專利名稱：：色烯s1p1受體拮抗劑的制作方法色烯S1P1受體拮抗劑本發(fā)明涉及多環(huán)的化合物、它們的制備方法、它們作為藥物的用途以及包含它們的藥物組合物。更具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了式I化合物或其生理學(xué)上可水解的衍生物、其鹽、水合物和/或溶劑化物(I)其中R,和R2各自獨立地選自以下基團氫；鹵素；硝基；任選取代的C,_8烷基(例如被芳基、C^環(huán)烷基或d-s烷氧基取代)；任選取代的卣代d-8烷基；任選取代的C,—8烷氧基(例如被d-8烷氧基、C^環(huán)烷基、芳基取代)；任選取代的鹵代d-s烷氧基；R3為包含至少一個環(huán)N原子的飽和雜環(huán)，且其通過R3的環(huán)C原子與環(huán)A連接，該環(huán)碳原子或任何其他環(huán)C原子任選被取代(例如被卣素、d-6烷基、Cw烷氧基、C！—6烷基d-6烷氧基取代)；且R3在所述環(huán)A的3位或4位上，優(yōu)選在4位上；R4為氫；羥基；卣素；卣代C,-s烷基；任選取代的C^烷基；C卜6烷氧基；或囟代C"烷氧基；且R4在2位(鄰位)或3位(間位)上。鹵素可以是氟、氯或溴，優(yōu)選氟或氯。作為基團或在基團中存在的烷基或烷氧基可以是直鏈或支鏈。亞烷基可以是直鏈或支鏈。作為基團或在基團中存在的烷基可以是被取代的，例如被羥基、卣素、烷氧基取代。作為基團或在基團中存在的烷氧基可以是被取代的，例如被羥基取代。當(dāng)烷基或烷氧基被羥基取代時，則羥基優(yōu)選在烷基或烷氧基的末端位置。鏈烯基可以例如被烷基、羥基取代。如本文所定義的卣代烷基和囟代烷氧基分別指被l至5個卣素取代的作為基團或在基團中存在的烷基和烷氧基，例如CFr、CHF2-、CH2F-或CF3-CH20-、CHF2-CH20-、CH2FCH2-0。卣代烷基和面代烷氧基可以例如被羥基取代。任意芳基可以是苯基或萘基，優(yōu)選苯基。作為基團或自基團中存在的<:3.8環(huán)烷基，例如R，、R2，是指三至八元，優(yōu)選五至七元的不包含雜原子非芳環(huán)。優(yōu)選地R3為下式(Ia)廣X、N(Ia)其中X選自N、O、C和S原子。優(yōu)選地R3為如下式(Ib)的三至八元飽和雜環(huán)R(Ib)其中X選自NR、O、CH2和S原子，其中R和R，彼此獨立地為H或d-4烷基，且其中所述的R3與式(I)中的所述A環(huán)通過帶氫原子的式(Ib)環(huán)內(nèi)任何碳原子相連，該氫然后^L所述連接替換。在式(Ib)中，所述變量可獨立地、共同地或其任意組合地具有以下優(yōu)選的含義R為H、甲基或乙基；R，為H或甲基；X選自NR、0和CH2，其中R為H或Cw烷基或更優(yōu)選地為H、甲基或乙基；式(Ib)的殘基可以是手性的，例如R-或S-對映體，或者可以是其外消旋混合物。另一方面本發(fā)明涉及式(I)化合物的代謝物，例如其中R3為式(Ic)或(Id)殘基的式(I)化合物<image>imageseeoriginaldocumentpage7</image>其中x選自o和s原子，R為H或d—4烷基，且波浪鍵表示R-或S-對映體或其混合物。例如，R3為包含1或2個優(yōu)選地選自N、O和S的雜原子的三至八元、優(yōu)選為五至八元飽和雜環(huán)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解當(dāng)環(huán)的大小為五至八個原子時，雜環(huán)中一般地可以存在2個雜原子。因此在三和/或四元雜環(huán)中一般地存在不多于1個雜原子。在另一方面，R3通過R3的環(huán)C原子與環(huán)A相連，使其在R3的環(huán)N原子(或者R3的多個環(huán)N原子中的一個)的鄰位或間位。優(yōu)選的R3選自3-嗎啉基、2-嗎啉基、2-哌噪基、2-派咬基、3-哌咬基、3-硫代嗎啉基、2-碌L代嗎啉基、2-吡咯烷基和3-吡咯烷基。任選地R3為4皮取代的。當(dāng)R3為被取代的時，其可以在一個或多個環(huán)碳原子和/或當(dāng)存在時的環(huán)氮原子上被取代。環(huán)碳原子上的取代基的實例包括例如C,-4烷基、C,-6烷氧基、鹵素、鹵代d—4烷基。環(huán)雜原子上的取代基實例包括例如C,—4烷基。環(huán)A不包括雜原子。獨立地、共同地或者以任意組合或亞組合優(yōu)選以下意義1.R,和R2彼此獨立地選自氫；任選取代的d-s烷基；任選取代的卣代d—s烷基；任選取代的d—8烷氧基；任選取代的囟代C,-8烷氧基；2.R,和R2彼此獨立地選自氬；C，-8烷基；Cu烷氧基；3.R,和R2兩者不都為氫；4.R,和R2兩者均為Cu烷氧基；5.R3為3-嗎啉基、2-艱溱基、2-哌咬基或2-吡咯烷基；6.R3為3-S-嗎啉基、2-S-艱漆基、2-R-哌梵基或2-R-吡咯烷基；7.1義3在4位；8.R和R2彼此獨立地選自氫；C^烷基；Cu烷氧基；R3選自3-嗎啉基、2-哌嗪基、2-哌咬基和2-吡咯烷基；9.!^和R2彼此獨立地選自Cu烷基；Q-8烷^J^;R3選自3-S-嗎啉基、2-S-哌嗪基、2-R-艱"定基和2-R-吡咯烷基；且R4為氫；10.R,和R2彼此獨立地選自任選取代的d—8烷基；任選取代的囟代C^烷基；任選取代的C,—8烷氧基；和任選取代的卣代d—8烷氧基；11.R，和R2彼此獨立地選自d—8烷基；卣代C,-8烷基；C^烷氧基；和卣代Ci—8坑氧^^;12.R,和R2彼此獨立地選自d-s烷基；和Cu烷氧基；13.R3為手性殘基并且是R-或S-對映體或其混合物(消旋體)；14.R3為S-對映體；15.R3為R-對映體；16.Rj為氫。式I化合物可以以游離形式或鹽形式存在，所述的鹽形式例如有與例如有機酸或無機酸如鹽酸或乙酸形成的加成鹽，或者與堿形成的當(dāng)R5是COOH或包含COOH時可得到的鹽，例如堿鹽，諸如鈉或鉀鹽或者取代或未取代的銨鹽。應(yīng)當(dāng)理解，式I化合物可以以旋光異構(gòu)體、外消旋物或非對映異構(gòu)體的形式存在。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括所有對映異構(gòu)體和構(gòu)象異構(gòu)體及其混合物。類似的考慮如上文所提及的那樣應(yīng)用于顯示出不對稱碳原子的原料。式l化合物和本身在生理學(xué)上是可接受的副產(chǎn)物的化合物，例如水解產(chǎn)生式I化合物和在所需劑量水平上無毒的醇的酯。本發(fā)明還包括制備式I化合物的方法，這些方法包括使式II化合物(其中Ri、R2如上所定義)與式III化合物(其中R3和R4如上所定義)反應(yīng)，如途徑A(方案l)所示。方案l:途徑A所有反應(yīng)均在溶劑中進行，所述的溶劑諸如有曱醇、乙醇、四氫呋喃、甲苯、二氯曱烷、1，2-二氯乙烷、N-甲基吡咯烷酮、二曱苯、乙酸乙酯、乙醚、己烷、環(huán)己烷、二曱基甲酰胺、丙酮、二甲基亞砜、叔丁基曱基醚。所有化合物均可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來分離(例如結(jié)晶、珪膠色i普法、HPLC)。式IV的2-羥基苯甲醛在適宜的堿(例如仲胺，諸如哌咬)的存在下在適宜的溶劑中與丙二酸二乙酯縮合，得到式V的2-氧代-2H-色烯-3-曱酸酯。如果R2是羥基，則可以在該階段在堿性條件下使用烷基卣作為親電子試劑在適宜的堿如三乙胺、哌啶、氫化鈉、碳酸鉀或碳酸銫的存在下在適宜溶劑的存在下，或者使用光延(Mitsunobu)條件用相應(yīng)的醇在三苯基膦和I)EAI)試劑的存在下，使羥基烷基化而使R2為烷氧基。然后將式V的2-氧代-2H-色烯-3-曱酸酯在氫氧化鋰或氫氧化鈉的存在下在適宜的溶劑中進行皂化，得到式II的2-氧代-2H-色烯-3-甲酸。對于形成酰胺鍵，使用試劑諸如亞硫酰氯或1-(3-二曱基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺或l，l，-羰二咪唑或丙烷膦酸酐在適宜的堿諸如三乙胺、N，N-二異丙基乙胺或碳酸氫鈉的存在下在適宜的溶劑中使式n化合物活化，使其與式1II化合物(苯胺衍生物)進行反應(yīng)，得到所需的式I化合物。如果R4或R5含有氮官能團保護基團如氨基甲酸叔丁酯官能團，則通過使其在適宜的溶劑中與酸諸如鹽酸或三氟乙酸進行反應(yīng)而實現(xiàn)脫保護。9采用途徑A和與本發(fā)明有關(guān)的其它方法制備2-氧代-2H-色烯-3-甲酸和式I化合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且已經(jīng)在文獻(Horing，E.C.等人(1955)o尸gflrt/c，,to&，集合巻III，165，Livingstone,R.(1977);R()dd，sC^e附/s外ca/"6owc0附/7o朋ffe，第IV巻，第96頁，Staunton,J.(1979);7/etefY<^c//cC7^附&,/j(編者P.G.Sammes),第4巻)中進行了綜述。在原料的制備沒有被特別描述的情況下，化合物是已知的或者可以類似于本領(lǐng)域已知的方法或按照下文公開的方法來制備。制備非市售的式IV的2-羥基苯甲醛化合物(其中R,是烯丙基或丙基)的便利方法顯示在流程2(途徑B)中?？梢杂糜H電子試劑諸如烯丙基溴將其中R,是H的式IV的2-羥基苯甲醛在適宜的堿諸如碳酸鉀或碳酸銫的存在下在適宜的溶劑中進行O-烷基化，得到式VI化合物。式VI化合物在熱條件(油浴或微波加熱)下的克萊森(Claisen)重排可以在凈溶劑條件下或在適宜的溶劑中進行，得到其中R,是烯丙基的式IV化合物。在醛的存在下將雙鍵進行選擇性還原，得到其中R,是丙基的式IV化合物，該過程可以在標(biāo)準(zhǔn)氫化條件下使用阮內(nèi)鎳作為催化劑在適宜的溶劑中實現(xiàn)。或者，如流程2(途徑C)中所示，如果R2是烷氧基，則使式VII化合物與強堿諸如丁基鋰和烷基卣或酰卣進行反應(yīng)，得到式VIII化合物，將其通過酸諸如鹽酸、氫溴酸或三溴化硼的作用在適宜的溶劑中進行O-脫烷基化，得到式IX化合物(酚)。將式X化合物在維爾斯梅爾(Vilsmeier)條件下使用例如POCl3和N，N-二曱基曱酰胺作為羰基源在適宜的溶劑中轉(zhuǎn)化為式IV化合物(其中R，是烷基或-CO烷基且R2是OH)。方案2:途徑B:VIIVHIXR2-烷氧基(R"烷基,-CO烷基,R2:烷氧基)(R"烷基,-CO烷基,R2=OH)制備非市售的式IV的2-羥基苯曱醛中間體(其中R2是羥基)的便利方法顯示在流程3(途徑D)中。按照文獻方法(SyntheticCommunications,20(12)，1869-1876)仿制式XI化合物的合成。將式X化合物在維爾斯梅爾(Vilsmder)條件下使用例如POCb和N，N-二甲基甲酰胺作為羰基源在適宜的溶劑中轉(zhuǎn)化為式IV化合物(其中R2是羥基)。方案3:途徑I):HR1R1R1XW(R2-羥基)式III的苯胺中間體可以購買或各硝基化合物是購買的，并在適宜的溶劑中通過鈀炭和氫或鈀炭與硼氫化鈉或氯化亞錫的作用被還原成式III的苯胺。如果R4或Rs帶氨基官能團，其在適宜的溶劑中、適宜的堿諸如三乙胺、二乙基異丙胺存在下，使用作為親電試劑的BOC酐被保護成叔丁氧基氨基甲酸酯。式III的苯胺可由相應(yīng)的硝基或溴代苯基XI在適宜的溶劑中通過鈀炭和氫或鈀炭與硼氫化鈉或氯化亞錫的作用下被還原而得到，或在標(biāo)準(zhǔn)的Pd催化條件下使用諸如氨、六曱基二硅氮烷或亞氨基二苯甲酮的氮源進行溴或氨基交換而被還原而得到。式XI硝基苯基或溴代苯基如方案4(途徑E)以下實施例說明了本發(fā)明。溶液的濃縮在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器上在減壓下進行。常規(guī)的快速色譜法在硅膠上進行。還使用Biotage快速色譜儀或Flashmaster儀進行了快速色語法。所用的縮寫為TBME=叔丁基甲基醚BOC=ik丁氧基羰基I)MF=二曱基甲酰胺LiOH=氬氧化鋰HC1=鹽酸THF=四氫吹喃CH2C12=二氯甲烷RT=室溫NaOH=氫氧化鈉Min=分鐘實施例l:7-甲氧基-2-氧代-8-丙基-2H-色烯-3-曱酸(4-吡咯烷-2-基-苯基)-酰胺12a)2-烯丙基氧基-4-曱氧基-苯甲醛的制備向2-羥基-4-甲氧基-苯甲醛(5g，32.8mmol)和烯丙基溴(3.89ml，46mmo1)在丙酮(50ml)中的溶液中加入碳酸鉀(6.8g，49.3mmo1)。然后將反應(yīng)混合物在回流下?lián)璋?小時。將反應(yīng)混合物濃縮，在200mlTBME和150ml1NNa()H之間分配，分層。將有機層用150ml鹽水和150ml水洗涂，干燥，濃縮。使用快速色譜法(洗脫劑CH2C12/己烷8/2)純化后，分離出2-烯丙基氧基-4-曱氧基-苯甲醛。b)3-烯丙基-2-幾基-4-曱氧基-苯曱醛的制備于230。C將2-烯丙基氧基-4-曱氧基-苯甲醛(5g，26mmol)在NMP(10ml)中的溶液進行微波加熱30分鐘。然后將反應(yīng)混合物倒入水/水(200ml)混合物中，加入TBME(200ml)，分離有機層，用150ml鹽水和150ml水洗滌，干燥，濃縮。使用快速色譜法(洗脫劑CH2C12/己烷8/2)純化后，分離出3-烯丙基-2-羥基-4-甲氧基-苯甲醛。c)2-羥基-4-甲氧基-3-丙基-苯曱醛的制備向3-烯丙基-2-羥基-4-甲氧基-苯甲醛(5g，26mmol)在THF(25ml)中的溶液中加入10。/。重量Pt/C。然后于室溫將反應(yīng)混合物攪拌直至消耗l當(dāng)量氫氣。然后將反應(yīng)混合物通過硅藻土過濾，濃縮。2-羥基-4-甲氧基-3-丙基-苯甲醛未經(jīng)進一步純化而使用。d)7-曱氧基-2-氧4、-8-丙基-2H-色烯-3-甲酸乙酯的制備13向2-羥基-4-甲氧基-3-丙基-苯曱醛(l5g，77,2mmol)在乙醇(450ml)中的溶液中加入丙二酸二乙酯(11.7ml，77.2mmol)和咪咬(7.6ml，77.2mmmo1)。于室溫將反應(yīng)混合物攪拌過夜。然后使用冰/水浴將反應(yīng)混合物冷卻至0。C，將形成的沉淀物過濾，用乙醇洗滌。將母液濃縮，使用快速色譜法(洗脫劑乙酸乙酯/己烷3/7)進行純化，得到7-曱氧基-2-氧代-8-丙基-2H-色烯-3-甲酸乙酯。e)7-甲氧基-2-氧代-8-丙基-211-色烯-3-甲酸的制備于0。C向7-甲氧基-2-氧代-8-丙基-211-色烯-3-甲酸乙酯(15.4g，53.0mmo1)在THF(300ml)中的溶液中加入lNNaOH溶液(120ml)，然后于室溫將反應(yīng)混合物攪拌過夜。使用水/水浴將反應(yīng)混合物冷卻至(fC，使用1NHC1溶液使pH降為l。于0。C將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，將形成的沉淀物過濾，用水洗滌。將沉淀物干燥后，分離出7-甲氧基-2-氧代-8-丙基-2H-色烯-3-曱酸。f)2-{4-[(7-甲氧基-2-氧代-8-丙基-211-色烯-3-羰基)-氨基卜苯基}-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯的制備向7-曱氧基-2-氧代-8-丙基-2H-色烯-3-甲酸(150mg，0.572mmol)在CH2CI2(6ml)中的溶液中加入二異丙基乙胺(147ul，0.858mmol)和丙烷膦酸酐在乙酸乙酯中的溶液(456ul，0.858mmo1)。然后于室溫將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘。將2-(4-氨基-苯基)-吡咯烷-l-甲酸叔丁酯(150mg，0.572mmol)加入到反應(yīng)混合物中。于室溫將其攪拌4小時。反應(yīng)混合物用二氯甲烷(40ml)稀釋，用40ml的NaHCO3飽和溶液、40ml鹽水洗滌，然后萃^"機層，干燥并濃縮。在沉淀后分離2-{4-[(7-甲氧基-2-氧代-8-丙基-211-色烯-3-羰基)-氨基卜苯基}-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯，用己烷洗滌得到淺黃色固體。g)7-甲氧基-2-氧代-8-丙基-211-色烯-3-甲酸(4-吡咯烷-2-基-苯基)-酰胺的制備向2-(4-l(7-曱氧基-2-氧代-8-丙基-2H-色烯-3-羰基)-氨基j-苯基)-吡咯烷-l-甲酸叔丁酯(194mg,0.38mmo1)在二氯甲烷(5ml)中的溶液中加入在二噁烷(lmL)中的4NHC1。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2h(加入HC1后生成沉淀)。然后將反應(yīng)混合物減壓濃縮，固體用乙醚研磨。過濾后分離出7-甲氧基-2-氧代-8-丙基-2H-色烯-3-曱酸(4-吡咯烷-2-基-苯基)-酰胺。14其中R,、R2、R3和Rj如以下表l中所定義,表l<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>全部以下實施例按照上文描述的方法合成。通過以上實施例1中描述的方法并使用途徑A中描述的方法，并使用適宜起始原料得到式Xa化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>17丙基OMe4-[l-(2-羥基-乙基)-吡咯烷-2-基-*H451.418異丙基OMe4-l-甲基-p比咯烷-2-基一*H421.319丙基OMerac-4畫旅咬畫2-基-H421.320乙基OMerac-4-哌咬-2-基-H407.321OEtOMe4-咪咬-2-基畫*H423.122OEtOMe4-旅咬-2-基-*H42323OiPrOMe4-哌咬-2國基-*H43724OiPrOMe4-旅咬-2-基-*H43725丙基OMerac-4-(l-甲基-旅咬-2-基)-H435.426乙基OMerac—4-(l-甲基-哌咬-2畫基)-H421,327丙基OMe4-(S)-嗎啉-3-基-H423.228乙基OMe4-(S)-嗎啉-3-基-H409.129OEtOMe4-(S)-嗎啉-3-基-H425.130OEtOMe4-(11)-嗎啉-3-基-H42531—OiPrOMe4-(S)-嗎啉-3-基-H439.232OCH;j環(huán)丙基OMe4-(S)-嗎啉-3-基-H45133OEtOMe4-(S)-4-甲基-嗎啉-3-基-H439.834甲基OMerac-4-p馬淋-2-基-H395.135乙基OMerac-4-嗎啉畫2-基畫H409.536乙基OMe4-嗎淋-2-基-*H409.137OEtOMerac國4-嗎啉-2-基-H425,138OEtOMe4-嗎啉-2-基-*H425.139OEtOMe4-嗎淋-2-基-*H425.140OiPrOMerac畫4-嗎淋-2-基-H439.641OiPrOMe4-嗎淋-2-基-*H439.142OiPrOMe4-嗎啉-2-基-*H439,143丙基OMerac-4-n底噪-2-基-H42244乙基OMeH40845乙基OMe4-哌喚-2-基-*H40816<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>75甲基OMe4-(R)-吡咯烷-2-基-H379.1876曱基OMe4-(R)-吡咯烷-2-基-2-F397.1877曱基OMe4-(R)-吡咯烷-2-基-2-Me393.2178丙基(S)OCH(Me)Et4-(R)-吡咯烷-2-基-H449.1i79丙基(S)OCH(Me)Et4-(R)-吡咯烷-2-基-3畫Et477.1180丙基(S)OCH(Me)Et4-(R)-吡咯烷-:2-基誦2-Me463.1;81OiPrOiPr4-(R)-吡咯烷-2-基-H451.6;82OiPrOiPr4-(R)-吡咯烷-2-基-2-Me465.283丙基(S)OCH(Me)Et4-(R)-吡咯烷-2-基-3Me463.384丙基EtO4-(R)-吡咯烷-2-基-H421.285丙基EtO4-(R)-吡咯烷-:2岡基國2-Me435.386丙基EtO4曙(R)-吡咯烷-2-基-3-Me435.387EtOEtO4-(R)-吡咯垸-2-基-H423.2i88EtOEtO4-(R)-吡咯烷-2-基-2-Me437.389—EtOEtO4-(議)-吡咯烷-2-基-2-F441.5卯OiPrOMe4-(S)-嗎啉-3-基畫3-Me453.391OiPrOMe4(-2掘-旅咬-2-基)畫*H451.392OiPrOMe4(-2-Me-哌咬-2-基)畫六H451.393EtOOMe4(-2-Me-咪咬-2-基)^H437.394EtOOMe4(-2-Me-哌啶-2-基)-夫H437.3:95EtOOMe3-(S)-嗎啉-3-基-H425.3i96OiPrOMe3-(S)-嗎啉-3-基畫H439.397甲基OMe4-(S)-嗎啉-3-基誦H395.198CH2OMeOMe4-(S)-嗎啉-3-基-H425.299EtOEtO4-(S)-嗎啉-3-基-H439.2100OiPrOiPr4-(S)-嗎啉-3-基-H467.2101EtOCH2OMe4-(8)-嗎啉-3-基-H439.3102CH2OMeEtO4-(11)-吡咯烷-2-基-H409103EtOCH2OMe4-(R)-吡略烷-2-基-H423.4104OiPrOiPr4-(R)-吡咯烷-2-基-2-F469.5105OiPrEtO4-(R)-吡咯烷-2-基-H437.3106OiPrEtO4-(S)-嗎啉-3-基-H453.3上ITf"貫例表示的"i兌明*表示未知絕對構(gòu)型的手性化合物。rac表示S和R對映體的消旋混合物。18游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物顯示出有價值的藥理學(xué)性質(zhì)，例如作為S1P1受體激動劑，例如如在體外和體內(nèi)試驗中所表明的那樣，因此其表明可用于治療。A.體外式I化合物對個體人S1P受體具有結(jié)合親和力，如在以下試驗中測定的那樣A.l體外測定GTP〖y-"Sl與由表達人EDG受體的CHO細胞制備的膜結(jié)合的GPCR激活試驗SIP!(EDG-1)GTPY-35S1結(jié)合試驗由穩(wěn)定表達人EDG-lN-末端c-myc標(biāo)記的CHO細胞克隆制備了勻化的膜。在收集前，將細胞在兩個850cm2滾瓶中懸浮培養(yǎng)3或4天。將細胞離心下來，用冷PBS洗滌1次，重新混懸在^20ml緩沖液A(20mMHEPES，pH7.4,lOmMEDTA，不含EDTA的完全蛋白酶抑制劑合劑11片/25m11)中。使用Polytron勻化器以30000rpm、以3個間隔(每個15秒)將細胞懸液在冰上勻化。首先將勻化物在臺式低速離心機上以2000rpm離心10分鐘。通過細胞濾過器后，然后于4。C以50，000xg將上層液再次離心25分鐘。將沉淀物重新混懸在緩沖液B(15。/。甘油，20mMHEPES,pH7.4，O.lmMEDTA，不含EDTA的完全蛋白酶抑制劑合劑[1片/10ml])中。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(皮爾斯(Pierce)公司)、使用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)測定了制備物的蛋白質(zhì)濃度。將膜進行等分，于-80。C保持冷凍。用DMSO制備了范圍為10mM至0.01nM的受試化合物溶液。將S1P用4。/。BSA溶液稀釋作為陽性對照。將所需量的膜制備物用冰冷的測定緩沖液(20mMHEPES，pH7.4，lOOmMNaCl，10mMMgCl2，0.1%不含脂肪酸的BSA，5pMGDP)稀釋，充分渦旋。將2iul或更少的化合物分配到圓底96孔聚苯乙烯測定板的各孔中，然后加入100nl稀釋的膜(3-10ng/孔)，在水上保持直至加入熱GTPyS。將[35s卜GTPyS用冷測定緩沖液稀釋l:1000(v/v)，將lOOiul加入到各孔中。反應(yīng)于室溫進行90分鐘，然后使用帕卡德^^司(Packard)的Filtermate采集器將膜收集到珀金埃爾默(Perkin-Elmer)UnifilterGF/B-96濾板上。用洗滌緩沖液(20mMHEPES，pH7,4，100mMNaCl,10mMMgCl2)洗滌數(shù)次并用95。/。乙醇沖洗后，將過濾器在37。C干燥19箱中干;J^30分鐘。加入MicroScint-20,將板密封用于在TopCount上進行閃爍計數(shù)。通過用GraphPadPrism劑量響應(yīng)曲線擬合工具將GTPly-"Sl結(jié)合曲線(原始數(shù)據(jù))擬合而得到EC50值。使用了6或12種不同濃度以產(chǎn)生濃度響應(yīng)曲線(每種濃度使用3個數(shù)據(jù)點)。使用來自穩(wěn)定表達c-末端c-myc標(biāo)記的或未標(biāo)記的受體的CHO細胞的膜以與S1P1GTP[Y-35S]結(jié)合試驗相當(dāng)?shù)姆绞竭M行了S1P3、-5、-6和-8GTPh^SSj結(jié)合試驗。對于各膜制備物，首先用S1P對照進行了劑量遞增實驗以確定將加入每個試驗孔的膜的最佳量。按照以上測定對式I化合物進行了試驗，這些化合物顯示出對S1P受體如S1P1受體具有選擇性，其ECsq〈1hM。此外，與S1P3、S1P4和S1P5相比，式I化合物可顯示出對S1P1受體的選擇性，例如，式I化合物對S1P1的選擇性可以是對S1P3、S1P4和S1P5的選擇性的至少20倍。同樣一般地，式I化合物可以對S1P1和S1P5受體較其他亞型即S1P3和S1P4具有所謂的雙重選擇性。所述選擇性一般約為20-30(以受體親和性表示)。這樣的S1P1/S1P5受體雙重激動劑亦具有有價值的藥理學(xué)效果。ExS1P-1EC50[闊10扁130.001680.0075230.0755270細2410.0029430細1440扁2530據(jù)6620細5720.0018820.0024890.0128900.0062960.002820A.2FLIPR4丐流分析用FLIPR釣流分析測定了本發(fā)明的化合物對S1P1、S1P3、S1P5和S1P6的激動劑活性。簡言之，將表達SlP受體的CHO細胞在含有5。/oFBS和500ug/mlG418的F-12K培養(yǎng)基(ATCC)中維持。在試驗前，將細胞以在含有l(wèi)。/,FBS的F-12K培養(yǎng)基中10,000個細胞/孔/25iul的密度鋪在384孔黑色透明底的板中。第二天，將細胞用洗滌緩沖液洗滌3次(25^1/每次)。將約25pl染料加入到各孔中，在37。C和5。/。C02下孵育1小時。然后將細胞用洗滌緩沖液洗滌4次(25iul/每次)。在將25plSEW2871(由Rosen等人公開，用作參考)溶液加入到細胞的各孔中后測定4丐流。對表達各不同S1P受體的細胞進行了相同試驗。經(jīng)3分鐘間隔記錄FLIPR鈣流分析中的遞增，將其定量為相對于S1P-1激活的最大峰高百分數(shù)響應(yīng)。本發(fā)明的化合物在該試驗中在10—12至3.10-SnM的濃度下具有活性。例如，實施例13對SlP-l具有的ECso=92nM，對所有其它同工型(SlP-2、SlP-3、SlP-4、SlP-5)具有的ECso〉lum。B.體內(nèi)測定血液淋巴細胞消減的篩選試驗循環(huán)、淋巴細胞的測定:將受試化合物溶解在DMSO/PEG200中，用去離子水進一步稀釋。經(jīng)口應(yīng)用給大鼠(路易斯品系，雌性，6-12周齡)施用在4ml栽體/kg(最大2。/。DMSO/最大2。/。PEG200/水)中的lmg/kg受試化合物。DMSO/PEG200/水和FTY720(0.3mg/kg)包括在內(nèi)分別作為陰性和陽性對照、。在施用后2、6、24和48小時在短時異氟烷麻醉下由舌下靜脈采集血液。對全血樣品進行血液學(xué)分析。使用自動分析器測定了外周淋巴細胞計數(shù)。通過熒光染料結(jié)合的特異性抗體將外周血淋巴細胞的亞群染色，使用熒光激活細胞分類器(Facscalibur)對其進行了分析。使用了兩只大鼠以評價篩選的各化合物的淋巴細胞消減活性。結(jié)果為EDso，其定義為顯示出50%血液淋巴細胞消減所需的有效劑量。按照以上測定對式I化合物進行了試驗，其具有的EDsQ在10mg/kg以下。例如，實施例9的化合物在6小時所具有的EI)so=1.4mg/kg。因此，式I化合物可用于治療和/或預(yù)防由淋巴細胞相互作用介導(dǎo)的疾病或障礙，例如在移植中，諸如細胞、組織或器官同種異體或異種移植物的急性或慢性排斥或者移植物功能延遲恢復(fù)(delayedgraftfunction)、移植物抗宿主病，自身免疫性疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、橋本甲狀腺炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、I型或II型糖尿病及與其有關(guān)的障礙、脈管炎、惡性貧血、舍格倫綜合征、眼色素層炎、銀屑病、格雷夫斯眼病、局限性脫發(fā)及其它，變應(yīng)性疾病，例如變應(yīng)性哞喘、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性鼻炎/結(jié)膜炎、變應(yīng)性接觸性皮炎，任選具有潛在異常反應(yīng)的炎性疾病，例如炎性腸病、克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎、內(nèi)源性孝喘、炎性肺損傷、炎性肝損傷、炎性腎小球損傷、動脈粥樣硬化、骨關(guān)節(jié)炎、刺激性接觸性皮炎和還有濕滲性皮炎、脂溢性皮炎、免疫學(xué)上介導(dǎo)的障礙的皮膚表現(xiàn)、炎性眼病、角結(jié)膜炎、心肌炎或肝炎，缺血/再灌注損傷，例如心肌梗塞、中風(fēng)、腸缺血、腎衰竭或出血性休克、創(chuàng)傷性休克，癌癥，例如乳癌、T細胞淋巴瘤或T細胞白血病，感染性疾病，例如中毒性休克(例如超抗原引起的)、敗血癥性休克、成人呼吸窘迫綜合征或病毒感染如AIDS、病毒性肝炎、慢性細菌感染，或者老年性癡呆。細胞、組織或?qū)嶓w器官移植物的實例例如包括胰島、干細胞、骨髓、角膜組織、神經(jīng)組織、心臟、肺、心-肺聯(lián)合、腎臟、肝臟、腸、胰、氣管或食管。對于以上用途，所需的劑量當(dāng)然將根據(jù)施用模式、所治療的具體病癥和所需的作用而改變。通常，以約0.03至5.0mg/kg體重的日劑量全身施用被指示可獲得令人滿意的結(jié)果。在較大的哺乳動物如人中的指示日劑量為約0.5mg至約500mg，可方l更地例如以一天至多四次的分開劑量或延遲形式施用。適用于口服施用的單位劑量形式包含約0.1至50mg活性成分。式I化合物可以通過任意常規(guī)途徑來施用，特別是經(jīng)腸施用，例如口月良施用，例如以片劑或膠嚢劑的形式施用，或者胃腸道外施用，例如以注射溶液或混懸液的形式施用，局部施用，例如以洗劑、凝膠劑、軟膏劑或乳膏劑的形式施用，或者以經(jīng)鼻或栓劑的形式施用。包含游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物以及至少一種可藥用載體或稀釋劑的藥物組合物可以以常規(guī)方式通過與可藥用載體或稀釋劑混合來制備。式I化合物可以以游離形式或可藥用鹽形式、例如如上表明的那些來施用。這類鹽可以以常規(guī)方式來制備并且顯示出與游離化合物相同級別的活性。根據(jù)上文，本發(fā)明還提供了1.1在需要該治療的個體中預(yù)防或治療由淋巴細胞介導(dǎo)的障礙或疾病、例如如上表明的那些的方法，該方法包括給所述個體施用有效量的式I化合物或其可藥用鹽；1.2在需要該治療的個體中預(yù)防或治療急性或慢性移植排斥或者T-細胞介導(dǎo)的炎性或自身免疫性疾病、例如如上表明的那些的方法，該方法包括給所述個體施用有效量的式I化合物或其可藥用鹽；2.用作藥物、例如以上1.1或1.2表明的任意方法中用作藥物的游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物。3.例如用于以上1.1或1.2中任意方法的藥物組合物，包含游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物以及用于此的可藥用稀釋劑或載體。4.用于制備用于以上1.1或1.2中任意方法的藥物組合物的式I化合物或其可藥用鹽。式I化合物可以作為單獨的活性成分或者例如作為其它藥物的輔劑而與其它藥物聯(lián)合施用，所述的其它藥物例如有免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑或其它抗炎劑，例如用于治療或預(yù)防同種異體或異種移植物急性或慢性排斥或者炎性或自身免疫性障礙，或者化學(xué)治療劑如惡性細胞抗增殖劑。例如，式I化合物可以與如下藥物組合使用鈣神經(jīng)素抑制劑，例如環(huán)孢素A或FK506;mTOR抑制劑，例如雷帕霉素、40-O-(2-羥基乙基)-雷帕霉素、CCl779、ABT578、AP23573、biolimus-7或biolimus-9;具有免疫抑制性質(zhì)的子嚢霉素，例如ABT-281、ASM981等；皮質(zhì)類固醇；環(huán)磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；來氟米特；咪唑立賓；麥考酚酸或鹽；麥考酚酸嗎乙酯；15-脫氧精胍菌素或其免疫抑制同系物、類似物或衍生物；PKC抑制劑，例如如在WO02/38561或WO03/82859中^Hf的那些，例如實施例56或70的化合物；JAK3激酶抑制劑，例如N-千基-3，4-二羥基-亞爺基-氰基乙酰胺a-氰基-(3,4-二羥基)-N-千基肉桂酰胺(TyrphostinAG4卯)、靈菌紅素25-C23(PNU156804)4-(4'-羥基苯基)-氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉(WHI-P131)、^國(3，-溴-4'-羥基苯基)-氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉l(WHI-P154)4-(3，,5'-二溴-4'-羥基苯基)-氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉WHI-P97、KRX-211、3-{(31^，411)-4-甲基-3-曱基-(711-吡咯并[2，3-(1]嘧啶-4-基)-氨基-哌啶-1-基}_3_氧代_丙腈，為游離形式或可藥用鹽形式，例如單枸櫞酸鹽(還稱為CP-6卯，550)，或如在WO04/052359或WO05/066156中z^開的化合物；S1P受體激動劑或調(diào)節(jié)劑，例如任選磷酸化的FTY720或其類似物，例如任選磷酸化的2-氨基-2-[4-(3-節(jié)基氧基苯硫基)-2-氯苯基乙基-l，3-丙二醇或1-{4-[1-(4-環(huán)己基-3-三氟曱基-節(jié)基氧基亞氨基)-乙基卜2-乙基-千基}-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸或其可藥用鹽；免疫抑制單克隆抗體，例如白細胞受體如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD52、CD58、CD80、CD86或其配體的單克隆抗體；其它免疫調(diào)節(jié)化合物，例如具有CTLA4或其突變體的至少一部分胞外域的重組結(jié)合分子，例例如CTLA4Ig(例如指定的ATCC68629)或其突變體的重組結(jié)合分子，例如LEA29Y;粘著分子抑制劑，例如LFA-1拮抗劑、ICAM-l或-3拮抗劑、VCAM-4拮抗劑或VLA-4拮抗劑；或化學(xué)治療劑，例如紫杉醇、吉西他濱、順鉑、多柔比星或5-氟尿嘧啶；或抗感染劑。當(dāng)式I化合物與其它免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)治療、抗炎、化學(xué)治療或抗感染治療聯(lián)合施用時，共同施用的免疫抑制化合物、免疫調(diào)節(jié)化合物、抗炎化合物、化學(xué)治療化合物或抗感染化合物的劑量當(dāng)然將根據(jù)所采用的共用藥物的類型(例如它是類固醇還是鈣神經(jīng)素抑制劑)、所采用的具體藥物、所治療的病癥等等而改變。根據(jù)上文，本發(fā)明還在另一方面提供了5.如上所定義的方法，該方法包括共同施用、例如并行或依次施用治療有效的無毒量的式I化合物和至少第二種藥物、例如免疫抑制藥、免疫調(diào)節(jié)藥、抗炎藥或化學(xué)治療藥、例如如上表明的那些。6.藥物組合、例如藥盒，包含a)第一種物質(zhì)，該物質(zhì)為游離形式或可藥用鹽形式的如本文所公開的式I化合物，和b)至少一種共用物質(zhì)，例如免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、抗炎劑、化學(xué)治療劑或抗感染劑。該藥盒可以包24含其施用說明書。如本文所用的術(shù)語"共同施用"或"組合施用"等意欲包括將所選的治療劑施用于單一患者，并且意欲包括其中物質(zhì)不一定通過相同施用途徑或同時施用的治療方案。如本文所用的術(shù)語"藥物組合"表示由將一種以上活性成分混合或合并所得到的產(chǎn)品，包括活性成分的固定和非固定組合。術(shù)語"固定組合"表示將活性成分、例如式I化合物和共用物質(zhì)以單一實體或劑量的形式同時均施用于患者。術(shù)語"非固定組合"表示將活性成分、例如式I化合物和共用物質(zhì)作為單獨的實體同時、并行或依次而沒有特定時間限制地均施用于患者，其中該施用可在患者體內(nèi)提供這2種化合物的治療有效水平。后者還可應(yīng)用于雞尾酒療法，例如施用3種或更多種活性成分。權(quán)利要求1.式I化合物或其生理學(xué)上可水解的衍生物、其鹽、水合物和/或溶劑化物其中R1和R2各自獨立地選自氫；鹵素；硝基；任選取代的C1-8烷基；任選取代的鹵代C1-8烷基；任選取代的C1-8烷氧基；和任選取代的鹵代C1-8烷氧基；R3為包含至少一個環(huán)N原子的飽和雜環(huán)，且其通過環(huán)C原子與環(huán)A連接，該環(huán)碳原子或任何其他環(huán)C原子任選被取代；R3在3位或4位上，優(yōu)選在4位上；R4為氫；羥基；鹵素；鹵代C1-8烷基；任選取代的C1-6烷基；C1-6烷氧基；或鹵代C1-6烷氧基；優(yōu)選R4為氫；R4在2位(鄰位)或3位(間位)上。2，根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R3為如下式(Ib)的三至八元飽和雜環(huán)<image>imageseeoriginaldocumentpage2</image>其中X選自NR、O、CH2和S原子，其中R和R，彼此獨立地為H或d-4烷基，且其中所述的R3與式(I)中的所述A環(huán)通過帶氫原子的式(Ib)環(huán)內(nèi)任何碳原子相連，該氫然后被所述連接替換。3.權(quán)利要求1的化合物，其中R3為包含1或2個優(yōu)選地選自N、O和S的雜原子的三至八元、優(yōu)選為四至七元的飽和雜環(huán)。4.權(quán)利要求l的化合物，其中R3經(jīng)由形成所述的R3的碳原子與環(huán)A連接。5.權(quán)利要求4的化合物，其中連接的碳原子在R3的雜原子的2位或3位。6.權(quán)利要求l的化合物，其中R,和R2各自獨立地選自任選取代的d—8烷基；任選取代的卣代d、8烷基；任選取代的C,-s烷氧基；任選取代的卣代d-8烷氧基。7.權(quán)利要求1的化合物，其中R，和R2彼此獨立地選自d，8烷基和Q—8烷氧基；優(yōu)選R,和R2兩者均為C^烷氧基。8.權(quán)利要求1的化合物，其中R3為3-S-嗎啉基、2-S-哌溱基、2-R-哌咬基或2-R-吡咯烷基；且R3在環(huán)A的4位連接。9.用作藥物的根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項的化合物。10.用作藥物的根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項的化合物，其中所述的用途為治療和/或預(yù)防通過淋巴細胞相互作用介導(dǎo)的疾病或障礙；例如在移植中，諸如細胞、組織或器官同種異體或異種移植物的急性或慢性排斥或者移植物功能延遲恢復(fù)、移植物抗宿主病，自身免疫性疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、橋本甲狀腺炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、I型或II型糖尿病及與其有關(guān)的障礙、脈管炎、惡性貧血、舍格倫綜合征、眼色素層炎、銀屑病、格雷夫斯眼病、局限性脫發(fā)及其它，變應(yīng)性疾病，例如變應(yīng)性哮喘、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性鼻炎/結(jié)膜炎、變應(yīng)性接觸性皮炎，任選具有潛在異常反應(yīng)的炎性疾病，例如炎性腸病、克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎、內(nèi)源性哮喘、炎性肺損傷、炎性肝損傷、炎性腎小球損傷、動脈粥樣硬化、骨關(guān)節(jié)炎、刺激性接觸性皮炎和還有濕滲性皮炎、脂溢性皮炎、免疫學(xué)上介導(dǎo)的障礙的皮膚表現(xiàn)、炎性眼病、角結(jié)膜炎、心肌炎或肝炎，缺血/再灌注損傷，例如心肌梗塞、中風(fēng)、腸缺血、腎衰竭或出血性休克、創(chuàng)傷性休克，癌癥，例如乳癌、T細胞淋巴瘤或T細胞白血病，感染性疾病，例如中毒性休克(例如超抗原引起的)、敗血癥性休克、成人呼吸窘迫綜合征或病毒感染如AIDS、病毒性肝炎、慢性細菌感染，或者老年性癡呆。全文摘要式(I)化合物、它們的制備方法、它們的用途、特別是在移植中的用途以及含有它們的藥物組合物，其中R₁、R₂、R₃和R₄如說明書中所定義。文檔編號C07D311/16GK101583608SQ200880002594公開日2009年11月18日申請日期2008年1月31日優(yōu)先權(quán)日2007年2月2日發(fā)明者A·B·史密斯,F·澤克里,N·G·庫克,R·班特里申請人:諾瓦提斯公司