念珠菌病中具有相異作用。為使這些發(fā)現(xiàn)結(jié)果與IL-12/Thl及IL-23/Thl7免疫反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，在感染l天或 3天后評(píng)估小鼠的MLN中p35、 p19、 IL-12R卩2以及IL-23RmRNA表達(dá)(圖1C)，在 感染后第7天評(píng)估MLN中產(chǎn)IFN個(gè)IL-4或IL-17的CD4+細(xì)胞的頻率(圖1D)。我們 發(fā)現(xiàn)與C57BL/6小鼠相比，在pl9一小鼠中p35和IL-12R(32含量以基IFN-Y+細(xì)胞數(shù) 量增加，這證明在不存在IL-23的情況下IL-12/Thl反應(yīng)增加。相比之下，在缺乏 IL-12的小鼠(p35,中pl9和IL-23R的含量以及產(chǎn)IL-17細(xì)胞的數(shù)量增加。不出所 料，p35一小鼠中產(chǎn)IL-4的細(xì)胞的數(shù)量也顯著增加。這些數(shù)據(jù)證明在野生型 C57BL/6小鼠中主要的Thl反應(yīng)受到IL-12促進(jìn)且受到IL-23限制。IL-12抑制IL-23 和IL-17產(chǎn)生，且反過(guò)來(lái)IL-23抑制IL-12和IFN-y產(chǎn)生，這表明IL-23/Thl7與 IL-12/Thl通路交叉調(diào)節(jié)。這些數(shù)據(jù)表明升高的IL-23/Thl7反應(yīng)使小鼠對(duì)念珠菌 病具有高度易感性。實(shí)施例5IL-23/IL-17在對(duì)曲菌病的易感性中的作用為確定是否與念珠菌病類似，IL-23/IL-17通路的活化與對(duì)曲菌病的易感性50相關(guān)聯(lián)，評(píng)估pl9一、 p357—、 p40一或C57BL/6小鼠對(duì)肺曲菌病的易感性以及炎癥 和獲得性Thl/Thl7免疫性的參數(shù)。結(jié)果(圖2A)顯示真菌負(fù)荷在p35〃—小鼠中降低， 在p 19—A小鼠中降低程度甚至更大，這表明IL-12尤其IL-23抑制對(duì)曲霉菌感染的 控制(即，促進(jìn)曲霉菌感染)。肺的組織病理學(xué)檢查揭示在C57BL/6、 p40一或pl9一 小鼠中存在輕度炎癥病理學(xué)，特征為分歉在另外完整的肺實(shí)質(zhì)中的炎癥單核細(xì) 胞的少量浸潤(rùn)。雖然pl9一小鼠中浸潤(rùn)單核細(xì)胞的數(shù)目較高，但未觀測(cè)到實(shí)質(zhì)破 壞的體征。相比之下，PMN的大量浸潤(rùn)(Grl+CDllc-PMN增加約8-10倍)存在于 與大范圍間質(zhì)性肺炎體征相關(guān)的p35;小鼠的肺中。類似于念珠菌感染，IL-12 及IL-23與其各自的受體的表達(dá)受到交叉調(diào)節(jié)，其中與C57BL/6小鼠相比，pl9一 小鼠的TLN中p35和IL-12R卩2上調(diào)，p35;小鼠的TLN中pl9和IL-23R上調(diào)(圖 2B)。相比之下，p40一小鼠中IL-12和IL-23二者的不存在未顯著改變p35和pl9或 其受體IL-12RP2和IL-23R的表達(dá)。此外，在感染后第7天，產(chǎn)0^-丫+和產(chǎn)11^-17+ 的CD4十T細(xì)胞的數(shù)目分別在pl9一及p35;小鼠中增力口(數(shù)據(jù)未展示)。在肺中， pl9-、J、鼠中IL-12p70含量(554 土 44 pg/ml)比C57BL/6小鼠中(68 ± 8 pg/ml)高得 多，且IL-23僅可在p35- 、鼠中檢測(cè)到(79士 11)。與C57BL/6小鼠(37 ± 7 pg/ml) 相比，p35;小鼠中IL-17增加(246土 17pg/ml)。這些數(shù)據(jù)表明加強(qiáng)的IL-23/IL-17 依賴性炎癥反應(yīng)還與對(duì)曲菌病的易感性有關(guān)。
實(shí)施例6
TGF-p在IL-23/IL-17介導(dǎo)的對(duì)真菌感染的易感性中的作用
為研究IL-17在對(duì)真菌感染的易感性中的作用，在真菌感染后不久用抗IL-17 中和抗體處理小鼠。如通過(guò)相關(guān)靶器官中真菌生長(zhǎng)的減少(圖3A)、組織炎癥和 PMN浸潤(rùn)(數(shù)據(jù)未展示)所判斷，IL-17的阻斷極大地增加對(duì)白色念珠菌和煙曲霉 兩者的抗性?？剐耘cIFN-y+Thl細(xì)胞的頻率增加和Thl7細(xì)胞的頻率降低有關(guān)， 這使得MLN細(xì)胞分泌的IL-17的量降低(圖3B)。類似地，抗體對(duì)IL-23的中和作 用增加對(duì)真菌感染和Thl發(fā)育的抗性，這證實(shí)了我們?cè)趐l9;小鼠中獲得的數(shù)據(jù) (圖3B)。這些結(jié)果清楚證明IL-23/IL-17通路通過(guò)抑制保護(hù)性Thl免疫性賦予對(duì)真 菌感染的易感性。
近來(lái)的結(jié)果表明TGF-p與IL-6—起促進(jìn)Thl7發(fā)育。Bettelli和Kuchroo (2005) 201:169; Mangan等人(2006) 7Va^re 441:231; Veldhoen等人(2006)/附mw"^ 24:179。我們通過(guò)用TGF-(3中和抗體處理來(lái)評(píng)估小鼠中TGF-(3對(duì)Th細(xì)胞 發(fā)育和真菌控制的作用。顯著地，在白色念珠菌和煙曲霉感染期間，TGF-(3抑 制都不影響產(chǎn)IL-17細(xì)胞的發(fā)育(圖3B)，僅在具有曲霉菌但不具有念珠菌的小鼠 中觀測(cè)到真菌負(fù)荷輕微但明顯的減少(圖3A)，但在兩種感染中CD4+Thl7細(xì)胞的 活化均未受處理所影響。因?yàn)門GF-P中和作用有效降低感染中的TGF-(3產(chǎn)生(胃 中46至24pg/ml，肺中36至15pg/ml),所以我們推斷TGF-(3在Thl7介導(dǎo)的對(duì)真菌 感染的易感性中起次要作用。
實(shí)施例7
在il-12不存在的情況下il-23/il-17在真菌感染中的作用
以上數(shù)據(jù)表明IL-23/IL-17軸決定對(duì)真菌感染的易感性的 一種可能機(jī)制在于 抑制保護(hù)性Thl反應(yīng)的相對(duì)能力。為正式對(duì)其加以證明，在加強(qiáng)(IL-4〃-小鼠)或 缺乏(IFN-f 、鼠)Thl反應(yīng)性的條件下，對(duì)IL-23進(jìn)行阻斷。使小鼠經(jīng)胃內(nèi)感染白 色念珠菌，通過(guò)中和抗體進(jìn)行IL-23阻斷。與先公開(kāi)物(Romani等人(1992)乂五x; . Me《176:19; Cenci等人(1998)/mmw"o/. 161:3543)—致，與BALB/c小鼠相比， IL-4一小鼠中真菌負(fù)荷較低，IFN-Y一小鼠中真菌負(fù)荷較高，這證明了IFN-Y對(duì)感 染控制的重要性。類似于WT小鼠，IL-23的阻斷大大減少IL-《M、鼠胃中的真菌 負(fù)荷(圖3C)，同時(shí)增加MLN中的IL-12p70/IFN-y產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未展示)，這表明Th2 和IL-23/Thl7通路兩者均加性拮抗保護(hù)性抗真菌反應(yīng)。意外地，IFN-y;小鼠中 升高的真菌負(fù)荷在中和IL-23后進(jìn)一步增加(圖3C),這導(dǎo)致經(jīng)抗IL-23處理的小鼠 中IL-23產(chǎn)生減少(229對(duì)21 pg/ml), IL-17產(chǎn)生減少(279對(duì)95 pg/ml)。因此，在IFN-y 不存在的情況下，IL-23在真菌感染中可具有保護(hù)性作用。然而，如通過(guò)p35一 或雙重缺陷的IFN- 7p35一的小鼠中中和IL-23后真菌負(fù)荷降低所證明，IL-23在
IL-12p70不存在的情況下或在IL-12p70和IFN-Y兩者都不存在的情況下具有相反 作用(圖3 C)。這些數(shù)據(jù)表明在IFN-y不存在的情況下IL-23的保護(hù)性作用由 IL-12p70所介導(dǎo)。顯著地，還在結(jié)核病中觀測(cè)到在IL-12p70不存在的情況下IL-23 的中度的保護(hù)性作用，其中在產(chǎn)0^-丫的保護(hù)性€04+ T細(xì)胞誘導(dǎo)下IL-23部分替 代IL-12p70。 Khader等人(2005)。
實(shí)施例8樹(shù)突狀細(xì)胞響應(yīng)真菌感染產(chǎn)生IL-23和IL-12
已顯示IL-23是由人DC響應(yīng)體外曲霉菌而產(chǎn)生。Gafa等人(2006) /"/e". /mwM". 74:1480。此處我們?cè)u(píng)估IL-23是否由DC相應(yīng)白色念珠菌而產(chǎn)生以及其與 IL-12和IL-10(基本上為誘導(dǎo)對(duì)真菌的保護(hù)性耐受性所需的兩種細(xì)胞因子)的產(chǎn) 生如何相關(guān)。Romani和Puccetti (2006)。
為達(dá)成此目的，我們?cè)贕M-CSF(GM-DC)或Flt3-L(FL-DC)存在下制備源自 骨髓的DC，它們分別具有脊髓DC和漿細(xì)胞樣DC的特征。雖然FL-DC涵蓋與新 鮮收集的脾CD8+、 CD8-和B220+LyC6+漿細(xì)胞樣DC的混合物等效的群體(Naik 等人(2005) J. Immunol. 174:6592)，但我們近來(lái)證明FL-DC的功能活性存在于漿 細(xì)胞樣DC中或CD8-與CD8十DC的組合中。Romani等人(2006)別ood 108:2265。 在體外用酵母或真菌菌絲刺激DC且評(píng)估其中的細(xì)胞因子mRNA表達(dá)和產(chǎn)生。酵 母聚糖和LPS用作GM-DC的陽(yáng)性對(duì)照，CpG-ODN用作FL-DC的陽(yáng)性對(duì)照。
結(jié)果顯示DC亞群的兩個(gè)亞群相應(yīng)對(duì)真菌反應(yīng)而表達(dá)和產(chǎn)生細(xì)胞因子的分 歧性(dichotomy)。 RT-PCR分析揭示p19 mRNA表達(dá)僅在GM-DC中增加，對(duì)酵母 的反應(yīng)強(qiáng)于菌絲；p35 mRNA表達(dá)在對(duì)酵母反應(yīng)的GM-DC中略微增加，但類似 于IL-IO，在暴露于菌絲的FL-DC中極大增力口(圖4A)。培養(yǎng)物上清液中實(shí)際細(xì)胞 因子產(chǎn)生的檢測(cè)證實(shí)IL-23由GM-DC對(duì)酵母(尤其在高真菌:DC比率下)以及酵母 聚糖或LPS反應(yīng)產(chǎn)生(圖4B)。 IL-23產(chǎn)生的最大含量在培育第12 h時(shí)觀測(cè)到(圖 4B),此后下降(數(shù)據(jù)未展示)。相反的，IL-12p70和IL-10兩者主要由用念珠菌菌 絲、LPS或CpG-0DN刺激12 h的FL-DC產(chǎn)生(圖4B)，而且此后繼續(xù)升高(數(shù)據(jù)未 展示)。綜合而言，這些數(shù)據(jù)表明IL-23由脊髓DC對(duì)真菌反應(yīng)(尤其在高水平真菌 生長(zhǎng)的條件下)且早于其它指示性細(xì)胞因子產(chǎn)生。因此，不同DC亞群對(duì)念珠菌 反應(yīng)產(chǎn)生指示性細(xì)胞因子的能力可調(diào)節(jié)其在體內(nèi)的抗真菌免疫性。實(shí)際上，如 已針對(duì)曲霉菌所示(Romani等人(2006) 108:2265)，在獲得性(adoptive)
轉(zhuǎn)移至患有念珠菌病的受體小鼠中后，念珠菌脈沖的FL-DC賦予保護(hù)作用且念 珠菌脈沖的GM-DC加重感染。
實(shí)施例9
IL-23與IL-12的交叉調(diào)節(jié)
為證實(shí)IL-12p70與IL-23產(chǎn)生在對(duì)真菌反應(yīng)時(shí)是否受到交叉調(diào)節(jié)，我們檢測(cè)來(lái)自pl9;、 p35^和C57BL/6對(duì)照小鼠的脾DC在暴露于IL-12p70或IL-23或相應(yīng)中 和抗體后的IL-12p70和IL-23分泌。圖4C顯示示IL-12p70和IL-23確實(shí)受到交叉調(diào) 節(jié)，因?yàn)槿缗cWTDC相比，IL-12p70的產(chǎn)生在pl9一DC中較高，IL-23的產(chǎn)生在 p35一DC中較高。此外，暴露于IL-12p70或IL-23分別顯著減少WTDC的IL-23或 IL-12p70分泌，在IL-12或IL-23中和的條件下相反情況成立(圖4D)。因?yàn)镽T-PCR 揭示未經(jīng)刺激的DC表達(dá)兩種細(xì)胞因子受體(數(shù)據(jù)未展示)，所以這些數(shù)據(jù)表明存 在旁分泌環(huán)路，通過(guò)該旁分泌環(huán)路DC的IL-12p70和IL-23產(chǎn)生受到相互調(diào)節(jié)。
實(shí)施例IO
TLR在樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-23中的作用
為確定對(duì)真菌反應(yīng)產(chǎn)生IL-23 TLR依賴性的可能性，我們檢測(cè)自TLR-2—A或 TLR-4,小鼠以及自MyD88—z-和TRIF;小鼠產(chǎn)生的GM-DC對(duì)酵母或分生孢子反 應(yīng)所發(fā)生的IL-23產(chǎn)生。Akira和Takeda (2004) A^. T ev. /mmw"o/. 4:499。圖5A顯 示TLR2和TLR4對(duì)于由通過(guò)MyD88而非TRIF的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生IL-23都是必需的。 顯著地，甚至在TRIF不存在的情況下似乎也能促進(jìn)IL-23。因此，傳統(tǒng)的DC對(duì) 真菌反應(yīng)經(jīng)由TLR/MyD88依賴性炎癥通路產(chǎn)生IL-23 。
為確定T細(xì)胞是否還可調(diào)節(jié)IL-23產(chǎn)生，我們?cè)u(píng)估與CD4+T細(xì)胞一起培養(yǎng)的 DC的上清液中產(chǎn)生的IL-23含量。結(jié)果清楚證明IL-23產(chǎn)生在經(jīng)念珠菌脈沖的DC 刺激的T細(xì)胞培養(yǎng)物中受到上調(diào)(組3對(duì)組6，圖5B)，其中經(jīng)念珠菌脈沖的DC來(lái) 自C57BL/6 (尤其p35一)小鼠，發(fā)現(xiàn)結(jié)果表明經(jīng)活化的T細(xì)胞可對(duì)IL-23產(chǎn)生的 擴(kuò)增提供正反饋回路。此外，交叉實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)產(chǎn)生IL-23的DC為活化產(chǎn)IL-17 細(xì)胞所必需和足夠的(組7及8)。此外，添加至DC與T細(xì)胞的共培養(yǎng)物中的mAb 對(duì)IL-23的中和能抑制IL-17產(chǎn)生(組4對(duì)組5，圖5C),而TGF-p中和作用影響IFN^ 產(chǎn)生(組1對(duì)組3)而不影響IL-17產(chǎn)生(組4對(duì)組6)。
實(shí)施例ll
IL-23和IL-17對(duì)多形核嗜中性粒細(xì)胞的抗真菌效應(yīng)功能的作用
PMN在對(duì)真菌反應(yīng)的的急性炎癥的起始和進(jìn)行中是必需的。Romani (2004)。發(fā)現(xiàn)PMN大量募集至感染部位，這與p35一小鼠中早期真菌生長(zhǎng)一起導(dǎo) 致我們的假設(shè)IL-23/IL-17依賴性通路可能不利地影響PMN的抗真菌效應(yīng)功能。因此，我們?cè)u(píng)估了在IFN-y不存在或存在的情況下用重組IL-23或IL-17培養(yǎng)的來(lái) 自pl9;或p35一小鼠及來(lái)自WT小鼠的PMN的殺真菌活性。與C57BL/6 PMN相 比，殺傷活性在pl9一 PMN中顯著增加，在p35一小鼠中降低(圖6A)。在將PMN 暴露于這些細(xì)胞因子前，我們驗(yàn)證了是否類似于IL-17R(Yao等人(1995) /附mwm'(y 3:811-821), IL-23R還在鼠PMN上表達(dá)。定量RT-PCR揭示了未經(jīng)刺激 的PMN表達(dá)IL-23R，其表達(dá)在經(jīng)LPS刺激后進(jìn)一步增力n(數(shù)據(jù)未展示)，該發(fā)現(xiàn)表 明PMN還對(duì)IL-23反應(yīng)。
在IFN-Y不存在和存在的情況下(圖6C)暴露于任一細(xì)胞因子均以劑量依賴 性方式削弱WTPMN的殺傷活性(圖6B)。因此，IL-23及IL-17負(fù)性調(diào)節(jié)PMN的抗 真菌效應(yīng)功能，這可是為何p35一小鼠無(wú)法有效限制真菌生長(zhǎng)的原因。因此，雖 然IL-17為PMN的有效化學(xué)引誘劑(Ye等人(2001) J!五罕.Me丄194:519)使得外周 PMN流入受感染器官減少說(shuō)明IL-17AR缺陷型小鼠對(duì)念珠菌病的高度易感性 (Huang等人(2004) 乂/w/e". ZXy. 190:624)，但我們的結(jié)果還指出了IL-17對(duì)PMN 功能的不利影響。
實(shí)施例12
IL-23和IL-17對(duì)多形核嗜中性粒細(xì)胞的IDO農(nóng)賴性抗炎程序的作用
我們已證明IFN-y介導(dǎo)的IDO活化負(fù)性調(diào)節(jié)PMN抵抗念珠菌的炎癥程序，使 得IDO阻斷導(dǎo)致促進(jìn)PMN的炎癥狀態(tài)。Bozza等人(2005)。 MMP-9和MPO為所提 出的由IL-17活化的典型炎癥標(biāo)記。Kolls和Linden (2004)/mmwm^ 21:467。因此， 我們?cè)u(píng)估了IL-23和IL-17兩者對(duì)白色念珠菌誘導(dǎo)的MMP-9、 MPO,以及IFN-y介 導(dǎo)的IDO產(chǎn)生的作用。IL-23且尤其IL-17顯著增加MMP-9和MPO(圖6D)。 WT PMN的IDO表達(dá)和炎癥反應(yīng)。相比之下，兩種細(xì)胞因子完全拮抗IFN-y對(duì)IDO的 誘導(dǎo)(圖6E)。有趣地，凋亡PMN的數(shù)目在暴露于IL-23及IL-17兩者之后都顯著減 少(數(shù)據(jù)未展示)，這表明這些細(xì)胞因子還增強(qiáng)PMN存活力。這可為Thl7通路維 持炎癥的另一機(jī)制。因此，破壞PMN炎癥程序的能力以及炎癥組織中網(wǎng)狀蛋白 水解負(fù)載增加可解釋真菌感染中與Thl7細(xì)胞活化有關(guān)的炎癥病理學(xué)。
實(shí)施例13
基于IL-17產(chǎn)生的IL-23特異性拮抗劑的檢測(cè)
55如通過(guò)熒光活化細(xì)胞分類術(shù)^八€3@)分析所測(cè)定，使用鼠引流淋巴結(jié)(DLN)細(xì)胞的體外研究已證明消除IL-23能抑制或消除產(chǎn)IL-17細(xì)胞，而增加IL-23產(chǎn)生或刺激IL-17分泌。參見(jiàn)WO 2004/071517, Langrish等人(2005)丄Me丄201:233。還參見(jiàn)Aggarwal等人(2003) 說(shuō)o/. CAew. 278:1910。在這些實(shí)驗(yàn)中，用細(xì)胞因子或抗體處理DLN細(xì)胞5天。將細(xì)胞自抗原初免的正常野生型小鼠分離，在rlL-12或rlL-23存在下培養(yǎng)。對(duì)0!^培養(yǎng)物中€04+T細(xì)胞的分析證明IL-12促進(jìn)產(chǎn)IFN-Y細(xì)胞的發(fā)育，同時(shí)產(chǎn)IL-17的群體喪失。相比之下，IL-23促進(jìn)產(chǎn)IL-17細(xì)胞發(fā)育，同時(shí)產(chǎn)生IFN-Y的群體喪失?？筽l9抗體降低IL-17產(chǎn)生但不影響IFN-Y含量，而抗p35抗體不改變IL-17產(chǎn)生。總之，這些結(jié)果證明IL-23選擇性促進(jìn)產(chǎn)IL-17CD4+T細(xì)胞的發(fā)育。
如下，使用IL-23和IL-12的生物活性的這種差異來(lái)評(píng)估相對(duì)于IL-12，潛在
IL-23拮抗劑的效力和特異性。
如下獲得在潛在IL-23特異性拮抗劑不存在的情況下關(guān)于IL-23及IL-12活性的基線數(shù)據(jù)。(皮下)用在完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant)中乳化的蛋白脂質(zhì)肽(PLP)及用(靜脈內(nèi))百日咳毒素免疫正常野生型SJL小鼠。在免疫后第9天移除引流淋巴結(jié)，立刻評(píng)估單核細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)IFN-y和IL-17產(chǎn)生(如下所述)，或?qū)魏思?xì)胞分離且在PLP加rlL-12或rlL-23的存在下培養(yǎng)5天。在Golgi-plug存在下用PMA(50 ng/ml)/離子霉素(ionomycin)(500 ng/ml)刺激細(xì)胞3小時(shí)，接著針對(duì)CD4進(jìn)行表面染色，滲透，且針對(duì)IFN-Y及IL-17進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。流式細(xì)胞儀曲線圖以活CD4+T細(xì)胞為門區(qū)(gate)。
相對(duì)于未經(jīng)細(xì)胞因子處理的對(duì)照細(xì)胞評(píng)估IL-23和IL-12的作用。通常，經(jīng)IL-23處理的細(xì)胞表現(xiàn)出產(chǎn)IL-17細(xì)胞百分比增加，而產(chǎn)IFN-Y細(xì)胞不增加，而經(jīng)IL-12處理的細(xì)胞表現(xiàn)出產(chǎn)IFN-y細(xì)胞百分比增加，而產(chǎn)IL-12細(xì)胞不增加(或甚至減少)。
通過(guò)在拮抗劑存在下或優(yōu)選在一系列濃度拮抗劑存在下進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)，測(cè)定潛在IL-23特異性拮抗劑的效力和特異性。IL-23特異性拮抗劑抑制IL-23的活性(即，該拮抗劑減少另外由IL-23誘導(dǎo)的產(chǎn)IL-17細(xì)胞的百分比)，但并不實(shí)質(zhì)上降低IL-12的活性。抑制IL-12或IL-12與IL-23兩者的活性的藥劑并非IL-23特異性
拮抗劑。
任選，可包括其中使用已知抗pl9拮抗劑抗體來(lái)特異性抑制IL-23活性的陽(yáng)性對(duì)照。
實(shí)施例14分枝桿菌感染
提供一種證明本發(fā)明的組合物和方法在治療分枝桿菌感染中的功效的方法。如下將C57BL/6小鼠用分枝桿菌感染。如制造商所建議，將Theracys-BCGLive(Aventis Pasteur, Inc., Swiftwater， PA)(卡介苗(萬(wàn)a"7/e Ca/me"e and G^enVz)的Connaught菌林與牛分枝桿菌的減毒菌抹的凍干制劑)復(fù)溶。在10%甘油鹽水中使經(jīng)復(fù)溶的細(xì)菌達(dá)到約6x107 cfb/mL的濃度。在注射至小鼠之前，在0.02%Tween-80/0.9。/。鹽水中將等分試樣稀釋至適當(dāng)濃度。
經(jīng)由側(cè)尾靜脈將6至8周齡的雌性C57BL/6小鼠用約3.5xl05 cfii的BCG靜脈內(nèi)感染。在分枝桿菌感染前l(fā)天且再次在分枝桿菌感染后l-2周，皮下給藥小鼠lmg于0.9。/。鹽水中的適當(dāng)單克隆抗體(例如，同種型對(duì)照、抗IL-23p19、或抗IL-23R)。在感染后適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)通過(guò)C02麻醉處死小鼠。
如下分析處死的經(jīng)BCG感染的小鼠。通過(guò)在切斷下腔靜脈后經(jīng)由心臟的右心室灌注RPMI 1640，將血液自肺清除。無(wú)菌移除左肺、下右肝葉和一半的脾。使用Mini陽(yáng)Bead Beater-8勻化器(BioSpec Products, Bartlesville, OK)將組織在0.90/0NaCl/0.02% Tween 80中均化。通過(guò)將10倍連續(xù)稀釋的器官勻漿涂于7H10Middlebrook瓊脂板(Becton Dickinson, Sparks, MD)上來(lái)定量存活的分枝桿菌。在37。C下孵育兩周后人工計(jì)數(shù)菌落形成單位(CFU)。與對(duì)照小鼠(例如，同種型對(duì)照)相比，在經(jīng)抗IL-23抗體(例如，抗IL-23pl9抗體或抗IL-23R抗體)處理的動(dòng)物中細(xì)菌負(fù)荷在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減少(如通過(guò)CFU所檢測(cè))，這證明能有效治療分枝桿菌感染。
權(quán)利要求
1.一種治療患有感染的個(gè)體的方法，包括給予有效量的IL-23拮抗劑。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述感染為選自病毒感染、真 菌感染和細(xì)菌感染的慢性感染。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述慢性感染為真菌感染。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述真菌感染選自念珠菌病、 曲菌病、隱〗求菌病和曱真菌病。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述真菌感染為念珠菌病。
6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述真菌感染為慢性皮膚粘 膜念珠菌病(CMC)。
7. 如權(quán)利要求3所述的方法，還包括將一種或多種選自下列的抗真菌劑 給予所述個(gè)體泊沙康唑、氟康唑、伏立康唑、j尹曲康唑、酮康唑、利阿唑、 伊替馬唑、克霉唑、咪康唑、益康唑、布康唑、奧昔康唑、硫康唑、p塞康唑、 和特康唑、噻二唑、噁二唑、卡泊芬凈、兩性霉素B、制霉菌素、匹馬菌素、 氟胞嘧啶(5-氟胞嘧啶)、萘替芬、特比萘芬、布替萘芬、硫代碳酸托萘酯、灰黃 霉素、胺碘酮、環(huán)吡司、舒苯汀、阿莫羅芬、氯硤羥喹、龍膽紫、碘化鉀、硫 代碌u酸鈉、石炭酸-品紅溶液、乙酸卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述一種或多種抗真菌劑為 兩性霉素B、氟胞嘧，定、伊曲康哇、伏立康峻、氟康唑或泊沙康唑。
9. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述慢性感染為細(xì)菌感染。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述細(xì)菌感染為分枝桿菌感染。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述分枝桿菌感染由選自牛 分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌及結(jié)核分枝桿菌的分枝桿菌引起。
12. 如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述分枝桿菌感染為TB。
13. 如權(quán)利要求9所述的方法，還包括將一種或多種選自下列的抗微生物 劑給予所述個(gè)體異煙肼、利福平、吡溱酰胺、乙胺丁醇、鏈霉素、環(huán)丙沙星、 萬(wàn)古霉素和氧氟沙星。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述抗微生物劑為萬(wàn)古霉素。
15. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述慢性感染為病毒感染。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述病毒感染由選自HIV、 HPV、 HBV和HCV的病毒引起。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述病毒感染由HCV引起。
18. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述病毒感染由HIV引起。
19. 如權(quán)利要求15所述的方法，還包括將一種或多種選自下列的抗病毒劑 給予所述個(gè)體阿巴卡韋、阿昔洛韋、金剛烷胺、安普那韋、地拉韋啶、去羥 肌苷、依發(fā)韋侖、泛昔洛韋、茚地那韋、干擾素a、利巴韋林、拉米夫定、奈非 那韋、奈韋拉平、奧司他韋、噴昔洛韋、利巴韋林、利托那韋、沙奎那韋、司 他夫定、萬(wàn)乃洛韋、扎西他濱、扎那米韋以及齊多夫定。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述抗病毒劑為齊多夫定。
21. —種增強(qiáng)患有感染的個(gè)體Thl免疫反應(yīng)的方法，包括給予IL-23拮抗劑。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述增強(qiáng)的Thl免疫反應(yīng)包 括表達(dá)0^-丫的004+ T細(xì)胞的百分比與給予所述IL-23拮抗劑之前表達(dá)IFN-y的 CD4+ T細(xì)胞的百分比相比增力口2倍或更多。
23. 如權(quán)利要求21的方法，其特征在于，所述增強(qiáng)的Thl免疫反應(yīng)包括表 達(dá)工-17的004+ 了細(xì)胞的百分比與給予所述化-23拮抗劑之前表達(dá)11^17的〔04+ T 細(xì)胞的百分比相比減少2倍或更多。
24. 如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述感染為慢性真菌感染。
25. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，還包括給予IL-17A拮抗劑。
26. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，
27. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，
28. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，劑。
29. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法， 劑是與IL-23p 19結(jié)合的結(jié)合化合物。
30. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法， 劑是與IL-23R結(jié)合的結(jié)合化合物。還包括給予IL-6拮抗劑。 還包括給予TGF-p拮抗劑。 還包括給予IL-12或11^-12激動(dòng)其特征在于，所述IL-23拮抗其特征在于，所述IL-23拮抗
31. 如權(quán)利要求29或權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合化合 物是抗體或其抗原結(jié)合片段。
32. 如權(quán)利要求29或權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，抑制IL-12與 其受體結(jié)合的IC50與抑制IL-23與其受體結(jié)合的IC5 0的比率(IC50n^ 2/IC50IL-23) 經(jīng)ELISA測(cè)量為5或更大。
33. 如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合化合物為選自下列 的抗體片段Fab、 Fab'、 Fab'-SH、 Fv、 scFv、 F(ab')2和雙功能抗體。
34. 如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述抗體為人源化抗體。
35. 如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述抗體為完全人抗體。
36. 如權(quán)利要求29或權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合化合 物為單鏈抗體。
37. 如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述抗體具有降低補(bǔ)體活化、 ADCC或兩者的改變的效應(yīng)功能。
38. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合化合物是衍生自 IL-23R的可溶性受體片段。
39. 如權(quán)利要求l-28中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述IL-23拮抗 劑是siRNA。
40. 如權(quán)利要求l-28中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述IL-23拮抗 劑是反義核酸。
41. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述患有感染的 個(gè)體先前已使用其它方法或組合物治療所述感染。
42. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述患有感染的 個(gè)體免疫受損。
43. IL-23拮抗劑在制備用于治療感染的藥物中的用途。
44. 如權(quán)利要求43所述的用途，其特征在于，所述感染為慢性真菌感染。
45. —種治療懷疑患有感染的個(gè)體的方法，包括給予有效量的IL-23拮抗劑。
46. —種治療有獲得感染的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法，包括給予有效量的IL-23拮抗劑。
47. —種治療患有感染的個(gè)體的方法，包括給予有效量的IL-17A或IL-17F或二者的拮抗劑。
48. —種治療感染的方法，包括給予有效量的雙特異性抗體，該雙特異性 抗體與選自下列的任兩種蛋白特異性結(jié)合IL-23pl9、 IL-23R、 IL-17A、 IL-17F、 IL-17RA、 IL-17RC、 IL曙6和TGF-P。
49. 如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，該蛋白為人蛋白。
50. 如本文所述的任何發(fā)明。
全文摘要
本發(fā)明提供包含IL-23拮抗劑的方法及組合物，所述方法和組合物用于治療感染，諸如慢性細(xì)菌感染、病毒感染以及真菌感染。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101668775SQ200880010208
公開(kāi)日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2008年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月12日
發(fā)明者A·A·查克安, L·羅曼尼, M·科夫, R·A·凱斯提蘭 申請(qǐng)人:先靈公司